KR20130139041A - 식품의 향미를 증진시키는 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식품의 향미를 증진시키는 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) M1-4(KCTC 12159BP)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 균주를 발효균주로 이용함으로써 식품의 향미(香味)를 증진시키는 방법에 관한 기술이다. 보다 상세하게는 상기 식품은 된장, 고추장, 청국장, 간장, 요쿠르트, 김치 및 치즈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
조류독감, 광우병(BSE), 돼지콜레라, 가축사료의 항생제, MSG, GMO 문제 등으로 소비자의 선택이 천연지향적, 건강지향적으로 변화함과 동시에 더욱 다양하고 세련된 ‘맛’을 요구하면서 국내 맛내기 소재 산업은 정체기를 맞고 있다. 이러한 트렌드변화에 발맞춰 국내 조미식품업체들은 소비자의 선호도에 부합하게 천연추출물을 이용한 맛내기 소재를 개발하고 있으나, 맛의 깊이나 농후감, 지속성 등의 품질경쟁력이 부족한 실정이다. 이에 no meat, no MSG, no HVP, non-GMO 등의 특성을 갖춘 프리미엄급 고품질 천연·발효 맛내기 소재가 점진적으로 기존의 맛내기 소재를 대체할 것으로 판단된다.
조류독감, 광우병(BSE), 돼지콜레라, 가축사료의 항생제, MSG, GMO 문제 등으로 소비자의 선택이 천연지향적, 건강지향적으로 변화함과 동시에 더욱 다양하고 세련된 ‘맛’을 요구하면서 국내 맛내기 소재 산업은 정체기를 맞고 있다. 이러한 트렌드변화에 발맞춰 국내 조미식품업체들은 소비자의 선호도에 부합하게 천연추출물을 이용한 맛내기 소재를 개발하고 있으나, 맛의 깊이나 농후감, 지속성 등의 품질경쟁력이 부족한 실정이다. 이에 no meat, no MSG, no HVP, non-GMO 등의 특성을 갖춘 프리미엄급 고품질 천연·발효 맛내기 소재가 점진적으로 기존의 맛내기 소재를 대체할 것으로 판단된다.
Description
본 발명은 식품의 향미를 증진시키는 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) M1-4(KCTC 12159BP)에 관한 기술이다.
본 발명의 또 다른 일면은 상기 균주를 발효균주로 이용함으로써 식품의 향미(香味)를 증진시키는 방법에 관한 기술이다. 보다 상세하게는 상기 식품은 된장, 고추장, 청국장, 간장, 요쿠르트, 김치 및 치즈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
국내의 맛내기 소재는 원가경쟁력 증대 및 효율적 생산에 입각해 저가·저품질의 농축수산물 및 이의 가공품, 그리고 식품산업에서 유발되는 부산물을 기반으로 산 가수분해, 효소분해의 방법으로 제조되어 오고 있다.
반면, 해외 맛내기 소재는 아래 테이블과 같이 일본을 중심으로 생산/판매되고 있음. 이들 제품들은 산분해기술, 효소분해기술, 양조발효기술등이 접목된 것으로 일본내의 식품산업에서 그 사용량이 점차 증가하고 있는 실정이며 국내로의 유입량 또한 증가하고 있다.
아미노산 중심의 맛성분을 지니고 있는 일본의 간장제품은 맛내기 소재의 한 부류로 볼수 있으나 간장특유의 향이 강하고 색상이 진해 맛내기 소재로서는 적합하지 못한 특성이 있다. 또한 천연 원료인 대두만을 주원료로 사용한 제품은 없는 실정이다.
이 밖에 아지노모토사의 “koji-aji"제품과 같은 고 TN 함량 소재는 대부분 wheat gluten을 분해하여 분말화한 것(또는 여기에 효모추출물등을 첨가한것)으로 대두발효물이 아니라는 점과 매우 높은 가격으로 인해 대중화되기 어렵고 가격경쟁력이 떨어지는 실정이다.
또한, 소득증대 및 생활수준의 향상과 함께 진행되는 “입맛”의 서구화와 고급화에 따라 한식에서 뿐만 아니라 서양요리에서도 어울림이 좋은 맛내기 소재의 요구성이 날로 높아지고 있어 “웰빙”이라는 트랜드에 부합하면서도 한식 및 서양요리에 어울림이 좋은 맛내기 소재로 시장환경이 변화하고 있다고 사료된다.
단백질을 산으로 가수분해 시켜 고농도의 아미노산을 획득하는 방법은 반응시간이 매우 짧고 원료 이용률이 높으며 경제적이라는 장점을 가지고 있음에도 불구하고 소재로 사용하기에는 산분해취가 강해 적합하지 못하다.
이로 인해 효소반응을 이용한 분해법이 산업체를 중심으로 시도되고 있으나 이 역시 고가의 효소사용으로 인해 생산단가가 인상되고 맛이 단순하고 풍부하지 못한 문제점을 앉고 있는 실정이다.
반면, 전통 자연양조법은 원료 단백질에 미생물원을 투입하여 자연 숙성시키는 방법으로, 단백질분해가 효율적이지 못해 고농도의 정미성 물질 수득이 어렵고 바람직하지 못한 이취의 발생이 난점으로 지적되고 있으나, 산분해법과 비교하여 취가 약해 소재로 사용하기 적합할뿐더러 제조방법상 천연 지향적이고 경제적이라는 큰 장점을 가진다. 따라서 전통 자연양조법의 과학화 및 산업화를 통해 전통 자연양조법의 단점을 보완하여 고농도의 정미성 물질을 수득 할 수 있는 기술 개발의 방향으로 전환되고 있다.
샘표식품(주)는 60년 전통의 양조발효 및 효소분해 기술을 핵심기술로 보유하고 있으며, 특히 양조발효기술은 식물성 원료를 기반으로 한 미생물 발효에서부터 산업화기술까지 국내적으로 독보적인 위치에 있다. 이에 샘표식품(주)는 기 확보된 기술을 바탕으로 한 단계 진일보한 맛내기 소재 제조기술 개발을 리드 할 수 있을 것으로 사료된다.
이하 본 발명과 관련된 배경기술에 대해서 기재한다.
1. Jeong, S.Y.; Chung, S.J.; Shu, D.S.; Shu, B.C.; Kim, K.O. Developing a descriptive analysis procedure for evaluating the sensory characteristics of soy sauce. J. Food . Sci. 2004, 69, S319-S325
2. Baek, H.H.; Kim, H.J. Solid phase microextraction-gas chromatography-olfactometry of soy sauce based on sample dilution analysis. Food Sci . Biotechnol. 2004, 13, 90-95
3. Lee, S.M.; Seo, B.C.; Kim, Y.-S. Volatile compounds in fermented and acid-hydrolyzed soy sauces. J. Food . Sci. 2006, 71, C146-C156
4. Cho, I.H.; Choi, H.-K.; Kim, Y.-S. Difference in the volatile composition of pine-mushrooms (Tricholoma matsutake Sing.) according to their grades. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 4820-4825
5. Steinhaus, P.; Schieberle, P. Characterization of the key aroma compounds in soy sauce using approaches of molecular sensory science. J. Agric . Food Chem . 2007, 55, 6262-6269
6. Cho, I.H.; Lee, K.-W.; Kim, Y.-S.; Choi, H.-K. Determination of differences in the non-volatile metabolites of pine-mushrooms (TricholomamatsutakeSing.)according to different parts and heating times using 1HNMRandprincipalcomponentanalysis. J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17, 1682-1687
7. Cho, I.H.; Lee, S.M.; Kim, SY; Choi, H-K; Kim, KO; Kim, Y-S. Differentiation of aroma characteristics of pine-mushrooms (Tricholoma matsutakeSing.) of different grades using gaschromatography-olfactometry (GC-O) and sensoryanalysis. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 2323-2328
8. Cho, I.H.; Kim, Y.-S.; Choi, H.-K. Metabolomic discrimination of different grades of pine-mushroom (Tricholoma matsutake Sing.) using 1H NMR spectrometry and multivariate data analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 43, 900-904
9. Park, M.K.; Choi, H.-K.; Kwon, D.-Y.; Kim, Y.-S. Study of volatile organic acids in freeze-dried Cheonggukjang formed during fermentation using SPME and stable-isotope dilution assay (SIDA). Food Chem. 2007, 105, 1276-1280
10. Park, H.K.; Kim, J.K. Optimal manufacturing conditions for Korean soybean paste and soy sauce, using Aspergillus oryzae AJ 100 as a flavor improver. Food Sci . Biotechnol. 2008, 17, 208-211
11. Gao, S.L.; Zhao, H.F.; Zhao, M.M.; Cui, C.; Ren, J.Y. Comparative study on volatile flavor compounds of traditional Chines-type soy sauces prepared with soybean and defatted soy meal. Food Sci . Biotechnol . 2009, 18, 1447-1458
12. Ko, B.-K.; Ahn, H.-J.; van den Berg, F.; Lee, C.-H.; Hong, Y.-S. Metabolomic insight soy sauce through 1H NMR spectroscopy. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 6862-6870
13. Giri, A.; Osako, K.; Okamoto, A.; Ohshima, T. Olfactometric characterization of aroma active compounds in fermented fish paste in comparison with fish sauce, fermented soy paste and sauce products. Food Res . Intl. 2010 (In Press).1.
14. 서성희, 황인경, 양호승, 이형주. 재래식 간장의 냄새 성분 및 관능특성. 한국콩연구회. 1995, 12, 21-32
15. 박옥진, 손경희, 박현경. 담금용기에 따른 한국전통 간장의 맛성분 분석. 한국식생활문화학회지. 1996. 11, 229-233
16. 박현경, 손경희, 박옥진. 한국전통간장의 맛과 향에 관여하는 주요 향미인자의 분석 (1) - 일반특성 및 당류와 유기산 분석 -한국식생활문화학회. 1997, 12, 63-69
17. 박현경, 손경희. 한국전통간장의 맛과 향에 관여하는 주요 향미인자의 분석 (2) - 질소 화합물 , 유리아미노산 및 핵산관련물질 분석. 한국식생활문화학회. 1997, 12, 53-61
18. 박현경, 손경희, 박옥진. 한국전통간장의 맛과 향에 관여하는 주요 향미인자의 분석 (3) - 향기성분 분석 -한국식생활문화학회. 1997, 12, 173-182
본 발명은 식품의 향미를 증진시키는 균주, 보다 상세하게는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) M1-4(KCTC 12159BP)을 제공하는 것을 목적으로 한다.
나아가, 본 발명은 상기 균주를 발효균주로 이용함으로써 된장, 고추장, 청국장, 간장, 요쿠르트, 김치 및 치즈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 식품의 향미(香味)를 증진시키는 방법을 제공함을 목적으로 한다.
이하, 본 발명의 지향점을 세분하여 설명한다.
1. 향미가 증진된 천연 맛내기 소재 개발 요구
우리의 선조들은 음식의 맛을 내기 위해 간장, 된장, 고추장, 식초 등의 천연조미료를 사용해왔다. 이중 간장은 대두를 기반으로 제조된 맛내기 소재로서 유리아미노산과 펩타이드를 주성분으로 한다는 특징을 지니고 있다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고 총질소(total nitrogen, TN)이 0.5～0.8 % 수준으로 맛이 풍부하지 못하고 특유의 강한 향미(쿰쿰한 향, 불쾌취)가 있어 원재료 고유의 맛을 살려야 하는 한식요리 및 서양요리에는 적합하지 못해 그 활용도가 적다. 조미료 시장은 1세대 조리료라 불리우는 'MSG(monosodium glutamate)'에서 2세대 조미료('혼합조미료': MSG와 기타 첨가물의 혼합물)를 거쳐, 근래 "웰빙"이라는 소비자의 트랜드에 부합하기 위해 3세대 조미료('자연재료 조미료')로 변화해가고 있으나, 관능적으로 맛이 풍부하지 못해 소비자로부터 외면을 받고 있는 실정이다. (국내 조미료시장은 2002년을 기준으로 시장규모와 국내 생산량이 모두 지속적으로 감소하고 있으며 2007년 생산량을 기준으로 -7%성장을 보이고 있음.) 따라서 “웰빙”이라는 트렌드에 부합하면서도 맛이 깊고 풍부하며 부드러운 향미를 지녀 한식에서 뿐만 아니라 서양요리에서도 어울림이 좋은 맛내기 소재의 요구성이 날로 높아지고 있다.
2. 식물성 천연원료 대두를 이용한 맛내기 소재 개발의 필요성
동물성 원료는 관능적으로 우수하여 현재까지 맛내기 소재의 원료로 주로 사용되어 왔으나 광우병, 조류독감, 항생제 등의 문제로 인해 식물성 원료에 대한 관심이 높아지고 있고, 특히, 대두는 기능성물질과 관련하여 장점이 있을 뿐 만 아니라 다른 곡물과는 달리 단백질 30-45%, 지방 16-22%로 매우 높아 맛내기 소재로서 적합한 식물성원료로 주목받고 있다. 기존의 맛내기 소재는 단순히 맛 자체만을 향상시키는 방향으로 개발되어 왔기 때문에 정미성물질인 아미노산 함량을 최대로 높이기 위해 대두 그 자체를 사용하기 보다는 지방성분이 제거된 탈지대두가 주로 사용되어 왔고, 대두의 지방성분은 주목받지 못했다. 그러나 최근 들어 대두의 지방성분이 발효과정 중 발생하는 지용성 이취성분을 용해 및 제거하고 발효물의 산소접촉을 막아 산화를 방지하여 향을 부드럽게 한다는 연구결과가 발표되는 등 지방성분이 향에 중요한 역할을 한다는 점이 차츰 밝혀지고 있으며 glycerol이 부드러운 맛을 유발한다는 점이 알려지면서 향미가 증진된 맛내기 소재개발을 위해서는 대두 자체를 사용하면서도 높은 정미성 물질(아미노산, 펩타이드)를 얻을 수 있는 기술 개발이 중요하다.
3. 천연 맛내기 소재 개발을 통한 수입소재 대체 필요성
국내의 맛내기 소재는 원가경쟁력 증대 및 효율적 생산에 입각해 저가·저품질의 농축수산물 및 이의 가공품, 그리고 식품산업에서 유발되는 부산물을 기반으로 산 가수분해, 효소분해 등의 방법으로 제조되어 왔다. 그러나 최근 들어 소득 및 생활수준 향상과 더불어 천연 지향적이면서도 유해성이 없는 건강 지향적인 맛내기 소재에 대한 요구가 날로 증대되고 있어, 기존의 맛내기 소재로는 소비자의 욕구를 충족시키지 못하고 있는 실정이다. 이러한 국내실정과는 달리, 일본 및 유럽업체들은 밀, 대두 등의 전통 양조 발효물 및 효소분해물을 이용하여 고부가가치의 천연 맛내기 소재를 개발 및 판매하고 있고, 이러한 소재들은 기존의 제품보다 맛의 깊이, 농후감, 지속성을 부여하는 고부가가치 소재로 해외 식품산업계에서 사용이 증가할 뿐만 아니라 국내로의 유입이 증가추세에 있다. 이렇듯 국내에서는 고품질의 천연 맛내기 소재가 개발되지 않아, 일본과 유럽업체가 개발한 소재를 수입하여 조미식품의 맛을 보강하고 있는 실정으로, 그 사용량 또한 점차 증가하고 있음. 따라서 국내에서도 전통 식품산업과 바이오 기술을 접목한 새로운 천연·발효 맛내기 소재 개발이 시급한 실정이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에서는 식품의 향미를 증진시키는 균주를 제공한다. 보다 상세하게는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) M1-4(KCTC 12159BP)를 제공한다.
상기 아스퍼질러스 오리제는 protease, amylase, glutaminase에 대한 활성이 높은 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 오리제는 독성물질로 알려진 aflatoxin 생성능이 없는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 오리제는 맛내기 소재의 색상에 영향을 주지 않기 위해 포자의 색상이 진하지 않은 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 균주를 발효균주로 이용함으로써 식품의 향미(香味)를 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 식품은 된장, 고추장, 청국장, 간장, 요쿠르트, 김치 및 치즈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명의 기술적 내용에 대해 부가하여 설명한다. 국내의 맛내기 소재는 원가경쟁력 증대 및 효율적 생산에 입각해 저가·저품질의 농축수산물 및 이의 가공품 그리고 식품산업에서 유발되는 부산물을 기반으로 산가수분해, 효소분해 등의 방법으로 제조되어 왔다. 그러나 최근 들어 소득 및 생활수준 향상과 더불어 천연 지향적이면서도 유해성이 없는 건강 지향적인 맛내기 소재에 대한 요구성이 날로 증대되고 있어, 기존의 맛내기 소재로는 소비자의 욕구를 충족시키지 못하고 있는 실정이다. 이러한 국내실정과는 달리, 일본 및 유럽업체들은 밀, 대두 등의 전통 양조발효물 및 효소분해물을 이용하여 고부가가치의 천연 맛내기 소재를 개발 및 판매하고 있고 이러한 소재들은 기존의 제품보다 맛의 깊이, 농후감, 지속성을 부여하는 고부가가치 소재로 해외 식품산업계에서 사용이 증가할 뿐만 아니라 국내로의 유입이 증가하고 있는 실정이다. 이렇듯 국내에서는 고품질의 천연 맛내기 소재가 개발되지 않아 일본과 유럽업체가 개발한 소재를 수입하여 조미식품의 맛을 보강하고 있는 실정으로 그 사용량 또한 점차 증가하고 있다. 따라서 국내에서도 전통 식품산업과 바이오기술을 접목한 새로운 천연·발효 맛내기 소재 개발에 동참해야만 세계화시대의 경쟁에서 살아남을 수 있다.
소득증대, 생활수준 향상과 더불어 건강지향적이면서도 천연지향적인 맛내기 소재의 요구성이 날로 증대하고 있으나 현재의 맛내기 소재는 원료적 측면과 제조방법적인 면에서 천연지향적인 제품은 소수일 뿐만 아니라 그 품질력 또한 미약한 실정임. 이에 본 연구개발제품은 원료적 측면에서 동물성이 아닌 천연 식물성 원료인 대두를 사용하면서도 제조방법적인 면에서 개선된 전통양조법을 통해 천연·발효 맛내기 소재를 개발하여 웰빙이라는 트랜드에 적합하면서도 맛이 깊고 풍부하며 부드러운 향미를 지녀 한식 및 서양요리에서도 어울림이 좋은 것을 그 특징으로 한다. “웰빙”이라는 트렌드에 부합하면서도 맛이 깊고 풍부하며 부드러운 향미를 지니면서 밝은 색상을 띄고 있는 천연·발효 맛내기의 요구성이 날로 커지고 있어 천연식물성 원료인 대두를 사용하고 개선된 전통양조기술의 접목을 통해 구현하고자 노력하였다.
맛내기 소재는 밝은 색상을 띄어야 다양한 요리 및 식품에 사용이 가능하고 밝은 색상을 구현하기 위해서는 메일라드 반응을 최소화하는 것이 중요하다. 그러므로 단백분해기간의 단축을 통해 메일라드 반응시간을 줄이는 것이 중요하고 이를 위해서는 단백분해효소의 활성이 높은 균주를 사용해야 한다. 이에 Protease, amylase의 효소활성이 기존대비 52%, 55% 향상 되고 aflatoxin 생성능이 없는 우량 국균 1종을 분리하였다. 또한 좋은 향을 부여하고 알코올생성능이 높으며 산막생성능이 없는 효모 1종, Lactic acid 생성능이 높고 좋은 향미를 부여하며 산막생성을 억제하면서 Histidine decarboxylase 활성이 없는 유산균 1종을 최종적으로 선별/분리하여 활용하였다.
이화학적 목표수준인 TN=1.5이상, AN=0.9이상, Color(O.D500)=3 이하를 달성하기 위해 원료비, 염분함량, 숙성기간의 설정을 통해 단백분해/발효조건을 최적화 하였다.
그리고 상기와 같이 설정된 조건을 기반으로 대량 생산시 맛내기 제조공정별 시간단축을 통해 오염미생물에 의한 품질저하 방지 및 생산효율 극대화를 도모하였고 각 공정별 균질화와 이물제거 공정의 적용을 통해 품질안정화 및 안전화를 위한 시스템을 구축/최적화 하였다.
대량생산시스템을 통해 생산된 천연·발효 맛내기는 이화학적 목표수준을 모두 달성하였을 뿐만 아니라 일반소비자를 대상으로 관능평가를 수행한 결과 아래와 같이 콩향이 강하고 화학약품향이 약하며 색상이 밝아 높은 소비자 만족도(3.8점)를 보여(유사시판제품의 경우 소비자만족도=3.2～3.4점) 긍정적으로 평가되었다.
상기와 같이 진행된 1차 천연·발효 맛내기의 제조기술을 기반으로 2차년도에는 보다 향미가 증진된 2차 천연·발효 맛내기(TN 2.0% 이상, AN 1.2% 이상)제조기술 개발과 천연·발효 맛내기를 활용한 동서양 요리에 적합한 응용제품 개발을 원할히 진행할 수 있을 것으로 사료된다.
조류독감, 광우병(BSE), 돼지콜레라, 가축사료의 항생제, MSG, GMO 문제 등으로 소비자의 선택이 천연지향적, 건강지향적으로 변화함과 동시에 더욱 다양하고 세련된 ‘맛’을 요구하면서 국내 맛내기 소재 산업은 정체기를 맞고 있다. 이러한 트렌드변화에 발맞춰 국내 조미식품업체들은 소비자의 선호도에 부합하게 천연추출물을 이용한 맛내기 소재를 개발하고 있으나, 맛의 깊이나 농후감, 지속성 등의 품질경쟁력이 부족한 실정이다. 이에 no meat, no MSG, no HVP, non-GMO 등의 특성을 갖춘 프리미엄급 고품질 천연·발효 맛내기 소재가 점진적으로 기존의 맛내기 소재를 대체할 것으로 판단된다.
도 1은 Protease Plate assay에 관한 것이다.
도 2는 Amylase Plate assay에 관한 것이다.
도 3은 수분함량 변화에 따른 국균 배양물의 포자수와 총세균수의 변화에 관한 것이다.
도 4는 Decarboxylating agar에 관한 것이다(좌:Decarboxylase 생성; 우:Decarboxylase 비생성).
도 5는 효모/유산균 발효에 따른 향미의 특성강도에 관한 것이다.
도 6은 효모/유산균 발효에 따른 TN 함량의 변화에 관한 것이다.
도 7은 효모/유산균 발효에 따른 pH 변화에 관한 것이다.
도 8은 맛내기 소재 제조 공정 flow에 관한 것이다.
도 9는 Scale-up 시제품의 관능특성(특성강도) 분석 결과에 관한 것이다.
도 10은 Scale-up 시제품의 관능특성(특성강도) 분석 결과에 관한 것이다.
도 11은 본 발명의 시제품 사진이다.
도 2는 Amylase Plate assay에 관한 것이다.
도 3은 수분함량 변화에 따른 국균 배양물의 포자수와 총세균수의 변화에 관한 것이다.
도 4는 Decarboxylating agar에 관한 것이다(좌:Decarboxylase 생성; 우:Decarboxylase 비생성).
도 5는 효모/유산균 발효에 따른 향미의 특성강도에 관한 것이다.
도 6은 효모/유산균 발효에 따른 TN 함량의 변화에 관한 것이다.
도 7은 효모/유산균 발효에 따른 pH 변화에 관한 것이다.
도 8은 맛내기 소재 제조 공정 flow에 관한 것이다.
도 9는 Scale-up 시제품의 관능특성(특성강도) 분석 결과에 관한 것이다.
도 10은 Scale-up 시제품의 관능특성(특성강도) 분석 결과에 관한 것이다.
도 11은 본 발명의 시제품 사진이다.
본 발명은 식품의 향미를 증진시키는 균주를 제공한다. 보다 상세하게는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) M1-4(KCTC 12159BP)에 관한 것이다. 상기 아스퍼질러스 오리제는 protease, amylase, glutaminase에 대한 활성이 높은 것을 특징으로 할 수 있고, 독성물질로 알려진 aflatoxin 생성능이 없는 것을 특징으로 할 수 있으며, 맛내기 소재의 색상에 영향을 주지 않기 위해 포자의 색상이 진하지 않은 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 균주를 발효균주로 이용함으로써 식품의 향미(香味)를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 상기 식품은 된장, 고추장, 청국장, 간장, 요쿠르트, 김치 및 치즈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다.
제 1 절 제품개발의 개요
본 발명은 식물성 천연원료인 대두에 미생물 발효기술을 접목하여 고품질 천연·발효 맛내기 소재 및 응용제품 개발을 최종목표로 한다.
제 2 절 연구내용 및 결과
[1] 대두발효기술을 이용한 신규 향미증진 발효 맛내기 소재 개발
1. 재료 및 실험방법
가. 국균 배양 및 선별
Potato dextrose agar(PDA) 배지에 샘표식품(주) 기술연구소에서 보유한 곰팡이 균주를 계대배양 한 후 30℃에서 5일간 배양한다. 균사의 성장이 빠른 균주를 1차로 선별하여 lab-scale 제국을 실시한다. 제국 조건은 샘표식품(주)의 제국 배양 조건으로 시행하였다.
나. Lab-scale 제국
함수율이 48%가 되도록 밀기울 또는 대두에 증류수를 혼합 후 이를 삼각플라스크에 옮겨 담고 121℃, 20min동안 autoclave 수행하고 여기에 국균을 접종 후 30℃에서 3일 동안 제국을 실시하였다.
다. protease plate assay
Lab-scale 제국을 실시하여 획득한 제국물을 생리식염수에 현탁하여 효소액을 추출하였다. 추출한 효소액을 2%의 casein을 함유한 potato dextrose agar(PDA)배지상에서 clear zone 생성정도를 측정하였다.
라. Amylase plate assay
Lab-scale 제국물에서 효소액을 추출하여 1% starch가 함유된 potato dextrose agar(PDA)배지상에서 clear zone 생성정도를 측정하였다.
마. 국균의 효소 측정
Lab-scale 제국을 통해 획득한 효소액은 각각의 효소측정법에 따라 Protease, Amylase, Glutaminas, Pectinase의 활성을 측정하였다.
바. 국균의 culture condition 확립
선별된 균주를 potato dextrose agar (PDA)배지에 1차 배양 후 함수율이 각기 다른 증자된 밀기울(wheat bran)에 transfer후 30℃에서 5일간 배양 한다. 5일간 배양한 국균을 생리식염수에 현탁한 후 PDA 배지에 도말하여 포자생성량을 측정하였다.
사. 유기산 생성 미생물의 스크리닝 및 선별
샘표식품(주) 기술연구소에서 보유한 박테리아를 MRS 배지에서 plating하여 aerobic jar에서 30℃에서 3일동안 배양하였다. Single colony를 취하여 염분농도별(5%, 10%, 15%)로 제조된 MRS 배지에서 배양하여 내염성 미생물을 선별하였다.
아. Histidine decarboxylase 비생성 균주 선별
Decarboxylating agar medium에 유산균을 접종후 30℃에서 3일간 배양한 후 배지의 색상이 붉은색으로 변하면 Histidine decarboxylase 활성이 있는 것으로 판별하였다.
하기 표 1은 Decarboxylating agar medium 에 관한 것이다.
| 구성성분 | 함량 (%) |
| Tryptone | 0.125 |
| Yeast extract | 0.125 |
| (NH4)2SO4 | 0.75 |
| NaCl | 0.5 |
| Glucose | 0.1 |
| MgSO47H2O | 0.02 |
| MnSO47H2O | 0.005 |
| FeSO47H2O | 0.004 |
| Tween 80 | 0.05 |
| Cresol red | 0.02 |
| agar | 3 |
| L-histidine hydrochloride monohydrate | 2 |
자. 유기산 분석
HPLC를 이용하여 각각의 표준시료(Lactic acid, Acetic acid, Citric acid, Malic acid, Succinic acid)의 Standard curve를 작성하고 시료(유산균 배양액, 맛내기 소재 등)와 비교하여 유기산을 정량분석을 실시하였다.
차. 고알코올 생성 효모의 스크리닝 및 선별
Yeast modified agar(YM)배지에 샘표식품(주) 기술연구소에서 보유한 효모 균주를 계대 배양 한 후 30℃에서 72시간동안 배양하였다. 배양 24, 48, 72 시간마다 배양액내의 Ethanol과 Glucose의 함량을 분석하여 Glucose를 Ethanol로 많이 전환시킨 균주를 1차적으로 선별하였다. 그리고 선별된 균주를 염분함량이 8% 및 16%인 간장덧에 각각 1% 씩 접종하고 30℃에서 1개월동안 배양 후 Ethanol 생성량이 많고 산막형성능이 없는 균주를 선별하였다.
카. 포르말테질소
시료 5㎖을 100㎖ 비이커에 칭량하고 증류수를 가하여 충분히 교반한 후 250㎖ m-flask에 넣고 비이커는 증류수로 충분히 씻어 m-flask에 넣고 250ml로 정용한 후 충분히 혼합하여 N0.2여지를 이용하여 100㎖ 삼각 플라스크에 약 90㎖ 정도 받고 25㎖를 홀피펫으로 취한 후 0.1N NaOH를 사용하여 pH 8.4로 적정해둔 formaldehyde를 20㎖를 넣고 pH8.4가 될 때까지 적정하여 소비량을 기록하여 산출하였다.
A : 시료용액 중화에 소비된 0.1N NaOH 용액 ㎖수
B : 바탕시험에 소비된 0.1N NaOH 용액 ㎖수
f : 0.1N NaOH 농도계수
S : 시료무게(g)
타. 식염
시료 5㎖를 250㎖ m-flask에 넣고 mass up한 후 5㎖를 취해 2% K2CrO4 1㎖를 넣고 0.02N AgNO3로 적정하면서 노란색에서 붉은 색으로 변하는 시점에 소비량을 기록하여 산출하였다.
파. T-N
시료 50㎖(질소함량이 0.1㎎ 이상일 경우에는 희석)를 분해병에 넣고 알카리성과황산 칼륨 용액 10㎖를 넣어 마개를 닫고 흔들어 섞은 다음 고압증기멸균기에 넣고 가열한 후, 약 120℃가 될 때부터 30 분간 가열 분해하고 분해병을 꺼내어 방냉하였다. 전처리 한 시료의 상등액을 취하여 유리섬유 여지(GF/C)로 여과한 후 여액 25㎖를 정확히 취하고 여기에 염산 5㎖를 넣어 pH 2～3으로 하였다. 이 용액의 일부를 층장 10 ㎜ 흡수셀에 옮겨 검액으로 하고 물 50㎖를 취하여 시료의 전처리 시험방법에 따라 시험하고 바탕시험액으로 하였다. 바탕시험액을 대조액으로 하여 220㎚에서 검액의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검량선으로부터 질소의 양을 구하여 다음 식으로 시료중의 총질소 농도(㎎/ℓ)를 산출하였다.
a : 검량선으로부터 구한 질소의 양( ㎎ )
V : 전처리에 사용한 시료량( ㎖ )
하. 아미노산 조성 분석
아미노산 조성은 AccQ-Tag 법을 이용하여 분석하였다. 즉, 시료 0.5g에 증류수를 가하여 초음파처리(sonication)한 용액을 50㎖ 취하여 붕산염 완충액(borate buffer) 350㎖와 AccQ-Tag 유도체시약 100㎖을 넣어 잘 혼합한 후 55℃에서 10분간 유도체화 하였다. 유도체화 되어진 시료를 각각 10㎖씩 취한 후 HPLC의 자동시료주입기에 안치하여 표 1과 같은 조건으로 분석하였다. 표준물질은 40㎖, 시료용액은 10㎖을 HPLC에 주입하여 아미노산을 분석하였으며, 컬럼(column)은 AccQ-Tag C18(Millipore Co. Milford,. MA, USA) 아미노산 분석 컬럼(amino acid analysis column)을 사용하였으며 이동상은 0.14 M 아세트산 나트륨 (sodium acetate)과 10% 트리에틸아민(triethylamine)을 1% 인산 (phosphoric acid) 으로 pH 5.02를 맞춘 용액(eluent A)과 물과 아세토니트릴(acetonitrile)을 4:6으로 혼합한 용액(eluent B)을 선형 구배(linear gradient)로 용출하였다.
하기 표 2는 HPLC analysis condition for amino acid 에 관한 것이다.
| 항 목 | 실 험 조 건 |
| 장비(Instrument) | Waters 1525 Binary Pump, Waters 717 plus Autosampler, Waters 474 Fluorescence detector |
| 컬럼(Column) | AccQ-Tag column C18 |
| 컬럼크기(Column size) | 3.9 × 150 mm |
| 용출용매 A(Eluent A) | 0.14 M Sodium acetate, 10% triethylamine in water, pH 5.02 |
| 용출용매 B(Eluent B) | Acetonitrile : water = 6:4 |
| 구배(Gradient) | AccQ-Teg method |
| 유속(Flow rate) | 1.0 mL/min |
| 가동시간(Run time) | 45 min |
| 파장(Wavelength) | ex. = 250 nm, em. = 395 nm |
거. 미생물 독소 Aflatoxin 함량 측정
AOAC의 공인 분석법에 제시된 ELISA(enzyme-linked immubosorbent assay)법을 사용하여 발효숙성 과정 중의 Aflatoxin을 측정하였다.
너. 발효식품 안전성 규명을 위한 Biogenic amine 측정
저염 간장 발효숙성물을 채취하여 시료를 전처리하고 식품의약품안전청에서 제시한 HPLC 방법을 통한 Biogenic amine 2종(Histamine, Tyramine)을 분석하였다.
더. 질소 이용률
질소 이용률은 원료로부터 유래되는 질소성분을 맛내기 소재로의 얼마나 용출시켰는지를 보여주는 인자로 아래와 같이 계산하였다.
* 대두의 TN(%) = 5.5
러. 간장덧 제조
각각 열처리한 대두(또는 탈지대두)와 밀쌀을 혼합하여 30℃에서 3일간 곰팡이 발효를 수행하고 여기에 적정량의 염수를 혼합한 후 수일동안 숙성시켜 제조하였다. 이때 첨가하는 염수의 농도와 투입량은 간장덧의 최종 목표염분에 따라 조절하였다.
머. 관능 검사
- 패널 선정 및 훈련
일반소비자중 미각이 뛰어난 20명을 선정하여 관능패널로 구성하였다. 이들은 단맛(sweet, 5% sucrose solution), 신맛(sour, 0.08% lactic acid solution), 짠맛(salty, 1% sodium chloride solution), 감칠맛(glutamate-like; umami, 0.3% MSG solution), 쓴맛(bitter, 0.05% caffein solution)을 기준물질로 훈련하였다.
- 시료 준비 및 제시
외관/향 평가시에는 50㎖ 비이커에 시료 10㎖씩을 담고 뚜껑아 닫아 백열등 밑에서 개별적으로 평가를 하도록 샘플을 제시하였고 향미 평가시에는 플라스틱용기에 시료 5㎖씩 담아 붉은 등 밑에서 평가(외관영향 배제)하도록 제시하였다.
- 평가 내용 및 절차
검사는 오전 11시와 오후 5시에 실시되었으며 실험에 참여하는 관능검사원들에게는 검사 1시간 전부터 물 이외의 음료나 음식물 섭취와 구강세척제 사용을 피하도록 하였고 향이 진한 화장품의 사용을 금하도록 하였다. 특성강도 평가시에는 15점 항목 척도를 사용하였고 시료는 랜덤하게 제공하였으며 평가는 훈련과 본실험으로 나누어 진행하였다. 또한 미각의 둔화현상을 방지하기 위하여 한 사람에게 최대 3개의 샘플을 제시하였다. 기호도 평가시에는 5점 항목 척도를 사용하였고 기타사항은 특성강도 평가시와 동일하게 수행하였다.
- 향미의 정의
알코올향(Alcohol) : Ethyl alcohol에서 나는 휘발성 향
화학약품향(Chemical) : 간장에서 느껴지는 인공적인 향
콩향(Soy) : 삶은 콩의 구수한 향
메주향(Meju) : 메주에서 나는 특유의 향
볶음콩향(Roasted soybean) : 볶은 콩에서 나는 고소한 향
참기름향(Roasted sesame oil) : 참기름에서 나는 향
탄향(Burnt) : 종이나 나무 등이 탄 냄새
단향(Sweet) : 당밀, 시럽 등 단 물질에서 나는 단 향
신향(Sour) : Acetic acid에서 나는 신향
바닷물향(Briny) : 바닷물, 물다시마 등에서 나는 찝찔한 향
쿰쿰함 : 오래된 간장의 꼬릿꼬릿한 향
카라멜향 : 카라멜에서 나는 향
곰팡내 : 먼지, 지하실에서 나는 탁하고 퀘퀘한 향
발효취(Fermented) : 이스트에 의해 발효된 당에서 나는 특유의 향
김향(Laver) : 김에서 나는 특유의 냄새
짠맛(Salty) : 혀에서 느껴지는 NaCl 등 나트륨 이온과 관련된 맛
단맛(Sweet) : 혀에서 느껴지는 설탕, 인공감미료 등 단 물질과 관련된 맛
신맛(Sour) : 혀에서 느껴지는 산과 관련된 물질의 맛
MSG맛, 감칠맛(MSG) : 혀에서 느껴지는 MSG 특유의 맛
쓴맛(Bitter) : 혀 뒤쪽에서 후미로써 느껴지는 카페인, 퀴닌 등의 쓴맛
아린 감각(Biting) : 혀 앞쪽에서 느껴지는 자극적인 감각
톡 쏘는 감각(Pungent) : 후각에서 느껴지는 톡 쏘는 감각
알코올향미(Alcohol) : Ethyl alcohol에서 나는 휘발성 향미
화학약품향미(Chemical) : 간장에서 느껴지는 인공적인 화학약품 향미
메주향미(Meju) : 메주에서 나는 메주 특유의 향미
볶은콩향미(Roasted soybean) : 볶은 콩에서 나는 고소한 향미
콩향미 (Boiled soybean) : 삶은 콩에서 나는 구소한 향미
참기름향(Roasted sesame oil) : 참기름에서 나는 고소한 향미
금속성향미(Metallic) : 철이나 구리 등과 같은 금속에서 나는 향미
김향미(Laver) : 김에서 나는 특유의 향미
탄향미(Burnt) : 탄 종이나 탄 숯에서 나는 탄 향미
텁텁/떫음 : 탄닌에 의해 느껴지는 혀가 오므라들거나 마른 느낌
전반적 맛 강도 : 맛의 강하고 약함
풍미(Mouthfull) : 맛의 복합성
농도 : 농후함, 바디감
버. 소비자 조사
Prototype의 소비자 만족도 조사는 Home Usage Test(HUT)로 진행하였으며 28세～45세로 구성된 샘표패널 72명을 대상으로 준비된 시료 200㎖을 제공하고 2주에 걸쳐 가열요리 및 비가열요리에 자유롭게 사용하면서 평가하도록 하였다.
2. 세부수행결과
가. 향미증진 우량 발효미생물 분리 및 생물학적 특성분석
(1) 고 protease 활성 국균 분리
대두는 단백질 함량이 약 40%수준으로 다른 일반적인 곡물에 비해 매우 높은 단백질을 함유하고 있고 대두단백을 정미성물질인 아미노산으로 효과적으로 분해해야만 맛내기 소재화가 가능하다. 이렇게 대두단백을 효과적으로 분해하기 위해서는 단백분해효소의 활성이 높은 우량미생물을 분리/적용해야 하고 단백분해효소를 생산하는 다양한 미생물중, 국균을 고상발효 하였을 때 높은 활성의 단백분해효소를 취할 수 있는 것으로 알려져 있다.
양조간장과 같은 기존 맛내기 제조시에 사용되었던 국균의 고상발효물에서는 Protease 활성이 약 600～800 unit/g 으로 본 효소역가에서 정미성 물질인 아미노산으로 분해시키기 위해서는 약 5～6개월의 시간이 소요된다. 그러나 이렇게 오랜 기간 동안 분해를 하게 될 경우 메일라드반응으로 인해 색상이 검게 된다. 이러한 진한 색상은 요리 및 식품에 사용될 경우 요리 및 식품 자체의 색상을 검게 변화 시키므로 활용처의 폭이 좁아 맛내기 소재로서 부적합하다.
이러한 이유로 인해 protease 활성이 높은 우량균주의 선별/적용을 통해 단백분해시간을 단축시켜 맛내기 소재의 색상을 밝게하면서도 정미성 물질(아미노산)의 함량을 증진 시킬 수 있다는 점에서 중요하다. 또한, amylase의 경우 원료자체가 함유하고 탄수화물을 당류로 분해하여 감미를 증진 시킬 수 있고 glutaminase는 glutamine을 glutamic acid로 전환시켜 감칠맛을 증진 시킬 수 있다는 점에서 중요한 효소로 알려져 있다. 이에, protease, amylase, glutaminase 활성이 높고 독성물질로 알려진 aflatoxin 생성능이 없으며 맛내기 소재의 색상에 영향을 주지 않기 위해 포자의 색상이 진하지 않은 국균을 최종적으로 선별하였다.
(가) 1st screening - Plate assay
표 3과 같이 각각의 국균을 고상배후 생리식염수에 현탁하여 획득한 효소액을 Skim milk가 함유되어 있는 plate에서 반응시켜 clear zone의 크기를 측정(도 1)하여 대조구(기사용 국균) M1-2, M1-4, M2-1균주가 대조구(기사용 국균)보다 Protease 활성이 높음을 확인하였다.
하기 표 3은 국균별 Protease plate assay 에 관한 것이다.
| 균주번호 | Clear zone size(mm) | |||
| 1st | 2nd | 3rd | average(mm) | |
| 대조구 | 5.3 | 5.3 | 5.1 | 5.2 |
| M1-1 | 3.3 | 3.3 | 3.3 | 3.3 |
| M1 -2 | 6.5 | 6.4 | 6.5 | 6.5 |
| M1-3 | 4.5 | 4.6 | 4.6 | 4.6 |
| M1 -4 | 6.0 | 5.8 | 6.0 | 6.0 |
| M2 -1 | 5.8 | 5.6 | 5.7 | 5.7 |
| M2-2 | 2.9 | 3.1 | 2.9 | 3.0 |
| M3-1 | 3.0 | 3.2 | 3.1 | 3.1 |
| M3-2 | 1.8 | 1.9 | 2.1 | 1.9 |
| M4-1 | 3.5 | 3.7 | 3.5 | 3.6 |
| M5-1 | 5.4 | 5.3 | 5.1 | 5.3 |
표 4와 같이 각각의 국균을 고상배양후 생리식염수에 현탁하여 획득한 효소액을 starch가 함유되어 있는 plate에서 반응시켜 clear zone의 크기를 측정(도 2)하여 M1-4, M3-1, M3-2균주가 대조구(기사용 국균)보다 Amylase 활성이 높은 국균임을 확인하였다.
하기 표 4은 국균별 Amylase plate assay에 관한 것이다.
| 균주번호 | Clear zone size(mm) | |||
| 1st | 2nd | 3rd | average(mm) | |
| 대조구 | 5.3 | 5.5 | 5.7 | 5.5 |
| M1-1 | 5.0 | 5.2 | 5.1 | 5.1 |
| M1-2 | 4.4 | 4.3 | 4.5 | 4.4 |
| M1-3 | 4.2 | 4.1 | 4.2 | 4.2 |
| M1 -4 | 7.0 | 7.0 | 7.2 | 7.1 |
| M2-1 | 4.0 | 3.8 | 3.9 | 3.9 |
| M2-2 | 3.5 | 3.4 | 3.5 | 3.5 |
| M3 -1 | 7.1 | 7.5 | 7.3 | 7.3 |
| M3 -2 | 5.5 | 5.4 | 5.5 | 5.5 |
| M4-1 | 3.7 | 3.1 | 3.5 | 3.4 |
| M5-1 | 4.5 | 4.8 | 4.2 | 4.5 |
(나) 2nd screening - Enzyme assay & Aflatoxin 분석
Plate assay를 통해 Protease 활성 우수 국균인 M1-2, M1-4, M2-1과 Amylase 활성 우수 국균인 M1-4, M3-1, M3-2를 30℃에서 40시간동안 고상배양한 후 배양물 내의 각종 효소의 활성과 aflatoxin의 분석을 통해 효소활성이 높고 aflatoxin 생성능이 없으면서 짙은 색상을 띄지 않는 M1-4 균주를 최종적으로 선별하였다.
M1-4 균주는 대조구(기사용 국균)대비 Glutaminase 활성은 동등하면서도 Protease 활성과 Amylase 활성은 대조구(기사용 국균)대비 각각 52%, 55% 높고 Aflatoxin 생성능이 없으며 짙은 색상을 띄지 않고(황색)있어 본 균주를 최종적으로 선택하였다.
하기 표 5은 국균 고상발효물의 효소역가 및 Aflatoxin에 관한 것이다.
| 균 주 번 호 |
Protease (U/g) |
Amylase (U/g) |
Glutaminase (U/g) |
pH | Aflatoxin | 비 고 |
| 대조구 | 616±25 | 220.2±10.5 | 1.81±0.12 | 6.7.1±0.28 | 음성 | 청색 |
| M1-2 | 916±25 | 120.2±10.5 | 1.78±0.12 | 7.10±0.28 | 음성 | 짙은 청색 |
| M1 -4 | 934±28 | 342.1±24.1 | 1.84±0.11 | 6.70±0.21 | 음성 | 황색 |
| M2-1 | 685±11 | 170.1±13.2 | 1.81±0.11 | 6.73±0.18 | 음성 | 황색 |
| M3-1 | 498±21 | 247.4±3.8 | 0.83±0.09 | 6.74±0.21 | 음성 | 흰색 |
| M3-2 | 611±31 | 96.3±6.4 | 0.79±0.08 | 6.65±0.17 | 음성 | 황색 |
(2) 분리 국균의 배양조건 확립
일반적으로 산업적 국균 배양시에는 곡물 등의 원료에 물을 첨가한 후 열처리를 통해 원료를 연화시킴과 동시에 원료자체에 부착되어 있는 미생물을 제거시킨후 순수 분리된 국균을 접종하여 배양한다. 이때, 원료자체의 수분함량이 낮아(곡물의 경우 통상 10% 전후임) 물을 첨가하여 열처리시 열전달이 원활 할 수 있도록 함과 동시에 국균의 생육이 증진될 수 있도록 한다.
국균을 포함한 대부분의 미생물은 수분함량이 높을수록(수분활성도가 높을수록) 생육이 원활하기에 다량의 물을 첨가하는 것이 바람직하지만, 액상배양과 달리 고상배양의 경우 배양기의 특성상 완벽한 순수배양이 불가능함으로 열처리한 원료내의 수분함량이 과다할 경우 국균보다는 세균류의 미생물이 폭발적으로 증가하는 문제가 발생한다. 그러므로 세균류에 비해 낮은 수분활성도에서도 국균의 생육이 원활하다는 점을 이용하여 국균의 배양은 원활하면서도 세균류의 생육은 최소화 할 수 있는 수분함량을 설정하는 것이 국균배양에 있어서 무엇보다 중요하다.
밀브랜(wheat bran)에 첨가하는 물량의 조절을 통해 국균배양지의 수분함량을 35, 40, 45, 50, 55, 60%로 변화시켜 이중 최대의 포자수를 획득할 수 있으면서도 총세균수는 최소가 될 수 있는 조건을 조사하였다.
수분함량이 35%에서 증가할수록 포자수는 점진적으로 증가하여 수분함량 50%일때 최고조에 도달했으며 이후 수분함량 더 증가할수록 포자수는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 그리고 총세균수는 수분함량 50%까지는 10 cfu/g 미만으로 유지되다가 수분함량 55% 이상부터는 급격히 증가하는 모습을 보여 최대의 포자수를 획득하면서 총세균수를 최소화 할수 있는 최적조건이 수분함량 50%임을 확인할 수 있었다.
본 최적조건인 수분함량 50%에서의 포자수(2.0×109 cfu/g)와 총세균수(7 cfu/g)는 기사용 국균 배양시의 포자수(1.6×109 cfu/g)과 총세균수(10 cfu/g 미만)와 비교하여 포자수에서 약 25% 향상된 것이다(도 3).
(3) 고 알코올 생성 효모 분리 및 특성분석
(가) 1st screening - 알코올 생성능
효모는 에탄올을 포함하여 다양한 알코올성분을 생성하는 것으로 알려져 있고 이러한 알코올 성분은 향을 부여하면서도 일반세균의 증식을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이에 NaCl 8%를 함유한 Yeast modified agar(YM)배지에서 24, 48, 72시간 배양하면서 Ethanol과 Glucose함량을 측정하여 표 6과 같이 ethanol 생성능이 우수한 효모 Y2-1, Y2-3, Y3-3, Y4-1, Y8-3을 1차적으로 선별하였다.
하기 표 6은 효모 균주별 배양시간에 따른 Ethanol 생성량 및 Glucose 소진량 에 관한 것이다.
| 균주명 | 24 hr | 48 hr | 72 hr | |||
| Ethanol (%) |
Glucose (%) |
Ethanol (%) |
Glucose (%) |
Ethanol (%) |
Glucose (%) |
|
| Y2 -1 | 2.25 | 14.4 | 6.46 | 5.50 | 6.95 | 4.19 |
| Y2 -3 | 3.36 | 12.0 | 7.35 | 3.80 | 7.80 | 2.68 |
| Y3 -3 | 3.38 | 11.8 | 5.97 | 4.20 | 6.57 | 3.39 |
| Y4 -1 | 4.01 | 11.0 | 7.56 | 3.80 | 8.06 | 2.44 |
| Y6-2 | 1.55 | 15.8 | 1.70 | 15.0 | 2.88 | 12.53 |
| Y8-1 | 1.51 | 15.6 | 2.01 | 14.8 | 2.95 | 13.00 |
| Y8 -3 | 2.58 | 13.6 | 6.40 | 4.50 | 6.95 | 4.13 |
(나) 2nd screening - 산막생성 및 Ethanol 생성능
1차 선별된 효모를 NaCl 함량이 8% 및 16%인 간장덧에 1%씩 접종하고 30℃에서 한 달간 발효시킨 후 간장덧내의 산막발생여부와 Ethanol 함량을 측정하였다. 표 7과 같이 Y2-1, Y2-3, Y4-1 균주가 가장 높은 Ethanol 생성능을 나타내었다.
하기 표 7은 효모 균주별 간장덧에서의 Ethanol 생성능 및 산막생성여부 에 관한 것이다.
| 균 주 명 | 간장덧(NaCl 8%) | 간장덧(NaCl 16%) | ||
| Ethanol(%) | 산막 생성여부 | Ethanol(%) | 산막 생성여부 | |
| Y2 -1 | 1.28 | X | 0.61 | X |
| Y2 -3 | 1.40 | X | 0.88 | X |
| Y3-3 | 1.17 | O | 0.19 | O |
| Y4 -1 | 1.42 | X | 0.80 | X |
| Y8-3 | 1.20 | O | 0.17 | O |
(다) 3rd Screening - 관능특성
앞서 선별된 효모 3종(Y2-1, Y2-3, Y4-1)을 각각 NaCl 함량이 16%인 간장덧에 1%씩 접종하고 30℃에서 한달 간 발효 시킨 후 간장덧의 관능평가를 수행하였다. 표 8과 같이 각각의 효모 균주별 향미특성을 관능평가로 확인하였다. 특성강도 분석에서 단향이 강하고 화학약품향과 신향이 약하게 나타났으며 묘사분석에서 향긋한 향을 발생시킨 Y4-1 균주를 최종적으로 선별하였다.
하기 표 8은 효모 균주별 간장덧의 관능특성 에 관한 것이다.
| 구 분 | Y2-1 | Y2-3 | Y4 -1 | 유의수준 | |
| 특성 강도* |
알코올향 | 7.2 | 7.7 | 7.6 | 0.75 |
| 화학약품향 | 5.1b | 6.8a | 5.2b | 0.05 | |
| 콩향 | 6.8 | 6.5 | 6.2 | 0.62 | |
| 단향 | 6.0b | 5.2c | 6.8a | 0.03 | |
| 신향 | 4.8b | 6.1a | 4.7b | 0.04 | |
| 쿰쿰함 | 5.5 | 5.7 | 5.8 | 0.85 | |
| 짠맛 | 8.8 | 8.5 | 8.7 | 0.99 | |
| 단맛 | 7.7 | 7.2 | 7.3 | 0.92 | |
| 신맛 | 5.6 | 6.1 | 5.6 | 0.71 | |
| 감칠맛 | 5.6 | 5.7 | 5.1 | 0.81 | |
| 콩향미 | 7.5 | 7.2 | 7.1 | 0.80 | |
| 쓴맛 | 5.7 | 5.6 | 5.4 | 0.91 | |
| 아린정도 | 5.7 | 5.4 | 5.8 | 0.72 | |
| 묘 사 분 석 | 달콤한 향 | 쉰내와 약품향이 강함. | 향긋한 향 | - | |
* 15점 척도: 강도(1점 매우약하다, 8점 적당하다, 15점 매우강하다)
평가 대상: 식품 연구원 10명
a, b, c : 유의적 차이 (p<0.05)
(4) 유기산 생성 미생물 분리 및 특성분석
(가) 1st screening - Histidine decarboxylase 생성능 및 내염성
발효식품에서 발견되는 Biogenic amine은 체내에서 신경전달물질로서 직간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류등의 심혈관계에 영향을 미치는 것으로 알려져 있고 미국과 유럽에서는 식품내의 Biogenic amine 함량을 규제하는 경우가 있다. 국내에서도 발효식품내의 Biogenic amine 저감화에 대한 노력이 각계에서 진행 중에 있다. Biogenic amine은 화학구조에 의해 지방족화합물(putrescine, cadaverine, agmatine, spermine, spermidine), 방향족화합물(tyramine, 2-phenylethylamine), 헤테로환상화합물(histamine, tryptamine)로 나눌 수 있다. 이 중 histamine과 tyramine은 널리 알려진 Biogenic amine으로 식약청에서는 histamine을 기준으로 500ppm 이하의 가이드 라인을 제시하고 있다.
유산균이 생성하는 decarboxylase는 아미노산을 Biogenic amine으로 전환시키는 효소로 Decarboxylase 활성이 낮을수록 발효식품내의 Biogenic amine 함량이 낮아지게 된다. 이에 안전한 발효식품을 제조하기 위해서 Decarboxyase 활성이 낮으면서 고염상태에서도 생육 가능한 유산균을 선별하였다. Histidine decarboxylase 활성은 도 4.와 같이 Decarboxylating agar 배지에서 붉은 색상을 나타낼 경우 Histidine decarboxylase 생성능이 있고 노란색을 나타낼 경우 Histidine decarboxylase 생성능이 없는 것으로 간주하였다(도 4 참조).
표 9에서와 같이 고염상태에서의 생육이 가능하면서도 Histidine decarboxylase 생성능이 없는 L1-1, L3-2, L4-1, L5-1, L5-2, L6-1, L6-2, L7-2, L9-2, L9-3 균주를 1차적으로 선별하였다.
하기 표 9는 Histidine decarboxylase 생성능 및 내염성 측정 에 관한 것이다.
| 균주번호 | 생육 가능 여부 | Histidine decarboxylase 생성능 | ||
| MRS (5% NaCl) |
MRS (10% NaCl) |
MRS (15% NaCl) |
||
| L1 -1 | + | + | + | - |
| L1-2 | + | + | + | + |
| L1-3 | + | + | + | + |
| L1-4 | + | + | - | - |
| L2-1 | + | - | - | + |
| L2-2 | + | + | + | + |
| L2-3 | + | + | - | - |
| L3-1 | + | + | + | + |
| L3 -2 | + | + | + | - |
| L4 -1 | + | + | + | - |
| L5 -1 | + | + | + | - |
| L5 -2 | + | + | + | - |
| L6 -1 | + | + | + | - |
| L6 -2 | + | + | + | - |
| L6-3 | + | + | - | - |
| L7-1 | + | + | + | + |
| L7 -2 | + | + | + | - |
| L9 -2 | + | + | + | - |
| L9 -3 | + | + | + | - |
(나) 2nd screening -유기산 생성능 & 산막생성 억제
간장덧은 대두를 주원료한 곰팡이발효물에 염수를 첨가하여 제조한 것으로 염분함량이 높고 다량의 고형물을 포함하고 있어 맛내기소재의 중간산물과 그 특성이 유사하다. 이에, 간장덧에서 유기산생성능이 우수한 균주를 선별하는 것이 일반 배지상에서의 생육시간에 따른 유기산 생성정도를 측정하는 것보다 유기산생성능이 높은 균주를 선별하기에 더욱 적합한 방법이라고 사료되어 협약시 계획했던 유산균의 growth time에 따른 유기산 생성 정도 측정에서 간장덧을 이용한 유기산생성능 선별실험으로 변경하였다.
Acetic acid의 과도한 생성은 강한 신맛으로 인해 부정적인 기호를 나타내는 것으로 알려져 있다. 반면 Lactic acid는 적당한 산미를 부여하면서도 오염미생물들의 생육을 억제하는 효과가 있어 긍정적으로 받아들여지고 있다.
본 실험에서는 1차 선별된 유산균을 NaCl 함량이 16%인 간장덧에 1%씩 접종하고 30℃에서 한달 간 발효 시킨 후 간장덧내의 유기산(lactic acid, acetic), Biogenic amine (histamine, tyramine) 함량을 측정하여 Lactic acid 함량이 높고 Acetic acid 함량이 낮으며 산막 형성을 억제한 것으로 보이는 L1-2, L3-2, L5-1, L5-2 균주를 선별하였다.
하기 표 10은 유산균별 간장덧에서의 품질변화 에 관한 것이다.
| 균주번호 | pH | Organic acid(ppm) | Biogenic amine(ppm) | 산막생성 억제여부 |
||
| Lactic acid | Acetic acid | Histamine | Tyramine | |||
| L1 -1 | 5.4 | 9,061 | 3,126 | 12.7 | 4.5 | O |
| L3 -2 | 4.9 | 8,045 | 2,254 | 20.6 | 8.9 | O |
| L4-1 | 5.5 | 154 | 412 | 14.8 | 10.3 | X |
| L5 -1 | 5.4 | 7,012 | 2,458 | 16.8 | 9.9 | O |
| L5 -2 | 4.8 | 11,875 | 6,120 |
8.5
|
7.9
|
O |
| L6-1 | 5.5 | 624 | 421 | 14.6 |
11.6 |
X |
| L6-2 | 5.5 | 978 | 741 | 7.8 |
10.9 |
X |
(다) 3rd screening - 관능특성
앞서 선별된 유산균 4종(L1-2, L3-2, L5-1, L5-2)을 각각 NaCl 함량이 16%인 간장덧에 1%씩 접종하고 30℃에서 한달 간 발효 시킨 후 간장덧의 관능평가를 수행하였다. 표 11과 같이 각각의 유산균에 의한 향미특성을 확인하였고 이중 콩향/콩향미가 강하면서도 화학약품향과 쿰쿰함이 가장적은 L1-2 균주를 최종적으로 선별하였다.
하기 표 11은 유산균별 간장덧의 관능특성(특성강도분석*)에 관한 것이다.
| 구 분 | L1 -2 | L3-2 | L5-1 | L5-2 | 유의수준 |
| 알코올향 | 5.3 | 5.6 | 5.5 | 5.2 | 0.92 |
| 화학약품향 | 5.1c | 6.8a | 5.1c | 6.0b | 0.05 |
| 콩향 | 7.8a | 7.5a | 5.2c | 6.6b | 0.02 |
| 단향 | 6.5 | 6.2 | 6.8 | 6.8 | 0.67 |
| 신향 | 4.8 | 5.1 | 4.5 | 4.7 | 0.83 |
| 쿰쿰함 | 5.7c | 6.8a | 5.3c | 6.1b | 0.05 |
| 짠맛 | 8.4 | 8.2 | 8.5 | 8.7 | 0.78 |
| 단맛 | 7.4 | 7.6 | 7.6 | 7.2 | 0.58 |
| 신맛 | 5.8 | 6 | 5.6 | 5.7 | 0.51 |
| 감칠맛 | 5.6 | 5.7 | 6.1 | 6.2 | 0.21 |
| 콩향미 | 8.1a | 8.2a | 7.2b | 7.6ab | 0.04 |
| 쓴맛 | 5.5 | 5.5 | 5.4 | 5.6 | 0.91 |
| 아린정도 | 6.4 | 6.5 | 6.3 | 6.5 | 0.92 |
* 15점 척도: 강도(1점 매우약하다, 8점 적당하다, 15점 매우강하다),
평가 대상: 식품 연구원 10명
a, b, c : 유의적 차이 (p<0.05)
나. 1차 맛내기(깔끔한 맛) 소재 제조를 위한 기술개발 및 최적 발효조건 확립
(1) 단백분해조건 설정 및 최적화
맛내기 소재의 단백질 함량에 영향을 줄 수 있는 대두와 염수의 사용비율, 염분함량, 숙성기간을 3가지 중요 인자로 설정하였고 표 12과 같이 각각의 인자별 처리조건으로 완전요인실험을 수행하였다.
하기 표 12는 실험설계-3인자 완전요인실험 에 관한 것이다.
| 요 인 | 수준수 | 처리조건 |
| 대두와 염수의 사용비율 | 3 | 1:1.4, 1:1.3, 1:1.2 |
| 염분함량(%) | 2 | 21%, 16% |
| 숙성기간 | 3 | 1개월, 2개월, 3개월 |
완전요인실험의 결과는 표 13에서 보는바와 같다. 맛내기 소재의 이화학적 목표수준인 TN=1.5 이상, AN=0.9 이상, Color(O.D500)=3.0 이하를 만족시킬 수 있는 조건은 원료비=1:1.3, 염분농도=16%, 3개월 숙성했을 경우와 원료비=1:1.2, 염수농도=16%, 3개월 숙성했을 경우 2가지였다. 그러나 첫 번째 조건에서(원료비=1:1.3, 염분농도=16%, 3개월 숙성)의 맛내기 소재의 O.D500=2.1로 색상이 밝고 질소이용률이 82.7%로 높은데 반해, 두 번째 조건(원료비=1:1.2, 염분농도=16%, 3개월 숙성)에서는 O.D500=2.7 로 어둡고 질소이용률이 79.9%로 낮았기에 첫 번째 조건(원료비=1:1.3, 염수농도=16%, 3개월)이 최적 조건임을 확인할 수 있었다.
하기 표 13은 원료비, 염분농도, 숙성기간에 따른 일반성분 변화 분석 결과 에 관한 것이다.
| 원료비 (대두:염수) |
염분 함량 (%w/v) |
숙성 기간 (월) |
일반성분 | 질소 이용률 (%) |
|||
| TN (%) |
AN (%) |
pH | Color (O.D500) |
||||
| 1:1.4 | 21 | 1 | 1.22±0.05 | 0.59±0.11 | 5.34±0.01 | 1.2±0.02 | 69.17 |
| 2 | 1.28±0.04 | 0.73±0.08 | 5.30±0.01 | 1.5±0.02 | 72.91 | ||
| 3 | 1.32±0.03 | 0.79±0.05 | 5.27±0.00 | 1.6±0.04 | 74.84 | ||
| 16 | 1 | 1.29±0.06 | 0.71±0.09 | 5.31±0.00 | 1.3±0.02 | 71.63 | |
| 2 | 1.38±0.03 | 0.78±0.07 | 5.23±0.01 | 1.5±0.03 | 77.48 | ||
| 3 | 1.46±0.03 | 0.82±0.07 | 5.21±0.01 | 1.8±0.04 | 82.89 | ||
| 1:1.3 | 21 | 1 | 1.26±0.06 | 0.62±0.08 | 5.35±0.00 | 1.5±0.03 | 69.06 |
| 2 | 1.31±0.04 | 0.73±0.11 | 5.30±0.00 | 1.8±0.02 | 72.14 | ||
| 3 | 1.35±0.03 | 0.79±0.05 | 5.26±0.01 | 2.0±0.04 | 73.29 | ||
| 16 | 1 | 1.33±0.04 | 0.78±0.03 | 5.35±0.01 | 1.6±0.02 | 71.51 | |
| 2 | 1.43±0.03 | 0.85±0.04 | 5.22±0.01 | 1.9±0.04 | 77.33 | ||
| 3 | 1.52±0.02 | 0.92±0.03 | 5.19±0.01 | 2.1±0.03 | 82.67 | ||
| 1:1.2 | 21 | 1 | 1.29±0.05 | 0.65±0.07 | 5.37±0.01 | 1.9±0.03 | 66.42 |
| 2 | 1.36±0.06 | 0.77±0.06 | 5.33±0.01 | 2.1±0.03 | 70.36 | ||
| 3 | 1.39±0.05 | 0.83±0.03 | 5.29±0.02 | 2.4±0.03 | 71.92 | ||
| 16 | 1 | 1.37±0.04 | 0.80±0.08 | 5.34±0.01 | 2.1±0.03 | 68.99 | |
| 2 | 1.47±0.03 | 0.88±0.05 | 5.23±0.02 | 2.4±0.03 | 74.89 | ||
| 3 | 1.55±0.06 | 0.94±0.07 | 5.20±0.01 | 2.7±0.04 | 79.91 | ||
(2) 효모/유산균 발효조건 설정 및 최적화
맛내기 소재 제조시 앞서 분리한 우량미생물(효모, 유산균)에 의한 발효조건을 설정하기 위해 효모와 유산균 발효를 동시 혹은 각각 진행한 후 이화학 및 관능적 특성을 확인해본 결과 효모와 유산균을 동시에 발효 시켰을 때 관능적으로 우수하면서도 색상이 밝아 가장 적합한 맛내기 소재를 제조할 수 있음을 확인하였다.
(가) 관능평가
[특성강도 조사]
맛내기 소재 제조시 앞서 분리한 우량미생물(효모, 유산균)에 의한 발효조건을 설정하기 위해 효모와 유산균 발효를 동시 혹은 각각 진행한 후 관능적 특성을 확인해본 결과, 도 5과 표 14와 같이 내염성미생물 발효를 진행하지 않은 맛내기 소재(실험구 1)의 경우 콩향/콩향미가 약한 특성을 나타내었고 효모발효를 진행한 맛내기 소재(실험구 2)의 경우는 알코올향과 약품향이 강한 것으로 나타났다. 그리고 유산균발효를 진행한 맛내기 소재(실험구 3)의 경우는 콩향/콩향미, 단향, 쿰쿰함이 강하면서 알코올과 화학약품향이 약한 특징을 나타내었다. 또한 효모발효와 유산균발효를 동시에 진행한 맛내기 소재(실험구 4)의 경우는 콩향/콩향미, 단향이 강하게 나타나 효모발효 맛내기 소재(실험구 2)와 유산균발효 맛내기 소재(실험구 3)의 중간정도의 특성을 나타내었다.
상기와 같은 관능특징을 통해 긍정적 요소인 콩향/콩향미, 단향이 강하면서도 비교적 화학약품향이 약한 것으로 나타난 실험구의 발효조건(유산균과 효모발효 동시수행)을 최종적으로 설정 하였다(도 5).
하기 표 14는 효모/유산균 발효 실험구의 관능특성(특성강도*) 에 관한 것이다.
| 구 분 | 무첨가 | 효모 | 유산균 | 효모+유산균 | 유의수준 |
| 알코올향 | 6.3b | 6.9a | 5.5c | 6.2ab | 0 |
| 화학약품향 | 6.0b | 6.8a | 5.1c | 5.8bc | 0 |
| 콩향 | 5.8b | 5.5b | 7.2a | 7.6a | 0 |
| 단향 | 6.5ab | 5.9b | 6.9a | 6.8a | 0.02 |
| 신향 | 5.2 | 4.8 | 4.5 | 5 | 0.23 |
| 쿰쿰함 | 5.7b | 5.9b | 7.3a | 6.6ab | 0 |
| 짠맛 | 8.5 | 8.1 | 8 | 8.7 | 0.28 |
| 단맛 | 6.4 | 6.7 | 6.5 | 6.1 | 0.5 |
| 신맛 | 5.1 | 6 | 5.6 | 5.7 | 0.1 |
| 감칠맛 | 6.6 | 6.9 | 7.2 | 7.2 | 0.21 |
| 콩향미 | 6.3c | 7.1b | 8.0a | 7.5 ab | 0 |
| 쓴맛 | 6.5 | 6.4 | 6.2 | 6.5 | 0.91 |
| 아린정도 | 6.9 | 6.5 | 6.6 | 6.9 | 0.6 |
| 풍미 | 6.9 | 7.5 | 7.3 | 7.2 | 0.58 |
* 15점 척도: 강도(1점 매우약하다, 8점 적당하다, 15점 매우강하다)
평가대상 : 일반소비자 관능패널 20명
a, b, c : 유의적 차이 (p<0.05)
(나) 이화학분석
우량미생물(효모, 유산균)에 의한 발효 맛내기 소재의 이화학적 특성을 조사한 결과, 도 6에서와 같이 TN함량에서는 각 발효조건에 따른 차이는 없었으나 pH(도 7), 유기산(표 15), 아미노산(표 16) 분석에 있어서는 차이가 발생하였다.
발효 맛내기 소재의 TN은 효모/유산균 발효조건과는 무관하게 모두 동일수준으로 확인되었고 모든 실험구가 목표치인 1.5 이상인 1.6수준임을 확인하였다.
도 7과 같이 발효 1개월차 까지는 모든 실험구의 pH가 유사하였으나 1개월 이후 부터는 유산균발효를 수행한 실험구(실험구 3, 4)의 pH가 유산균발효를 수행하지 않은 실험구에 비해 낮게 나타났다. 이와 같이 유산균발효를 수행한 실험구의 pH가 더 낮은 이유는 표 15.의 유기산 분석 DATA를 참고해 볼 때 Lactic acid와 Acetic acid의 증가에 의한 것으로 판단되었다(도 6 및 7).
유기산을 분석한 결과는 표 15와 같다. Citric acid는 유산균발효를 수행한 실험구(실험구 3, 4)의 경우 7,676～7,751 ppm인 반면 유산균발효를 수행하지 않은 실험구(실험구 1, 2)는 11,220～11,311 ppm으로 유산균발효를 수행하면 Citric acid 함량이 약 30%정도 감소됨을 확인 할 수 있었다. Lactic acid는 유산균발효를 수행한 실험구(실험구 3, 4)가 9,701～9,787 ppm인 반면 유산균발효를 수행하지 않은 실험구(실험구 1, 2)는 불검출로 발효 맛내기 소재의 Lactic acid는 유산균발효에 의해 생성됨을 확인하였다. 또한, Acetic acid는 유산균발효를 수행한 실험구(실험구 3, 4)의 경우 2,457～2,803 ppm인 반면 유산균발효를 수행하지 않은 실험구(실험구 1, 2)는 824～835 ppm으로 약 0.16～0.2%가 높게 검출됨을 확인하였다.
하기 표 15은 효모/유산균 발효 실험구간의 유기산 함량 에 관한 것이다.
| 구 분 | 발효조건 | 유기산(ppm) | |||||
| 효모 발효 |
유산균 발효 |
Citric acid | Succinic acid | Malic acid | Lactic acid | Acetic acid | |
| 실험구1 | X | X | 11,220 | 5,479 | 4,838 | 불검출 | 824 |
| 실험구2 | O | X | 11,311 | 5,476 | 4,203 | 불검출 | 835 |
| 실험구3 | X | O | 7,751 | 5,321 | 13,747 | 9,701 | 2,803 |
| 실험구4 | O | O | 7,676 | 4,657 | 5,877 | 9,787 | 2,457 |
유리아미노산 조성상 모든 실험구의 유리아미노산 조성이 거의 동일함을 알 수 있었다. 그러나 Arginine의 경우 유산균발효를 수행한 실험구(실험구3, 실험구4)에서 유산균발효 수행하지 않은 실험구(실험구1, 실험구2)에 비해 소폭 낮음을 확인하였고 이는 유산균 Tetragenococcus halophillus 가 Arginine 에 대한 대사능력이 있는 것으로 알려져 있음을 볼 때 이에 기인한 것으로 판단되었다.
하기 표 16은 효모/유산균 발효 실험구간의 유리 아미노산 조성 에 관한 것이다.
| 구 분 | 유리 아미노산 함량(%) | 비 고 | |||
| 실험구1 (무첨가) |
실험구 2 (효모발효) |
실험구 3 (유산균발효) |
실험구 4 (효모&유산균) |
||
| ASP | 0.95 | 0.93 | 0.86 | 0.90 | |
| THR | 0.41 | 0.41 | 0.40 | 0.41 | |
| SER | 0.56 | 0.55 | 0.54 | 0.54 | |
| GLU | 1.41 | 1.30 | 1.26 | 1.26 | |
| PRO | 0.34 | 0.33 | 0.33 | 0.34 | |
| GLY | 0.33 | 0.32 | 0.31 | 0.31 | |
| ALA | 0.44 | 0.43 | 0.47 | 0.45 | |
| CYS | 0.07 | 0.06 | 0.07 | 0.08 | |
| VAL | 0.57 | 0.56 | 0.55 | 0.56 | |
| MET | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | |
| ILE | 0.44 | 0.48 | 0.47 | 0.48 | |
| LEU | 0.74 | 0.72 | 0.72 | 0.74 | |
| TYR | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| PHE | 0.42 | 0.41 | 0.40 | 0.41 | |
| HIS | 0.28 | 0.27 | 0.27 | 0.28 | |
| LYS | 0.61 | 0.60 | 0.61 | 0.62 | |
| ARG | 0.32 | 0.34 | 0.06 | 0.06 | 유산균발효시 감소경향 |
| 합계(%) | 8.09 | 7.93 | 7.52 | 7.65 | |
하기 표 17은 효모/유산균 발효 실험구간의 총 아미노산 조성 에 관한 것이다.
| 구 분 | 총 아미노산 함량(%) | 비 고 | |||
| 실험구 1 (무첨가) |
실험구 2 (효모발효) |
실험구 3 (유산균발효) |
실험구 4 (효모&유산균) |
||
| ASP | 1.33 | 1.31 | 1.24 | 1.25 | |
| THR | 0.44 | 0.44 | 0.43 | 0.43 | |
| SER | 0.59 | 0.59 | 0.58 | 0.58 | |
| GLU | 2.04 | 2.01 | 1.97 | 1.94 | |
| PRO | 0.48 | 0.48 | 0.47 | 0.48 | |
| GLY | 0.44 | 0.44 | 0.43 | 0.43 | |
| ALA | 0.47 | 0.46 | 0.50 | 0.47 | |
| CYS | 0.06 | 0.07 | 0.08 | 0.09 | |
| VAL | 0.57 | 0.57 | 0.55 | 0.55 | |
| MET | 0.13 | 0.13 | 0.13 | 0.13 | |
| ILE | 0.50 | 0.49 | 0.49 | 0.48 | |
| LEU | 0.74 | 0.73 | 0.73 | 0.72 | |
| TYR | 0.08 | 0.08 | 0.07 | 0.07 | |
| PHE | 0.43 | 0.43 | 0.43 | 0.41 | |
| HIS | 0.34 | 0.34 | 0.32 | 0.32 | |
| LYS | 0.66 | 0.65 | 0.65 | 0.63 | |
| ARG | 0.34 | 0.36 | 0.08 | 0.08 | 유산균발효시 감소경향 |
| 합계(%) | 9.66 | 9.57 | 9.16 | 9.07 | |
효모/유산균 발효여부와 상관없이 표 18.과 같이 Biogenic amine의 함량이 40ppm 이하로 극미량만이 검출되어 안전성이 확보됨을 확인할 수 있었다. Biogenic amine은 주로 유산균에 의해 생성되는 것으로 알려져 있는데 본 발효 맛내기 소재에 사용된 유산균은 Decarboxylase 활성이 없는 균주를 screening 한 것으로 Biogenic amine 생성능이 없음을 다시 한 번 확인할 수 있었다.
하기 표 18은 효모/유산균 발효 실험구간별 Biogenic amine 분석 에 관한 것이다.
| 구 분 | 미생물첨가유무 | Biogenic amines(ppm) | ||
| 효모 | 유산균 | Histamine | Tyramine | |
| 실험구1 | X | X | 2.51 | 1.34 |
| 실험구2 | O | X | 2.4 | 1.65 |
| 실험구3 | X | O | 3.72 | 2.66 |
| 실험구4 | O | O | 3.26 | 4.94 |
(3) 발효 맛내기 소재 관능평가 실시를 통한 제품 적합성 조사
앞서 설정된 단백분해조건과 효모/유산균 발효조건으로 제조한 발효 맛내기 소재의 관능평가를 시행하고 소비자의 구매의사를 확인하였다. 표 19과 같이 소비자 72명을 대상으로 진행한 결과 만족도점수가 3.9점으로 매우 높은 높았고 매우 좋음과 좋음이라고 평가한 비율이 각각 17%, 62%로 전체 응답자의 79%가 긍정적 평가를 했고 단지 7%만이 부정적 평가를 하여 전체적으로 매우 높은 만족도를 보여주었다.
또한, 가열요리와 비가열요리로 나누어 만족도를 조사한 결과(표 20), 요리 type에 상관없이 전반적 만족도가 3.8점으로 높은 점수를 보여주었으며 외관기호도, 맛 기호도, 짠맛, 감칠맛, 단맛, 구수한맛에서 차이가 없음을 보여주었다. 이로서 본 발효 맛내기 소재의 경우 가열요리와 비가열 요리 모두에 적합한 소재임을 확인하였다.
소비자의 구입의사를 조사한 결과(표 21), 구입의사가 3.7점으로 만족도와 동일하게 높게 조사되었으며 평가자의 65%가 구매하겠다고 하여 매우 긍정적인 평가를 받았다.
하기 표 19는 발효 맛내기 소재의 소비자 만족도 조사 결과 에 관한 것이다.
| 평가자수 | 전반적 만족도 | 응답비율(%) | |||
| 좋지 않음 | 보통 | 좋음 | 매우 좋음 | ||
| n=72 | 3.9 | 7 | 13 | 62 | 17 |
하기 표 20은 발효맛내기 소재를 적용한 요리Type별 만족도 및 특성강도조사 결과 에 관한 것이다(n=72).
| 요리형태 | 전반적 만족도 |
응답비율(%) | 기호도 | 긍정도 | |||||||
| 좋지 않음 |
보통 | 좋음 | 매우좋음 | 외관 | 맛 | 짠맛 | 감칠맛 | 단맛 | 구수 한맛 |
||
| 가열 요리 |
3.8 | 3 | 26 | 62 | 9 | 3.7 | 3.8 | 3.5 | 3.8 | 3.5 | 3.8 |
| 비가열 요리 | 3.8 | 9 | 25 | 45 | 22 | 3.8 | 3.8 | 3.7 | 3.8 | 3.6 | 3.6 |
| 유의수준 | 0.83 | - | - | - | - | 0.28 | 0.70 | 0.19 | 0.87 | 0.92 | 0.64 |
하기 표 21은 발효 맛내기 소재의 소비자 구입의사 조사 결과 에 관한 것이다.
| 평가자수 | 구입의사 | 응답비율(%) | ||||
| 구매안함 | 아마도 비구매 |
반반임 | 아마도 구매 |
꼭 구입 | ||
| n=72 | 3.7 | 1 | 12 | 22 | 48 | 17 |
(4) 발효 맛내기 소재의 이화학적 분석
발효 맛내기 소재의 이화학적 분석 결과는 표 22과 같다. 목표수준이었던 TN 1.5% 보다 0.2%가 높은 1.7%수준이었으며, AN의 경우 목표수준이었던 0.9%보다 0.13%가 높은 1.03%로 나타났다. 또한 Color(O.D500)의 목표수준인 3.0 이하를 모두 만족시킴을 확인할 수 있었다.
하기 표 22는 맛내기 소재의 이화학적 분석 결과 에 관한 것이다.
| 항 목 | 분 석 치 | 비 고 |
| TN(%) | 1.7 | 목표수준 = 1.5% 이상 |
| AN(%) | 1.03 | 목표수준 = 0.9% 이상 |
| pH | 5.0 | |
| Color(O.D500) | 2.05 | 목표수준 = 3.0 이하 |
| 환원당(%) | 0.27 | |
| 총당(%) | 1.13 |
다. 1차 맛내기(깔끔한 맛) 소재의 Scale-up 및 표준화
(1) 대량 생산 시스템 구축 및 최적화
(가) 대량생산시의 제조공정 및 문제점
Plant scale에서의 맛내기 소재를 제조하기 위해 도 8.과 같이 대두 30,000kg을 증자하여 곰팡이발효(고상발효)를 수행하고 여기에 미리 제조된 염수, 효모배양액, 유산균배양액을 투입한 후 100KL 탱크에서 단백분해/미생물발효를 3개월 동안 수행하고 이를 압착/여과시켜 최종적으로 1차 맛내기 소재를 제조하였다.
Plant scale은 Lab scale과 비교하여 규모가 약 100～300배정도로 크기 때문에 반복수행이 어려워 대량 생산시에 발생할 수 있는 문제를 미리 예측하여 해결하는 것이 중요하다.
대량 생산시의 발생할 수 있는 문제점으로는 그 규모가 크기 때문에 각 공정의 처리시간이 길어질 수 있다. 그러므로 각각의 공정처리시간을 최대한 단축시키는 점이 중요하다. 대두 30톤을 사용할 경우에는 최단시간에 원료를 가수하고 증자한 후 이송시켜 다음공정으로 전환을 해야만 미생물오염으로 인한 품질저하 및 생산효율 감소를 막을 수 있다.
또한, Plant scale에서는 균질화와 이물 제거가 매우 중요한 부분이다. 이에 각 공정별로 효과적으로 균질화 할 수 있는 방법과 이물을 제거할 수 있는 방법을 고안하고 적용하여 품질의 안정성 및 안전성을 도모해야 한다.
이에, 대량생산시스템을 구축하기 위해 맛내기 소재 제조공정을 대두전처리, 염수제조, 단백분해/미생물발효, 압착/여과공정으로 구분한 후 각 공정별로 처리속도증진, 균질화, 이물제거를 위한 방법을 고안 및 적용하였다(도 8).
(나) 대두 전처리
대두를 침지할 경우 수분 흡수를 위해서 많은 시간이 소요되고 배치식(Batch type)으로 작업을 해야 하므로 생산성이 떨어지게 된다. 이에 수분흡수의 시간을 단축시키고 연속식(Continuous type)으로 작업을 하기 위해 대두를 압편 후 분사노즐을 통해 물을 골고루 살수시켜 단시간에 대두가 물을 흡수할 수 있도록 하였다. 그리고 열처리시간의 단축을 위해 고온에서 단시간 증자를 수행하였다. 열처리된 대두는 자체 배양한 국균을 골고루 접종 및 혼합 한 후 고체발효실에서 42시간동안 곰팡이 발효를 진행하였다. 그리고 발효물의 수분증발을 막기 위해 발효실내의 습도는 90% 이상을 유지시켰으며 발효과정중의 곰팡이 균사체의 뭉침 현상과 상하층부의 비균질성을 해소하기 위해 발효물을 부분적으로 파쇄 및 혼합하였다.
하기 표 23는 대두전처리시의 LAB 및 Plant 조건 비교 에 관한 것이다.
| 구 분 | Lab scale 조건 | Plant scale 조건 | 비 고 |
| 대두 가공 | 없음 | 압편 | 대두 압편을 통한 수분흡수 속도 향상 |
| 가수방법 | 배치식 침지 |
연속식 살수 |
시간당 처리량 증대 |
| 열처리 조건 | 배치식 120℃ 30～40 min |
연속식 135℃(2kgf/cm2), 5～10 min |
시간당 처리량 증대 |
(다) 단백분해/미생물 발효
상기 조건과 같이 제조된 곰팡이 발효물(대두), 염수, 효모배양액, 유산균 배양액을 혼합하여 100KL 용량의 발효탱크로 이송 시킨 후 3개월 동안 적정온도를 유지시켜 대두단백질의 분해와 내염성 미생물의 발효를 원활하도록 유도하였다.
곰팡이 발효물은 곰팡이의 균사체로 인해 뭉침현상이 발생하고 이로 인해 염수가 곰팡이 발효물내로의 침투시간이 지연되는 현상이 발생한다. 이에 염수가 곰팡이 발효물내로의 신속하게 침투할 수 있도록 하기 위해 파쇄기를 적용하여 뭉쳐진 곰팡이 발효물을 풀어 주었고 또한 곰팡이 발효물은 비중이 낮아 염수상층부에 떠오르는 현상이 발생하기에 폭기장치를 적용하여 발효탱크 하단에서 공기를 불어 넣음으로서 곰팡이 발효물과 염수가 균질하게 혼합될 수 있도록 유도하였다.
하기 표 24는 단백분해/미생물 발효시의 LAB 및 Plant 조건 비교 에 관한 것이다.
| 구 분 | Lab scale 조건 | Plant scale 조건 | 비 고 |
| 곰팡이 발효물 전처리 |
수작업으로 파쇄 | 파쇄기 적용 | 염수의 곰팡이 발효물내로의 신속한 침투를 유도. |
| 균질화 | 수작업으로 진행 | 폭기장치 적용 | 균질화를 통한 품질 안정화 |
(라) 압착 및 여과
단백분해 및 미생물발효과정을 거친 중간산물은 페이스트 상태로 이로부터 청징한 발효 맛내기 소재를 효과적으로 분리하기 위해 1차적으로 가압여과 공정을 적용하여 발효 맛내기 소재의 생산량 및 공정처리속도를 증대시키고 2단계로 Micro Filteration를 통해 맑고 청징한 발효 맛내기 소재를 확보함과 동시에 이물제거 효과를 통해 안전성을 증대하였다.
하기 표 25은 압착/여과시의 LAB 및 Plant 조건 비교 에 관한 것이다.
| 구 분 | Lab scale 조건 | Plant scale 조건 | 비 고 |
| 압착/여과 | - 1단계 : 자연여과 Filter paper NO.4 - 2단계 : 없음 |
- 1단계 : 가압여과 Filter press 적용 - 2단계 : Micro Filteration (pore size = 0.1 ㎛ ) |
가압여과를 통한 수율 및 처리속도 향상 2단계 공정으로 시간당 처리량 증대 Micro Filteration 적용을 통한 안전성 증대 |
(2) Scale-up 시제품 분석 및 보안
(가) 이화학적 분석 결과
Plant scale에서 제조된 1차 맛내기 소재의 일반분석을 수행한 결과는 표 27과 같다. TN은 목표기준인 1.5%보다 약 0.13%가 높은 1.63%를 나타내었고 AN은 목표기준인 0.9%보다 0.15%가 높은 1.05%를 달성하였다. 또한 Color의 경우 목표기준인 O.D500 = 3.0 이하보다 훨씬 낮은 1.46로 분석되어 전체적으로 1차 맛내기 소재(1차 콩발효맛내기 소재)는 TN과 AN이 높아 맛이 풍부하면서도 색상은 매우 밝아 다양한 식품 및 요리에 적용 가능한 소재로 분석되었다.
하기 표 26은 Scale-up 시제품의 이화학적 분석 결과 에 관한 것이다.
| 구 분 | 분 석 치 | 비 고 |
| TN(%) | 1.63 | 목표기준 1.5 이상 달성 |
| AN(%) | 1.05 | 목표기준 0.9 이상 달성 |
| pH | 5.41 | |
| Color(O.D 500) | 1.46 | 목표기준 3.0 이하 달성 |
| 산도 I | 6.7 | |
| 산도 II | 8.2 |
(나) 아미노산 조성
유리아미노산은 맛내기 소재의 관능적 특성을 직접적으로 관여하는 요소로 유리아미노산의 조성과 총아미노산의 조성을 분석하였다. 유리 아미노산중 Glutamic acid는 대표적인 감칠맛 성분으로 목표기준인 1.0% 보다 0.17%가 높은 1.17%로 매우 높게 분석되었다.
유리아미노산 및 총아미노산의 총함량은 각각 6.80%, 8.40%로 대부분의 단백질성분이 유리아미노산으로 분해되어 있음을 알 수 있었고 이는 단백분해가 효과적으로 이루어진 것으로 판단되었다.
하기 표 27은 Scale-up 시제품의 아미노산 분석 결과 에 관한 것이다.
| 구 분 | 아미노산 함량(%) | |
| 유리아미노산 | 총아미노산 | |
| ASP | 0.02 | 0.40 |
| THR | 0.38 | 0.40 |
| SER | 0.51 | 0.56 |
| GLU | 1.17 | 1.86 |
| PRO | 0.31 | 0.48 |
| GLY | 0.31 | 0.43 |
| ALA | 0.98 | 0.99 |
| CYS | 0.16 | 0.19 |
| VAL | 0.50 | 0.50 |
| MET | 0.15 | 0.13 |
| ILE | 0.46 | 0.47 |
| LEU | 0.70 | 0.70 |
| TYR | 0.06 | 0.06 |
| PHE | 0.39 | 0.42 |
| HIS | 0.05 | 0.09 |
| LYS | 0.59 | 0.63 |
| ARG | 0.06 | 0.09 |
| 합계(%) | 6.80 | 8.40 |
(3) 관능평가를 통한 제품 적합성 조사(Blind test; 유사제품과의 비교)
Plant scale에서 제조된 1차 맛내기 소재를 유사제품 4종과 비교하기 위해 관능평가(blind test)를 수행하였고 관능평가는 특성강도와 기호도로 나누어 실시하였다.
(가) 특성강도 분석 결과
시료의 특성강도 분석은 훈련된 전문패널이 15점 척도법으로 수행하였고 그 결과는 도 9～10(* 제품 간 유의차가 나타남 p<0.05)에서 보는바와 같이 색상, 쿰쿰함, 탄향, 신향, 단향, 메주향, 콩향, 화학약품향, 알코올향, 농도, 짠맛, 신맛, 콩향미, 금속향미에서 유의적 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 특히 1차 맛내기 소재의 경우 다른 유사제품과 비교하여 콩향/향미, 메주향이 강하면서도 신맛, 화학약품향, 알코올향이 적고 색상이 연하다는 특징을 나타내고 있어 유사제품(국시시판제품-A 제품, B제품; 해외시판제품-C제품, D제품)과 비교하여 관능적 특성이 유의적 수준(p<0.05)으로 좋은 결과가 나타났다(도 9 및 10).
(나) 소비자 조사
아래 표 31과 같이 일반소비자를 대상으로 전반적인 만족도와 항목별 기호도를 조사결과, 1차 맛내기 소재가 다른 시료에 비해 색상, 맛조화도, 구수한 맛에서 3.8, 4.0, 3.8, 3.6점으로(5점척도) 유의적으로 높은 기호도를 보였으며 전반적인 만족도에서도 유의적으로 좋게 평가를 받았다.
하기 표 28은 Scale-up 시제품 및 유사제품의 소비자 기호도 조사 결과 에 관한 것이다.
| 시 료 명 | 전반적 만족도 |
기 호 도 | |||||
| 색상 | 맛조화도 | 구수한맛 | 짠맛 | 단맛 | 감칠맛 | ||
| 1차 맛내기 | 3.8a | 4.0a | 3.8a | 3.6a | 3.1 | 3.2 | 3.4 |
| A 제품 | 3.3b | 3.4ab | 3.3b | 3.1b | 3.1 | 3.3 | 3.2 |
| B 제품 | 3.4b | 3.2b | 3.4b | 3.4ab | 3.0 | 3.3 | 3.2 |
| C 제품 | 3.2b | 3.4ab | 3.2b | 3.1b | 2.9 | 3.1 | 3.1 |
| D 제품 | 3.4b | 3.1b | 3.3b | 3.3b | 3.3 | 3.5 | 3.2 |
| 유의수준 | 0.05 | 0.00 | 0.05 | 0.04 | 0.56 | 0.55 | 0.52 |
평가 대상 : 일반소비자 38명
a, b, c : 유의적 차이 (p<0.05)
이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.
Claims (3)
- 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) M1-4(KCTC 12159BP)
- 제1항의 균주를 발효균주로 이용함으로써 식품의 향미(香味)를 증진시키는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 식품은 된장, 고추장, 청국장, 간장, 요쿠르트, 김치 및 치즈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식품의 향미를 증진시키는 방법.
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| KR20120062727A KR101486522B1 (ko) | 2012-06-12 | 2012-06-12 | 식품의 향미를 증진시키는 균주 |
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| KR20120062727A KR101486522B1 (ko) | 2012-06-12 | 2012-06-12 | 식품의 향미를 증진시키는 균주 |
Publications (2)
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN111808757A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-10-23 | 江南大学 | 一株产高蛋白酶活的米曲霉及其在豆酱发酵中的应用 |
| KR20210033195A (ko) * | 2019-09-18 | 2021-03-26 | 순천대학교 산학협력단 | 유해 미생물의 오염 및 바이오제닉 아민의 생성이 억제된 숙성치즈의 제조방법 및 이에 의해 제조된 숙성치즈 |
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-
2012
- 2012-06-12 KR KR20120062727A patent/KR101486522B1/ko active IP Right Grant
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