CN110938558A - 木质纤维素降解复合菌系及其培养方法和应用 - Google Patents

木质纤维素降解复合菌系及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种木质纤维素降解复合菌系及其培养方法和应用，解决现有木质纤维素生物降解过程主要针对单一的微生物，降解速度较低的问题。其中复合菌系包括从腐烂秸秆中分离出的木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属及草螺菌属；所述木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属的质量百分比分别为20％～40％、20％～40％、5％～10％、20％～40％、5％～10％。用于培养该复合菌系的复合菌培养基为纤维素刚果红培养基。利用该复合菌系的发酵培养基成分为：麦麸5％、玉米秸秆粉20％、酵母膏0.05％、蛋白胨0.3％、七水硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.4％、二水氯化钙0.03％、硫酸铵1.5％、吐温‑80 0.8％、余量为水。该复合菌系在秸秆降解中的应用。

Description

木质纤维素降解复合菌系及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及复合菌剂技术，具体涉及一种木质纤维素降解复合菌系及其培养方法和应用。
背景技术
近几年来，全球粮食危机、能源危机、环境危机日益严重，人们逐渐将注意力转向地球上最丰富、最便宜的木质纤维素资源，木质纤维素是纤维素、半纤维素、木质素的混合物，是地球上最大的可再生资源。微生物降解和木质纤维素的转化是天然碳循环的重要部分，如果有效利用这一资源，将对解决当今世界面临的能源短缺和环境污染问题具有深远的意义。
由于约80％的玉米秸秆组分是纤维素、半纤维素、木质素，并且难以降解的木质素包覆了纤维素和半纤维素，因此，若想要实现纤维素和半纤维素的有效降解，首先去除木质素的屏障。
目前，对于木质纤维素生物降解的研究主要集中在真菌方面，并取得了一定的成效。木质纤维素是难以分解的物质，除了真菌，只有纤维素分解细菌和一些软体动物才能将其分解。分解的主要因素是形成纤维素酶。在真菌中，从其异养生命的实际过程中，可以看到许多物种发挥这种作用，主要称为野生型曲霉菌，青霉菌，毛壳菌，镰刀菌，木霉菌，漆斑菌属，尤其是所谓的植物寄生虫和腐朽木霉菌，如蜡伞属、奇果菌属、耙菌属、层孔菌等，它们会造成褐色斑块。纤维素分解细菌是分解木质纤维素的细菌，由于纤维素酶等的作用，纤维素总是可以分解成葡萄糖。这些细菌在腐殖质中更为常见。这些细菌包括能分解纤维素的好氧细菌，如细胞弧菌和细胞噬菌体。而在好氧条件下，土壤中纤维素的分解主要是由于真菌的分解。厌氧梭菌属的一些细菌在厌氧条件下具有分解纤维素的能力。纤维素分解菌(厌氧菌)也可寄生于食草动物的消化道，尤其是反刍动物的瘤胃。其中，它们参与纤维素分解活动，如产琥珀酸拟杆菌(Bacteroides succinoge-nes)、牛黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefacien－s)、白色瘤胃球菌(R.albus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)。
由于目前木质纤维素生物降解过程主要针对单一的微生物，而单一的微生物只能发挥低弱的作用甚至没有作用。其中包括纤维素降解真菌、细菌和放线菌。
发明内容
为了解决现有木质纤维素生物降解过程主要针对单一的微生物，降解速度较低的技术问题，本发明以腐烂的秸秆为新的生物资源，提供了一种木质纤维素降解复合菌系及其培养方法和应用。
本发明的技术方案为：
随着木质纤维素生物降解机理研究的不断深入，在生物降解过程中微生物间的协同关系也逐渐受到重视，秸秆的降解经过实验探究发现具有一定降解能力的微生物系进行组建，能够更好地发挥作用。
一种木质纤维素降解复合菌系，其特殊之处在于：包括从腐烂秸秆中分离出的木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属及草螺菌属；所述木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属的质量百分比分别为20％～40％、20％～40％、5％～10％、20％～40％、5％～10％。
进一步地，所述木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属的质量百分比分别为30％、30％、5％、30％、5％。
一种用于培养上述木质纤维素降解复合菌系的复合菌培养基，其特殊之处在于：
所述复合菌培养基为纤维素刚果红培养基，其包括2.0g/L CMC—Na、2.0g/L(NH4)2S04、0.5g/L NaCl、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgS04·7H2O、0.4g/L刚果红、12g/L琼脂；
CMC—Na溶液通过CMC添加柠檬酸缓冲溶液加热溶解制得；
所述复合菌培养基的pH为7.0。
一种上述木质纤维素降解复合菌系的发酵培养基，所述发酵培养基的成分为：麦麸5％、玉米秸秆粉20％、酵母膏0.05％、蛋白胨0.3％、七水硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.4％、二水氯化钙0.03％、硫酸铵1.5％、吐温-80 0.8％，余量为水。
利用上述木质纤维素降解复合菌系制备复合菌酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种培养
1.1)将木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属分别在相应培养基上扩增和培养；
2)发酵过程
2.1)活化后的菌种接种到一级种子罐中通气培养，培养后再接种到二级种子罐中，培养后接种到发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；
发酵培养基：麦麸5％、玉米秸秆粉20％、酵母膏0.05％、蛋白胨0.3％、七水硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.4％、二水氯化钙0.03％、硫酸铵1.5％、吐温-80 0.8％，余量为水；
2.2)根据发酵液的pH值，以及镜检观察来确定菌的状态；
3)酶的提取分离与纯化
3.1)使发酵液温度维持在90℃，保持10min；
3.2)发酵液进行过滤、浓缩后，采用盐析进行酶分离；
3.3)使用纤维素酶抑制剂进行纯化，获得纯化的复合菌酶。
进一步地，将木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属活化后接种于发酵培养基中，28～30℃发酵7～10d，期间持续搅拌；接种量为7％。
一种木质纤维素降解复合菌系的分离鉴定方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
1)样品处理与初筛
1.1)样品处理
称取一定量的秸秆样本，加入到盛有无菌生理盐水并且带有玻璃珠三角瓶中，于37℃恒温摇床摇动，将样品充分混匀打散备用；
1.2)初筛
1.2.1)将步骤1.1)获得的样本用无菌水逐级10倍稀释至10-6、10-7、10-8倍后，分别取0.1mL涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，每个浓度重复涂布3个平板；
所述纤维素刚果红选择性培养基包括2.0g/L CMC—Na、2.0g/L(NH4)2S04、0.5g/LNaCl、41g/L K2HPO4、0.5g/L MgS04·7H2O、0.4g/L刚果红、12g/L琼脂；
所述CMC—Na溶液通过0.51g CMC，添加一定量的0.05mol/L的柠檬酸缓冲溶液，加热溶解制得；
所述纤维素刚果红培养基的pH为7.0；
1.2.2)28℃下培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株；
1.2.3)通过划线分离纯化所挑取的菌株，直至得到单菌落；
2)酶活性的测定
2.1)将纯化后的菌株进行筛选，选择生长状况良好的菌株，显微镜下观察并初步根据菌株形态确定菌株的种属；
2.2)将霉菌和放线菌制成菌悬液分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和高氏合成一号培养基上，待霉菌菌落和放线菌菌落长出后，用打孔器打菌饼并接种于纤维素刚果红平板培养基上；细菌直接采取点接的方式接种于纤维素刚果红培养基上；
其中，马铃薯葡萄糖琼脂培养基：100mL马铃薯浸汁、2g琼脂、2g葡萄糖；
高氏合成一号培养基：2.0g可溶性淀粉、0.1g KNO3、0.05g K2HPO4·3H2O、0.001gFeSO4·7H2O、0.05g NaCl、0.05g MgSO4·7H2O、1.5-2g琼脂、100mL蒸馏水，pH为7.2-7.4；
2.3)在28℃恒温培养箱中培养3～5天，观察并测量透明圈的直径大小；
2.4)计算透明圈直径D与菌落直径d的比值，测定各菌株的羧甲基纤维素酶活性的高低，所述透明圈直径D与菌落直径d的比值越大酶活性越高；
2.5)筛选出具有高羧甲基纤维素酶活性的菌株；
3)滤纸条崩解实验
3.1)将步骤2.5)筛选出的菌株进行活化，取用1mL接种于装有20ml的滤纸条崩解培养基的试管中，培养10～12天，定期观察滤纸条崩解情况；
其中，滤纸条崩解培养基：1.0g/L(NH4)2S04、0.5g/L MgS04·7H2O、1.0g/L KH2PO4、0.1g/L酵母膏、滤纸条；pH为7.0；
3.2)筛选出纤维素酶活性最高的的菌株
4)菌株的鉴定
4.1)形态鉴定
4.1.1)将筛选出的菌株进行划线分离纯化后，挑选单菌株划线于培养基上培养，各菌株在适宜生长温度下培养，观察各菌株的生长状况；
4.1.2)对生长良好的菌株进行镜检观察，观察其在显微镜下的形态特征；
4.2)序列比对鉴定
4.2.1)细菌16SrDNA序列扩增
采用338F与806R引物进行PCR扩增得到细菌菌株16SrDNA序列，将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求，获得每个样本中细菌的物种；
4.2.2)真菌ITS2序列扩增
采用fITS7与ITS4引物进行PCR扩增得到真菌菌株ITS序列，将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求，获得每个样本中细菌的物种；
4.3)复合菌系
筛选得到在常温实验室条件下，能降解玉米秸秆，主要包括木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属和草螺菌属。
进一步地，在步骤3)与步骤4)之间还包括步骤菌株复筛a，具体为：
a1)制作葡萄糖标准曲线
a11)分别取8只试管按顺序进行编号，依次取葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml加入试管中，并加入蒸馏水将每支试管补加至2.0ml；
a12)将蒸馏水与葡萄糖标准液的混合溶液充分摇匀后，分别加入2ml DNS试剂，摇匀后沸水浴加热5min，冷却后用水补足至20ml；
其中，DNS试剂通过18.2g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水中并加热，在热溶液中依次加入0.63g 3，5-二硝基水杨酸、2.1g NaOH、0.5g苯酚，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定容至100ml；
a13)在540nm波长下分别测定8只试管的吸光度，以第一支试管进行调零，并且以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，获得葡萄糖标准曲线；
a2)制备粗酶液
将步骤3.2)筛选出的菌株成菌悬液，分别取一定菌悬液加入发酵产酶培养基中；在30℃、160r/min下培养，获得的培养液在离心机下离心获得上清液，所述上清液为粗酶液；
其中，发酵产酶培养基：20g玉米秸秆粉、4g NH4NO3、2g K2HPO4、0.5MgS04·7H2Og、0.4g无水CaCl2、0.5g NaCl、1000mL蒸馏水，pH为6.0；
a3)酶活性鉴定
a31)滤纸条酶活
a311)取3支试管，分别加入0.5ml的粗酶液、1.5ml的柠檬酸缓冲液；
a312)向其中一支试管中加入2.0mlDNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热5min；
a313)向三支试管中各加入滤纸条，摇匀，50℃反应60min，取出后立即向其中另外两个试管中加入2.0ml DNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热5min；
a314)在540nm波长下测定吸光值；
a32)羧甲基纤维素酶活
a321)取3支试管，分别加入1.5ml的0.51％CMC柠檬酸缓冲液、0.5ml酶液；
其中，0.51％的CMC-Na溶液通过0.51g CMC，添加一定量的0.05mol/L的柠檬酸缓冲溶液，加热溶解制得；
a322)向第一支试管中加入2.0mlDNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热5min，50℃反应下30分钟；
a323)取出后除第一支试管外均加入1.5ml的DNS试剂，摇匀并沸水浴5min，取出冷却至室温，摇匀；
a324)在540nm波长下测定吸光值。
进一步地，步骤4.1.1)中，挑选出的菌株在CMC培养基中划线分离纯化；
细菌和放线菌在28℃下培养，真菌在30℃下进行培养；
步骤3.1)中每支试管中放入2个滤纸条，每个滤纸条尺寸为1*6cm；
或者，每支试管中放入1个滤纸条，每个滤纸条尺寸为1*7cm。
步骤4.2)中，PCR反应条件：预变性98℃30s、变性98℃10s、退火54℃30s、延伸72℃45s、35个循环、延伸72℃10min、保持4℃。
一种上述木质纤维素降解复合菌系或利用上述方法制备的复合菌酶在秸秆降解中的应用，木质纤维素降解复合菌系和复合菌酶添加量为秸秆量(按重量计)的5％～15％，优以8％为最佳。
本发明的有益效果是：
1、本发明复合菌系包括木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属及草螺菌属，选择合适的质量百分比，多个菌株之间相互协同作用，相互促进可以有效降解木质纤维素。
2、通过样品处理与初筛实验得到能将木质素降解的菌落，并将其进行分离纯化，得到单菌落，然后通过刚果红纤维素培养基在适宜温度条件下进行培养，得到初筛菌落，通过透明圈直径大小与菌落大小的比值，进一步判断菌落是否符合要求，再通过酶活的测定进行复筛，将选出的菌落划线分离纯化，将得到单菌落进行镜检观察其形态，确定菌株的种属类型，并构建复合菌系，该复合菌系降解木质纤维素的速度高。
3、本发明以腐烂秸秆为主要原材料，可有效解决秸秆利用率低、转化率低、经济效益低、环境污染严重的缺陷。
4、本发明复合菌酶的制备方法符合生产化在经济技术、环境上的可行性。
附图说明
图1为本发明实施例中菌株分离纯化后的生长情况图，其图a、b、c分别是选择出若干株菌株；
图2和图3为本发明实施例中刚果红透明圈初筛图；
图4和图5为本发明实施例中滤纸条崩解试验图；
图6为本发明实施例中DNS测定葡萄糖标准曲线图；
图7为本发明实施例中单菌株形态图；
图8为本发明实施例中镜检结果图；
图9为本发明实施例中细菌菌株16SrDNA序列电泳图；
图10为本发明实施例中真菌ITS序列电泳图；
图11为本发明实施例复合菌酶制剂的制备工艺流程图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步详细描述。
实验材料与试剂
一、样品来源
宣城市宣州区合肥工业大学周边田地里腐烂的玉米秸秆。
二、实验药品与试剂
1)实验药品
本实施例所用药品来自宣城市精科化玻仪器经营所，试验药品见表1。
表1试验药品一览表
Figure BDA0002275190340000081
2)实验试剂
a)DNS试剂：酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH 2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存。
b)pH4.8柠檬酸缓冲液(0.05mol/L)：分别称取10.51克柠檬酸、14.71克柠檬酸钠，各自定容至500mL，即为0.1mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠溶液。取柠檬酸溶液11.5mL，取柠檬酸钠溶液11.5mL，混匀后加入蒸馏水至50mL，即为0.05mol/L的pH4.8的柠檬酸缓冲溶液。
c)0.51％的CMC-Na溶液：称取0.51克CMC，添加适量的0.05mol/L的柠檬酸缓冲溶液，加热溶解定容至100mL，用前充分摇匀。
d)葡萄糖标准溶液(1mg/mL):称取1克葡萄糖，加入蒸馏水定容至1L，即为1mg/mL的葡萄糖标准溶液。
3)培养基
a)纤维素刚果红培养基：CMC—Na 2.0g/L，(NH4)2S04 2.0g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO41 g/L，MgS04·7H2O 0.5g/L，刚果红0.4g/L，琼脂12g/L，pH 7.0
b)滤纸条崩解培养基[41]：(NH4)2S04 1.0g/L，MgS04·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1.0g/L，酵母膏0.1g/L，滤纸条(1cm×7cm)1条/试管，pH 7.0。
c)羧甲基纤维素钠培养基：CMC—Na 10g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO41 g/L，MgS04 7H2O 0.5g/L，酵母膏0.5g/L，琼脂20/L，pH 7.0
d)发酵产酶培养基[42]:玉米秸秆粉20g，NH4NO3 4g，K2HPO4 2g，MgS04·7H2O0.5g，无水CaCl20.4g，NaCl0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.0。
e)CMC-Na固体培养基：CMC-Na 15g，NH4NO3 1.0g，酵母膏1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1.0g，蒸馏水1000mL，加入琼脂20g
f)PDA培养基：马铃薯浸汁(20％)100mL，琼脂2g，葡萄糖2g，pH自然
g)高氏合成1号培养基：可溶性淀粉2.0g，KNO3 0.1g，K2HPO4·3H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，NaCl 0.05g，MgSO4·7H2O 0.05g,pH 7.2-7.4琼脂1.5-2g，蒸馏水100mL
h)肉汤培养基：牛肉膏0.5g，NaCl 0.5g，蛋白胨1.0g，蒸馏水100mL，琼脂2g，pH7.2-7.4。
4)主要仪器
本试验中所用到的主要仪器设备见表2。
表2试验仪器一览表
Figure BDA0002275190340000101
实施例一
本实施例主要涉及筛选高效生物质纤维素降解菌，构建复合菌系，主要包括：
一、试验方案
1.1样品的处理与初筛
1.1.1、样品处理
准确称取秸秆样品10.0g，加入到一个盛有90mL的无菌生理盐水并且带有玻璃珠的250mL三角瓶中，于37℃恒温摇床摇动，将样品充分混匀打散3个小时备用。
1.1.2、初筛
a)将采集的样品用无菌水逐级10倍稀释至10-6、10-7和10-8倍后，分别取0.1mL涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，每个浓度重复涂布3个平板，28℃下培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株；
b)通过划线分离纯化所挑取的菌株，直至得到单菌落。
1.2羧甲基纤维素酶活性的测定实验设计
将纯化后的菌株进行筛选，选择生长状况较为良好的菌株，初步根据显微镜下形态观察确定菌株的种属，然后将霉菌和放线菌制成菌悬液分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和高氏一号培养基上，其中待霉菌菌落和放线菌菌落长出后，用打孔器打6mm得菌饼接种于纤维素刚果红平板；而细菌则直接采取点接的方式接种于纤维素刚果红培养基上，在28℃恒温培养箱中培养3-5天，观察并测量透明圈的直径大小；酶活高低的判断则通过透明圈直径大小(D)与菌落直径大小(d)的比值来进行初步判断。
1.3滤纸条崩解的实验设计
将筛选出的具有高CMCase活性的菌株进行活化，分别取用1mL接种于装有20ml的滤纸条崩解培养基的试管中(每根试管中放入2条滤纸条/1*6cm)，培养10-12天，定期观察滤纸条崩解情况[43]。
1.4菌株的复筛
1.4.1葡萄糖标准曲线的制作
取用8支洁净的具塞试管进行编号，并按照表3所要求的依次加入溶液，绘制葡萄糖标准曲线。
分别取葡萄糖标准液(1mg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml于20ml试管中，之后蒸馏水将每支试管补加至2.0ml,将蒸馏水与标准葡萄糖标准液的混合溶液充分摇匀后，分别准确加入DNS试剂2ml，摇匀后沸水浴加热5min，流水冷却，用水补足到20ml刻度。在540nm波长下测定吸光度，以第一支试管进行调零，并且以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
表3葡萄糖标准曲线的配制
Figure BDA0002275190340000111
Figure BDA0002275190340000121
1.4.2粗酶液的制备
将通过挑选的的菌株制成菌悬液，分别取2mL菌悬液加入装有50mL发酵培养基的150mL三角瓶中。30℃，160r/min，摇床培养3d，获得的培养液在离心机内8000r/min下离心15min。所获得的上清液就是粗酶液。
1.4.3酶活的测定
a)滤纸条酶活(FPA)
取3根20ml的具塞试管，分别向其中加入0.5ml的粗酶液、1.5ml的柠檬酸缓冲液(0.05mol/L,pH4.8),向第一支试管中加入2.0mlDNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热5min。各加入1*6cm滤纸条，摇匀，50℃反应60min,取出后立即在二三试管中加入2.0mlDNS试剂，摇匀，沸水浴5min。取出冷却至室温，摇匀。以第一支试管为空白，在540nm处测定吸光值。
酶活单位定义：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个酶活力国际单位用U/mL表示。
滤纸酶活力(U/mL)＝糖量(mg)×1(min)×1000(umol/mmol)×稀释倍数÷[180(mg/mol)×60(min)×0.05(mL)]
b)羧甲基纤维素酶活
取3根20ml的具塞试管，其中加入1.5ml的0.51％CMC柠檬酸缓冲液，各加入0.5ml酶液，向第一支试管中加入2.0mlDNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热。50℃反应30分钟。取出之后除第一支试管都加入1.5ml的DNS试剂终止酶反应。之后摇匀并沸水浴5min，取出冷却至室温，摇匀。以第一支试管为空白，在540nm处测定吸光值。酶活的单位与滤纸条酶活类似。
1.5菌株的鉴定
将挑选出来的菌株首先采用形态观察鉴定，之后根据它们的DNA序列和ITS序列比对进行鉴定。
1.5.1)形态观察
a、采用划线分离，挑取单菌落划线于不同得培养基上，让各菌株在适宜生长温度下培养(细菌和放线菌28℃下培养，真菌在30℃下进行培养)，观察菌落的生长状况，并做好记录。
b、对生长良好的菌株进行镜检观察，观察其在显微镜下的形态特征，并拍照记录。
1.5.2)序列比对鉴定
细菌和放线菌总DNA采用细菌基因组提取试剂盒提取，真菌总DNA采用真菌基因组提取试剂盒提取。以提取的细菌和放线菌总DNA为模板，该过程由于技术设备不完善，我们将得到的单菌落斜面培养储存后拿到杭州联川生物技术股份有限公司进行送检，确定最后菌株的种属类型。
a、细菌16SrDNA序列扩增
采用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')与806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')引物扩增细菌菌株16SrDNA序列。
PCR反应体系：
Figure BDA0002275190340000131
Hot Start Flex 2X Master Mixart Version：12.5uL、Forward Primer(1μM)：2.5uL、Reverse Primer(1μM：2.5uL、模板DNA：50uL、加ddH2O 25uL。
PCR反应条件：预变性98℃30s；变性98℃10s，退火54℃30s，延伸72℃45s，35个循环；最后延伸72℃10min；保持4℃。
将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求。
b、真菌ITS2序列扩增
采用fITS7(5'-GTGARTCATCGAATCTTTG-3')与ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')引物扩增真菌菌株ITS序列。
PCR反应体系：
Figure BDA0002275190340000132
Hot Start Flex 2X Master Mixart Version：12.5uL、Forward Primer(1μM)：2.5uL、Reverse Primer(1μM：2.5uL、模板DNA：50uL、加ddH2O 25uL。
PCR反应条件：预变性98℃30s；变性98℃10s，退火54℃30s，延伸72℃45s，35个循环；最后延伸72℃10min；保持4℃。
将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求。
1.5.2)筛选得到能降解玉米秸秆，主要包括木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属和草螺菌属。
1.5.3)确定复合菌系中菌种的质量百分比
将木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属选择不同的质量百分比，见表A，进行玉米秸秆的降解试验，确定最优方案
表A
Figure BDA0002275190340000141
从表中可以的得出木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属的质量百分比分别为20％～40％、20％～40％、5％～10％、20％～40％、5％～10％，对玉米秸秆效果好，尤其是木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属的质量百分比分别为30％、30％、5％、30％、5％时，降解率效果最好。
二、试验结果与分析
2.1初筛结果
2.1.1分离纯化结果
通过纤维素刚果红培养基的涂布培养，选择出24株生长较好的菌株对其编号，并进行分离纯化。并选择出几株菌株的生长情况如图1所示。从菌落形态可以初步判断多数菌为霉菌、放线菌和少量的细菌。
2.1.2刚果红初筛结果
将分离纯化后生长迅速的菌株分别采取打孔，点接的方式进行刚果红培养筛选，观察并测量其透明圈的直径大小和菌落直径大小，并选择了几株菌株的筛选结果如图2和图3所示，以及测量结果汇总表如下表4。
表4菌落直径与其对应透明圈直径大小汇总表
Figure BDA0002275190340000151
根据透明圈直径与菌落直径的比值大小，选择出A2,A3,A4,N1,C1,G3,P1这8株菌株进行滤纸条崩解试验。其中在这8株菌株中C1,N1这两株菌株的纤维素酶活较为显著。
2.1.3滤纸条崩解试验结果
根据数天观察滤纸条的降解情况来对判定符合条件的菌株。从如图4和图5所示的结果可以看出来：多数滤纸条的降解程度不完全，处于滤纸条周边出现毛边的情况；部分是3/5发生降解；较少部分发生完全降解。
总之，得出结论：发生降解的只是少部分，其原因可能是只以滤纸条为碳源，其微生物需要生长碳源供给不够。
2.2复筛结果
2.2.1酶活测定
葡萄糖标准曲线如图6所示，根据检测所作的葡萄糖标准曲线图；
滤纸酶活与CMCase酶活汇总表如下表5
表5筛选菌株酶活力
Figure BDA0002275190340000161
2.3菌株鉴定结果
1)形态鉴定结果：
将酶活较大的几株菌株经过CMC培养基划线分离纯化培养后得到不同的如图1和图7所示的菌落。根据菌落形态可以初步看出部分菌落表面是有菌丝的，颜色呈现白色；也有菌落看起来为偏黄色，气味有酒香味；有形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，菌落表面为粉末状或颗粒状的菌落。
2)显微镜观察结果如图8所示。
3)分子生物学鉴定
a、将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，得到如图9和10所示的序列电泳图，序列1、2、4为所挑选菌株目的条带片段。由引物338F和806R PCR扩增得到的目的片段长度约为469bp，为了满足建库的需要，需对引物进行修饰，合成带有测序用接头的引物，因此实际电泳得到的片段长度更长。
b、将扩增后的ITS进行凝胶电泳检测，得到如图9和10所示的序列电泳图，序列1、3为所挑选菌株目的条带片段。由PCR扩增得到的目的片段长度约为353bp，为了满足建库的需要，需对引物进行修饰，合成带有测序用接头的引物，因此实际电泳得到的片段长度更长。
本实施例首先通过样品处理与初筛实验得到满足要求能将木质素降解的部分菌落，并将其进行分离纯化，得到单菌落；其次通过刚果红纤维素培养基在适宜温度条件下进行培养，得到初筛菌落透明圈直径大小与菌落大小的比值，进而进一步判断菌落是否符合要求，并初步判断其酶活的大小；再次采用滤纸条培养基观察纤维素降解菌对滤纸条的降解效果，得到较优菌；然后通过酶活测定实验，测定滤纸条酶活和羧甲基纤维素酶活的大小；将选出的菌落划线分离纯化，将得到单菌落进行镜检观察其形态，并送至杭州联川生物技术股份有限公司进行送检，确定最后菌株的种属类型，筛选得到能降解玉米秸秆，主要包括木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属和草螺菌属。
实施例二
本实施例利用实施例一筛选出高效生物质纤维素降解菌构建的复合菌系制备复合菌酶制剂，其工艺流程如图11所示，主要包括菌种培养、发酵过程、酶的提取分离与纯化、酶成品与检测包装的过程。
工艺操作要点
1、菌种培养
选择的真菌、细菌、放线菌的复合菌株在相应的培养基上扩增和培养。具体步骤：
1.1)用无菌生理盐水清洗倾斜表面，摇匀，放入无菌烧瓶中摇匀；
1.2)在种子瓶中接种斜培养物，将细菌在30℃，180r/rain下培养12小时以获得种子液，将模具在28℃，220r/rain下培养48小时以获得种子液；浓度为10％的种子液体通过接种到发酵烧瓶中并使培养物膨胀48小时来获得发酵液。
2.发酵过程
2.1)发酵培养基
麦麸5％、玉米秸秆粉20％、酵母膏0.05％、蛋白胨0.3％、七水硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.4％、二水氯化钙0.03％、硫酸铵1.5％、吐温-80 0.8％，余量为水；
其中，玉米秸秆粉通过玉米秸秆原料粉碎过筛、高温高压灭菌后获得；
2.2)种子培养基
40目玉米秸秆粉1％、酵母膏0.05％、蛋白胨0.3％、硫酸镁0.03％、硫酸铵0.2％、磷酸二氢钾0.4％。
菌种活化后按7％的接种量接种到一级种子罐中通气培养，培养48小时后再接种到二级种子罐中，培养48小时后按7％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵。
2.3)发酵培养基灭菌
采用高压蒸汽直接通入发酵罐里的一种实罐灭菌的方式。既能节省空间资源，又能节约成本。
2.4)发酵条件控制
根据影响发酵的因素，包括所需的时间、温度(25℃-35℃)、pH(7.2-7.5)、通气量(1:0.2-0.3)、搅拌的速度(100-150r)、溶氧量等，选择出较为适合的量来对发酵过程进行控制。
2.5)发酵终点的控制
根据发酵液的pH值，以及镜检观察来确定菌的状态，如霉菌菌丝自溶、断裂，或者80％以上的菌丝着色时选择放罐。
3.纤维素酶的提取分离与纯化
3.1)发酵液预处理
待到发酵结束后往向冷蛇管内通入蒸汽，使发酵液温度维持在90℃，10min。
3.2)发酵液的过滤
一般采用板式过滤机进行过滤，在常压滤饼形成后，加压至0.3-0.4Mpa来进行过滤。之后将滤液储存于储罐中，分批次进行后续操作过程。
3.3)浓缩
调节pH到4.5，在40℃、2.0Kpa下利用真空蒸发仪将滤液浓缩。
3.4)沉淀与酶泥的再溶
采用盐析的方法进行酶分离，采用向沉淀中加入硫酸铵。
3.5)依次经过过滤、溶解酶泥、离心
3.6)纯化
使用单宁这一种纯天然的纤维素酶抑制剂来进行纯化过程。用单宁与活化的琼脂糖进行亲和力层析，用蒸馏水平衡，使前一步骤中得到的酶溶液通过柱子，然后用磷酸盐缓冲液洗脱。获得纯化的液体纤维素酶。
3.7)浓缩
采用真空蒸发器，在50℃时进行真空浓缩，除去液态酶中约2/3的水分。
4.酶成品与检测包装
4.1)液体酶的混合与包装
采用喷雾干燥的方式使浓缩液形成粉状的酶，该过程之前需要向浓缩液中加入丙二醇，用以维持复合酶制剂的活性。并标明酶制剂的名称，生产厂家、保质期等信息。
4.2)检测
酶制剂的成品各项指标要符合《工业酶制剂通用检测规定和标志、包装、运输、贮存》QB/T1840-93的要求。并根据一定的方法检测酶活力。
物料衡算
1、基础数据
年产量：1000t/年；
实际生产天数：300d/年；
日产量：3.33t/天；
生产制：两班/d，8h/班；
班产量：1.67t/班；
发酵罐的装料系数：70％；
生产周期：霉菌5d；细菌产芽孢的为5d；放线菌为5d；混合比例为3:1:1，选择合适的生产周期为5d，在300个工作日内日，周期共有60个；
发酵产率：6.5％；
酶的提取率：75％；
种子罐的装料系数：75％；
发酵液的密度：1020kg/m3。
使用发酵罐的数量：3个，容积为200m3；
2、物料衡算
本实施例要求日产量1.5吨，考虑到各个工序的物料损耗情况，故每日原料处理量需大于1.5吨生产物料衡算表见表6；
1)玉米秸秆：玉米秸秆需要经过粉碎后才能使用，其中损失率按15％计算，投料比为3:1进行计算，则每次发酵所需的玉米秸秆的量＝发酵液总质量*产酶率*玉米秸秆投料比*(1-损失率)；
则m＝[3*200*70％+9*5*75％+3*4*75％]*1020*6.5％*3/85％＝108.3t
年产量为108.3*60＝6498t
2)麦麸：秸秆与麦麸的比例为4:1时酶产量最高；
所以麦麸的用量为：玉米秸秆量/4＝108.3/4＝27.1t
年产量为27.1*60＝1626t
3)酵母膏:一个发酵周期所需的培养基量为
[3*200*70％+4*3*75％+5*9*75％]*1020＝462.75t
酵母膏的用量为0.05％，则462.75*0.05％＝0.23t，
年产量为0.23*60＝13.9t
4)木质纤维：充当碳源，用量为1％。462.75*1％＝4.63t，
年产量为4.63×60＝277.8t
5)蛋白胨:用量为0.3％，则462.75*0.3％＝1.4t
年产量为1.4×60＝84t
6)七水硫酸镁:用量为0.03％，则462.75*0.03％＝0.14t
年产量为0.14×60＝8.4t
7)磷酸二氢钾：用量为0.4％，则462.75*0.4％＝1.85t
年产量为1.85×60＝111t
8)二水氯化钙:用量为0.03％，则462.75*0.03％＝0.14t
年产量为0.14×60＝8.4t
9)吐温-80:发酵培养基中添加0.8％，种子培养基中添加0.02％，则3*200*70％*0.8％+[4*3*75％+5*9*75％]*0.02％＝3.37t
年产量为3.3×60＝202.2t
10)硫酸铵：作为氮源时用量为1.5％，在种子培养基中用量为0.2％，则3*200*70％*1020*1.5％+[5*9*75％+4*3*75％]*1020*0.2％＝7.3t
年产量为7.3*60＝438t。
11)沉淀剂：过滤后的滤液体积：200*70％*2*80％*40％＝89.6m3(两个罐为一个周期)；
硫酸铵可用作沉淀剂，其中用量为20％饱和度和60％的饱和度。查表可知，采用盐析法时，在25℃条件下，需向1m3的溶液中加入114kg的硫酸铵。经过静置、过滤处理后，再向滤液中加入硫酸铵，使饱和度由20％到60％，此过程应加入262kg的硫酸铵。
此时用量为89.6*114+89.6*262*90％＝31342.1kg＝31.34t
年产量为31.34*60＝1880.4t
12)消泡剂：用量为0.03％，则3*200*70％*0.03％＝0.126t
年产量为0.126*60＝7.56t
13)乙醇:沉淀过程中所采用的是70％的乙醇，其用量为2倍
所以产量为89.6*2*70％*789＝99t
年产量为99*60＝5940t
表6生产物料衡算表
Figure BDA0002275190340000211
3、设备选型
3.1)设备选型原则
a)满足工艺生产要求，确保产品的质量和产量。
b)通常而言，大型工厂应使用更先进的机械化设备。而中型工厂，一些主要产品可以配备更高程度的机械化和连续工艺，而小型工厂使用更简单的设备。
c)所选设备可充分利用原材料，损耗小，效率低，体积小，维护方便，劳动强度低，用途多。
d)所选设备应符合产品卫生要求，易于清洗，安装和拆卸，与产品接触的材料不易腐蚀，不会造成污染。
e)设备结构合理，材料性能可适应各种工况(如温度，湿度，压力，pH等)。
f)在温度，压力，真空度，浓度，时间，速度，流量，液位，计数和程序等方面都有合理的控制系统，并尝试采用自动控制。
3.2)设备选型设计
1)粉碎机
玉米秸秆粉碎机及40目筛分器：年用量/处理时间＝2092.2×1000÷300÷8＝871.75kg/h，根据玉米秸秆硬度较大要求，选择玉米秸秆粉碎型号为9ZT-12C。见表7所示，该型号粉碎机结构简单坚固、易清洗、粉碎效果良好，通过更换不同孔径的网筛以获得不同粒径的粉碎产物。
表7粉碎机规格
Figure BDA0002275190340000221
2)配料罐，见表8所示，
配料罐总体积＝发酵培养基体积/装料率＝200*70％*(1-7％)/85％＝153.2m3
根据各物料的配比，确定各配料罐的体积分别为：
酵母膏：153.2×0.05％＝0.077m3，选择100L的配料罐。
蛋白胨：153.2×3％＝4.57m3，选择5m3配料罐。
无机盐：153.2×(0.03+0.03+0.4+1.5)％＝3.0m3,选择3m3的配料罐。
表8配料罐规格
Figure BDA0002275190340000222
3)发酵罐，见表9
设计月生产量83.33吨，则日平均产量为3.33吨。设计发酵温度控制在28℃～35℃；PH控制在6.5-7.2；搅拌转速180-220r/min。转速过快会对菌丝体产生破坏，转速过慢易产生发酵泡沫，会因为溶解氧不足而影响微生物的生长繁殖。
年产酶量＝发酵罐容积×发酵液密度×所需发酵罐个数×全年发酵周期数×发酵罐装液量×产酶率×酶提取率
则发酵罐体积为1000×1000÷1020÷60÷0.7÷0.065÷3÷0.7＝171m3
所以发酵罐的有效体积为200m3。
表9发酵罐规格
Figure BDA0002275190340000231
4)种子罐，见表10
(1)二级种子罐体积＝发酵罐容积×装料系数×接种量÷一级种子罐装料系数(每班用2个)＝200×0.7×0.07÷0.75＝13.1m3
故选择5m3种子罐，故可以估计数量为9个。
一级种子罐体积＝二级种子罐体积×装料系数×接种量÷一级种子罐装料系数＝13.1×0.75×10％÷0.75×9＝11.79m3，
故选择4m3的种子罐，估计数量为3个。
表10种子罐规格
Figure BDA0002275190340000232
5)沉淀罐，见表11
经真空浓缩的处理液分3批进行后续的过程。
发酵结束后需要进行过滤的滤液量为200×0.85＝170m3，其装液率为0.8，经处理的液体量为(102-3.83×16)÷16＝2.55m3，则沉淀罐的体积为2.55÷0.8＝3.2m3，选用5m3沉淀罐。醇溶罐与发酵罐的尺寸比例相同。
表11沉淀罐规格
Figure BDA0002275190340000241
6)储罐，见表12
发酵液储罐体积＝3个发酵罐中发酵液的体积÷装液系数
＝3×200×0.7÷0.85＝494.12m3
选择温州市伯泰机械科技有限公司的立式储罐，由设备内筒体和外包皮组成，中间填充保温材料。设备材料均为优质不锈钢制造，内为镜面抛光，无死角。有快开式人孔、数显温度表、T型清洗头、拉杆式出料阀、可调式锥形支脚，操作方便快捷，安全可靠。设备参数：
表4.8储罐规格
Figure BDA0002275190340000242
7)真空蒸发器，见表13
本次生产工艺要求在低于60℃的条件下将水分除去2/3，其装液率为0.8，经处理的液体量为170×0.8×0.75＝102m3，经真空蒸发后要求产物浓度由0.065到0.17，时间为16小时，则其生产能力为W＝F(1-0.065/0.17)＝3.94m3/h
表13真空蒸发器规格
Figure BDA0002275190340000243
Figure BDA0002275190340000251
8)过滤机，见表14
发酵结束后需要过滤的发酵液体积102m3，含固形物的量为27％，采用WYBL型板式密闭过滤机，是一种高效节能的精密过滤设备。其技术参数如下表所示：
表14板式密闭过滤器规格
Figure BDA0002275190340000252
9)喷雾干燥器，见表15
对固体酶制剂的含水量要求很低，所以采用喷雾干燥器在两三小时内将水分蒸发至最低。选择JY-PWGZ-600型喷雾干燥器，水份蒸发量2000kg/h。其技术参数如下表所示。
表15喷雾干燥器规格
Figure BDA0002275190340000253
10)包装机
使用逸飞包装机械的YF-320/430/520四边封自立袋包装机，用于将晶体多糖进行包装。不锈钢(304)机体，确保卫生，易于清洁。PLC控制，触摸屏显示，性能卓越，操作和维护简便。双伺服系统分别控制拉膜机构和横封机构。打码机与送膜机构同步运行，自动打印日期、批号。一体化成型器，拆装、更换简便。
3.3)本实施例设备一览表见表16；
表16设备一览表
Figure BDA0002275190340000261
4.环境保护
4.1)废气及处理措施
废气主要来源：浓缩过程的乙醇及水蒸汽；
处理措施：冷凝回收循环使用。
4.2)废渣及处理措施
微波处理后，离心产生的黑豆皮废渣，处理后可做肥料使用。
4.3)噪音及处理措施
生产过程中尽量选取噪声小的设备，把工厂噪音控制在标准范围之内。
4.4)环境影响评价
综合以上分析，本申请人在生产过程中产生的废水、废气、废渣以及噪音等均不会对环境产生有毒有害物质，在工厂建成投产之后，并不会对周围环境产生明显破坏。
本实施例复合菌酶制剂的工艺流程、工艺衡算、车间设备布置与主要生产设备设计结果，以及经济技术与环境影响初步评估结果显示，符合工业化生产在经济技术、环境上可行性。
以上仅是对本发明的优选实施方式进行了描述，并不将本发明的技术方案限制于此，本领域技术人员在本发明主要技术构思的基础上所作的任何公知变形都属于本发明所要保护的技术范畴。

Claims (10)

1.一种木质纤维素降解复合菌系，其特征在于：包括从腐烂秸秆中分离出的木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属及草螺菌属；
所述木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属的质量百分比分别为20％～40％、20％～40％、5％～10％、20％～40％、5％～10％。
2.根据权利要求1所述木质纤维素降解复合菌系，其特征在于：所述木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属的质量百分比分别为30％、30％、5％、30％、5％。
3.一种用于培养权利要求1或2所述木质纤维素降解复合菌系的复合菌培养基，其特征在于：
所述复合菌培养基为纤维素刚果红培养基，包括2.0g/L CMC—Na、2.0g/L(NH4)2S04、0.5g/L NaCl、1g/L K2HPO4、0.5g/L MgS04·7H2O、0.4g/L刚果红、12g/L琼脂；
CMC—Na通过CMC添加柠檬酸缓冲溶液加热溶解制得；
所述复合菌培养基的pH为7.0。
4.一种权利要求1或2所述木质纤维素降解复合菌系的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：
麦麸5％、玉米秸秆粉20％、酵母膏0.05％、蛋白胨0.3％、七水硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.4％、二水氯化钙0.03％、硫酸铵1.5％、吐温-80 0.8％，余量为水。
5.利用权利要求1或2所述木质纤维素降解复合菌系制备复合菌酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种培养
1.1)将木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属分别在相应培养基上扩增和培养；
2)发酵过程
2.1)活化后的菌种接种到一级种子罐中通气培养，培养后再接种到二级种子罐中，培养后接种到发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；
发酵培养基：麦麸5％、玉米秸秆粉20％、酵母膏0.05％、蛋白胨0.3％、七水硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.4％、二水氯化钙0.03％、硫酸铵1.5％、吐温-80 0.8％，余量为水；
2.2)根据发酵液的pH值，以及镜检观察来确定菌的状态；
3)酶的提取分离与纯化
3.1)使发酵液温度维持在90℃，保持10min；
3.2)发酵液进行过滤、浓缩后，采用盐析进行酶分离；
3.3)使用纤维素酶抑制剂进行纯化，获得纯化的复合菌酶。
6.根据权利要求5所述木质纤维素降解复合菌系制备复合菌酶的方法，其特征在于：将木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属、草螺菌属活化后接种于发酵培养基中，28～30℃发酵7～10d，期间持续搅拌；接种量为7％。
7.一种木质纤维素降解复合菌系的分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样品处理与初筛
1.1)样品处理
称取一定量的秸秆样本，加入到盛有无菌生理盐水并且带有玻璃珠三角瓶中，于37℃恒温摇床摇动，将样品充分混匀打散备用；
1.2)初筛
1.2.1)将步骤1.1)获得的样本用无菌水逐级10倍稀释至10-6、10-7、10-8倍后，分别取0.1mL涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，每个浓度重复涂布3个平板；
所述纤维素刚果红选择性培养基包括2.0g/L CMC—Na、2.0g/L(NH4)2S04、0.5g/LNaCl、41g/L K2HPO4、0.5g/L MgS04·7H2O、0.4g/L刚果红、12g/L琼脂；
所述CMC—Na溶液通过0.51g CMC，添加一定量的0.05mol/L的柠檬酸缓冲溶液，加热溶解制得；
所述纤维素刚果红培养基的pH为7.0；
1.2.2)28℃下培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株；
1.2.3)通过划线分离纯化所挑取的菌株，直至得到单菌落；
2)酶活性的测定
2.1)将纯化后的菌株进行筛选，选择生长状况良好的菌株，显微镜下观察并初步根据菌株形态确定菌株的种属；
2.2)将霉菌和放线菌制成菌悬液分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和高氏合成一号培养基上，待霉菌菌落和放线菌菌落长出后，用打孔器打菌饼并接种于纤维素刚果红平板培养基上；细菌直接采取点接的方式接种于纤维素刚果红培养基上；
其中，马铃薯葡萄糖琼脂培养基：100mL马铃薯浸汁、2g琼脂、2g葡萄糖；
高氏合成一号培养基：2.0g可溶性淀粉、0.1g KNO3、0.05g K2HPO4·3H2O、0.001gFeSO4·7H2O、0.05g NaCl、0.05g MgSO4·7H2O、1.5-2g琼脂、100mL蒸馏水，pH为7.2-7.4；
2.3)在28℃恒温培养箱中培养3～5天，观察并测量透明圈的直径大小；
2.4)计算透明圈直径D与菌落直径d的比值，测定各菌株的羧甲基纤维素酶活性的高低，所述透明圈直径D与菌落直径d的比值越大酶活性越高；
2.5)筛选出具有高羧甲基纤维素酶活性的菌株；
3)滤纸条崩解实验
3.1)将步骤2.5)筛选出的菌株进行活化，取用1mL接种于装有20ml的滤纸条崩解培养基的试管中，培养10～12天，定期观察滤纸条崩解情况；
其中，滤纸条崩解培养基：1.0g/L(NH4)2S04、0.5g/L MgS04·7H2O、1.0g/L KH2PO4、0.1g/L酵母膏、滤纸条；pH为7.0；
3.2)筛选出纤维素酶活性最高的的菌株
4)菌株的鉴定
4.1)形态鉴定
4.1.1)将筛选出的菌株进行划线分离纯化后，挑选单菌株划线于培养基上培养，各菌株在适宜生长温度下培养，观察各菌株的生长状况；
4.1.2)对生长良好的菌株进行镜检观察，观察其在显微镜下的形态特征；
4.2)序列比对鉴定
4.2.1)细菌16SrDNA序列扩增
采用338F与806R引物进行PCR扩增得到细菌菌株16SrDNA序列，将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求，获得每个样本中细菌的物种；
4.2.2)真菌ITS2序列扩增
采用fITS7与ITS4引物进行PCR扩增得到真菌菌株ITS序列，将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求，获得每个样本中细菌的物种；
4.3)复合菌系
筛选得到能降解玉米秸秆，主要包括木霉、青霉、梭菌属、芽孢杆菌属和草螺菌属。
8.根据权利要求7所述木质纤维素降解复合菌系的分离鉴定方法，其特征在于，在步骤3)与步骤4)之间还包括步骤菌株复筛a，具体为：
a1)制作葡萄糖标准曲线
a11)分别取8只试管按顺序进行编号，依次取葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml加入试管中，并加入蒸馏水将每支试管补加至2.0ml；
a12)将蒸馏水与葡萄糖标准液的混合溶液充分摇匀后，分别加入2ml DNS试剂，摇匀后沸水浴加热5min，冷却后用水补足至20ml；
其中，DNS试剂通过18.2g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水中并加热，在热溶液中依次加入0.63g 3，5-二硝基水杨酸、2.1g NaOH、0.5g苯酚，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定容至100ml；
a13)在540nm波长下分别测定8只试管的吸光度，获得葡萄糖标准曲线；
a2)制备粗酶液
将步骤3.2)筛选出的菌株成菌悬液，分别取一定菌悬液加入发酵产酶培养基中；在30℃、160r/min下培养，获得的培养液在离心机下离心获得上清液，所述上清液为粗酶液；
其中，发酵产酶培养基：20g玉米秸秆粉、4g NH4NO3、2g K2HPO4、0.5MgS04·7H2Og、0.4g无水CaCl2、0.5g NaCl、1000mL蒸馏水，pH为6.0；
a3)酶活性鉴定
a31)滤纸条酶活
a311)取3支试管，分别加入0.5ml的粗酶液、1.5ml的柠檬酸缓冲液；
a312)向其中一支试管中加入2.0mlDNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热5min；
a313)向三支试管中各加入滤纸条，摇匀，50℃反应60min，取出后立即向其中另外两个试管中加入2.0ml DNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热5min；
a314)在540nm波长下测定吸光值；
a32)羧甲基纤维素酶活
a321)取3支试管，分别加入1.5ml的0.51％CMC柠檬酸缓冲液、0.5ml酶液；
其中，0.51％的CMC-Na溶液通过0.51g CMC，添加一定量的0.05mol/L的柠檬酸缓冲溶液，加热溶解制得；
a322)向第一支试管中加入2.0mlDNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热5min，50℃反应下30分钟；
a323)取出后除第一支试管外均加入1.5ml的DNS试剂，摇匀并沸水浴5min，取出冷却至室温，摇匀；
a324)在540nm波长下测定吸光值。
9.根据权利要求7所述木质纤维素降解复合菌系的分离鉴定方法，其特征在于：步骤3.1)中每支试管中放入2个滤纸条，每个滤纸条尺寸为1*6cm；
或者，每支试管中放入1个滤纸条，每个滤纸条尺寸为1*7cm
步骤4.1.1)中，挑选出的菌株在CMC培养基中划线分离纯化；
细菌和放线菌在28℃下培养，真菌在30℃下进行培养；
步骤4.2)中，PCR反应条件：预变性98℃30s、变性98℃10s、退火54℃30s、延伸72℃45s、35个循环、延伸72℃10min、保持4℃。
10.一种权利要求1或2所述木质纤维素降解复合菌系或利用权利要求6所述方法制备的复合菌酶在秸秆降解中的应用。
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