JP2002122568A - 哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法及びその装置 - Google Patents
哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法及びその装置Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 哺乳動物胚の形態観察と代謝活性の指標であ
る酸素消費量の計測を行い、個々の哺乳動物胚の生存性
や正常性を、早期に正確に把握できる哺乳動物胚の無侵
襲的品質評価方法及びその装置を提供する。 【解決手段】 哺乳動物胚の無侵襲的品質評価のため
に、（ａ）単一哺乳動物胚の形態観察を行うための顕微
鏡と、（ｂ）単一哺乳動物胚の酸素消費量の計測を行う
電気化学顕微鏡と、（ｃ）培養液に準ずる計測溶液３
と、（ｄ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）を用いて単一胚
近傍の酸素濃度変化を高空間分解能で定量する手段と、
（ｅ）上記（ｄ）によりあらかじめ作出した哺乳動物胚
の大きさと酸素消費量の関係および哺乳動物胚のその後
の発生結果を集計する手段と、（ｆ）上記（ｅ）により
哺乳動物胚の正常性を判定する手段とを具備する。上記
電気化学顕微鏡は、顕微鏡ステージ１５上に設置した微
小電極１、電極位置決め装置６、微小電流計測装置８、
温度制御装置１０、培養気相条件（酸素、二酸化炭素）
制御装置を有する。
る酸素消費量の計測を行い、個々の哺乳動物胚の生存性
や正常性を、早期に正確に把握できる哺乳動物胚の無侵
襲的品質評価方法及びその装置を提供する。 【解決手段】 哺乳動物胚の無侵襲的品質評価のため
に、（ａ）単一哺乳動物胚の形態観察を行うための顕微
鏡と、（ｂ）単一哺乳動物胚の酸素消費量の計測を行う
電気化学顕微鏡と、（ｃ）培養液に準ずる計測溶液３
と、（ｄ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）を用いて単一胚
近傍の酸素濃度変化を高空間分解能で定量する手段と、
（ｅ）上記（ｄ）によりあらかじめ作出した哺乳動物胚
の大きさと酸素消費量の関係および哺乳動物胚のその後
の発生結果を集計する手段と、（ｆ）上記（ｅ）により
哺乳動物胚の正常性を判定する手段とを具備する。上記
電気化学顕微鏡は、顕微鏡ステージ１５上に設置した微
小電極１、電極位置決め装置６、微小電流計測装置８、
温度制御装置１０、培養気相条件（酸素、二酸化炭素）
制御装置を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物胚の無侵
襲的品質評価方法及びその装置に関するものである。
襲的品質評価方法及びその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、培養技術の目覚ましい進歩によ
り、多くの哺乳動物胚（マウス、ラット、ハムスター、
ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヒトなど）の体外
培養が可能となってきた。体外培養された胚はレシピエ
ント（雌仮腹）の子宮に移植され、産仔の誕生も可能と
なっている。
り、多くの哺乳動物胚（マウス、ラット、ハムスター、
ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヒトなど）の体外
培養が可能となってきた。体外培養された胚はレシピエ
ント（雌仮腹）の子宮に移植され、産仔の誕生も可能と
なっている。
【０００３】しかしながら、作出した胚が生存し、しか
も正常に発生が進行しているかどうかの判断基準は、一
般的に形態観察のみに基づいている。このような形態的
評価では、低品質と判定した胚が移植後に受胎したり、
高品質と判定した胚が受胎しない例が報告されている
〔Ｆ．Ｓｈｅａ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１
５，３１−４２（１９８１）〕。また、形態的評価法と
胚の生存性との間に相関関係が見られないことも報告さ
れている〔Ｄ．Ｓ．Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕ
ｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，８，１７１９−１７２２（１９９
３）〕。これらのことは、形態的観察による胚評価法だ
けでは、必ずしも正確に胚の生存性や品質を判断できな
いことを示唆している。
も正常に発生が進行しているかどうかの判断基準は、一
般的に形態観察のみに基づいている。このような形態的
評価では、低品質と判定した胚が移植後に受胎したり、
高品質と判定した胚が受胎しない例が報告されている
〔Ｆ．Ｓｈｅａ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１
５，３１−４２（１９８１）〕。また、形態的評価法と
胚の生存性との間に相関関係が見られないことも報告さ
れている〔Ｄ．Ｓ．Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕ
ｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，８，１７１９−１７２２（１９９
３）〕。これらのことは、形態的観察による胚評価法だ
けでは、必ずしも正確に胚の生存性や品質を判断できな
いことを示唆している。
【０００４】胚の品質評価において、形態的評価法の他
に、胚のグルコースやアミノ酸代謝活性を指標とした品
質評価法の試みも行われてきた〔Ｄ．Ｋ．Ｇａｒｄｎｅ
ｒａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｌｅｅｓｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏ
ｌ．，２４２，１０３−１０５（１９８７）；Ｍ．Ｒｏ
ｎｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏ
ｇｙ，４４，３５１−３６６（１９９５）〕。
に、胚のグルコースやアミノ酸代謝活性を指標とした品
質評価法の試みも行われてきた〔Ｄ．Ｋ．Ｇａｒｄｎｅ
ｒａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｌｅｅｓｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏ
ｌ．，２４２，１０３−１０５（１９８７）；Ｍ．Ｒｏ
ｎｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏ
ｇｙ，４４，３５１−３６６（１９９５）〕。
【０００５】これらの方法では、計測にラジオアイソト
ープを用いなければならなかったり、複数個以上の胚が
必要であるなどの欠点があった。一方、細胞や胚などの
代謝活性や特異的な生体反応を評価する手法として、少
数の細胞数でも無侵襲に計測可能な電気化学的手法が注
目されつつある。
ープを用いなければならなかったり、複数個以上の胚が
必要であるなどの欠点があった。一方、細胞や胚などの
代謝活性や特異的な生体反応を評価する手法として、少
数の細胞数でも無侵襲に計測可能な電気化学的手法が注
目されつつある。
【０００６】以下、その関連技術について説明する。
【０００７】（１）クラーク型酸素電極をはじめとす
る、精密位置決め機能を有さない固定型／通常サイズの
電極が細胞呼吸活性評価に広く適用されている。空間分
解能を有さない従来型の酸素電極を工夫することによ
り、培養したままリアルタイムで細胞呼吸活性を計測可
能な装置は既にある。ウシ初期胚に関して、通常サイズ
のクラーク型酸素電極を用いて、単一の胚盤胞期胚の酸
素消費量を定量した報告がある〔Ｅ．Ｗ．Ｏｖｅｒｓｔ
ｏｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇ
ｙ，３７，２６９（１９９２）〕。胚盤胞期胚におい
て、形態的に正常／異常に分類した２グループ間で、正
常胚のグループが酸素消費量も多く、その後の胚発生能
も高かったと報告している。しかしこれは明らかに形態
観察のみで判定可能な基準であり、酸素消費量計測の意
義は極めて小さい。
る、精密位置決め機能を有さない固定型／通常サイズの
電極が細胞呼吸活性評価に広く適用されている。空間分
解能を有さない従来型の酸素電極を工夫することによ
り、培養したままリアルタイムで細胞呼吸活性を計測可
能な装置は既にある。ウシ初期胚に関して、通常サイズ
のクラーク型酸素電極を用いて、単一の胚盤胞期胚の酸
素消費量を定量した報告がある〔Ｅ．Ｗ．Ｏｖｅｒｓｔ
ｏｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇ
ｙ，３７，２６９（１９９２）〕。胚盤胞期胚におい
て、形態的に正常／異常に分類した２グループ間で、正
常胚のグループが酸素消費量も多く、その後の胚発生能
も高かったと報告している。しかしこれは明らかに形態
観察のみで判定可能な基準であり、酸素消費量計測の意
義は極めて小さい。
【０００８】この手法は、桑実胚と胚盤胞期胚の酸素消
費量の差を検出していない。しかも空間分解能を有さな
い計測法は、胚表面の濃度が場所により異なる場合に局
所の濃度を正確に検出できない。したがって、局所の濃
度差情報を胚の品質判定に利用できないという欠点があ
る。
費量の差を検出していない。しかも空間分解能を有さな
い計測法は、胚表面の濃度が場所により異なる場合に局
所の濃度を正確に検出できない。したがって、局所の濃
度差情報を胚の品質判定に利用できないという欠点があ
る。
【０００９】（２）電気化学顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ
ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐ
ｙ）は、精密位置決め機能を有し、マイクロ（微小）電
極を探針とする計測装置であり、探針を試料表面に近接
し走査することにより、試料の放出／吸収する分子種の
検出や、分子種の分布の画像化を可能にする〔Ａ．Ｊ．
Ｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６
１，１３２−１３８（１９８９）；Ｒ．Ｃ．Ｅｎｇｓｔ
ｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，
８４４−８４８（１９８６）〕。
ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐ
ｙ）は、精密位置決め機能を有し、マイクロ（微小）電
極を探針とする計測装置であり、探針を試料表面に近接
し走査することにより、試料の放出／吸収する分子種の
検出や、分子種の分布の画像化を可能にする〔Ａ．Ｊ．
Ｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６
１，１３２−１３８（１９８９）；Ｒ．Ｃ．Ｅｎｇｓｔ
ｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，
８４４−８４８（１９８６）〕。
【００１０】球状の単一細胞が特定の分子種を放出／吸
収する際に、細胞近傍に形成される濃度分布を電気化学
顕微鏡類似の装置で直接計測した研究が既にある。マイ
クロ電極を細胞表面に向かって近接／遠ざけることによ
り計測した電流プロファイルから、細胞表面濃度と細胞
から十分離れた位置の濃度の差（ΔＣ）が求められてい
る。
収する際に、細胞近傍に形成される濃度分布を電気化学
顕微鏡類似の装置で直接計測した研究が既にある。マイ
クロ電極を細胞表面に向かって近接／遠ざけることによ
り計測した電流プロファイルから、細胞表面濃度と細胞
から十分離れた位置の濃度の差（ΔＣ）が求められてい
る。
【００１１】さらに、濃度の差（ΔＣ）より、試料１個
あたりの特定分子種放出／吸収速度が定量されている
〔Ｔ．Ｙａｓｕｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｊ．，７６，１１２９−１１３５（１９９９）〕。
この方法で、酸素還元電流プロファイルを計測し、生体
からの酸素放出／吸収量を定量することも可能となって
いる 〔Ｔ．Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｎ
ｋｉ Ｋａｇａｋｕ，６６，６６０−６６１（１９９
８）〕。しかし、この方法で体外培養胚の酸素消費量の
定量化に成功した例は報告されていない。
あたりの特定分子種放出／吸収速度が定量されている
〔Ｔ．Ｙａｓｕｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｊ．，７６，１１２９−１１３５（１９９９）〕。
この方法で、酸素還元電流プロファイルを計測し、生体
からの酸素放出／吸収量を定量することも可能となって
いる 〔Ｔ．Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｎ
ｋｉ Ｋａｇａｋｕ，６６，６６０−６６１（１９９
８）〕。しかし、この方法で体外培養胚の酸素消費量の
定量化に成功した例は報告されていない。
【００１２】（３）自己参照電極法（Ｓｅｌｆ−ｒｅｆ
ｅｒｅｎｃｉｎｇ ｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｉ
ｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ／Ｓｅｌｆ−ｒｅｆｅｒｅｎ
ｃｉｎｇ ｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｘｙｇｅｎ
−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄ
ｅ）は、電気化学顕微鏡類似の計測装置である〔Ｐ．
Ｊ．Ｓ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃ．
Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，４６，３９８−４１７（１９９
９）；Ｓ．Ｃ．Ｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｂｉｏｌ．，２０２，２１１−２１８（１９９９）〕。
電極の位置を周期０．３Ｈｚ振幅１０μｍ程度で振動さ
せ、電流信号をロックイン検出することにより高感度化
が図られている。
ｅｒｅｎｃｉｎｇ ｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｉ
ｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ／Ｓｅｌｆ−ｒｅｆｅｒｅｎ
ｃｉｎｇ ｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｘｙｇｅｎ
−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄ
ｅ）は、電気化学顕微鏡類似の計測装置である〔Ｐ．
Ｊ．Ｓ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃ．
Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，４６，３９８−４１７（１９９
９）；Ｓ．Ｃ．Ｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｂｉｏｌ．，２０２，２１１−２１８（１９９９）〕。
電極の位置を周期０．３Ｈｚ振幅１０μｍ程度で振動さ
せ、電流信号をロックイン検出することにより高感度化
が図られている。
【００１３】この方法の欠点として、検出原理や出力信
号の解釈が複雑であること、また、計測に余分な時間を
要することが挙げられる。
号の解釈が複雑であること、また、計測に余分な時間を
要することが挙げられる。
【００１４】この方法は、本来、イオン選択性電極を探
針とする電位感応型の計測法であるが、近年では微小酸
素電極を探針として電流検出も行っている。最近、自己
参照電極法がマウス体外培養胚の酸素消費量の定量に適
用された〔Ｊ．Ｒ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６２，１８６６−１
８７４（２０００）〕。この報告では自己参照電極法が
無侵襲であることに言及し、計測に供した胚がその後も
正常に発生することも確認している。しかし、酸素消費
量と発生率の関係については相関が得られなかったと明
言している。つまり、彼らの用いた計測法では、胚の酸
素消費量からその後の発生過程を予測する基準を設定す
ることができていない。さらに、彼らは、マウス初期胚
の酸素消費量計測に際し胚細胞を包む透明帯の除去を施
しており、このような損傷を与えた胚は継続して培養す
る目的に適さない。
針とする電位感応型の計測法であるが、近年では微小酸
素電極を探針として電流検出も行っている。最近、自己
参照電極法がマウス体外培養胚の酸素消費量の定量に適
用された〔Ｊ．Ｒ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６２，１８６６−１
８７４（２０００）〕。この報告では自己参照電極法が
無侵襲であることに言及し、計測に供した胚がその後も
正常に発生することも確認している。しかし、酸素消費
量と発生率の関係については相関が得られなかったと明
言している。つまり、彼らの用いた計測法では、胚の酸
素消費量からその後の発生過程を予測する基準を設定す
ることができていない。さらに、彼らは、マウス初期胚
の酸素消費量計測に際し胚細胞を包む透明帯の除去を施
しており、このような損傷を与えた胚は継続して培養す
る目的に適さない。
【００１５】（４）ヒトの体外培養胚の評価法として、
個々の胚につき形態観察と酸素消費量の対応付けを試み
た研究例がある〔Ｃ．Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，１８３−１８４
（１９８６）〕。形態観察において品質の劣った胚と正
常胚との間には、酸素消費量に有為な差が見られた。し
かしながら、形態観察で正常と判別された胚の中では、
酸素消費量とその後の胚発生率の関係において相関性は
見られなかった。また、酸素消費量計測の原理は、オキ
シヘモグロビンがヘモグロビンに変換する時の吸収スペ
クトル強度変化に因るものであり、空間分解能は期待で
きない。さらに、計測は、検出試薬の存在下でしかも、
低酸素濃度で行う必要があり、胚を損傷する可能性も否
定できない。
個々の胚につき形態観察と酸素消費量の対応付けを試み
た研究例がある〔Ｃ．Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，１８３−１８４
（１９８６）〕。形態観察において品質の劣った胚と正
常胚との間には、酸素消費量に有為な差が見られた。し
かしながら、形態観察で正常と判別された胚の中では、
酸素消費量とその後の胚発生率の関係において相関性は
見られなかった。また、酸素消費量計測の原理は、オキ
シヘモグロビンがヘモグロビンに変換する時の吸収スペ
クトル強度変化に因るものであり、空間分解能は期待で
きない。さらに、計測は、検出試薬の存在下でしかも、
低酸素濃度で行う必要があり、胚を損傷する可能性も否
定できない。
【００１６】（５）計測技術が空間分解能を有する利点
は、上記（１）で述べた「局所の濃度差情報を胚の品質
判定に利用できる」他に、「試料近傍に形成される酸素
濃度勾配を直接計測できる」、「複数の試料でも画像化
等により１本のプローブで定量的計測が可能である」、
「任意に電極の位置を胚から十分離れた位置に移動し、
ベースラインの濃度を参照できる」こと等が挙げられ
る。
は、上記（１）で述べた「局所の濃度差情報を胚の品質
判定に利用できる」他に、「試料近傍に形成される酸素
濃度勾配を直接計測できる」、「複数の試料でも画像化
等により１本のプローブで定量的計測が可能である」、
「任意に電極の位置を胚から十分離れた位置に移動し、
ベースラインの濃度を参照できる」こと等が挙げられ
る。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】（１）現行では形態観
察に頼るところが大きい胚の品質評価に際し、１個１個
の胚毎に代謝活性を数値化し情報を加えることにより、
品質評価の精度向上を実現する。
察に頼るところが大きい胚の品質評価に際し、１個１個
の胚毎に代謝活性を数値化し情報を加えることにより、
品質評価の精度向上を実現する。
【００１８】（２）代謝活性を評価する指標として、単
一胚毎の酸素消費量を計測する。ただし、胚の代謝活性
を正確に把握するために、計測は培養条件あるいはそれ
に限り無く近い条件で行われる必要がある。さらに、測
定後の胚を利用するために、計測は短時間にかつ無侵襲
で行われる必要がある。また、局所の濃度差情報を品質
判定に利用するために、空間分解能を有する計測装置の
適用が望ましい。そのような条件を満たす計測手段とし
て、例えば電気化学顕微鏡は適用可能性が高い。
一胚毎の酸素消費量を計測する。ただし、胚の代謝活性
を正確に把握するために、計測は培養条件あるいはそれ
に限り無く近い条件で行われる必要がある。さらに、測
定後の胚を利用するために、計測は短時間にかつ無侵襲
で行われる必要がある。また、局所の濃度差情報を品質
判定に利用するために、空間分解能を有する計測装置の
適用が望ましい。そのような条件を満たす計測手段とし
て、例えば電気化学顕微鏡は適用可能性が高い。
【００１９】（３）しかしながら、個々の動物種により
胚の発生過程、代謝活性、培養条件は大きく異なるた
め、実用可能性を示すためには、正常な胚がたどる発生
過程をあらかじめ把握しておくことが不可欠である。
胚の発生過程、代謝活性、培養条件は大きく異なるた
め、実用可能性を示すためには、正常な胚がたどる発生
過程をあらかじめ把握しておくことが不可欠である。
【００２０】（４）電極位置決め装置付きの微小電極や
電気化学顕微鏡類似の計測装置を生存した細胞に対して
適用した例は既にある〔Ｔ．Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ
ａｌ．，Ｄｅｎｋｉ Ｋａｇａｋｕ，６６，６６０−６
６１（１９９８）；Ｐ．Ｊ．Ｓ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，４６，３
９８−４１７（１９９９）；Ｓ．Ｃ．Ｌａｎｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２０２，２１１−２
１８（１９９９）〕。
電気化学顕微鏡類似の計測装置を生存した細胞に対して
適用した例は既にある〔Ｔ．Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ
ａｌ．，Ｄｅｎｋｉ Ｋａｇａｋｕ，６６，６６０−６
６１（１９９８）；Ｐ．Ｊ．Ｓ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，４６，３
９８−４１７（１９９９）；Ｓ．Ｃ．Ｌａｎｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２０２，２１１−２
１８（１９９９）〕。
【００２１】さらに、体外培養胚の代謝活性を無侵襲に
計測することを目的とした研究も近年報告されつつある
〔Ｄ．Ｋ．Ｇａｒｄｎｅｒ ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｌｅｅｓ
ｅ，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，２５−２７（１９８
６）；Ｄ．Ｋ．Ｇａｒｄｎｅｒ ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｌｅ
ｅｓｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．，２４２，１０３−１
０５（１９８７）；Ｊ．Ｒ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６２，１８６６
−１８７４（２０００）〕。これらの報告の中には、計
測の後も胚が損傷を受けないで正常に発生することを確
認したという報告もある。しかし、胚のある時期におい
て計測された個々の検体の代謝活性から、被計測検体の
その時期以降の発生過程を予測し、判定基準を明確に示
した例はない。これまでの報告例では、単一胚毎の形態
観察と酸素消費量の対応が明確化されておらず、形態観
察で判断可能な異常と酸素消費量に基づく異常の区別が
極めて曖昧である。
計測することを目的とした研究も近年報告されつつある
〔Ｄ．Ｋ．Ｇａｒｄｎｅｒ ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｌｅｅｓ
ｅ，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，２５−２７（１９８
６）；Ｄ．Ｋ．Ｇａｒｄｎｅｒ ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｌｅ
ｅｓｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．，２４２，１０３−１
０５（１９８７）；Ｊ．Ｒ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６２，１８６６
−１８７４（２０００）〕。これらの報告の中には、計
測の後も胚が損傷を受けないで正常に発生することを確
認したという報告もある。しかし、胚のある時期におい
て計測された個々の検体の代謝活性から、被計測検体の
その時期以降の発生過程を予測し、判定基準を明確に示
した例はない。これまでの報告例では、単一胚毎の形態
観察と酸素消費量の対応が明確化されておらず、形態観
察で判断可能な異常と酸素消費量に基づく異常の区別が
極めて曖昧である。
【００２２】本発明は、上記状況に鑑みて、哺乳動物胚
の形態観察と代謝活性の指標である酸素消費量の計測を
行い、個々の哺乳動物胚の生存性や正常性を、早期に正
確に把握できる哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法及び
その装置を提供することを目的とする。
の形態観察と代謝活性の指標である酸素消費量の計測を
行い、個々の哺乳動物胚の生存性や正常性を、早期に正
確に把握できる哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法及び
その装置を提供することを目的とする。
【００２３】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために、 〔１〕哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法において、哺
乳動物胚の形態観察と代謝活性の指標である酸素消費量
の計測を行い、その結果を元に、個々の哺乳動物胚の正
常性を判定することを特徴とする。
成するために、 〔１〕哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法において、哺
乳動物胚の形態観察と代謝活性の指標である酸素消費量
の計測を行い、その結果を元に、個々の哺乳動物胚の正
常性を判定することを特徴とする。
【００２４】〔２〕上記〔１〕記載の哺乳動物胚の無侵
襲的品質評価方法において、前記正常性が判定された哺
乳動物胚を培養し、再び形態観察と酸素消費量の計測を
行うことを特徴とする。
襲的品質評価方法において、前記正常性が判定された哺
乳動物胚を培養し、再び形態観察と酸素消費量の計測を
行うことを特徴とする。
【００２５】〔３〕哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法
において、（ａ）顕微鏡観察により単一哺乳動物胚の大
きさを計測し、かつ、形態的評価を行う工程と、（ｂ）
前記単一哺乳動物胚に関して、すみやかに酸素消費量を
計測する工程と、（ｃ）上記工程（ａ）および工程
（ｂ）により、あらかじめ哺乳動物胚の大きさと酸素消
費量の関係、さらに哺乳動物胚のその後の成長過程を記
録するとともに、判定基準を設定する工程と、（ｄ）上
記工程（ｃ）を参照し、哺乳動物胚の品質を判定する工
程とを施すことを特徴とする。
において、（ａ）顕微鏡観察により単一哺乳動物胚の大
きさを計測し、かつ、形態的評価を行う工程と、（ｂ）
前記単一哺乳動物胚に関して、すみやかに酸素消費量を
計測する工程と、（ｃ）上記工程（ａ）および工程
（ｂ）により、あらかじめ哺乳動物胚の大きさと酸素消
費量の関係、さらに哺乳動物胚のその後の成長過程を記
録するとともに、判定基準を設定する工程と、（ｄ）上
記工程（ｃ）を参照し、哺乳動物胚の品質を判定する工
程とを施すことを特徴とする。
【００２６】〔４〕哺乳動物胚の無侵襲的品質評価装置
において、（ａ）単一哺乳動物胚の形態観察を行うため
の顕微鏡と、（ｂ）単一哺乳動物胚の酸素消費量の計測
を行う電気化学顕微鏡計測装置と、（ｃ）培養液に準ず
る計測溶液と、（ｄ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）を用
いて単一胚近傍の酸素濃度変化を高空間分解能で定量す
る手段と、（ｅ）上記（ｄ）によりあらかじめ作出した
哺乳動物胚の大きさと酸素消費量の関係および哺乳動物
胚のその後の発生結果を集計する手段と、（ｆ）上記
（ｅ）により哺乳動物胚の正常性を判定する手段とを具
備することを特徴とする。
において、（ａ）単一哺乳動物胚の形態観察を行うため
の顕微鏡と、（ｂ）単一哺乳動物胚の酸素消費量の計測
を行う電気化学顕微鏡計測装置と、（ｃ）培養液に準ず
る計測溶液と、（ｄ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）を用
いて単一胚近傍の酸素濃度変化を高空間分解能で定量す
る手段と、（ｅ）上記（ｄ）によりあらかじめ作出した
哺乳動物胚の大きさと酸素消費量の関係および哺乳動物
胚のその後の発生結果を集計する手段と、（ｆ）上記
（ｅ）により哺乳動物胚の正常性を判定する手段とを具
備することを特徴とする。
【００２７】〔５〕上記〔４〕記載の哺乳動物胚の無侵
襲的品質評価装置において、前記電気化学顕微鏡計測装
置は、顕微鏡ステージ上に設置した微小電極、電極位置
決め装置、微小電流計測装置、温度制御装置、培養気相
条件（酸素、二酸化炭素）制御装置を含むことを特徴と
する。
襲的品質評価装置において、前記電気化学顕微鏡計測装
置は、顕微鏡ステージ上に設置した微小電極、電極位置
決め装置、微小電流計測装置、温度制御装置、培養気相
条件（酸素、二酸化炭素）制御装置を含むことを特徴と
する。
【００２８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図を
参照しながら説明する。
参照しながら説明する。
【００２９】体外培養胚の移植は、通常胚盤胞期胚を使
用する。受胎率を上げるためには、この時期に品質の優
れた正常胚を１個づつ正確に判別することが必要であ
る。
用する。受胎率を上げるためには、この時期に品質の優
れた正常胚を１個づつ正確に判別することが必要であ
る。
【００３０】本発明では、まず、形態観察で品質評価し
た胚の酸素消費量の定量化を行い、胚の品質に対する形
態と酸素消費量の関係について検討した。形態観察のみ
では胚の品質評価が難しいので、酸素消費量を計測し、
その後、胚を培養し再び形態観察と酸素消費量を計測し
た。
た胚の酸素消費量の定量化を行い、胚の品質に対する形
態と酸素消費量の関係について検討した。形態観察のみ
では胚の品質評価が難しいので、酸素消費量を計測し、
その後、胚を培養し再び形態観察と酸素消費量を計測し
た。
【００３１】以下、具体的な実施例について述べる。
【００３２】体外培養のウシ卵子体外成熟／体外受精
は、定法により行った〔Ｓ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，１２
１−１２９（１９９９）〕。体外受精後の胚の発生培養
には、無血清培養液（ＩＶＤ１０１，機能性ペプチド研
究所製）を用い、低酸素条件（５％酸素、５％二酸化炭
素、９０％窒素、湿度１００％、３８．５℃）で培養し
た。
は、定法により行った〔Ｓ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，１２
１−１２９（１９９９）〕。体外受精後の胚の発生培養
には、無血清培養液（ＩＶＤ１０１，機能性ペプチド研
究所製）を用い、低酸素条件（５％酸素、５％二酸化炭
素、９０％窒素、湿度１００％、３８．５℃）で培養し
た。
【００３３】定法により単一胚毎に形態観察に基づく判
定を行った。胚の形状、大きさ（透明帯を含む半径
ｒs ）を記録した。具体的には胚の光学顕微鏡写真を撮
影した。単一胚の酸素消費量の計測にあたっては、電気
化学顕微鏡を応用した。
定を行った。胚の形状、大きさ（透明帯を含む半径
ｒs ）を記録した。具体的には胚の光学顕微鏡写真を撮
影した。単一胚の酸素消費量の計測にあたっては、電気
化学顕微鏡を応用した。
【００３４】電気化学顕微鏡計測においては、探針であ
る微小（マイクロ）電極を胚近傍に近接させながら酸素
還元電流を観測し、溶液中の酸素濃度と胚表面酸素濃度
の差（ΔＣ）を記録した。
る微小（マイクロ）電極を胚近傍に近接させながら酸素
還元電流を観測し、溶液中の酸素濃度と胚表面酸素濃度
の差（ΔＣ）を記録した。
【００３５】図１は本発明の実施例を示す哺乳動物胚の
無侵襲的品質評価装置の構成図であり、図１（Ａ）はそ
の無侵襲的品質評価装置の全体構成図、図１（Ｂ）はそ
の無侵襲的品質評価装置の部分拡大図である。
無侵襲的品質評価装置の構成図であり、図１（Ａ）はそ
の無侵襲的品質評価装置の全体構成図、図１（Ｂ）はそ
の無侵襲的品質評価装置の部分拡大図である。
【００３６】これらの図において、１は微小（マイク
ロ）電極、２は参照極／対極、３は培地／計測溶液、４
はディッシュ、５は胚試料、６は電極位置決め装置（精
密位置決め装置）、７はコンピュータ、８は微小電流計
測装置（ポテンショスタット）、９は試料保持装置、１
０は温度制御装置、１１はガスボンベ、１２はバブラ
ー、１３はグローブボックス、１４は倒立顕微鏡、１５
は顕微鏡ステージ、１６は電極シール部、１７は電極デ
ィスク面である。
ロ）電極、２は参照極／対極、３は培地／計測溶液、４
はディッシュ、５は胚試料、６は電極位置決め装置（精
密位置決め装置）、７はコンピュータ、８は微小電流計
測装置（ポテンショスタット）、９は試料保持装置、１
０は温度制御装置、１１はガスボンベ、１２はバブラ
ー、１３はグローブボックス、１４は倒立顕微鏡、１５
は顕微鏡ステージ、１６は電極シール部、１７は電極デ
ィスク面である。
【００３７】電気化学計測系は、マイクロ電極１、参照
極／対極電極２、微小電流計測装置（ポテンショスタッ
ト）８で構成される。電極の駆動は、電極位置決め装置
６により行った。電気化学計測系および電極駆動系はコ
ンピュータ７により制御した。３５ｍｍディッシュ（Ｎ
ｕｎｃ社製）中で、胚試料５が顕微鏡視野の中心に位置
するよう、試料保持装置（マニピュレータおよびマイク
ロインジェクタ、ナリシゲ社製）９で操作した。
極／対極電極２、微小電流計測装置（ポテンショスタッ
ト）８で構成される。電極の駆動は、電極位置決め装置
６により行った。電気化学計測系および電極駆動系はコ
ンピュータ７により制御した。３５ｍｍディッシュ（Ｎ
ｕｎｃ社製）中で、胚試料５が顕微鏡視野の中心に位置
するよう、試料保持装置（マニピュレータおよびマイク
ロインジェクタ、ナリシゲ社製）９で操作した。
【００３８】培地／計測溶液３は胚発生培養液に準ずる
無血清培養液（ＩＶＭＤ１０１，機能性ペプチド研究所
製）を用いた。温度制御装置１０には恒温循環槽を用い
た。培養気相条件は（５％二酸化炭素、９５％空気、湿
度１００％）ガスを流し制御した。諸装置を倒立顕微鏡
ステージ１５上に設置した。マイクロ電極１は、電極半
径が０．９２μｍ、シール部を含めた全体半径が４．０
μｍのものを用いた。酸素還元電流の記録にあたり、電
極電位を銀／塩化銀参照電極に対し、−０．６Ｖに印加
した。
無血清培養液（ＩＶＭＤ１０１，機能性ペプチド研究所
製）を用いた。温度制御装置１０には恒温循環槽を用い
た。培養気相条件は（５％二酸化炭素、９５％空気、湿
度１００％）ガスを流し制御した。諸装置を倒立顕微鏡
ステージ１５上に設置した。マイクロ電極１は、電極半
径が０．９２μｍ、シール部を含めた全体半径が４．０
μｍのものを用いた。酸素還元電流の記録にあたり、電
極電位を銀／塩化銀参照電極に対し、−０．６Ｖに印加
した。
【００３９】マイクロ電極１を胚試料５の表面に最近接
させた地点では、マイクロ電極１の先端が胚試料５の中
心と同じ高さで表面に接するように配置した。この際、
マイクロ電極１の先端の電極ディスク面１７と胚試料５
の表面はほぼ直交する配置になるため、マイクロ電極１
−胚試料５の表面間の最近接距離は、電極シール半径
（４．０μｍ）と同値である。電極走査速度は１４．７
μｍ／ｓとした。電極走査範囲としてマイクロ電極１−
胚試料５の最近接地点とその点より５００μｍ離れた地
点を往復した。
させた地点では、マイクロ電極１の先端が胚試料５の中
心と同じ高さで表面に接するように配置した。この際、
マイクロ電極１の先端の電極ディスク面１７と胚試料５
の表面はほぼ直交する配置になるため、マイクロ電極１
−胚試料５の表面間の最近接距離は、電極シール半径
（４．０μｍ）と同値である。電極走査速度は１４．７
μｍ／ｓとした。電極走査範囲としてマイクロ電極１−
胚試料５の最近接地点とその点より５００μｍ離れた地
点を往復した。
【００４０】図２は本発明の実施例を示すマイクロ電極
で記録された酸素還元電流より求められた特性図であ
り、図２（Ａ）はその酸素濃度プロファイルと胚の表面
から電極までの距離（ｒ）の関係を示す図、図２（Ｂ）
は酸素濃度プロファイルと、胚の中心から電極までの距
離と胚半径の比〔（ｒs ／（ｒ＋ｒs ）〕の関係を示す
図である。図中の線ａは、受精後６日目のウシ単一桑実
胚に対するプロファイルを示す。計測後４８時間継続培
養し胚盤胞期に到達した同一胚に対して、電極を栄養芽
細胞（ＴＲＰ，ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）側〔線ｂ〕お
よび内部細胞塊（ＩＣＭ，ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａ
ｓｓ）側に向かって近接した場合〔線ｃ〕のプロファイ
ルも図中に示した。
で記録された酸素還元電流より求められた特性図であ
り、図２（Ａ）はその酸素濃度プロファイルと胚の表面
から電極までの距離（ｒ）の関係を示す図、図２（Ｂ）
は酸素濃度プロファイルと、胚の中心から電極までの距
離と胚半径の比〔（ｒs ／（ｒ＋ｒs ）〕の関係を示す
図である。図中の線ａは、受精後６日目のウシ単一桑実
胚に対するプロファイルを示す。計測後４８時間継続培
養し胚盤胞期に到達した同一胚に対して、電極を栄養芽
細胞（ＴＲＰ，ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）側〔線ｂ〕お
よび内部細胞塊（ＩＣＭ，ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａ
ｓｓ）側に向かって近接した場合〔線ｃ〕のプロファイ
ルも図中に示した。
【００４１】図２より、本発明の計測が無侵襲的に行わ
れ、計測後の発生過程に影響を与えないこと、胚表面の
局所濃度変化を検出可能であることが示された。すなわ
ち、図２（Ｂ）においてプロットが良好な直線性を示す
ことは、胚試料近傍の濃度勾配が球面拡散の理論式によ
く従うことを意味する。
れ、計測後の発生過程に影響を与えないこと、胚表面の
局所濃度変化を検出可能であることが示された。すなわ
ち、図２（Ｂ）においてプロットが良好な直線性を示す
ことは、胚試料近傍の濃度勾配が球面拡散の理論式によ
く従うことを意味する。
【００４２】この図２（Ｂ）より、ｒs ／（ｒ＋
ｒs ）＝０および１における酸素濃度は、各々胚から十
分離れた地点および胚試料表面における酸素濃度に相当
する。従って、両地点の酸素濃度の差がΔＣに相当する
〔Ｔ．Ｙａｓｕｋａｗａ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｊ．，７６，１１２９−１１３５（１９９９）〕。
上記ΔＣの決定には、酸素還元電流のプロファイルが往
路（電極を胚に近接）と復路（電極を胚から遠ざける）
で対称性が良いことを確認し、往路／復路各々の電流プ
ロファイルを解析した。１個の胚に対して３往復以上電
流プロファイルを記録し、ΔＣの平均およびその標準偏
差を得た。ΔＣとｒs から、次式を用いて、単一胚あた
りの酸素消費速度（Ｆ）を算出することもできる。
ｒs ）＝０および１における酸素濃度は、各々胚から十
分離れた地点および胚試料表面における酸素濃度に相当
する。従って、両地点の酸素濃度の差がΔＣに相当する
〔Ｔ．Ｙａｓｕｋａｗａ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｊ．，７６，１１２９−１１３５（１９９９）〕。
上記ΔＣの決定には、酸素還元電流のプロファイルが往
路（電極を胚に近接）と復路（電極を胚から遠ざける）
で対称性が良いことを確認し、往路／復路各々の電流プ
ロファイルを解析した。１個の胚に対して３往復以上電
流プロファイルを記録し、ΔＣの平均およびその標準偏
差を得た。ΔＣとｒs から、次式を用いて、単一胚あた
りの酸素消費速度（Ｆ）を算出することもできる。
【００４３】Ｆ＝４πＤｒs ΔＣここで、Ｄは酸素の拡
散係数、ｒs は透明帯を含む胚の半径である。この式か
ら明らかなように、ΔＣは酸素消費速度の定量化や、個
々の胚における酸素消費量を比較する際に指標となる数
値である。特に桑実胚においては胚半径（ｒs ）がほぼ
同一であるため、ΔＣにより酸素消費量を比較可能であ
る。
散係数、ｒs は透明帯を含む胚の半径である。この式か
ら明らかなように、ΔＣは酸素消費速度の定量化や、個
々の胚における酸素消費量を比較する際に指標となる数
値である。特に桑実胚においては胚半径（ｒs ）がほぼ
同一であるため、ΔＣにより酸素消費量を比較可能であ
る。
【００４４】上記した図２の線ａ、線ｂ、線ｃに対して
求められたΔＣは、各々６．９０±１．３５、９．１４
±１．６７、１６．４０±１．８３μＭであった。
求められたΔＣは、各々６．９０±１．３５、９．１４
±１．６７、１６．４０±１．８３μＭであった。
【００４５】桑実胚（ｒs ＝７４μｍ）に関しては、胚
表面の酸素濃度は均一であるので直ちにＦ＝１．４０±
０．２７×１０-14 ｍｏｌｓ-1が求まる。胚盤胞期胚
（ｒs＝１００μｍ）に関しては、ＴＲＰ側とＩＣＭ側
で濃度差があるため、Ｆを求めることは難しい。しか
し、ＴＲＰ側とＩＣＭ側に近接させた際のΔＣを用い
て、近似的に、２．５０±０．４６×１０-14 ｍｏｌｓ
-1＜Ｆ＜４．４９±０．５０×１０-14 ｍｏｌｓ-1と表
すことは可能である。
表面の酸素濃度は均一であるので直ちにＦ＝１．４０±
０．２７×１０-14 ｍｏｌｓ-1が求まる。胚盤胞期胚
（ｒs＝１００μｍ）に関しては、ＴＲＰ側とＩＣＭ側
で濃度差があるため、Ｆを求めることは難しい。しか
し、ＴＲＰ側とＩＣＭ側に近接させた際のΔＣを用い
て、近似的に、２．５０±０．４６×１０-14 ｍｏｌｓ
-1＜Ｆ＜４．４９±０．５０×１０-14 ｍｏｌｓ-1と表
すことは可能である。
【００４６】上記と同一条件で、受精後６日の桑実胚２
９個に対し、形態観察と酸素消費量計測を実施し、その
後の発生過程を記録した。発生過程の指標としては、表
中の計測後４８時間継続培養した胚の半径（ｒs ）、胚
胞腔形成率、脱出胚盤胞到達率を調査し、結果を表１に
まとめた。
９個に対し、形態観察と酸素消費量計測を実施し、その
後の発生過程を記録した。発生過程の指標としては、表
中の計測後４８時間継続培養した胚の半径（ｒs ）、胚
胞腔形成率、脱出胚盤胞到達率を調査し、結果を表１に
まとめた。
【００４７】
【表１】
【００４８】表１は受精後６日のウシ桑実胚（ｎ＝２
９）の、溶液中の酸素濃度と胚表面酸素濃度の差（Δ
Ｃ）と、受精後８日目の胚半径（ｒs ）、胚胞腔形成
率、脱出胚盤胞到達率の関係を示している。
９）の、溶液中の酸素濃度と胚表面酸素濃度の差（Δ
Ｃ）と、受精後８日目の胚半径（ｒs ）、胚胞腔形成
率、脱出胚盤胞到達率の関係を示している。
【００４９】受精後６日の桑実胚のうち、溶液中の酸素
濃度と胚表面酸素濃度の差（ΔＣ）が５．０μＭ未満の
胚（ΔＣ＜５．０μＭ）は、受精後８日目の胚半径８０
μｍ未満（ｒs ＜８０μｍ）が７８％、胚胞腔形成率３
３％、脱出胚盤胞到達率０％であったのに対し、ΔＣが
５．０μＭ以上の胚（ΔＣ＞５．０μＭ）は、受精後８
日目の胚半径８０μｍ以上（ｒs ＞８０μｍ）が８０
％、胚胞腔形成率９５％、脱出胚盤胞到達率６８％であ
った。即ち、受精後６日の桑実胚において、判定基準と
して「ΔＣが５．０μＭ以上」を設定した場合、基準を
満たす胚と満たさない胚では、その後の胚発生過程に著
しい違いがあることが分かった。
濃度と胚表面酸素濃度の差（ΔＣ）が５．０μＭ未満の
胚（ΔＣ＜５．０μＭ）は、受精後８日目の胚半径８０
μｍ未満（ｒs ＜８０μｍ）が７８％、胚胞腔形成率３
３％、脱出胚盤胞到達率０％であったのに対し、ΔＣが
５．０μＭ以上の胚（ΔＣ＞５．０μＭ）は、受精後８
日目の胚半径８０μｍ以上（ｒs ＞８０μｍ）が８０
％、胚胞腔形成率９５％、脱出胚盤胞到達率６８％であ
った。即ち、受精後６日の桑実胚において、判定基準と
して「ΔＣが５．０μＭ以上」を設定した場合、基準を
満たす胚と満たさない胚では、その後の胚発生過程に著
しい違いがあることが分かった。
【００５０】ここで重要なことは、このような代謝活性
の数値化に基づく判定基準は、形態観察のみから設定す
ることが不可能な点にある。
の数値化に基づく判定基準は、形態観察のみから設定す
ることが不可能な点にある。
【００５１】図３は基準値近傍の桑実胚のうち典型的な
試料の光学顕微鏡写真を示す図である。
試料の光学顕微鏡写真を示す図である。
【００５２】図中Ａ、ＢはΔＣが５．０μＭ未満、Ｃか
らＦはΔＣが５．０μＭ以上であった。図３より、本発
明により設定された基準を、形態観察のみに基づき判別
することは極めて困難であることが分かる。
らＦはΔＣが５．０μＭ以上であった。図３より、本発
明により設定された基準を、形態観察のみに基づき判別
することは極めて困難であることが分かる。
【００５３】例えば、ウシを含む哺乳動物胚が正常胚か
異常胚であるかは、胚の凍結保存時の耐凍能や受胎率に
大きな影響を与える。従って、胚の品質を生存したまま
（無侵襲的に）しかも発生の早い時期に評価できる技術
が求められている。通常形態的観察による評価法が一般
的に用いられているが、この方法では正確な正常胚の判
別が難しいという欠点があった。本発明では、上記した
ように、電気化学顕微鏡を用いて、単一胚の酸素消費量
を定量的に計測可能であることを示し、さらに、形態的
には見分けの困難な胚の品質評価をより正確に行えるこ
とを特徴としている。この結果、移植や凍結保存に適し
た胚の選択により信頼性の高い品質評価法としての意義
は大きい。
異常胚であるかは、胚の凍結保存時の耐凍能や受胎率に
大きな影響を与える。従って、胚の品質を生存したまま
（無侵襲的に）しかも発生の早い時期に評価できる技術
が求められている。通常形態的観察による評価法が一般
的に用いられているが、この方法では正確な正常胚の判
別が難しいという欠点があった。本発明では、上記した
ように、電気化学顕微鏡を用いて、単一胚の酸素消費量
を定量的に計測可能であることを示し、さらに、形態的
には見分けの困難な胚の品質評価をより正確に行えるこ
とを特徴としている。この結果、移植や凍結保存に適し
た胚の選択により信頼性の高い品質評価法としての意義
は大きい。
【００５４】以下、本発明の効果について説明する。
【００５５】平成９年度の国内でのウシ受精卵移植の受
胎率は、体内受精卵新鮮胚移植で５１％、体内受精卵凍
結胚移植で４５％、体外受精卵移植では３４％となって
いる〔農林水産省畜産局統計資料〕。本発明によれば、
それぞれの胚の品質をより正確に判定できることによ
り、受胎率を１０％向上させるだけでも畜産業に与える
経済的利益は多大なものとなる。さらに、家畜胚のみな
らずヒト胚の品質評価も可能と考えられ、ヒト体外受精
における不妊治療に対しても大きな期待が寄せられる。
具体的には、ヒト体外受精で得られた胚の妊娠率は約２
０％と低く、治療には複数個の胚（３個程度まで）が移
植される。その結果、双子以上多胎妊娠の例も多く報告
され、妊娠や出産後の子育ての大きな問題となってい
る。移植前に正確な胚の品質評価ができれば、移植に用
いる胚を１個に減らすことが可能となり、多胎妊娠を防
止することで母体への負担等が著しく軽減する。
胎率は、体内受精卵新鮮胚移植で５１％、体内受精卵凍
結胚移植で４５％、体外受精卵移植では３４％となって
いる〔農林水産省畜産局統計資料〕。本発明によれば、
それぞれの胚の品質をより正確に判定できることによ
り、受胎率を１０％向上させるだけでも畜産業に与える
経済的利益は多大なものとなる。さらに、家畜胚のみな
らずヒト胚の品質評価も可能と考えられ、ヒト体外受精
における不妊治療に対しても大きな期待が寄せられる。
具体的には、ヒト体外受精で得られた胚の妊娠率は約２
０％と低く、治療には複数個の胚（３個程度まで）が移
植される。その結果、双子以上多胎妊娠の例も多く報告
され、妊娠や出産後の子育ての大きな問題となってい
る。移植前に正確な胚の品質評価ができれば、移植に用
いる胚を１個に減らすことが可能となり、多胎妊娠を防
止することで母体への負担等が著しく軽減する。
【００５６】また、妊娠率の向上は、患者の経済的負担
を減らすことが期待される。
を減らすことが期待される。
【００５７】単一胚の酸素消費量を高感度に計測可能な
本発明は、胚の酸素消費量の計測のみならず、細菌など
の前核性生物、植物細胞、動物細胞など多種多様な細胞
の酸素消費量をごく少量の細胞数で計測できることが考
えられる。さらに、酸素消費量だけでなく、プローブを
代えることにより、他の分子種（Ｃａ，Ｋなど）の細胞
内変化を鋭敏に定量化することも可能である。
本発明は、胚の酸素消費量の計測のみならず、細菌など
の前核性生物、植物細胞、動物細胞など多種多様な細胞
の酸素消費量をごく少量の細胞数で計測できることが考
えられる。さらに、酸素消費量だけでなく、プローブを
代えることにより、他の分子種（Ｃａ，Ｋなど）の細胞
内変化を鋭敏に定量化することも可能である。
【００５８】なお、本発明は上記実施例に限定されるも
のではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能
であり、それらを本発明の範囲から排除するものではな
い。
のではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能
であり、それらを本発明の範囲から排除するものではな
い。
【００５９】
【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明に
よれば、以下のような効果を奏することができる。
よれば、以下のような効果を奏することができる。
【００６０】電気化学顕微鏡を用いて、単一胚の酸素消
費量を定量的に計測可能であり、さらに、形態的には見
分けの困難な胚の品質評価をより正確に行うことができ
る。その結果、移植や凍結保存に適した胚の選択により
信頼性の高い品質評価を行うことができる。
費量を定量的に計測可能であり、さらに、形態的には見
分けの困難な胚の品質評価をより正確に行うことができ
る。その結果、移植や凍結保存に適した胚の選択により
信頼性の高い品質評価を行うことができる。
【図１】本発明の実施例を示す哺乳動物胚の無侵襲的品
質評価装置の構成図である。
質評価装置の構成図である。
【図２】本発明の実施例を示すマイクロ電極で記録され
た酸素還元電流より求められた特性図である。
た酸素還元電流より求められた特性図である。
【図３】基準値近傍の桑実胚のうち典型的な試料の光学
顕微鏡写真を示す図である。
顕微鏡写真を示す図である。
１ マイクロ電極 ２ 参照極／対極 ３ 培地／計測溶液 ４ ディッシュ ５ 胚試料 ６ 電極位置決め装置（精密位置決め装置） ７ コンピュータ ８ 微小電流計測装置（ポテンショスタット） ９ 試料保持装置 １０ 温度制御装置 １１ ガスボンベ １２ バブラー １３ グローブボックス １４ 倒立顕微鏡 １５ 顕微鏡ステージ １６ 電極シール部 １７ 電極ディスク面
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ //(Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５１ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 阿部 宏之 山形県山形市篭田３−５−27 (72)発明者 星 宏良 山形県山形市城西町５−10−５−Ｃ102 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB11 FA02 4B063 QA01 QQ08 QS36 QX10 4B065 AA90X BC05 BC41 CA46
Claims (5)
- 【請求項１】 哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法にお
いて、 哺乳動物胚の形態観察と代謝活性の指標である酸素消費
量の計測を行い、その結果を元に、個々の哺乳動物胚の
正常性を判定することを特徴とする哺乳動物胚の無侵襲
的品質評価方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の哺乳動物胚の無侵襲的品
質評価方法において、前記正常性が判定された哺乳動物
胚を培養し、再び形態観察と酸素消費量の計測を行うこ
とを特徴とする哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法。 - 【請求項３】 哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方法にお
いて、（ａ）顕微鏡観察により単一哺乳動物胚の大きさ
を計測し、かつ、形態的評価を行う工程と、（ｂ）前記
単一哺乳動物胚に関して、すみやかに酸素消費量を計測
する工程と、（ｃ）上記工程（ａ）および工程（ｂ）に
より、あらかじめ哺乳動物胚の大きさと酸素消費量の関
係、さらに哺乳動物胚のその後の成長過程を記録すると
ともに、判定基準を設定する工程と、（ｄ）上記工程
（ｃ）を参照し、哺乳動物胚の品質を判定する工程とを
施すことを特徴とする哺乳動物胚の無侵襲的品質評価方
法。 - 【請求項４】 哺乳動物胚の無侵襲的品質評価装置にお
いて、（ａ）単一哺乳動物胚の形態観察を行うための顕
微鏡と、（ｂ）単一哺乳動物胚の酸素消費量の計測を行
う電気化学顕微鏡計測装置と、（ｃ）培養液に準ずる計
測溶液と、（ｄ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）を用いて
単一胚近傍の酸素濃度変化を高空間分解能で定量する手
段と、（ｅ）上記（ｄ）によりあらかじめ作出した哺乳
動物胚の大きさと酸素消費量の関係および哺乳動物胚の
その後の発生結果を集計する手段と、（ｆ）上記（ｅ）
により哺乳動物胚の正常性を判定する手段とを具備する
ことを特徴とする哺乳動物胚の無侵襲的品質評価装置。 - 【請求項５】 請求項４記載の哺乳動物胚の無侵襲的品
質評価装置において、前記電気化学顕微鏡計測装置は、
顕微鏡ステージ上に設置した微小電極、電極位置決め装
置、微小電流計測装置、温度制御装置、培養気相条件
（酸素、二酸化炭素）制御装置を含むことを特徴とする
哺乳動物胚の無侵襲的品質評価装置。
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Cited By (7)
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| JP2006292468A (ja) * | 2005-04-07 | 2006-10-26 | Univ Of Electro-Communications | 検体動作制御装置及び方法 |
| WO2012002500A1 (ja) * | 2010-06-30 | 2012-01-05 | 大日本印刷株式会社 | 体外培養による胚の製造方法、並びに胚を選別するための方法、装置、及びシステム |
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Cited By (14)
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|---|---|---|---|---|
| JP2006512925A (ja) * | 2002-12-23 | 2006-04-20 | ユニセンス・ファーティリテック・アンパルトセルスカブ | 実質的に球形の代謝粒子の個々の代謝速度の非−侵入的測定のためのデバイスおよび方法 |
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