CN108048362B

CN108048362B - 一种高脲酶活性菌株及其在处理印花废水中的使用方法

Info

Publication number: CN108048362B
Application number: CN201810037019.1A
Authority: CN
Inventors: 胡殿国; 苏悦; 张淦深; 王开彬; 范一
Original assignee: Hangzhou Xiuchuan Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Xiuchuan Technology Co ltd
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN108048362A

Abstract

本发明公开了一株处理印花废水的高脲酶活性假单胞菌属菌（Pseudomonas benzenivorans）及其使用方法。该菌株分离自某纺织印染企业印花废水，已于2017年8月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No.14521该菌株具有生长速度快、耐盐、耐高温等多种优良特点，并且具有较高的脲酶活性，能将尿素迅速水解，24h后对尿素的水解率可达96.8%。该菌株适用于纺织印染行业，为其废水处理的生化阶段奠定了准备基础，提高了其废水的可生化性，从而明显提升其废水的生化处理效果，有效促进出水水质达标，为纺织印染印花废水处理提供了新的保障，进而推进纺织印染行业的健康持续发展。

Description

一种高脲酶活性菌株及其在处理印花废水中的使用方法

技术领域

本发明属于环境工程领域，具体涉及一株处理印花废水的高脲酶活性菌株及其使用方法。

背景技术

我国是纺织印染工业第一大国，纺织印染行业是废水排放大户，约占整个工业废水排放量的35%。其废水主要来自染整工段，包括退浆、煮炼、漂白、丝光、染色、印花和整理等。其中印花废水的污染程度很高，具有色度大、浓度高、可生化性差等特点。在印花的工艺中，除了因为用到各种难降解的染料外，还使用了大量的尿素。尿素常作为助溶剂，通过亲水性的氨基和羰基接近水分子，从而促进难溶解物质的溶解。在活性染料的汽蒸或固着中，也充当了水分子的角色，促进染料的扩散。如在人造棉织物印花色浆中要用150g/L以上的尿素，以帮助染料溶解和使纤维膨化。并且有的在印花前要浸轧尿素，以提高活性染料的上色量及增艳色泽。但是，大量的尿素投加到生产中，也使得废水的总氮含量增高，总氮超标。

脲酶（Urease，EC 3.5.1.5），又称酰胺水解酶（Urea amidohydrolase），一种寡聚酶，是人类首次获得晶体并发现含有镍的金属酶。它具有绝对专一性，能特异性催化尿素水解成氨和二氧化碳。研究发现，脲酶广存在于生物体中，比如植物、动物、细菌、真菌和古菌。目前，含脲酶活性的微生物被运用于多种领域，如医学、生物化学、农业、食品酿造等。而在纺织印染等工业生产领域中，因其废水水质成分复杂、细胞毒性大等特点，却鲜有使用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株处理印花废水的高脲酶活性菌株，能适应纺织印染行业复杂的废水环境，提升纺织印染废水的可生化性。本发明的另一个目的是，提供一个该菌株在处理印花废水中的使用方法，以促进企业污水的达标排放。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高脲酶活性菌株，所述的高脲酶活性菌株其分类学命名为Pseudomonasbenzenivorans F9，该菌株已于2017年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为：CGMCC No:14521,地址为：北京，中国科学院微生物研究所。

所述的菌株具有以下特性：

（1）菌落形态特征：菌落呈圆形，直径约1-2mm，乳白色，凸起，不透明，边缘整齐，表面光滑；

（2）细胞形态特征：属于革兰氏阴性菌，细胞形态为球状，有运动性；

（3）生理生化特征：好氧，在20-50℃、pH 5.5-10.0，盐度0-4%（w/v）范围内均能生长，作为优选，最佳生长条件为37℃、pH 7.5，盐度1-2%；能利用葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨等多种有机物；

主要极性脂：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油

（5）利用细菌通用引物27F和1492R对该菌株进行16S rRNA基因进行扩增和序列测定，得到815bp长度的基因片段（Seq ID No.1），其序列具体见序列表。将其与NCBI数据库和EzBioCloud数据库进行比对，结果表明菌株F9的16S rRNA基因与PseudomonasbenzenivoransDSM 8628T的相似度为98.90%。根据《Bergey’s Manual of SystematicBacteriology》指导，结合其生理生化特征、形态特征和16S rRNA基因相似度，鉴定菌株F9为Pseudomonas benzenivorans

（6）较高的脲酶活性，24h后对尿素的水解率达96.8%。

作为优选，所述菌株的16S核糖体亚基基因（16S rRNA）序列包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。

一种高脲酶活性菌株在处理印花废水中的使用方法，所述的方法具体步骤如下：

（1）将保存好的菌株F9投加到生化处理系统的好氧池中，与好氧污泥均匀混合、共同作用；

（2）添加营养元素以辅助菌株F9发挥其高脲酶活性。

作为优选，所述的步骤（1）中的菌株F9的投加方式为粉末，投加量与印花废水的质量比为1-2kg/吨，并且为一次性均匀投加。

作为优选，所述的步骤（1）中的菌株投加地点为好氧池，好氧池温度应为30-37℃，pH应为7.0-8.0，溶氧量应为2-3ppm。

作为优选，所述的步骤（2）中的营养元素配方为每1L培养基中添加KH₂PO₄ 0.3-0.5g、MnCl₂ 1.5-3mg、NiSO₄•6H₂O 1.5-4mg、Na₂MoO₄ 1-3mg、CoCl₂•6H₂O 2-4mg、FeSO₄•7H₂O2-4mg，在整个好氧处理系统中，应维持Ni²⁺的实际浓度在1mg/L，不可缺少该成分；各成分均保存于干燥处，避免强光和潮湿。

因此，本发明具有如下有益效果：（1）所得的菌株能适应纺织印染行业复杂的废水环境；（2）提升纺织印染废水的可生化性；（3）促进企业污水的达标排放。

附图说明

图1是本发明Pseudomonas benzenivorans F9对尿素的水解情况。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。

实施例1

产脲酶菌株F9的分离筛选、纯化、保种及脲酶活性

（1）样品采集

样品采集自浙江某纺织印染企业的印花废水

（2）菌株F9的分离、纯化及保种

1L富集培养基中含有：葡萄糖 2g、胰蛋白胨 2g、尿素 50g、KH₂PO₄ 0.5g、NaCl10g，pH 7.5。

1L分离培养基中含有：葡萄糖 1g、胰蛋白胨 1g、尿素 10g、KH₂PO₄ 0.5g、NaCl10g、0.2% 酚红 2mL，琼脂 20g，pH 7.5。

1L富集培养基中含有：葡萄糖 1g、胰蛋白胨 1g、尿素 10g、KH₂PO₄ 0.5g、NaCl10g， pH 7.5。

取5ml印花废水于100ml的富集培养基中，37℃震荡培养24h后，取富集培养液稀释涂布于无菌的固体分离培养基上，37℃静置培养一段时间，挑取使培养基变红的单菌落，反复划线纯化后，接种于生长培养基中，37℃震荡培养24h后，进行30%甘油保种及冷冻干燥保藏。

（3）序列比对

经细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA后，使用细菌通用引物27F和1492R对菌株的16S rRNA基因进行扩增，通用引物27F和1492R的序列如下：

27F：5'-agagtttgatcctggctcag-3'，

1492R：5'-tacggctaccttgttacgac-3'，

经测序获得序列后，将其16S rRNA基因序列提交到NCBI数据库和EzBioCloud数据库进行序列比对，构建系统邻接法（Neighbor-Joining，NJ）发育树，结合多相分类学鉴定方法，鉴定并命名为Pseudomonas benzenivorans F9。

（4）脲酶活性的测定

1L活化培养基中含有：胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g、MgCl₂ 1g，调节pH为7.0。

AM培养基：KH₂PO₄ 0.5g、MnCl₂ 2mg、NiSO₄•6H₂O 2mg、Na₂MoO₄ 2mg、CoCl₂•6H₂O3mg、FeSO₄•7H₂O 3mg、0.2%的酚红 2mL，印花废水补充到1L，pH调节到7.5。

将菌株F9经活化培养基37℃、140r/min培养24h后，按2%的接种量接种到AM培养基中，每隔4h取一次样，检测体系中的尿素含量，尿素的检测方法用对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法，该菌株对尿素的水解曲线如图1所示。发现该菌株在24h后对尿素的水解效率达96.8%，此时菌株F9的OD₆₀₀为0.989，菌浓度也较高，镜检该菌株处于活跃状态。

实施例2

针对印花废水菌株F9的使用方法

浙江某纺织印染企业印花废水生化进水水质：COD=2000-3000 mg/L，BOD=300-400mg/L，氨氮=30-40 mg/L，TN=70-100 mg/L，TP=1-2 mg/L，pH=9.0。采用“混凝沉淀-水解酸化-好氧”处理工艺，混凝沉淀采用3‰的硫酸亚铁和3mg/L的PAM，水解酸化HRT=48h，好氧生化HRT=48h。最终出水COD=1000-2000 mg/L，氨氮=30-38 mg/L，TN=70-100 mg/L。

菌株F9粉末投加量与印花废水的质量比为1-2kg/吨，将菌株F9粉末到好氧池并与好氧污泥均匀混合，好氧池溶氧量为2ppm，同时每吨废水中添加营养元素KH₂PO₄ 5g、MnCl₂20mg、NiSO₄•6H₂O 20mg、Na₂MoO₄ 20mg、CoCl₂•6H₂O 30mg、FeSO₄•7H₂O 30mg。经“混凝沉淀-水解酸化-好氧”工艺处理2个月后，最终出水水质得到大幅度改善，稳定为CODcr=360-420mg/L，氨氮=10-20 mg/L，TN=36-60 mg/L。

实施例3

浙江某纺织印染企业印花废水生化进水水质：COD=2500-3200 mg/L，BOD=450-500mg/L，氨氮=35-50 mg/L，TN=70-100 mg/L，TP=1-2 mg/L，pH=9.6。采用“混凝沉淀-水解酸化-好氧”处理工艺，混凝沉淀采用3‰的硫酸亚铁和3mg/L的PAM，水解酸化HRT=48h，好氧生化HRT=48h。最终出水COD=800-1500 mg/L，氨氮=30-35 mg/L，TN=80-95 mg/L。

菌株F9粉末投加量与印花废水的质量比为1-2kg/吨，将菌株F9粉末到好氧池并与好氧污泥均匀混合，好氧池溶氧量为2ppm，同时每吨废水中添加营养元素KH₂PO₄ 5g、MnCl₂20mg、NiSO₄•6H₂O 20mg、Na₂MoO₄ 20mg、CoCl₂•6H₂O 30mg、FeSO₄•7H₂O 30mg。经“混凝沉淀-水解酸化-好氧”工艺处理2个月后，最终出水水质得到大幅度改善，稳定为CODcr=340-380mg/L，氨氮=12-18 mg/L，TN=30-46 mg/L。

序列表

<110> 杭州秀川科技有限公司

<120> 一种高脲酶活性菌株及其在处理印花废水中的使用方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 通用引物(primer)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 通用引物(primer)

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac 20

<210> 3

<211> 815

<212> DNA

<213> 高脲酶活性菌株 16S核糖体亚基基因(Pseudomonas benzenivorans F916S rRNA gene)

<400> 3

agcttgctac ctgattcagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt 60

gggggacaac gtttcgaaag gaacgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagtgggg 120

gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa 180

tggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact 240

gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa 300

gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt 360

tgggaggaag ggttgtaacc taatacgttg caattttgac gttaccgaca gaataagcac 420

cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta atcggaatta 480

ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggtttgt taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac 540

ctgggaactg catccaaaac tggcaagcta gagtacggta gagggtggtg gaatttcctg 600

tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctgga 660

ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 720

tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tggaatcctt gagattttag tggcgcagct 780

aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccg 815

Claims

1.一种具有脲酶活性的菌株，其特征在于，所述的具有脲酶活性的菌株Pseudomonasbenzenivorans F9，保藏编号为：CGMCC No:14521。

2.一种利用权利要求1所述的具有脲酶活性的菌株在处理纺织印染企业印花废水中的使用方法，其特征在于，所述的方法具体步骤如下：

(1)将保存好的菌株F9投加到生化处理系统的好氧池中，与好氧污泥均匀混合、共同作用；

(2)添加营养元素以辅助菌株F9发挥其高脲酶活性。

3.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的菌株F9的投加方式为粉末，投加量与印花废水的质量比为1-2kg/吨，并且为一次性均匀投加。

4.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的菌株投加地点为好氧池，好氧池温度为30-37℃，pH为7.0-8.0，溶氧量为2-3ppm。

5.根据权利要求2所述的使用方法，其特征是，所述的步骤(2)中的营养元素的组成为：KH₂PO₄ 0.3-0.5g/L、MnCl₂ 1.5-3mg/L、NiSO₄·6H₂O 1.5-4mg/L、Na₂MoO₄ 1-3mg/L、CoCl₂·6H₂O 2-4mg/L、FeSO₄·7H₂O 2-4mg/L，在整个好氧处理系统中，添加上述营养元素维持Ni²⁺的实际浓度在1mg/L，不可缺少该成分；各成分均保存于干燥处，避免强光和潮湿。