CN106167769A - 一种利用铁载体制备富铁酵母的方法 - Google Patents

一种利用铁载体制备富铁酵母的方法 Download PDF

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张新国
马国弟
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Abstract

本发明公开一种利用铁载体制备富铁酵母的方法，采用筛选耐高铁并能产生铁载体的菌株、产铁载体最优菌的筛选、利用筛选的最优菌进行酵母铁的制备方法。本发明为后续通过在酿酒酵母中加入不同类型的铁载体或不同菌体产生的铁载体，筛选出高活性铁载体，能使酵母具有高转化铁的能力，为通过酵母来制备有机铁提供一个新思路；通过铁载体添加制备富铁酵母，具有酵母细胞铁转化率高，所得富铁酵母铁与常规增加培养基铁含量或者是对啤酒酵母进行菌株诱变制备富铁酵母的方法相比，含量明显增加；本发明中，最优菌胞内铁含量增长幅度为126.57%，细胞数增长幅度为248.3%；本发明中酵母铁其胞内铁含量为61.361mg/g。

Description

一种利用铁载体制备富铁酵母的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种利用铁载体制备富铁酵母的方法。
背景技术
铁是生物体需要量最大，而又最易发生代谢障碍的微量元素。缺铁能导致血红素合成障碍，引起人及动物缺铁性贫血及一些其他相关疾病。据世界卫生组织统计，约有30%的世界人口存在铁缺乏现象，而90%的贫血现象是由于铁缺乏引起。虽然自然界中含有大量的铁，但多以不溶性铁盐的形式存在，人体难以较好吸收。加之我国以植物性食物为主的膳食结构特点，食品源中铁可利用性差，所以，我国“营养性贫血症”的发病率较高。
补铁剂是治疗缺铁性贫血的主要药物，最常用的补铁剂主要以口服为主。虽然口服硫酸亚铁等可溶性化合物在全球范围内一直作为治疗缺铁性贫血常用的铁剂。但长期的实践证明，当这种防治方法作为公共卫生的一项策略时，它的应用效果并不能令人满意，铁吸收过程中肠黏膜对铁进一步吸收的“阻制作用”，以及铁制剂产生的胃肠道副作用，使人们无法坚持服用是其主要原因。
利用微生物转化将无机状态的铁合成人体容易吸收的有机状态铁，是目前获得有机铁最重要的尝试，是开发新型补铁剂及补铁添加剂，提高铁的利用率的主要措施。其中，用酵母细胞富集微量元素铁的研究己成为微生物转化获得有机状态铁的非常重要的研究方向之一。
酵母细胞能直接将无机状态的铁转化为有机状态的生物铁，可以提高铁的利用率。因此，以酵母为载体，将化学状态下的铁转化为生物状态的铁，是开发新的铁源，提高铁的生物利用度的有效措施。富铁酵母在预防和治疗人及动物缺铁性贫血及其他一些缺铁性疾病方面将发挥显著的作用。此外，富铁酵母细胞还含有丰富的蛋白质、核酸、维生素及机体必需的十几种微量元素，是一种丰富的营养物质。
近年来，尽管有些称作“富铁酵母”产品，但是这些产品存在着明显的缺陷和不足。
首先，是现有的富铁酵母利用微生物转化的流程和方法看，其菌种主要是沿用：食用酵母菌种扩培→分离纯化→耐铁能力筛选→耐铁驯化→富铁率测定的方式进行。或者是采用包括紫外诱变，化学方法诱变，原生质体融合等多方面的研究，但是酵母对铁的耐受富集并不理想，而且选育菌种极易退化。因此，利用现有技术并不能解决利用啤酒酵母制备富铁酵母的缺陷。
其次，在利用酵母制备富铁酵母的过程中，往往是通过提过培养基中的铁浓度来实现的，但是高的铁浓度会对酵母的生长产生抑制作用，进而影响富铁酵母的生长。因此，采用现有技术所得的富铁酵母，有机铁含量低，（每克干酵母细胞有机铁含量在25毫克以下）、细胞生物量也不高。
铁载体是由某些微生物分泌的一种鳌合剂，可以与铁络合形成非常稳定的化合物，是微生物在缺铁机制下为适应生长所分泌的一种铁转运因子，它能够从胞外环境中结合铁离子并运至胞内。一些能够在高铁环境中生长的微生物，能够分泌某些铁载体，能促使酵母细胞更好的吸收利用铁。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用铁载体制备富铁酵母的方法，旨在解决富铁酵母制备中铁吸收率不高，生物量低等技术问题。
本发明是这样实现的，一种利用铁载体制备富铁酵母的方法，该利用铁载体制备酵母铁的方法，包括以下步骤：
筛选耐高铁并能产生铁载体的菌株：通过菌株筛选的方法，逐步增加铁浓度，筛选出耐高铁的菌株；利用CAS平板法，从耐高铁菌株中，筛选出能产生铁载体的菌株；配制YPD培养基，进行接种，使筛选出的产生铁载体的菌株产生铁载体；
产铁载体最优菌的筛选：活化所有耐高铁并能产生铁载体的菌株，发酵，生成铁载体；进行离心，收集上清；利用CAS检测液，测上清的OD630；对活化酿酒酵母进行接种，作为种子液；配制与耐高铁并能产生铁载体的菌株相同数量的培养液，加入种子液；测定加入铁载体前后细胞数和胞内铁含量；计算加入不同菌株铁载体前后酿酒酵母细胞数和胞内铁含量增长幅度，筛选出最优菌；
利用筛选的最优菌进行酵母铁的制备：批量发酵最优菌，YPD培养液中加入最优菌产铁载体的最佳铁离子浓度的铁，离心，收集上清，判定有铁载体产生； 配制YPD培养基，加入酿酒酵母，并加入上清铁载体，发酵；过滤收集菌体；将所收集菌体放至已预处理过的透析袋内进行透析，将透析液离心，收集菌体，干燥；将所干燥菌体，消化，测胞内铁含量，酵母铁制备完成。
所述筛选耐高铁并能产生铁载体的菌株具体包括：
1）通过菌株筛选的方法，逐步增加铁浓度，筛选出耐高铁的菌株，利用CAS平板法，从耐高铁菌株中，筛选出能产生铁载体的菌株；
2）配制YPD培养基30ml,按1%的接种量，加入能够产生铁载体的菌株，28℃，200rpm，摇瓶发酵48 h，使能够产生铁载体的菌株产生铁载体；
3）吸取1ml发酵液，离心，收集上清；用CAS检测液与上清液以1:1混合，静置1小时，测发酵液的OD630，判定发酵液中有铁载体产生；
4）将步骤2）中接种后的YPD培养液，10000r/min，离心，收集上清铁载体，4℃保存备用。
所述产铁载体最优菌的筛选，具体包括：
（1）活化所有耐高铁并能产生铁载体的菌株，摇瓶发酵，使耐高铁并能产生铁载体的菌株产生铁载体，离心，收集上清，4℃保存备用；利用CAS检测液，测上清的OD630；将OD630值较高的菌体上清进行稀释，使OD630值较高的菌株上清中铁载体的量与上清中OD630较低的菌株铁载体量一致；
（2）活化酿酒酵母，以1%的接种量加入至装有10ml培养液的试管中，作为种子液；
（3）配制与菌株相同数量的培养液，加入1%步骤(2)中种子液于装有10ml培养液的试管中，Fe2+浓度为1000ug/ml，分别吸取培养液，对所有试管中菌液进行细胞计数和胞内铁含量测定，测定加入铁载体前各试管中细胞数和胞内铁含量；同时，在试管中分别加入相同量的步骤（1）中所制备的不同菌株所产生的铁载体，继续摇瓶发酵培养；
（4）发酵培养24小时后，分别吸取1ml培养液，对所有试管中菌液进行细胞计数和胞内铁含量测定，测定加入铁载体后各试管中细胞数和胞内铁含量；
（5）计算加入不同菌株铁载体前后酿酒酵母细胞数和胞内铁含量增长幅度，以判定加入哪种菌株所产铁载体，酿酒酵母的细胞数和胞内铁会最优，筛选出最优菌。
所述的利用筛选的最优菌进行酵母铁的制备，具体包括：
A、批量发酵最优菌，培养液中加入最优菌产铁载体的最佳铁离子浓度的铁；48小时后，离心，收集上清，测OD630，判定有铁载体产生；4℃保存备用；
B、配制YPD 培养基，加入1%酿酒酵母，并加入步骤A中的上清铁载体，加入量为1ml/10ml，摇瓶发酵；
C、48小时后，过滤收集菌体；将收集菌体用蒸馏水至少水洗3次，离心，收集菌体，备用；
D、将所收集菌体放至已预处理过的透析袋内，透析完全，直至再无铁离子透析出来；
E、将透析液转至离心管，离心，弃其上清，收集菌体，干燥至恒重；将所干燥菌体，称取0.1g，消化，测其胞内铁含量，酵母铁制备完成。
所述耐高铁的菌株为能在CAS平板上产生橙色螯合圈的菌株。
本发明另一目的在于提供一种利用铁载体制备富铁酵母的方法在制备有机铁上的应用。
本发明另一目的在于提供一种利用铁载体制备富铁酵母的方法在制备补铁添加剂上的应用。
本发明正常啤酒酵母是不能够耐高铁的，其胞内铁含量较低，现有的富铁啤酒酵母多为其突变菌株；通过本发明可以通过加入铁载体来达到啤酒酵母转化有机铁的目的，而啤酒酵母是相对安全的，尤其作为药品及食品添加剂而言；
本发明为后续通过在酿酒酵母中加入不同类型的铁载体或不同菌体产生的铁载体，筛选出高活性铁载体，进一步添加酵母从而使酵母具有高转化铁的能力，为通过酵母来制备有机铁提供了一个新思路。
与现有技术相比，本发明通过铁载体添加制备富铁酵母，具有酵母细胞铁转化率高，所得富铁酵母铁与常规增加培养基铁含量或者是对啤酒酵母进行菌株诱变制备富铁酵母的方法相比，含量明显增加，且操作简单。
本发明中，最优菌胞内铁含量增长幅度为126.57%，细胞数增长幅度为248.3%；本发明中酵母铁其胞内铁含量为61.361mg/g。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用铁载体制备富铁酵母的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示：本发明实施例提供的利用铁载体制备富铁酵母的方法，该利用铁载体制备酵母铁的方法，包括以下步骤：
S101：筛选耐高铁并能产生铁载体的菌株：通过菌株筛选的方法，逐步增加铁浓度，筛选出耐高铁的菌株；利用CAS平板法，从耐高铁菌株中，筛选出能产生铁载体的菌株；配制YPD培养基，进行接种，使筛选出的产生铁载体的菌株产生铁载体；
S102：产铁载体最优菌的筛选：活化所有耐高铁并能产生铁载体的菌株，发酵，生成铁载体；进行离心，收集上清；利用CAS检测液，测上清的OD630；对活化酿酒酵母进行接种，作为种子液；配制与耐高铁并能产生铁载体的菌株相同数量的培养液，加入种子液；测定加入铁载体前后细胞数和胞内铁含量；计算加入不同菌株铁载体前后酿酒酵母细胞数和胞内铁含量增长幅度，筛选出最优菌；
S103：利用筛选的最优菌进行酵母铁的制备：批量发酵最优菌，YPD培养液中加入最优菌产铁载体的最佳铁离子浓度的铁，离心，收集上清，判定有铁载体产生；配制YPD培养基，加入酿酒酵母，并加入上清铁载体，发酵；过滤收集菌体；将所收集菌体放至已预处理过的透析袋内进行透析，将透析液离心，收集菌体，干燥；将所干燥菌体，消化，测胞内铁含量，酵母铁制备完成。
本发明实施例提供一种利用铁载体制备富铁酵母的方法在制备有机铁上的应用。
本发明实施例提供一种利用铁载体制备富铁酵母的方法在制备补铁添加剂上的应用。
下面结合利用铁载体制备富铁酵母的方法的具体步骤对本发明的应用原理作进一步描述。
耐高铁特性：
本发明的菌株能在10000μg/ml的培养基上生长。
所述筛选耐高铁并能产生铁载体的菌株具体包括：
1）通过菌株筛选的方法，逐步增加铁浓度，筛选出耐高铁的菌株，利用CAS平板法，从耐高铁菌株中，筛选出能产生铁载体的菌株；
2）配制YPD培养基30ml，按1%的接种量，加入能够产生铁载体的菌株，28℃，200rpm，摇瓶发酵48 h，使能够产生铁载体的菌株产生铁载体；
3）吸取1ml发酵液，离心，收集上清；用CAS检测液与上清液以1:1混合，静置1小时，测发酵液的OD630，判定发酵液中有铁载体产生；
4）将步骤2）中接种后的YPD培养液，10000r/min，离心，收集上清铁载体，4℃保存备用；
5）将酿酒酵母在YPD培养液中摇瓶活化，发酵培养30ml菌液；
所述产铁载体最优菌的筛选，具体包括：
（1） 活化所有耐高铁并能产生铁载体的菌株，摇瓶发酵，使耐高铁并能产生铁载体的菌株产生铁载体，离心，收集上清，4℃保存备用；利用CAS检测液，测上清的OD630；将OD630值较高的菌体上清进行稀释，使OD630值较高的菌株上清中铁载体的量与上清中OD630较低的菌株铁载体量一致；
（2） 活化酿酒酵母，以1%的接种量加入至装有10ml培养液的试管中，作为种子液；
（3）配制与菌株相同数量的培养液，加入1%步骤(2)中种子液于装有10ml培养液的试管中，Fe2+浓度为1000ug/ml，分别吸取培养液，对所有试管中菌液进行细胞计数和胞内铁含量测定，测定加入铁载体前各试管中细胞数和胞内铁含量；同时，在试管中分别加入相同量的步骤（1）中所制备的不同菌株所产生的铁载体，继续摇瓶发酵培养；
（4）发酵培养24小时后，分别吸取1ml培养液，对所有试管中菌液进行细胞计数和胞内铁含量测定，测定加入铁载体后各试管中细胞数和胞内铁含量；
（5）计算加入不同菌株铁载体前后酿酒酵母细胞数和胞内铁含量增长幅度，以判定加入哪种菌株所产铁载体，酿酒酵母的细胞数和胞内铁会最优，筛选出最优菌。
所述的利用筛选的最优菌进行酵母铁的制备，具体包括：
A、批量发酵最优菌，培养液中加入最优菌产铁载体的最佳铁离子浓度的铁；48小时后，离心，收集上清，测OD630，判定有铁载体产生；4℃保存备用；
B、配制YPD 培养基，加入1%酿酒酵母，并加入步骤A中的上清铁载体，加入量为1ml/10ml，摇瓶发酵；
C、48小时后，过滤收集菌体；将收集菌体用蒸馏水至少水洗3次，离心，收集菌体，备用；
D、将所收集菌体放至已预处理过的透析袋内，透析完全，直至再无铁离子透析出来；
E、将透析液转至离心管，离心，弃其上清，收集菌体，干燥至恒重；将所干燥菌体，称取0.1g，消化，测其胞内铁含量，酵母铁制备完成。
所述耐高铁的菌株为能在CAS平板上产生橙色螯合圈的菌株。
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1
耐高铁菌株中产铁载体菌株的筛选
利用CAS平板法，从耐高铁菌株中，筛选出能产生铁载体的菌株，即能在CAS平板上产生橙色螯合圈的菌株。配制YPD培养基，按1%的接种量，加入能够产生铁载体的菌株，28℃，200rpm，摇瓶发酵48 h，让其产生铁载体。吸取1ml发酵液，离心，收集上清。用CAS检测液与上清液以1:1混合，静置1小时，测其OD630，确定发酵液中是有铁载体产生的。将上述发酵培养液，10000r/min，离心，收集上清铁载体，4℃保存备用。同时将酿酒酵母在YPD培养液中摇瓶活化。
实施例2
不同菌株所产铁载体加入酿酒酵母培养液的实验
活化所有耐高铁并能产生铁载体的菌株，摇瓶发酵，使其产生铁载体。离心，收集上清(4℃保存备用)，利用CAS检测液，测其上清的OD630。将OD630值较高的菌体上清进行稀释，使其菌株上清中铁载体的量与上清中OD630较低的菌株铁载体量一致。活化酿酒酵母，以1%的接种量加入至装有10ml培养液的试管中，作为种子液。
配制与菌株相同数量的培养液，加入1%种子液于装有10ml培养液的试管中（Fe2+浓度为1000μg/ml），分别吸取培养液，对所有试管中菌液进行细胞计数和胞内铁含量测定，测定加入铁载体前各试管中细胞数和胞内铁含量。同时在试管中分别加入相同量所制备的不同菌株所产生的铁载体，继续摇瓶发酵培养。发酵培养24小时后，分别吸取1ml培养液，对所有试管中菌液进行细胞计数和胞内铁含量测定，测定加入铁载体后各试管中细胞数和胞内铁含量。计算加入不同菌株铁载体前后酿酒酵母细胞数和胞内铁含量增长幅度，以确定加入哪种菌株所产铁载体，酿酒酵母的细胞数和胞内铁会最优，筛选出最优菌。
本发明中，最优菌胞内铁含量增长幅度为126.57%，细胞数增长幅度为248.3%。
实施例3
酵母铁的制备
批量发酵最优菌，培养液中加入最优菌产铁载体的最佳铁离子浓度的铁。48小时后，离心，收集上清，测OD630，确定有铁载体产生。4℃保存备用。
配制YPD 培养基，加入1%酿酒酵母，并加入上清铁载体，加入量为1ml/10ml，摇瓶发酵，48小时后，过滤收集菌体。将收集菌体用蒸馏水至少洗3次，离心，收集菌体。将所收集菌体放至已预处理过的透析袋内，透析完全，直至再无铁离子透析出来。将透析液转至离心管，离心，弃其上清，收集菌体，干燥至恒重。称取0.1g，消化，测其胞内铁含量，酵母铁制备完成。
本发明中酵母铁其胞内铁含量为61.361mg/g。
本发明将铁载体加入酿酒酵母培养基中，通过涂布平板，测定胞内铁含量和细胞数目，得出结论：加入铁载体有助于细胞铁转化。
正常啤酒酵母是不能够耐高铁的，其胞内铁含量较低，现有的富铁啤酒酵母多是多为其突变菌株；通过本发明可以通过加入铁载体来达到啤酒酵母转化有机铁的目的，而啤酒酵母是相对安全的，尤其作为药品及食品添加剂而言；
本发明为后续通过在酿酒酵母中加入不同类型的铁载体或不同菌体产生的铁载体，筛选出高活性铁载体，能使酵母具有高转化铁的能力。
与现有技术相比，本发明通过铁载体添加制备富铁酵母，具有酵母细胞铁转化率高的特征，所得富铁酵母铁与常规增加培养基铁含量或者是对啤酒酵母进行菌株诱变制备富铁酵母的方法相比，含量明显增加，且操作简单。最优菌胞内铁含量增长幅度为126.57%，细胞数增长幅度为248.3%；本发明中酵母铁其胞内铁含量为61.361mg/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种利用铁载体制备富铁酵母的方法，其特征在于，所述利用铁载体制备酵母铁的方法包括以下步骤：
筛选耐高铁并能产生铁载体的菌株：通过菌株筛选的方法，逐步增加铁浓度，筛选出耐高铁的菌株；利用CAS平板法，从耐高铁菌株中，筛选出能产生铁载体的菌株；配制YPD培养基，进行接种，使筛选出的产生铁载体的菌株产生铁载体；
产铁载体最优菌的筛选：活化所有耐高铁并能产生铁载体的菌株，发酵，生成铁载体；进行离心，收集上清；利用CAS检测液，测上清的OD630；对活化酿酒酵母进行接种，作为种子液；配制与耐高铁并能产生铁载体的菌株相同数量的培养液，加入种子液；测定加入铁载体前后细胞数和胞内铁含量；计算加入不同菌株铁载体前后酿酒酵母细胞数和胞内铁含量增长幅度，筛选出最优菌；
利用筛选的最优菌进行酵母铁的制备：批量发酵最优菌，YPD培养液中加入最优菌产铁载体的最佳铁离子浓度的铁，离心，收集上清，判定有铁载体产生；配制YPD培养基，加入酿酒酵母，并加入上清铁载体，发酵；过滤收集菌体；将所收集菌体放至已预处理过的透析袋内进行透析，将透析液离心，收集菌体，干燥；将所干燥菌体，消化，测胞内铁含量，酵母铁制备完成。
2.如权利要求1所述的利用铁载体制备富铁酵母的方法，其特征在于，所述筛选耐高铁并能产生铁载体的菌株具体包括：
1）通过菌株筛选的方法，逐步增加铁浓度，筛选出耐高铁的菌株，利用CAS平板法，从耐高铁菌株中，筛选出能产生铁载体的菌株；
2）配制YPD培养基30ml，按1%的接种量，加入能够产生铁载体的菌株，28℃，200rpm，摇瓶发酵48 h，使能够产生铁载体的菌株产生铁载体；
3）吸取1ml发酵液，离心，收集上清；用CAS检测液与上清液以1:1混合，静置1小时，测发酵液的OD630，判定发酵液中有铁载体产生；
4）将步骤2）中接种后的YPD培养液，10000r/min，离心，收集上清铁载体，4℃保存备用。
3.如权利要求1所述的利用铁载体制备富铁酵母的方法，其特征在于，所述产铁载体最优菌的筛选，具体包括：
（1）活化所有耐高铁并能产生铁载体的菌株，摇瓶发酵，使耐高铁并能产生铁载体的菌株产生铁载体，离心，收集上清，4℃保存备用；利用CAS检测液，测上清的OD630；将OD630值较高的菌体上清进行稀释，使OD630值较高的菌株上清中铁载体的量与上清中OD630较低的菌株铁载体量一致；
（2）活化酿酒酵母，以1%的接种量加入至装有10ml培养液的试管中，作为种子液；
（3）配制与菌株相同数量的培养液，加入1%步骤(2)中种子液于装有10ml培养液的试管中，Fe2+浓度为1000μg/ml，分别吸取培养液，对所有试管中菌液进行细胞计数和胞内铁含量测定，测定加入铁载体前各试管中细胞数和胞内铁含量；同时，在试管中分别加入相同量的步骤（1）中所制备的不同菌株所产生的铁载体，继续摇瓶发酵培养；
（4）发酵培养24小时后，分别吸取1ml培养液，对所有试管中菌液进行细胞计数和胞内铁含量测定，测定加入铁载体后各试管中细胞数和胞内铁含量；
（5）计算加入不同菌株铁载体前后酿酒酵母细胞数和胞内铁含量增长幅度，以判定加入哪种菌株所产铁载体，酿酒酵母的细胞数和胞内铁会最优，筛选出最优菌。
4.如权利要求1所述的利用铁载体制备富铁酵母的方法，其特征在于，所述的利用筛选的最优菌进行酵母铁的制备，具体包括：
A、批量发酵最优菌，培养液中加入最优菌产铁载体的最佳铁离子浓度的铁；48小时后，离心，收集上清，测OD630，判定有铁载体产生；4℃保存备用；
B、配制YPD培养基，加入1%酿酒酵母，并加入步骤A中的上清铁载体，加入量为1ml/10ml，摇瓶发酵；
C、48小时后，过滤收集菌体；将收集菌体用蒸馏水至少水洗3次，离心，收集菌体，备用；
D、将所收集菌体放至已预处理过的透析袋内，透析完全，直至再无铁离子透析出来；
E、将透析液转至离心管，离心，弃其上清，收集菌体，干燥至恒重；将所干燥菌体，称取0.1g，消化，测其胞内铁含量，酵母铁制备完成。
5.如权利要求1所述的利用铁载体制备富铁酵母的方法，其特征在于，所述耐高铁的菌株为能在CAS平板上产生橙色螯合圈的菌株。
6.一种如权利要求1所述的利用铁载体制备富铁酵母的方法在制备有机铁上的应用。
7.一种如权利要求1所述的利用铁载体制备富铁酵母的方法在制备补铁添加剂上的应用。
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