CN103451113B - 一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，该方法为：从蔬菜叶上采集被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸，从虫尸上分离虫生真菌，放入PDA培养基上培养后制成孢子悬浮液喷于烟粉虱2龄若虫上，培养后从虫尸上再次分离该虫生真菌，保存在试管斜面上，保存于冰箱中。从冰箱中取出虫生真菌，制成孢子悬浮液，用滤纸片沾取孢子悬浮液，接种于培养基上，对置于霉菌培养箱中培养，挑取菌丝接入无菌水中搅拌，过滤，将孢子悬浮液，置于培养皿中心，在菌落中心打孔，吐温-80打散，搅拌，过滤后计算产孢量和菌落直径。用该方法对最适培养基配方、温度、pH、光照条件和通气条件进行筛选。本发明的优点在于菌落直径面积大，产孢量大。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株的分离及培养方法，特别是涉及一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法。
背景技术
玫烟色棒束孢是一种重要的虫生真菌，分布广泛，能寄生同翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目和膜翅目等多种有害昆虫，我们在田间分离到了一株玫烟色棒束孢菌株，命名为IF-1106，我们对玫烟色棒束孢的生物学特性进行研究，有助于为该菌的大量生产提供理论依据。在进行生物学特性测定过程中，发现传统的用打孔器取菌饼接种的方法，会使孢子弹射，菌落生长不规则，无法测定菌落直径。因此，需要寻找一种合适的培养方法，避免孢子弹射，使菌落生长规则，能合理准确的进行菌落形态特征描述及菌落直径测定，明确菌的培养方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离方法。
本发明的另一目的在于提供一种玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种玫烟色棒束孢菌，其菌株为IF-1106，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2013年4月23日，保藏编号：CGMCCNo.7514，分类命名：玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea。
本发明玫烟色棒束孢菌菌株的分离方法为，首先从温室蔬菜叶上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸3-7头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3%的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经110-130℃灭菌10-30min后的去离子水5-15ml冲洗2-4次，放入马铃薯葡萄糖培养基（PDA）或马铃薯蔗糖培养基（PSA）上，倒置于20-30℃霉菌培养箱（培养箱的型号为MJ-250F-1霉菌培养箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产）中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）或马铃薯蔗糖培养基（PSA）上培养，8-12d后马铃薯葡萄糖培养基（PDA）或马铃薯蔗糖培养基（PSA）上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有5-15ml0.1%的吐温-80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用3-5层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有40-60头烟粉虱2龄若虫（2龄若虫的形态特征为：椭圆形，扁平，灰白色，稍透明，体长0.3-0.5mm）的蔬菜叶上，放入湿度为80-100%，温度为20-30℃的人工气候箱（人工气候箱的型号为PRX-450C智能人工气候箱，由宁波海曙赛福仪器厂生产）中培养4-6d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于3-5℃冰箱中。
本发明玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法为：从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为5-10的马铃薯葡萄糖培养基（PDA）或马铃薯蔗糖培养基（PSA）上，置于霉菌培养箱中培养8-12d；在培养的前4-6d设置霉菌培养箱的温度为15-30℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后4-6d设置霉菌培养箱的温度为15-30℃全黑暗培养，这样利于产孢；8-12d后挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1%的吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用3-5层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液。再用直径4-8mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径为9cm加入20-30ml马铃薯葡萄糖培养基（PDA）或马铃薯蔗糖培养基（PSA）的玻璃培养皿中心，先在温度为15-30℃光照为24h全光照的条件下培养4-6d，再转入温度为15-30℃全黑暗的条件下培养4-6d后，马铃薯葡萄糖培养基（PDA）或马铃薯蔗糖培养基（PSA）上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径为4-8mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色，这时菌落形成，用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔4-6处，且每处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温-80打散，放在磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basicKT/C，由IKA公司生产）上搅拌20-40min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量和菌落直径。
本发明玫烟色棒束孢菌菌株的分离方法优选为，首先从温室黄瓜叶片上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸5头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3%的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经121℃灭菌20min后的去离子水10ml冲洗3次，放入马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上，倒置于25℃霉菌培养箱（培养箱的型号为MJ-250F-1霉菌培养箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产）中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上培养，10d后马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有10ml0.1%的吐温-80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用4层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有50头烟粉虱2龄若虫（烟粉虱2龄若虫的形态特征为：椭圆形，扁平，灰白色，稍透明，体长0.4mm）的黄瓜叶片上，放入湿度为90%，温度为25℃的人工气候箱（人工气候箱的型号为PRX-450C智能人工气候箱，由宁波海曙赛福仪器厂生产）中培养5d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于4℃冰箱中。
本发明玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法优选为：从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为7左右的马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上，置于霉菌培养箱中培养；在培养的前5d设置霉菌培养箱的温度为30℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后5d设置霉菌培养箱的温度为25℃全黑暗培养，这样利于产孢；10d挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1%的吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用4层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液。再用直径6mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径9cm加入25ml马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的玻璃培养皿中心，先在温度为30℃光照为24h全光照的条件下培养5d，再转入温度为25℃全黑暗的条件下培养5d；10d马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径约6mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色；用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔5处，且5处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温-80打散，放在磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）上搅拌30min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量，菌落直径为（39.08±1.15）mm，产孢量为（1.992±0.165）×107孢子/ml。
所述马铃薯葡萄糖培养基（PDA），具体配方为：马铃薯100-300g，葡萄糖10-30g，琼脂8-25g，蒸馏水0.5-1.5L。
所述马铃薯葡萄糖培养基（PDA），具体配方优选为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水1L；或马铃薯150g，葡萄糖25g，琼脂12g，蒸馏水1.2L；或马铃薯250g，葡萄糖15g，琼脂22g，蒸馏水0.8L。
所述马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯切成1cm见方的小块，加蒸馏水煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂和葡萄糖，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
所述马铃薯蔗糖培养基（PSA）具体配方为：马铃薯100-300g，蔗糖10-30g，琼脂8-25g，蒸馏水0.5-1.5L。
所述马铃薯蔗糖培养基（PSA）具体配方优先为:马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂17g，蒸馏水1L；或马铃薯150g，蔗糖25g，琼脂12g，蒸馏水1.2L；或马铃薯250g，蔗糖15g，琼脂22g，蒸馏水0.8L。
所述马铃薯蔗糖培养基（PSA）的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯切成1cm见方的小块，加蒸馏水煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂和蔗糖，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
本发明玫烟色棒束孢菌菌株的分离方法和培养方法优点在于避免孢子弹射，使菌落生长规则，能合理准确的进行菌落形态特征描述及菌落直径测定，且菌落直径面积大，产孢量大等优点。
下述实验例用于进一步说明本发明，但不限于本发明。
1材料与方法
1.1供试菌株
玫烟色棒束孢IF-1106菌株，试管斜面保存于4℃冰箱中。使用时，取出活化，接种于PDA培养基上，置于25℃霉菌培养箱中培养。
1.2生物学指标测定方法
1.2.1菌落生长速率测定
挑取斜面菌种的分生孢子，接入已经灭菌的0.1%的吐温80溶液中，用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液。用灭菌的滤纸片（直径6mm）沾取孢子悬浮液，置于直径9cm加入25ml培养基的培养皿中心，25℃下黑暗培养。每个处理5次重复，从第3d开始每2d定时定方向测量菌落直径，同时观察菌落形态特征。
1.2.2产孢量的测定
在第5次测量菌落直径后，用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔5处，且5处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温80打散，放在磁力搅拌器上搅拌30min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数。
1.3培养条件设置
1.3.1培养基配方
马铃薯葡萄糖培养基（PDA）:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水1L。
马铃薯蔗糖培养基（PSA）:马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂17g，蒸馏水1L。
萨氏葡萄糖培养基（SDA）:蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂15g，蒸馏水1L。
萨氏葡萄糖酵母浸膏培养基（SDAY）:蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂15g，酵母粉2g，蒸馏水1L。
萨氏麦芽糖酵母浸膏培养基（SMAY）:蛋白胨10g，麦芽糖40g，琼脂15g，酵母粉2g，蒸馏水1L。
察氏培养基（Czperk）:NaNO32g，K2HPO41g，KCl0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，蔗糖30g，琼脂17g，蒸馏水1L。
菌株接种于以上各种培养基上，于25℃的恒温培养箱中全黑暗培养，每个处理5次重复，各生物学指标测定同1.2。
1.3.2温度条件
菌株接种于PDA培养基上，分别于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的恒温培养箱中全黑暗培养，每个温度设5次重复，各生物学指标测定同1.2。
1.3.3光周期条件
菌株接种于PDA培养基上，于25℃下设24L、16L/8D、12L/12D、8L/16D、24D五个光周期培养。每个温度设5次重复，各生物学指标测定同1.2。
1.3.4通气条件
菌种接种于PDA培养基上，于25℃下培养。将接好菌的培养皿：用Parafilm（美国，PM-996）封口膜（裁成3cm的宽度）封口、家用保鲜膜（裁成3cm的宽度）封口、不封口，共3个处理，每个处理5次重复，各生物学指标测定同1.2。
1.3.5不同初始pH
用NaOH和乳酸调节PDA培养基pH分别为5、6、7、8、9，然后接种于25℃条件下进行培养，每个处理5次重复，各生物学指标测定同1.2。
1.4数据处理
用SPSS17.0数据处理系统对实验数据进行统计分析，计算均值及标准误，均值差异显著性通过Duncan新复极差法进行多重比较分析。回归方程用SPSS线性回归分析得出，回归方程斜率即为菌落生长速率。
2.结果与分析
2.1不同培养基对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
玫烟色棒束孢在不同培养基条件下的菌落直径、菌落生长速率及产孢量如表1所示。从表中可知，该菌株在6种培养基上的菌落直径（F=67.10;df=5，24;P<0.001）及产孢量(F=55.39;df=5,24;P<0.001)差异显著，其中在SMAY培养基上菌落生长速率最大，为3.471mm/d，菌丝生长最快，菌落直径最大，为36.9mm。但该菌株在SMAY培养基上的产孢量却较低。玫烟色棒束孢在PDA培养基上的产孢量最大，达1.91×107孢子/ml。综合考虑，选用PDA培养基为该菌的最适培养基。
表1不同培养基对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
注：经Duncan多重比较，不同的小写字母代表在P<0.05水平差异性显著，下同。
2.2不同温度对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
玫烟色棒束孢在不同温度下的培养结果如表3所示。从表中可知，该菌在15～30℃的范围内可以生长，在不同温度下菌落直径（F=113.0;df=3,16;P<0.001）及产孢量（F=69.94;df=3,16;P<0.001）明显不同。在30℃时菌落直径最大，培养11d后菌落直径达33.04mm，但在25℃时菌丝生长速率和产孢最大，分别为2.486mm/d和1.910×107孢子/ml。温度为10、35和40℃时菌落不生长。
表3不同温度对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
2.3不同光周期对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
光周期对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响见表4。玫烟色棒束孢在不同的光周期下，菌落直径（F=127.1;df=4,20;P<0.0001）及产孢量（F=5.832;df=4,20;P=0.003）差异显著。24h全光照条件下，菌落直径最大，为48.76mm；生长速率最快，为4.627mm/d。但在24h全黑暗条件下，菌落的产孢量最大，为1.992×107孢子/ml。随着光照时间的延长，菌落直径逐渐增大，但是产孢量有下降的趋势。因此光照对菌落生长有促进作用，但会抑制产孢。
玫烟色棒束孢在不同光周期下菌落形态特征在全光照条件下菌落较薄，绒毛状菌丝较少，菌落较光滑。在光暗交替下，菌落有明显的同心轮纹，而在全黑暗条件下，菌落绒毛状菌丝较多，菌落较厚。
表4不同光周期对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
2.4不同通气条件对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
不同通气条件下玫烟色棒束孢菌落直径及产孢量如表5所示。玫烟色棒束孢菌株在
平板培养过程中，封口和未封口的培养皿的菌落直径（F=1.402;df=2,12;P=0.284）差异
不显著，但产孢量（F=8.030;df=2,12;P=0.006）差异显著。在不封口的情况下，菌落生长
较快，菌落直径最大，为35.84mm，产孢量也较大4.56×106孢子/ml。表明氧气对菌落生
长和产孢有一定的促进作用。
表5不同通气条件对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
2.5不同初始pH对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
不同初始pH下玫烟色棒束孢菌落直径及产孢量如表6所示。玫烟色棒束孢在5～10的范围内均可生长和产孢，但不同pH下的菌落直径（F=63.15;df=5,24;P<0.0001）及产孢量（F=62.83;df=5,24;P<0.0001）差异显著。pH为7时，菌落直径及产孢量最大，分别为36.88mm和5.69×106孢子/ml。随着pH的升高或降低，菌落直径及产孢量逐渐减小。
表6不同初始pH对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响
按照上述方法进行测定，对数据进行分析后，明确了玫烟色棒束孢的最适培养条件，
同时验证了该接种方法的可行性。
下述实施例用于进一步说明本发明，但不限于本发明。
实施例1
首先从温室黄瓜叶片上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸5头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3%的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经121℃灭菌20min后的去离子水10ml冲洗3次，放入马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上，倒置于25℃霉菌培养箱（培养箱的型号为MJ-250F-1霉菌培养箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产）中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上培养，10d后马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有10ml0.1%的吐温-80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用4层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有50头烟粉虱2龄若虫（烟粉虱2龄若虫的形态特征为：椭圆形，扁平，灰白色，稍透明，体长0.4mm）的黄瓜叶片上，放入湿度为90%，温度为25℃的人工气候箱（人工气候箱的型号为PRX-450C智能人工气候箱，由宁波海曙赛福仪器厂生产）中培养5d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于4℃冰箱中。
从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为7左右的马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上，置于霉菌培养箱中培养；在培养的前5d设置霉菌培养箱的温度为30℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后5d设置霉菌培养箱的温度为25℃全黑暗培养，这样利于产孢；10d挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1%的吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用4层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液。再用直径6mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径9cm加入25ml马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的玻璃培养皿中心，先在温度为30℃光照为24h全光照的条件下培养5d，再转入温度为25℃全黑暗的条件下培养5d；10d马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径约6mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色；用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔5处，且5处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温-80打散，放在磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）上搅拌30min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量，菌落直径为（39.08±1.15）mm，产孢量为（1.992±0.165）×107孢子/ml。
马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯200g切成1cm见方的小块，加蒸馏水1L煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂17g和葡萄糖20g，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
实施例2
首先从温室黄瓜叶片上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸5头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3%的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经121℃灭菌20min后的去离子水10ml冲洗3次，放入马铃薯蔗糖培养基（PSA）上，倒置于25℃霉菌培养箱（培养箱的型号为MJ-250F-1霉菌培养箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产）中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯蔗糖培养基（PSA）上培养，10d后马铃薯蔗糖培养基（PSA）上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有10ml0.1%的吐温-80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用4层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有50头烟粉虱2龄若虫（烟粉虱2龄若虫的形态特征为：椭圆形，扁平，灰白色，稍透明，体长0.4mm）的黄瓜叶片上，放入湿度为90%，温度为25℃的人工气候箱（人工气候箱的型号为PRX-450C智能人工气候箱，由宁波海曙赛福仪器厂生产）中培养5d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于4℃冰箱中。
从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为7左右的马铃薯蔗糖培养基（PSA）上，置于霉菌培养箱中培养；在培养的前5d设置霉菌培养箱的温度为30℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后5d设置霉菌培养箱的温度为25℃全黑暗培养，这样利于产孢；10d挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1%的吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用4层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液。再用直径6mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径9cm加入25ml马铃薯蔗糖培养基（PSA）的玻璃培养皿中心，先在温度为30℃光照为24h全光照的条件下培养5d，再转入温度为25℃全黑暗的条件下培养5d；10d马铃薯蔗糖培养基（PSA）上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径约6mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色；用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔5处，且5处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温-80打散，放在磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）上搅拌30min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量，菌落直径为(33.8±0.6)mm，产孢量为（1.54±0.09）×107孢子/ml。
马铃薯蔗糖培养基（PSA）的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯200g切成1cm见方的小块，加蒸馏水1L煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂17g和蔗糖20g，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
实施例3
首先从温室黄瓜菜叶上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸4头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3%的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经125℃灭菌15min后的去离子水13ml冲洗4次，放入马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上，倒置于22℃霉菌培养箱（培养箱的型号为MJ-250F-1霉菌培养箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产）中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上培养，12d后马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有8ml0.1%的吐温-80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用5层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有45头烟粉虱2龄若虫（2龄若虫的形态特征为：椭圆形，扁平，灰白色，稍透明，体长0.3mm）的黄瓜菜叶上，放入湿度为85%，温度为28℃的人工气候箱（人工气候箱的型号为PRX-450C智能人工气候箱，由宁波海曙赛福仪器厂生产）中培养4d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于3℃冰箱中。
从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为9的马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上，置于霉菌培养箱中培养9d；在培养的前5d设置霉菌培养箱的温度为20℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后4d设置霉菌培养箱的温度为28℃全黑暗培养，这样利于产孢；9d后挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1%的吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用3层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液。再用直径5mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径为9cm加入28ml马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的玻璃培养皿中心，先在温度为20℃光照为24h全光照的条件下培养5d，再转入温度为28℃全黑暗的条件下培养4d后，马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径为7mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色，这时菌落形成，用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔4处，且每处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温-80打散，放在磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basicKT/C，由IKA公司生产）上搅拌35min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量和菌落直径。
马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯150g切成1cm见方的小块，加蒸馏水1.2L煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂12g和葡萄糖25g，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
实施例4
首先从温室蔬菜叶上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸6头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3%的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经115℃灭菌25min后的去离子水7ml冲洗4次，放入马铃薯蔗糖培养基（PSA）上，倒置于28℃霉菌培养箱（培养箱的型号为MJ-250F-1霉菌培养箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产）中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯蔗糖培养基（PSA）上培养，8d后马铃薯蔗糖培养基（PSA）上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有12ml0.1%的吐温-80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用3层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有55头烟粉虱2龄若虫（2龄若虫的形态特征为：椭圆形，扁平，灰白色，稍透明，体长0.5mm）的黄瓜菜叶上，放入湿度为95%，温度为22℃的人工气候箱（人工气候箱的型号为PRX-450C智能人工气候箱，由宁波海曙赛福仪器厂生产）中培养6d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于5℃冰箱中。
从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为6的马铃薯蔗糖培养基（PSA）上，置于霉菌培养箱中培养11d；在培养的前6d设置霉菌培养箱的温度为28℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后5d设置霉菌培养箱的温度为18℃全黑暗培养，这样利于产孢；11d后挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1%的吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用5层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液。再用直径7mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径为9cm加入22ml马铃薯葡萄糖培养基（PDA）或马铃薯蔗糖培养基（PSA）的玻璃培养皿中心，先在温度为28℃光照为24h全光照的条件下培养6d，再转入温度为20℃全黑暗的条件下培养5d后，马铃薯葡萄糖培养基（PDA）或马铃薯蔗糖培养基（PSA）上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径为5mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色，这时菌落形成，用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔6处，且每处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐温-80打散，放在磁力搅拌器（磁力搅拌器型号为RH basic KT/C，由IKA公司生产）上搅拌25min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量和菌落直径。
马铃薯蔗糖培养基（PSA）的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯250g切成1cm见方的小块，加蒸馏水0.8L煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂22g和蔗糖15g，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
Claims (10)
1.一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述分离方法为：首先从温室蔬菜叶上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸3-7头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3％的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经110-130℃灭菌10-30min后的去离子水5-15ml冲洗2-4次，放入马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上，倒置于20-30℃霉菌培养箱中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上培养，8-12d后马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有5-15ml 0.1％的吐温-80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用3-5层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有40-60头烟粉虱2龄若虫的蔬菜叶上，放入湿度为80-100％，温度为20-30℃的人工气候箱中培养4-6d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于3-5℃冰箱中；
所述玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法为：从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为5-10的马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上，置于霉菌培养箱中培养8-12d；在培养的前4-6d设置霉菌培养箱的温度为15-30℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后4-6d设置霉菌培养箱的温度为15-30℃全黑暗培养，这样利于产孢；8-12d后挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1％的吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用3-5层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液；再用直径4-8mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径为9cm加入20-30ml马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA的玻璃培养皿中心，先在温度为15-30℃光照为24h全光照的条件下培养4-6d，再转入温度为15-30℃全黑暗的条件下培养4-6d后，马铃薯葡萄糖培养基PDA或马铃薯蔗糖培养基PSA上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径为4-8mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色，这时菌落形成，用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔4-6处，且每处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1％的吐温-80打散，放在磁力搅拌器上搅拌20-40min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量和菌落直径。
2.如权利要求1所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述分离方法为，首先从温室黄瓜叶片上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸5头，从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌；先利用3％的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒，然后用经121℃灭菌20min后的去离子水10ml冲洗3次，放入马铃薯葡萄糖培养基PDA上，倒置于25℃霉菌培养箱中培养，待有菌丝形成后，挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基PDA上培养，10d后马铃薯葡萄糖培养基PDA上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落，背面呈浅黄褐色，这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长，则分生孢子形成，挑取菌丝放入盛有10ml 0.1％的吐温-80的无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用4层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液，这时再用血球计数板计数，制成1.0×107分生孢子/ml的孢子悬浮液，将此孢子悬浮液喷于带有50头烟粉虱2龄若虫的黄瓜叶片上，放入湿度为90％，温度为25℃的人工气候箱中培养5d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝，即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌，证明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌，将该虫生真菌保存在试管斜面上，保存于4℃冰箱中；
所述玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法为：从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌，接种于pH为7左右的马铃薯葡萄糖培养基PDA上，置于霉菌培养箱中培养；在培养的前5d设置霉菌培养箱的温度为30℃光照为24h全光照，这样利于菌丝生长，后5d设置霉菌培养箱的温度为25℃全黑暗培养，这样利于产孢；10d挑取菌丝接入已经灭菌的含0.1％的吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器进行搅拌，分生孢子会从菌丝上脱落，用4层无菌纱布进行过滤，将菌丝过滤掉，分生孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液；用血球计数板调整孢子浓度为1.0×107孢子/ml，制成孢子悬浮液。再用直径6mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液，置于直径9cm加入25ml马铃薯葡萄糖培养基PDA的玻璃培养皿中心，先在温度为30℃光照为24h全光照的条件下培养5d，再转入温度为25℃全黑暗的条件下培养5d；10d马铃薯葡萄糖培养基PDA上呈现平板致密绒毛状白色菌落，菌落中心有直径约6mm的圆形凸起，菌落背面呈浅黄褐色；用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔，分别打孔5处，且5处菌饼的位置在不同平板中基本一致，用0.1％的吐温-80打散，放在磁力搅拌器上搅拌30min，用双层擦镜纸过滤后，用血球计数板计数，计算产孢量和菌落直径。
3.如权利要求1或2所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖培养基PDA的配方为：马铃薯100-300g，葡萄糖10-30g，琼脂8-25g，蒸馏水0.5-1.5L。
4.如权利要求3所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖培养基PDA的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水1L；或马铃薯150g，葡萄糖25g，琼脂12g，蒸馏水1.2L；或马铃薯250g，葡萄糖15g，琼脂22g，蒸馏水0.8L。
5.如权利要求3所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖培养基PDA的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯切成1cm见方的小块，加蒸馏水煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂和葡萄糖，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
6.如权利要求4所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖培养基PDA的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯切成1cm见方的小块，加蒸馏水煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂和葡萄糖，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
7.如权利要求1所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述马铃薯蔗糖培养基PSA配方为：马铃薯100-300g，蔗糖10-30g，琼脂8-25g，蒸馏水0.5-1.5L。
8.如权利要求7所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述马铃薯蔗糖培养基PSA配方为:马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂17g，蒸馏水1L；或马铃薯150g，蔗糖25g，琼脂12g，蒸馏水1.2L；或马铃薯250g，蔗糖15g，琼脂22g，蒸馏水0.8L。
9.如权利要求7所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述马铃薯蔗糖培养基PSA的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯切成1cm见方的小块，加蒸馏水煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂和蔗糖，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
10.如权利要求8所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法，其特征在于，所述马铃薯蔗糖培养基PSA的制备方法为：将洗净去皮的马铃薯切成1cm见方的小块，加蒸馏水煮半小时，用四层医用纱布滤去马铃薯，再加蒸馏水补充到1000ml，然后加入琼脂和蔗糖，待完全溶化后分装入250ml的三角瓶中，每瓶装入150ml，121℃下高温灭菌20min后即可。
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Granted publication date: 20150128 Termination date: 20170902 |