CN115181704B - 一株地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39及其应用 - Google Patents

一株地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5‑39及其在降低大豆抗原蛋白工艺中应用。属于微生物菌剂技术领域。保藏编号为CGMCC NO：22062。本发明地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5‑39可以高效降解大豆抗原蛋白，对大豆球蛋白的降解率达95.94％，对β‑伴大豆球蛋白的降解率达92.33％，明显高于其他菌种发酵对抗原蛋白的降解率，降解效果显著。

Description

一株地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39及其应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，更具体的说是涉及一株地衣芽孢杆菌BacillusLicheniformisY5-39及其应用。
背景技术
玉米、豆粕等是畜禽饲料的主要原料，其中豆粕是大豆经过榨油之后得到的副产物，蛋白质含量高，氨基酸组成平衡，在玉米-豆粕型日粮中约提供70％的蛋白质，可以满足畜禽生长所需营养，是动物饲料中不可缺少的植物性蛋白原料。但是，豆粕中含有多种抗营养因子如大豆抗原蛋白、胰蛋白酶剂、植酸等，这些都会干扰动物肠道对营养物质的吸收利用，破坏肠道形态结构，进而引发幼畜腹泻。研究表明大豆球蛋白(11s蛋白)和β-伴大豆球蛋白(7s蛋白)是大豆抗原蛋白主要致敏蛋白，可引发动物肠道发生过敏反应，特别对仔猪等幼龄动物影响较大，引发腹泻，造成幼畜生长受阻甚至死亡。因此，如何降低大豆中抗原蛋白含量，成为近年来国内外研究热点。现有技术表明，目前降低抗原蛋白含量的方法包括物理法、酶解法以及微生物发酵法，但是大豆中的主要蛋白是大豆球蛋白和β-伴球蛋白，其热稳定性高，物理方法很难降低其致敏性；酶解法中所需要的酶制剂应用成本较高不利于大规模生产，相对来说，微生物发酵法成本较低，且操作简单，备受研究学者的关注。
但是，现有技术中微生物发酵法降解大豆抗原蛋白的机制尚不明晰，可以高效降解大豆抗原蛋白的菌株数量有限，且菌株具有特异性，这些仍是制约菌株功能开发的关键因素。
因此，提供可以高效降解大豆抗原蛋白的菌株，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39，于2021年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO：22062，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌种发酵过程中可以高效降解大豆抗原蛋白，对大豆球蛋白的降解率达95.94％，对β-伴大豆球蛋白的降解率达92.33％，明显高于其他菌种发酵对抗原蛋白的降解率，降解效果显著。
本发明的另一目的是提供上述地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39在发酵豆粕工艺中的应用。
优选地，地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39和0.6％的磷酸氢二钠联合应用。
优选地，所述地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39在豆粕中所含大豆总蛋白溶解后加入。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39，该菌株可以高效降解大豆抗原蛋白，对大豆球蛋白的降解率达95.94％，对β-伴大豆球蛋白的降解率达92.33％，明显高于其他菌种发酵对抗原蛋白的降解率，降解效果显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为提取的大豆总蛋白的凝胶电泳图；
图2附图为提取的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的凝胶电泳图，注：1-1、2-1、3-1：得到的大豆球蛋白，1-2：方法一得到的β-伴大豆球蛋白，2-2：方法二得到的β-伴大豆球蛋白，3-2：方法三得到的β-伴大豆球蛋白；
图3附图为发酵大豆球蛋白电泳图；
图4附图为采用未优化发酵方法对总蛋白进行发酵后凝胶电泳图，注：12-1、12-2、12-3、12-4均为发酵12h，24-1、24-2、24-3、24-4均为发酵24h，36-1、36-2、36-3均为发酵36h，48-1、48-2、48-3均为发酵48h；
图5附图为采用优化发酵方法对总蛋白进行初步发酵后凝胶电泳图，注：20、30、48分别为发酵20h、36h、48h；
图6附图为采用优化发酵方法对总蛋白进行最终发酵后凝胶电泳图；
图7附图为α’亚基泳道信号图，注：不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P＜0.05)；
图8附图为α亚基泳道信号图，注：不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P＜0.05)；
图9附图为β亚基泳道信号图，注：不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P＜0.05)；
图10附图为酸性亚基泳道信号图，注：不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P＜0.05)；
图11附图为碱性亚基泳道信号，注：不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P＜0.05)；
图12附图为发酵过程中pH随发酵时间的变化，注：不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P＜0.05)；
图13附图为发酵过程中可溶性蛋白含量随发酵时间的变化，注：不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P＜0.05)；
图14附图为发酵过程中蛋白含量随发酵时间的变化，注：a代表发酵过程中大豆球蛋白含量随发酵时间的变化；b代表发酵过程中β-伴大豆球蛋白含量随发酵时间的变化；不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P＜0.05)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
大豆总蛋白的提取
将粉碎后的豆粕与蒸馏水按照料液比1:10(m/v)混合，用1M氢氧化钠调pH 9.0-9.3，随后在40℃条件下恒温水浴并缓慢搅拌90min，把溶液用三层纱布过滤，滤液9000r/min，离心10min，上清液用1M盐酸调pH至4.5，8000r/min，离心5min，所得沉淀为大豆总蛋白，冷冻干燥备用。
将实施例1制备的大豆总蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图1附图所示，结果表明：从图1可以看到，采用碱溶酸沉提取得到的总蛋白质，包含了大豆蛋白的主要成分。其中β-伴大豆球蛋白的三个主要亚基分布的条带清晰完整，位于40kDa-80kDa之间。位于20kDa-40kDa之间的两个主要条带是大豆球蛋白酸性多肽链和碱性多肽链。这五条带的分布表明上述提取方法可提取得到11S蛋白和7S蛋白的主要组分，从而能够应用于后续的分离及发酵。
实施例2
大豆球蛋白的提取
将粉碎后的豆粕与水按照料液比1:12(m/v)混合，用1M氢氧化钠调pH 9.0-9.3，随后在40℃条件下恒温水浴并缓慢搅拌90min，将溶液经过三层纱布过滤，滤液9000r/min，离心10min，所得上清液加入亚硫酸氢钠和氯化钙至浓度分别为0.01M、0.005M，即每100mL上清液加入0.104g亚硫酸氢钠、0.056g氯化钙，再用1M盐酸将溶液pH调至6.4，4℃过夜，4℃，8000r/min，离心20min，沉淀冷冻干燥为大豆球蛋白粗品。
实施例3
β-伴大豆球蛋白提取
方法一：根据Jinqiang Hu,Yang Liu,Guangjie An,et al.Characteristics ofmolecular composition and its anti-nutrition ofβ-conglycinin duringflavorzyme proteolysis[J].Food Bioscience,2021,42:101039的方法，将最后一步离心得到的上清液用2M盐酸调pH至5.0，4℃，8500r/min，离心20min，去除沉淀，向上清液中加入0.4M氯化钠，55℃孵育10min后，将上清液调pH至4.6，8000r/min，离心20min，收集沉淀。
方法二：参考Li T,Bu G,Xi G.Effects of heat treatment on theantigenicity,antigen epitopes,and structural properties ofβ-conglycinin[J].Food Chem,2021,346:128962制备β-伴大豆球蛋白的方法并稍作改动，用盐酸将得到的上清液调节至pH 5.5，4℃，用等体积的冰水稀释上清液，8500r/min离心20min。再将上清液调节至pH 4.8并离心，得到沉淀。
方法三：根据Nagano方法(Nagano T,Fukuda Y,Akasaka T.Dynamicviscoelastic study on the gelation properties ofβ-conglycinin-rich andglycinin-rich soybean protein isolates.Journal of Agricultural and FoodChemistry.1996,44:3484-3488)，向分离出大豆球蛋白后得到的上清液中加氯化钠至0.25M，用1M盐酸调pH至5.0，静置1h，随后4℃，8000r/min，离心20min，弃去沉淀，上清液用冰水稀释两倍并用1M盐酸调pH4.8，4℃，8500r/min，离心20min，得到沉淀。
将实施例2和实施例3制备大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图2附图所示，结果表明：图2中泳道1-1、2-1、3-1为提取的大豆球蛋白的凝胶电泳图，三条泳道在大豆球蛋白对应的两个条带位置处，条带颜色较深，说明提取得到了大豆球蛋白，而β-伴大豆球蛋白的α、α,亚基位置处，条带颜色明显变浅，表明β-伴大豆球蛋白经过分离后，含量明显降低，从而可确定采用上述大豆球蛋白的提取方法，可初步将大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分离开，并提取出大豆球蛋白。
图2中泳道1-2、2-2和3-2分别对应方法一、方法二和方法三提取得到的β-伴大豆球蛋白的凝胶电泳图，泳道1-2、2-2与3-2在β-伴大豆球蛋白三个亚基对应的分子量位置均有三个颜色较深的条带，证明提取到了β-伴大豆球蛋白，但泳道1-2与3-2在大豆球蛋白所对应的分子量位置，也出现了两条清晰条带，表明没有将β-伴大豆球蛋白从混合蛋白中初步分离出来。从上述结果显示，采用方法二可以将β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白分离开，并初步提取到β-伴大豆球蛋白，可用于后续发酵检测。
实施例4
地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39的活化与菌悬液制备
菌种活化：无菌条件下用移液枪吸取100μL保存在甘油中的菌种，加入至已灭菌的LB液体培养基里面，37℃摇床培养14h。挑取适量发酵液在试管斜面中划线，37℃培养14h，得到活化好的菌种。
菌悬液制备：从斜面挑取适量保存的菌种于LB液体培养基中，37℃，150r/min，摇床培养12-14h，作为接种液，其菌种浓度为7.4×108CFU/mL。
实施例5
地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39发酵对大豆球蛋白降解研究
向50mL的三角瓶中加入20mL 0.8％(m/v)的葡萄糖溶液，pH自然(没有调pH)，115℃，灭菌30min，冷却后按照C/N(葡萄糖：大豆球蛋白)＝2:5的比例，在无菌条件下加入0.4g实施例2制备的冻干大豆球蛋白，按照总发酵液3％(600μL)的接种量加入地衣芽孢杆菌菌悬液，37℃，200r/min，摇床发酵。对0h、24h和48h的发酵液进行SDS-PAGE电泳，结果如图3附图所示，结果表明：与发酵0h相比，发酵24h后大豆球蛋白的酸性多肽链条带完全消失，碱性多肽链条带颜色明显变浅，并且在10-25kDa范围内有新的条带产生，发酵48h后大豆球蛋白对应的两个条带几乎完全被降解，在10-25kDa范围内的条带颜色进一步变浅。
实施例6
地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39发酵对大豆总蛋白降解研究
未优化的发酵方法：将葡萄糖溶液，115℃，灭菌30min，向50mL的三角瓶中加入20mL 0.8％(w/v)的葡萄糖溶液，在无菌条件下加入0.4g已冻干的大豆总蛋白粗品，按照3％接种量加入600μL地衣芽孢杆菌菌悬液，37℃，200r/min，摇床发酵。发酵液通过SDS-PAGE电泳初步判断抗原蛋白降解情况。
优化的发酵方法：将葡萄糖及无机盐(磷酸氢二钠0.6％及磷酸氢二钾0.2％)溶液，分别115℃，灭菌30min，向50mL的三角瓶中加入19mL无机盐溶液，在无菌条件下加入0.4g实施例1制备的冻干大豆总蛋白，溶解后加入1mL0.16g/mL葡萄糖溶液至终浓度为0.8％，并接入总发酵液3％的地衣芽孢杆菌菌悬液，37℃，200r/min，摇床发酵，在发酵0、8、10、12、15、18、24、36、48h取样，-20℃保存，用于步判断抗原蛋白降解情况。
采用未优化的发酵方法和优化的发酵方法对大豆总蛋白进行发酵，取发酵液进行SDS-PAGE电泳，未优化发酵方法总蛋白SDS-PAGE结果如图4附图所示，图4结果显示，无论发酵时间如何变化，抗原蛋白的各个亚基在发酵后无显著变化，没有进行发酵条件优化前的地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39无法有效降解抗原蛋白，原因可能在于通过碱溶酸沉法得到的大豆总蛋白冷冻干燥再作为氮源加入水中后，溶液pH不变，此时的pH不利于微生物利用营养物质生长产酶，从而无法利用抗原蛋白并将其降解。
初步优化(使用磷酸氢二钠代替氢氧化钠对培养基调pH)发酵总蛋白SDS-PAGE结果如图5附图所示。结果显示，发酵20h时蛋白条带完整，包括了11S和7S蛋白的全部5个亚基，此时菌体生长产生的酶不足以降解抗原蛋白各亚基，发酵36h后β-伴大豆球蛋白的α,、α亚基消失，在25kDa产生了新的肽段，发酵48h后β-伴大豆球蛋白的β亚基和大豆球蛋白的酸性多肽进一步降解，说明初步优化发酵条件后，地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39能利用发酵液中的碳源、氮源产生蛋白酶，菌体在一定程度可以利用大豆蛋白将其从大分子逐步降解。发酵条件优化后地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39，可以高效降解抗原蛋白，其原因主要在于一方面将总蛋白溶解和菌体发酵两个过程分开进行，避免总蛋白溶解过程中pH过高，对菌体的影响，另一方面采用磷酸氢二钠代替强氢氧化钠强碱溶液，调节溶液pH溶解总蛋白，促进了地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisY5-39对可溶性蛋白的利用，避免了强碱溶液对微生物生长的不利影响，促进了菌种的繁殖和代谢产物的产生，对抗原性蛋白可以进行有效降解。
最终优化(使用葡萄糖及无机盐培养基发酵大豆总蛋白)后发酵总蛋白SDS-PAGE结果如图6附图所示。
泳道信号强度反应泳道中蛋白质浓度或蛋白质的含量的高低，为了更加直观地表示大豆抗原蛋白主要亚基的降解情况随着发酵时间的变化，采用Image J软件对大豆总蛋白最终优化发酵电泳图进行处理，选择了五个主要条带，即β-伴大豆球蛋白的α’亚基、α亚基、β亚基，大豆球蛋白酸性多肽链、碱性多肽链，并对各亚基条带在不同时间的信号强度进行采集，作为辅助判断蛋白降解的依据，实验结果如图7-图11附图所示。
结果显示：结合图7-图11可知，发酵8h后β-伴大豆球蛋白的α，亚基条带消失，图7条带信号显著降低，10h以后几乎没有采集到信号，发酵8h以后α’亚基完全降解。图8，α亚基从0h至10h条带逐渐变浅，12h及以后α亚基条带消失，采集的信号在12h时降至最低，表示此时α亚基几乎降解完全。图9，β亚基在发酵10h后条带明显减弱，条带信号显著降低，但12h时仍可采集到信号，发酵48h时仍有较浅的条带存在，与另外两个亚基相比β亚基具有一定抗降解能力，发酵48h后仍降解不完全。
大豆球蛋白的酸性多肽链降解趋势与β亚基相似，12h后条带完全消失，图10，采集的信号表明12h后信号消失，酸性多肽链完全降解。图11，碱性多肽链在发酵过程中变化不明显，电泳图结果显示发酵48h后条带深度与未发酵条带相同，碱性多肽链的抗发酵酶解的能力较强。图11采集的不同时间信号虽然存在显著差异，但不同时间的信号没有规律，与电泳图结果不一致，这可能与电泳上样前样品浓度没有调整一致以及采集信号图像前处理不当有关。
发酵大豆总蛋白过程中pH值变化
选取优化发酵方法对大豆蛋白发酵过程中pH值进行监测，实验结果如图12所示。结果显示，发酵过程中，发酵液的pH值整体表现为先下降再缓慢上升的趋势。与0h相比，发酵8h后pH由最初的6.47降至5.56，显著下降了14.06％(P<0.05)，然后再缓慢上升，发酵24h后重新上升至6.49，发酵48h后pH显著增加了20.40％(P<0.05)，显著高于初始pH值。
发酵大豆总蛋白过程中可溶性蛋白含量变化
选取优化发酵方法对大豆蛋白发酵过程中可溶性蛋白含量变化进行监测，实验结果如图13所示。结果显示，发酵8h后可溶性蛋白含量由最初的624.20ug/mg下降至207.88μg/mg，下降了66.70％(P<0.05)。发酵15h进一步降低至137.05μg/mg，比发酵初期下降了78.04％(P<0.05)，15h之后可溶性蛋白含量无显著变化。
发酵大豆总蛋白过程中大豆球蛋白含量的变化
选取优化发酵方法对大豆蛋白发酵过程中大豆球蛋白含量变化进行监测，实验结果如图14附图a所示。结果显示，大豆球蛋白在发酵过程中逐渐降解，其中发酵8h后，大豆球蛋白由最初的159.83mg/g显著降低至50.25mg/g，降低率为68.56％(P<0.05)，这与图7-图11结果一致，大豆球蛋白的酸性亚基条带降解显著，发酵24h后大豆球蛋白含量降至最低6.49mg/g，降低率为95.94％(P<0.05)，24h之后无显著性变化。
发酵大豆总蛋白过程中β-伴大豆球蛋白含量变化
选取优化发酵方法对大豆蛋白发酵过程中β-伴大豆球蛋白含量变化进行监测，实验结果如图14附图b所示。结果显示，β-伴大豆球蛋白降解趋势与大豆球蛋白相似，与未发酵相比，发酵10h时β-伴大豆球蛋白含量仅为9.675mg/g，显著低于发酵前水平，降解率达到70.77％(P<0.05)，图7-图9中此时α’亚基与α亚基几乎降解完全，β亚基条带明显减弱。发酵24h后β-伴大豆球蛋白降至最低，2.54mg/g，降低率最大为92.33％(P<0.05)，略低于大豆球蛋白。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一株地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)Y5-39，其特征在于，保藏编号为CGMCCNO：22062。
2.如权利要求1所述一株地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)Y5-39在发酵豆粕工艺中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)Y5-39和0.6％的磷酸氢二钠联合应用。
4.根据权利要求2或者权利要求3所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)Y5-39在豆粕中所含大豆总蛋白溶解后加入。
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