CN112941006A - 一种稻瘟病菌孢子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稻瘟病菌产孢的制备方法，包括以下步骤：(1)将含有稻瘟病菌菌丝体的滤纸片在无菌条件下放到无菌离心管里；(2)加入无菌的石英砂，并加入无菌水没过滤纸片，然后涡旋震荡，使石英砂和滤纸片上的菌丝体充分接触摩擦，得到菌液；(3)吸取菌液均匀涂布到燕麦片琼脂培养基上，用无菌的纱布盖在培养皿上，固定，使得纱布与培养基不接触；(4)培养4‑5天后即得。本发明所述的制备方法可以大大提高稻瘟病菌产孢量以及产孢速度。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种稻瘟病菌孢子的制备方法。
背景技术
稻瘟病是水稻重要病害之一，它可引起水稻的大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。稻瘟病分布遍及世界稻区，是稻作生产中的主要病害，其中以亚洲、非洲稻区发病为重。在中国地区一般山区重于平原，粳、糯重于籼稻，除华南稻区早稻重于晚稻外，其他稻区晚稻重于早稻。稻瘟病在世界各稻区的任何年头、任何季节都有可能发生，并且出现逐年增加趋势，而局部大爆发也并不少见。同—品种水稻在不同生育期抗性表现也不同，秧苗4叶期、分蘖期和抽穗期易感病，圆秆期发病轻，同—器官或组织在组织幼嫩期发病重。
因此，关于稻瘟病菌孢子的研究非常重要，它使人们对稻瘟病菌的分类、致病性等有了一个深入的了解，而其中的诱导产孢是一个关键环节，它在很大程度上决定着研究的进展及成败。目前对于稻瘟病菌产孢的研究众多，但稻瘟病菌产孢量以及产孢速度仍有待提高，因此提供一种能提高稻瘟病菌产孢量和产孢速度的制备方法极其重要。
发明内容：
本发明的目的是在于提供一种稻瘟病菌孢子的制备方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种稻瘟病菌孢子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将含有稻瘟病菌菌丝体的滤纸片在无菌条件下放到无菌离心管里；
(2)加入无菌的石英砂，并加入无菌水没过滤纸片，然后涡旋震荡，使石英砂和滤纸片上的菌丝体充分接触摩擦，得到菌液；
(3)吸取菌液均匀涂布到燕麦片琼脂培养基上，用无菌的纱布盖在培养皿上，固定，使得纱布与培养基不接触；
(4)培养4-5天后即得。
在其中一些实施例中，每个无菌离心管中放入铺满稻瘟病菌的滤纸片2-4片，所述滤纸片的大小为(0.5-0.7)cm×(0.5-0.7)cm。
在其中一些实施例中，每个无菌离心管中加入所述的石英砂的量为0.25-0.35g。
在其中一些实施例中，每个无菌离心管中加入所述的石英砂的量为0.28-0.32g。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述涡旋震荡为每30±1秒涡旋震荡1次，涡旋震荡3±1次。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述的纱布为双层纱布。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述的石英砂的粒径为0.5-1.2mm。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述的培养采用在25-26℃培养。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述的培养采用在25℃培养。
在其中一些实施例中，步骤(4)为培养4-5天后，揭开纱布，加入无菌水，用灭过菌的棉签洗下培养基上的孢子，即得。
本发明的发明人发现，在稻瘟病菌孢子的制备中，将石英砂和滤纸片上的菌丝体充分接触摩擦，产生逆境胁迫，在这种逆境胁迫下，稻瘟病菌形成孢子以休眠状态去度过恶劣的环境条件，当环境条件适宜的时候孢子会再萌发产出菌丝体；继而用无菌纱布盖在培养有菌液的培养皿上，利于形成透气干燥的环境。通过本发明上述制备方法可以大大提高稻瘟病菌产孢量以及产孢速度。
附图说明
图1：实施例1中涂布培养法稻瘟病菌生长情况。
图2：对比例1中常规培养法稻瘟病菌生长情况。
图3：对比例1和实施例1培养方法的产孢结果(纵坐标的单位是×105个/mL)。
具体实施方式
本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
除非特别说明或另有定义，本文所使用的“第一、第二…”仅仅是用于对名称的区分，不代表具体的数量或顺序。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
本发明实施例和对比例中所用材料如下：
石英砂(市售)：粒径为0.5-1.2mm。
燕麦片琼脂培养基，包括以下组分：Oatmeal Agar(燕麦琼脂)72.5克，水1000毫升。
滤纸片规格：0.5cm×0.5cm。
实施例1涂布培养法
(1)从-20℃冰箱中取出分别含有3个容易产孢(常规培养方法的产孢量≥105个/mL)的稻瘟病菌株的滤纸片和分别含有3个不易产孢(常规培养方法的产孢量为<105个/mL)的稻瘟病菌株的滤纸片，以上滤纸片都长满稻瘟病菌；
(2)在无菌条件下，将每个菌株的三张滤纸片放到2mL无菌离心管里(每个菌株3个重复，即取每个菌株的滤纸片9片)；
(3)每个无菌离心管加入灭过菌的石英砂0.3g±0.01g，加入无菌水0.5mL没过滤纸片，并且涡旋震荡30秒3次，使石英砂和滤纸片上的菌丝体充分接触摩擦并产生逆境胁迫，得到菌液；由于加入三张滤纸片，使得石英砂与滤纸片充分接触，并能很好产生逆境胁迫，得到的菌液含菌量较充分；
(4)吸取100-150μL菌液均匀涂布到燕麦片琼脂培养基上，用灭过菌的双层纱布替代盖子，保证菌液平板干燥透气，置于25℃条件下培养4-5天。对每个菌株重复3遍实验；参见图1；
(5)揭开纱布，加入无菌水10mL，用灭过菌的棉签洗下培养基上的孢子，重复洗3次，血球计数板测定孢子浓度备用；
(6)计算每种菌株重复实验三遍的孢子浓度的平均值。
对比例1常规培养法
(1)从-20℃冰箱中取出分别含有3个容易产孢(常规培养方法的产孢量≥105个/mL)的稻瘟病菌株的滤纸片和3个分别含有不易产孢(常规培养方法的产孢量为<105个/mL)的稻瘟病菌株的滤纸片，以上滤纸片都长满稻瘟病菌；
(2)在无菌条件下，将滤纸片放到燕麦片琼脂培养基上中央一片(每个菌株3个重复)，周围五片，盖上盖子置于25℃条件下培养7-10天。每个菌株重复3遍实验；参见图2；
(3)揭开盖子，加入无菌水10mL，用灭过菌的棉签洗下培养基上的孢子，重复洗3次，血球计数板测定孢子浓度备用；
(4)计算每种菌株重复实验三次的孢子浓度的平均值。
实验结果
对比例1中的常规培养法产孢需要7-10天，3个易产孢稻瘟病菌株15L22-3，IB49，IE1K的孢子浓度分别为14.67×105个/mL，1.53×105个/mL,1.60×105个/mL，产孢量都在105个/mL以上；不易产孢菌株88A1，SSID10，EN52的孢子浓度分别为0.43×105个/mL，0.63×105个/mL,0.73×105个/mL，产孢量都在105个/mL以下(如图3所示)。
实施例1中涂布培养法产孢需要4-5天，3个易产孢稻瘟病菌株15L22-3，IB49，IE1K的孢子浓度分别为37.33×105个/mL，25.66×105个/mL,9.20×105个/mL；不易产孢菌株88A1，SSID10，EN52的孢子浓度分别为22.00×105个/mL，34.00×105个/mL,16.67×105个/mL(如图3所示)。
相比于对比例1中的常规培养法，实施例1中涂布培养法的产孢量特别是不易产孢菌株有显著的提升，除了IE1K，其它菌株的产孢量都达到106个/mL以上。针对IE1K菌株而言，使用常规培养法培养时，其产孢量并不高，只有1.60×105个/mL，而使用涂布培养法培养时，其产孢量明显增加，能达到9.20×105个/mL，IE1K菌株的产孢量完全可以满足下游试验的需求。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有稻瘟病菌菌丝体的滤纸片在无菌条件下放到无菌离心管里；
(2)加入无菌的石英砂，并加入无菌水没过滤纸片，然后涡旋震荡，使石英砂和滤纸片上的菌丝体充分接触摩擦，得到菌液；
(3)吸取菌液均匀涂布到燕麦片琼脂培养基上，用无菌的纱布盖在培养皿上，固定，使得纱布与培养基不接触；
(4)培养4-5天后即得。
2.根据权利要求1所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，每个无菌离心管中放入铺满稻瘟病菌的滤纸片2-4片，所述滤纸片的大小为(0.5-0.7)cm×(0.5-0.7)cm。
3.根据权利要求2所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，每个无菌离心管中加入所述的石英砂的量为0.25-0.35g。
4.根据权利要求3所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，每个无菌离心管中加入所述的石英砂的量为0.28-0.32g。
5.根据权利要求1所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述涡旋震荡为每30±1秒涡旋震荡1次，涡旋震荡3±1次。
6.根据权利要求1所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的纱布采用双层纱布。
7.根据权利要求1所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的石英砂的粒径为0.5-1.2mm。
8.根据权利要求1所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的培养采用在25-26℃培养。
9.根据权利要求1所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的培养采用在25℃培养。
10.根据权利要求1所述的稻瘟病菌孢子的制备方法，其特征在于，步骤(4)为培养4-5天后，揭开纱布，加入无菌水，用灭过菌的棉签洗下培养基上的孢子，即得。
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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