CN113099948A

CN113099948A - 一种用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基及蜜环菌生产方法

Info

Publication number: CN113099948A
Application number: CN202110337024.6A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 刘天睿; 南铁贵; 李仰华; 张敏; 黄璐琦
Original assignee: Hubei Meng Yang Medicine Products Co ltd; Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Hubei Meng Yang Medicine Products Co ltd; Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-07-13

Abstract

本发明公开了一种用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基及其制备方法，包括主料碳源、无机盐营养物，所述主料碳源由如下重量百分比的组分组成：70～90％大豆秸秆粉、10～30％麦麸。还公开了一种采用前述的培养基生产蜜环菌的方法，包括如下步骤：1)制备培养基，灭菌，备用；2)接种活化后的蜜环菌到灭菌后的培养基中，23～27℃避光培养28～32天；优选25℃避光培养30天。本发明使用大豆秸秆代替蜜环菌生产种中使用的木材，筛选出的大豆秸秆培养基作为蜜环菌菌包替代原料，有利于降低栽培成本，以满足天麻种植需求，为工业化生产提供依据和参考，同时为减少资源浪费和保护环境提供新的思路。

Description

一种用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基及蜜环菌生产方法

技术领域

本发明涉及中药栽培生产技术领域，具体涉及一种用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基及蜜环菌生产方法。

背景技术

天麻为兰科名贵中药材，在治疗失眠、惊厥、抑郁、缺血性脑卒中、焦虑、认知障碍等中枢神经系统疾病方面疗效显著。随着天麻被列为“药食两用”中药材，在云南和贵州两省试生产，天麻在保健功能开发方面具有广阔前景，市场需求量逐渐增加。

天麻无叶片不能进行光合作用，其无性繁殖生长发育阶段所需的营养完全依赖于蜜环菌。蜜环菌(学名：Armillaria mellea(Vahl)P.Kumm.)通过分泌胞外纤维素酶、果胶酶等破坏植物细胞壁，侵染天麻和木材，天麻体内存在的抗真菌蛋白消化蜜环菌菌丝获取营养，二者的生长达到了动态平衡。蜜环菌菌索粗壮、分枝多、生长速度快就能为天麻提供充足的养分，所伴栽天麻的产量更高，品质更优。因此蜜环菌的生长情况是影响天麻产量和品质的决定性因素。

现有技术中，蜜环菌培养基通常使用木材作为主要碳源，天麻栽培周期短，见效快，经济效益显著，已经成为林下经济、高效农业以及精准扶贫的有效产业，栽培规模越来越大，但木材生长、周期长，价格高，使天麻栽培成本增加，也不符合绿色可持续发展的生态理念；有必要对天麻栽培技术进行研发以提供更经济、环保的栽培技术。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，使用大豆秸秆代替蜜环菌生产种中使用的木屑，变废为宝、降低生产成本。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，包括主料碳源、无机盐营养物，所述主料碳源由如下重量百分比的组分组成：70～90％大豆秸秆粉、10～30％麦麸；

优选组成为80％大豆秸秆粉、20％麦麸；

优选所述大豆秸秆粉由大豆干秸秆打碎至100目以下得到，麦麸颗粒为100目以下；

优选大豆秸秆粉和麦麸颗粒均为50目以下，优选30目。

所述无机盐营养物包含钙盐、钾盐、镁盐，无机盐营养物用量为为主料碳源重量的0.5～1.5％，优选0.5％；

优选所述钙盐为硫酸钙，钾盐为磷酸二氢钾，镁盐为硫酸镁；

优选钙盐为石膏。

优选硫酸钙或石膏、磷酸二氢钾、硫酸镁的重量比为8-12﹕1-5﹕0.5-2；

优选硫酸钙或石膏、磷酸二氢钾、硫酸镁的重量比为9-11﹕2-4﹕1-2；

优选硫酸钙或石膏、磷酸二氢钾、硫酸镁的重量比为10﹕3﹕1.5。

上述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基还包括糖类碳源，所述糖类碳源为白糖、蔗糖或葡萄糖；

优选所述糖类碳源的用量为主料碳源重量的0.5～1.5％，优选1％。

上述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基还包括水，所述培养基中含水量为50～70％；优选50％。

作为优选地，所述用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，由主料碳源、蔗糖、无机盐和水组成，所述培养基的含水量为50％，所述主料碳源的组成为大豆秸秆粉和麦麸按重量比4﹕1混合，蔗糖和无机盐分别占主料碳源重量的1％、0.5％，所述无机盐由石膏、磷酸二氢钾、硫酸镁按重量比10﹕3﹕1.5组成。

本发明还提供了上述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基的制备方法，包括如下步骤：将干大豆秸秆打碎得到大豆秸秆粉，加入麦麸、糖类碳源、无机盐营养物和水，拌匀即得。

本发明最后还提供了一种采用上述的培养基生产蜜环菌的方法，包括如下步骤：

1)按照前述的方法制备培养基，灭菌，备用；

2)接种活化后的蜜环菌到灭菌后的培养基中，23～27℃避光培养28～32天；优选25℃避光培养30天。

所述步骤2)中的活化蜜环菌的方法为：将取蜜环菌菌种用改良PDA培养基进行活化。

优选地，所述活化为采用改良PDA培养基25℃避光培养14天，所述PDA培养基含：马铃薯浸出粉4g，麦麸33g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，盐酸噻胺0.1g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL。

本发明的有益效果是：

我国作为农业大国，农作物余料如秸秆产量丰富，目前秸秆大量在田间焚烧，造成了严重的空气污染和资源浪费，蜜环菌主要消耗的木质纤维素种类为纤维素，大豆秸秆富含丰富的纤维素，其纤维素含量在28.14％～33.97％，可以满足蜜环菌的生长发育，使用大豆秸秆代替蜜环菌生产种中使用的木材，既实现了农业废物的利用又可以降低生产成本，同时对保护林木具有间接作用。

本发明筛选出的大豆秸秆培养基作为蜜环菌菌包替代原料，经试验证明，不仅仅可以可以满足蜜环菌的生长发育，而且显著优于常规的桦木屑培养基，是一种既优质又经济的培养基，有利于降低栽培成本，满足天麻种植需求，为工业化生产提供依据和参考，同时为减少资源浪费和保护环境提供新的思路。

附图说明

图1是蜜环菌在大豆秸秆培养基中的生长情况。

图2是蜜环菌在桦木木屑培养基中的生长情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

1实验材料：

本实验室分离的高卢蜜环菌菌种H，保存于中国中医科学院中药资源中心。

本实验室分离的高卢蜜环菌菌种NRC002,保藏号CGMCC No.15871，已经记载于中国发明专利申请202010236665.8中。

以上实验菌种为申请人实验室分离获得，可向公众发放。但本发明提供的大豆秸秆培养基不限于用于上述菌株。

如无特殊说明，本实施例所用生物和化学试剂均为本领域常规试剂，均为实验室纯级，均可商购获得。

2实验方法：

2.1培养基配制：

2.1.1改良PDA培养基：

马铃薯浸出粉4g，麦麸33g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，盐酸噻胺0.1g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min。

2.1.2大豆秸秆培养基：

干燥的大豆秸秆打粉，将大豆秸秆与麦麸混匀得到混合料(颗粒大小为30目)，加入蔗糖、无机盐(石膏、磷酸二氢钾和硫酸镁的混合物，石膏:磷酸二氢钾:硫酸镁的重量比＝20:6:3)，加水拌匀。

与木屑培养基的对比实验中，大豆秸秆培养基的配比为：主料碳源的组成为大豆秸秆粉和麦麸按重量比4﹕1混合，蔗糖和无机盐添加量分别为主料碳源重量的1％、0.5％，培养基含水量50％。

2.1.3木屑培养基：

取干燥的桦木木屑，制作桦木木屑和麦麸混合料，使混合料中桦木木屑含量为80％(wt％)，麦麸含量20％(wt％)。按混合料重量加入1％蔗糖、1％无机盐(石膏、磷酸二氢钾和硫酸镁的混合物，石膏:磷酸二氢钾:硫酸镁的重量比＝20:6:3)，培养基的含水量为60％。

2.2蜜环菌接种

2.2.1蜜环菌菌种活化

使用90mm培养皿，每个培养皿中加入20mL无菌的改良PDA培养基。将4℃保存的蜜环菌菌种H接种到改良PDA培养基上，25℃避光培养14天，长满培养皿备用。

2.2.2接种

将配制的大豆秸秆培养基和木屑培养基分别装入菌种瓶，每瓶装入200g。121℃高温灭菌2h，放冷后接种1/4培养皿活化后的蜜环菌H，25℃避光培养30d。

2.3蜜环菌菌丝生长情况测定

观察各配方栽培种培养基中菌丝生长情况(菌丝长势、疏密、颜色)，用划线法记录菌丝生长速度，记录至培养30d，计算菌丝平均生长速度。

2.4用于测试的蜜环菌样品制备

蜜环菌培养30d后，将蜜环菌取出，剥离培养基，65℃烘干至恒重，打粉，得到蜜环菌粉末备用。

2.5蜜环菌总多糖含量测定

2.5.1标准曲线制备

精密称定葡萄糖对照品10mg，加水定容至10mL，配置成1g·L^-1的葡萄糖标准溶液。准确移取1g·L^-1的葡萄糖标准液0.1～0.6mL于10mL量瓶中，并用蒸馏水补充至2mL，以2mL蒸馏水作对照。分别加入6％苯酚溶液1mL，浓硫酸5mL，摇匀定容至10mL。放于沸水浴中15min后取出，冷却至室温，在490nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为Y＝7.7965x+0.0637，R²＝0.9992，结果表明葡萄糖浓度在0.01～0.06g·L^-1与吸光度呈良好的线性关系。

2.5.2供试品溶液制备

精密称取前面制备的蜜环菌粉末0.1g，放入50mL离心管，加入90℃超纯水1.5mL，超声(120W，40kHZ，80℃)30分钟，室温10 000g离心5分钟，取上清，上清液补加95％乙醇使乙醇最终浓度为80％，在4℃冰箱中醇沉12小时，再次离心，倒掉废液，挥干乙醇，沉淀加水溶解定容至10mL。精密吸取1mL供试液，加入6％苯酚溶液1mL，浓硫酸5mL，摇匀定容至10mL。放于沸水浴中15min后取出，冷却至室温，在490nm处测定吸光度。

2.6蜜环菌胞外可溶性蛋白含量测定

使用真菌蛋白提取试剂盒(上海贝博生物科技有限公司，批号：BB-3127)、EasyⅡProtein quantitive Kit(BCA)(北京全式金公司生物技术有限公司，批号DQ111-01)，操作方法按说试剂盒明书进行。

2.7大豆秸秆培养基配方优化

使用四因素三水平L₉(3⁴)正交表设计正交实验，考察因素包括：农作物余料与麦麸配比(A)、蔗糖含量(B)、无机盐含量(C)、含水量(D)，各水平设置如表1。按表中配方制作农作物余料培养基，等量装入组培瓶121℃灭菌2h。放冷后接入1/4培养皿活化后的蜜环菌H，25℃黑暗培养30d，观察蜜环菌生长情况。

表1正交试验因素水平表

注：B，C，D的添加量均以A的重量为参考。

3实验结果：

3.1不同培养基对蜜环菌菌丝生长的影响

两种材料培养的蜜环菌H菌丝萌发时间不同且在外观形态上存在不同程度的差异，对比图见图1和图2。蜜环菌H菌丝在大豆秸秆培养基中长势最好，从接种第4天开始生长，菌丝洁白、浓密、粗壮。蜜环菌H在桦木屑培养基中，菌丝从第10天开始萌发，菌丝长势和生长速度低于大豆秸秆培养基。不同培养基中蜜环菌生长情况如表2所示：

表2蜜环菌生长情况表(n＝3)

注：^*表示与桦木屑培养基相比，P<0.05。

对高卢蜜环菌菌种NRC002的实验得到基本相同的结果。

3.2不同培养基对蜜环菌总多糖及胞外可溶性蛋白含量的影响

结果如表3所示，两种培养基中蜜环菌H的总多糖及胞外可溶性蛋白含量均存在显著差异(P<0.05)，在大豆秸秆培养基中培养的蜜环菌总多糖及胞外可溶性蛋白含量显著高于使用桦木屑培养的蜜环菌。

表3不同培养基中蜜环菌总多糖和胞外可溶性蛋白含量(n＝3)

注：^*表示与桦木屑培养基相比，P<0.05。

蜜环菌菌丝总多糖在大豆秸秆培养基中含量较高，达到了3.926％，蜜环菌菌丝的总多糖含量与蜜环菌菌丝的生长速度表现出极强的正相关关系(P<0.01)，Pearson相关系数为0.851。蜜环菌在大豆秸秆培养基中菌丝的生长速度和总多糖含量均表现较好，证明蜜环菌在大豆秸秆培养基中可以良好生长。

对高卢蜜环菌菌种NRC002的实验得到基本相同的结果。

3.3大豆秸秆培养基配方优化

表4大豆秸秆培养基三因素四水平正交结果表

K_jm：第j列因素m水平所对应的蜜环菌生长速度和

k_jm：第j列因素m水平所对应的蜜环菌生长速度平均值

R_j：第j列因素的极差

本研究选择了大豆秸秆作为培养蜜环菌H的主要营养源，以大豆秸秆和麦麸混合料作为主料碳源，通过更改蜜环菌培养基中主料碳源配比、蔗糖(额外添加碳源)含量、无机盐含量及含水量，观察以上因素对蜜环菌生长速度的影响，筛选出最适合培养蜜环菌的大豆秸秆培养基各成分配比。

根据表4中R值可以判断培养基各因素对蜜环菌生长速度的影响主次，即R_A>R_C>R_B>R_D。主料配比(A)是影响蜜环菌菌丝生长速度的主要因素，其次为无机盐含量(C)、蔗糖含量(B)，对蜜环菌生长速度影响最小的为含水量(D)。

根据K值挑选对应水平下的最优方案，确定K_A2>K_A3>K_A1，K_B2>K_B3>K_B1，K_C1>K_C3>K_C2，K_D1＝K_D2>K_D3。考虑到不同因素水平下对蜜环菌生长素的的影响(k)，C中k_C3蜜环菌的生长速度与k_C1生长速度相近，但是k_C3的无机盐用量是k_C1的三倍，k_D1与k_D2对蜜环菌生长速度的影响相同，但是加水量k_D2更多，从减少生产成本的角度出发，最终确定蜜环菌大豆秸秆培养基配方优化条件为A₂B₂C₁D₁，即主料(大豆秸秆与麦麸)配比为8:2、蔗糖含量为主料重量的1％、无机盐含量为主料重量的0.5％、含水量50％。

3.4最优工艺验证

选用3.3中筛选到的大豆秸秆培养基最佳方案培养蜜环菌H，进行三组平行试验，验证正交试验结果的可靠性和准确性。实验结果表明蜜环菌平均生长速度为0.392cm·d^-1，RSD值为0.031(表5)，表明使用筛选到的蜜环菌大豆秸秆培养基培养蜜环菌，蜜环菌生长速度稳定，适于应用于生产。

表5工艺验证试验

Claims

1.一种用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，其特征在于：包括主料碳源、无机盐营养物，所述主料碳源由如下重量百分比的组分组成：70～90％大豆秸秆粉、10～30％麦麸；

优选组成为80％大豆秸秆粉、20％麦麸；

优选大豆秸秆粉和麦麸颗粒均为50目以下，优选30目。

2.如权利要求1所述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，其特征在于：所述无机盐营养物包含钙盐、钾盐、镁盐，无机盐营养物用量为为主料碳源重量的0.5～1.5％，优选0.5％；

优选钙盐为石膏。

3.如权利要求2所述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，其特征在于：

硫酸钙或石膏、磷酸二氢钾、硫酸镁的重量比为8-12﹕1-5﹕0.5-2；

4.如权利要求1所述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，其特征在于：还包括糖类碳源，所述糖类碳源为白糖、蔗糖或葡萄糖；

5.如权利要求1至4任一项所述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，其特征在于：还包括水，所述培养基中含水量为50～70％；优选50％。

6.如权利要求5所述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基，其特征在于：由主料碳源、蔗糖、无机盐和水组成，所述培养基的含水量为50％，所述主料碳源的组成为大豆秸秆粉和麦麸按重量比4﹕1混合，蔗糖和无机盐分别占主料碳源重量的1％、0.5％，所述无机盐由石膏、磷酸二氢钾、硫酸镁按重量比10﹕3﹕1.5组成。

7.如权利要求1至6任一项所述的用于蜜环菌培养的大豆秸秆培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将干大豆秸秆打碎得到大豆秸秆粉，加入麦麸、糖类碳源、无机盐营养物和水，拌匀即得。

8.一种采用权利要求1至6任一项所述的培养基生产蜜环菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)按照权利要求7的方法制备培养基，灭菌，备用；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的活化蜜环菌的方法为：将取蜜环菌菌种用改良PDA培养基进行活化。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述活化为采用改良PDA培养基25℃避光培养14天，所述PDA培养基含：马铃薯浸出粉4g，麦麸33g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，盐酸噻胺0.1g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL。