CN101250568B - 一种发酵法从造纸黑液中提纯木质素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种发酵法从造纸黑液中提纯木质素的方法，以酒精酵母为菌种通过活化菌种后经一级、二级种子培养和发酵法，并且在发酵过程中添加酶制剂来降解造纸黑液中的多糖，使其分解为酒精酵母可以生长利用的单糖，从而除去发酵液中的糖，提高木质素的纯度；而且随着糖的消耗降低了液体的粘度，更有利于后期木质素的分离。本发明中所使用的菌种和酶制剂都是工业生产中较为普及而常用的。总之，本发明采用发酵法提取造纸黑液中的木质素有着重要的社会效益、经济效益和环境效益。
Description
技术领域
本发明涉及造纸废水的处理技术领域，具体是利用微生物进行厌氧或好氧发酵的工艺处理技术。同时也涉及到提取一种天然高分子化合物-木质素的方法。
背景技术
木质素是自然界合成量及存在量仅次于纤维素的天然高分子化合物。木质素与纤维素及半纤维素一起构成植物的主体，是地球上最丰富的可再生有机资源。每年地球上最的植物通过光合作用和生化作用可再生木质素200亿吨以上，是人类可以依存的最大量资源。尤其是随着石油资源日益枯竭，开发利用新的资源-木质素尤为重要。
造纸原料所用的秸秆，均含有纤维素、木质素和半纤维素(聚糖类)三部分，造纸仅取用其中的纤维素(约占40％)，而其中约占25％的木质素以及半纤维素、木糖、钾、氮、磷等物，则随黑液废弃，造成严重的环境污染。而且，目前国内外是把碱回收法作为草浆造纸黑液处理的有效方法。从资源衡算角度看，碱回收工程是把黑液中大量具有高附加值的木质素等多种生物资源一炬化为乌有，间接地换取生产所需的单一蒸煮碱，从生态工程角度看，这并不是一种最佳的循环经济技术，仍存在多级生物资源利用不充分的问题。
因此，在造纸行业中分离木质素并对之加以应用，不仅可以降低生产成本、回收有用资源，还能减少或消除黑液对环境的污染，但目前尚无达到此目的有效方法报道。
发明内容
本发明采用发酵法从造纸黑液中提纯木质素，其目的是除去木质素絮凝沉降时随着絮体颗粒的增大所夹带的糖和上清液中所存在的糖，提高木质素的纯度，而且随着糖的消耗降低了液体的粘度，更有利于后期木质素的分离。
具体操作方法如下：
第一步、培养基的制备。
斜面培养基，质量组成为：葡萄糖1g，酵母膏1g，碳酸钙1.5g，琼脂2.0g，水100ml。
种子培养基，质量组成为：：葡萄糖2g，酵母膏1g，蛋白胨2g，水100ml，121℃高压蒸汽灭菌20～30min。
发酵培养基：造纸黑液(pH值11.5)，盐酸调试pH值为5.4，100ml发酵培养基装入250ml三角瓶中杀菌。121℃高压蒸汽灭菌20～30min。
第二步、活化菌种。
在无菌的条件下，将实验室用酒精酵母(Saccharomyces cererisiae)接种于斜面培养基上，30℃培养3～5天，然后放入冰箱保存。留做一级种子。
第三步、二级种子培养。
将一级种子，直接种于二级液体种子培养基，于30℃下，摇床培养24小时。
第四步、发酵培养。
用250ml三角瓶，每瓶加100ml发酵培养基，而且加0.1％的酶，每瓶接种10％二级种子培养液。其中所述的酶为工业中使用较为普及而常用的强效复合酶和果胶酶，其质量比为1∶1。
发酵可以使用以下两种方法中任一种方法：
1、厌氧发酵：于30℃下，恒温培养，每三天测定残糖。
2、通风好氧发酵：于30℃下，摇床培养，每12小时测定残糖。
发酵液中的残糖含量不再发生变化时停止发酵，并测定发酵液的酒精得率和发酵液的粘度。
第五步、木质素的分离。
发酵液经离心分离，沉淀木素残糖量0.3％以下。
本发明采用发酵法提取造纸黑液中的木质素，并在造纸黑液中添加酶制剂来降解造纸黑液中的多糖，使其分解为酒精酵母可以生长利用的单糖，，从而除去发酵液中的糖，提高木质素的纯度，而且随着糖的消耗降低了液体的粘度，更有利于后期木质素的分离。并且，酒精酵母在厌氧发酵时会有酒精产生，使造纸黑液中的多级生物资源得到充分的利用；而酒精酵母进行好氧发酵可以很快的得到比较纯的木质素。本发明中所使用的菌种和酶制剂都是工业生产中较为普及而常用的。总之，本发明采用发酵法提取造纸黑液中的木质素有着重要的社会效益、经济效益和环境效益。
附图说明
本发明附图1幅，即：附图1为葡萄糖的标准曲线，采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法在530nm时进行比色测定，根据测定的OD值得知样品的总糖及还原糖含量。其中横坐标为OD值，纵坐标为葡萄糖浓度g/L。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1.
第一步、培养基的制备。
斜面培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，碳酸钙1.5g，琼脂2.0g，
种子培养基：葡萄糖2g，酵母膏1g，蛋白胨2g，水100ml，121℃高压蒸汽灭菌20～30min。
发酵培养基：造纸黑液(PH值11.5)，盐酸调试PH值为5.4，100ml发酵培养基装入250ml三角瓶中杀菌。121℃高压蒸汽灭菌20～30min。
第二步、活化菌种。
在无菌的条件下，将实验室用酒精酵母(Saccharomyces cererisiae)接种于斜面培养基上，30℃培养3～5天，然后放入冰箱保存。留做一级种子。
第三步、二级种子培养。
将一级种子，直接种于二级液体种子培养基，于30℃下，摇床培养24小时。
第四步、发酵培养。
用250ml三角瓶，每瓶加100ml发酵培养基，而且加0.1％的酶(发明中所使用的酶为：工业中使用较为普及而常用的强效复合酶和果胶酶，其质量比为1∶1)，每瓶接种10％二级种子培养液，于30℃下，恒温培养，每三天测定残糖。发酵液中的残糖含量不再发生变化时停止发酵，并测定发酵液的酒精得率和发酵液的粘度。
一、糖的测定
1.样品中还原糖的提取：准确称取10ml样品，放入100ml烧杯中，加入85％乙醇50ml。混匀，在50℃恒温水浴中保温30分钟，过滤，滤渣再用85％乙醇提取二次。将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水稀释到刻度，备用。
2.样品中总糖的水解及提取：准确称取10ml样品，放入100ml烧杯中，加入10ml 6N盐酸和15ml蒸馏水。混匀，在沸水浴中加热半小时左右，使总糖水解完全。冷却后加入酚酞指示剂，以10％氢氧化钠中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100ml，再精确吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶中，稀释到刻度，备用。
采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法在530nm时进行比色测定，根据测定的OD值，利用图1得知样品的总糖及还原糖含量。
表1原液中总糖和还原糖的含量
| 样品 | OD值 | 糖浓度g/L |
| 还原糖 | 0.098 | 2.96 |
| 总糖 | 0.084 | 25.51 |
表2厌氧发酵的发酵液中的残糖的含量(七天)
| 样品 | 残还原糖g/L | 残总糖g/L |
| 厌氧发酵液 | 2.58 | 3.40 |
二、酒精含量的测定
在约20℃时，用容量瓶量取试样100ml，全部移入500ml蒸馏瓶中。用100ml水分次洗涤容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，加数粒玻璃珠。装上冷凝管，通入冷水，用原100ml容量瓶接收馏出液(外加冰浴)。加热蒸馏，直至收集馏出液体积约95ml时，停止蒸馏。于水浴中冷却至约20℃，用水定容，摇匀，倒入100ml量筒中，测量馏出液的温度与酒精度。按测得的实际温度和酒精度标示值查GB/T13662-2000附录A，换算成20℃时的酒精度。
表3厌氧发酵的发酵液中酒精度及酒精得率
| 样品 | 酒精度(v/v) | 酒精得率g/L |
| 厌氧发酵液 | 1.4 | 10.92 |
三、粘度的测定
使物体在流体中落下，越是粘度高的流体，物体在其中落下越慢，因此从落下速度可比较流体粘度的大小。假设直径为d的小球在粘度为η的相同物质的流体中以一定速度ν运动，在满足速度很小、球是刚性球等条件时，而且在考虑了管壁等因素的影响，最终可得到
η＝{[d2(ρ0-ρ)gt]/(18l)}[1-2.104(d/D)+2.09(d/D)3]
η-液体粘度，Pa.s
ρ0-小球的密度，Kg/m3
ρ-流体的密度，Kg/m3
d-小球的直径，m
D-圆管的直径，m
t-小球在液体中的运动时间，s
l-时间t内小球落下的距离，m
所以，只要测定一定距离的落下时间和试料密度就可以求粘度了。
表4原液与厌氧发酵液的粘度
| 样品 | 时间(s) | 密度(Kg/m3) | 粘度(Pa.s) |
| 黑液 | 0.79 | 1075.5 | 8.78 |
| 厌氧发酵液 | 0.49 | 1055.5 | 5.45 |
第五步、木质素的分离。
发酵液经离心分离，沉淀木质素残糖量0.3％以下。
实施例2.
第一步、培养基的制备。
斜面培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，碳酸钙1.5g，琼脂2.0g，
种子培养基：葡萄糖2g，酵母膏1g，蛋白胨2g，水100ml，121℃高压蒸汽灭菌20～30min。
发酵培养基：造纸黑液(PH值11.5)盐酸调试PH值为5.4，100ml发酵培养基装入250ml三角瓶中杀菌。121℃高压蒸汽灭菌20～30min。
第二步、活化菌种。
在无菌的条件下，将实验室用酒精酵母(Saccharomyces cererisiae)接种于斜面培养基上，30℃培养3～5天，然后放入冰箱保存。留做一级种子。
第三步、二级种子培养。
将一级种子，直接种于二级液体种子培养基，于30℃下，摇床培养24小时。
第四步、发酵培养。
用250ml三角瓶，每瓶加100ml发酵培养基，而且加0.1g的酶(发明中所使用的酶为：工业中使用较为普及而常用的强效复合酶和果胶酶)，每瓶接种10％二级种子培养液，于30℃下，摇床培养，每12小时测定残糖。发酵液中的残糖含量不再发生变化时停止发酵，并测定发酵液的粘度。
一、糖的测定
1、样品中还原糖的提取：准确称取10ml样品，放入100ml烧杯中，加入85％乙醇50ml。混匀，在50℃恒温水浴中保温30分钟，过滤，滤渣再用85％乙醇提取二次。将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水稀释到刻度，备用。
2、样品中总糖的水解及提取：准确称取10ml样品，放入100ml烧杯中，加入10ml6N盐酸和15ml蒸馏水。混匀，在沸水浴中加热半小时左右，使总糖水解完全。冷却后加入酚酞指示剂，以10％氢氧化钠中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100ml，再精确吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶中，稀释到刻度，备用。
采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法在530nm时进行比色测定，根据测定的OD值，利用葡萄糖标准曲线得知样品的总糖及还原糖含量。
表5好氧发酵的发酵液中的残糖的含量(两天)
| 样品 | 残还原糖g/L | 残总糖g/L |
| 好氧发酵液 | 8.67 | 9.21 |
二、粘度的测定
用实例1测粘度同样方法测取黑液原液与好氧发酵液的粘度，结果如表6：
表6原液与好氧发酵液的粘度
| 样品 | 时间(s) | 密度(Kg/m3) | 粘度(Pa.s) |
| 黑液 | 0.79 | 1075.5 | 8.78 |
| 好氧发酵液 | 0.53 | 1080.5 | 5.89 |
第五步、木质素的分离。
发酵液经离心分离，沉淀木质素残糖量0.3％以下。
Claims (2)
1.一种发酵法从造纸黑液中提纯木质素的方法，按以下步骤进行操作：
第一步、培养基的制备
斜面培养基：质量组成为：葡萄糖1g，酵母膏1g，碳酸钙1.5g，琼脂2.0g，加水100ml；
种子培养基：质量组成为：葡萄糖2g，酵母膏1g，蛋白胨2g，水100ml，121℃高压蒸汽灭菌20～30min；
发酵培养基：造纸黑液加盐酸调试pH值为5.4，100ml发酵培养基装入250ml三角瓶中121℃高压蒸汽灭菌20～30min；
第二步、活化菌种
在无菌的条件下，将酒精酵母(Saccharomyces cererisiae)接种于第一步制备得到的斜面培养基上，30℃培养3～5天，然后放入冰箱保存，留做一级种子；
第三步、二级种子培养
将第二步活化的一级种子直接接种于第一步制得的二级液体种子培养基，于30℃下，摇床培养24小时；
第四步、发酵培养
用250ml三角瓶，每瓶加100ml由第一步制备得到的发酵培养基，而且加0.1％的酶，每瓶接种10％二级种子培养液；
其中，所述酶为强效复合酶和果胶酶，其质量比为1∶1；
采用厌氧发酵方法：于30℃下恒温培养，每2～3天测定残糖，发酵液中的残糖含量不再发生变化时为止；
第五步、木质素的分离；
发酵液经离心分离，沉淀木质素残糖量0.3％以下。
2.根据权利要求1所述一种发酵法从造纸黑液中提纯木质素的方法，其特征在于所述第四步的发酵培养中采用的是通风好氧发酵，其发酵条件为于30℃下摇床培养，每12小时测定残糖，发酵液中的残糖含量不再发生变化时为止。
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