CN106199078A - 一种活体细胞表面形貌原子力显微镜快速精确表征方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,包括如下步骤:步骤一:使用原子力显微镜获取细胞表面弹性值基本稳定的作用力范围,及其对应杨氏模量值;步骤二:使用原子力显微镜获得活体细胞在设定成像力下的来回扫描高度图像;步骤三:对探针与细胞间相互作用进行受力分析,将两者间相互作用分解为竖直成像力与水平侧向力;步骤四:根据成像力大小、在此力下细胞表面形貌、细胞表面弹性系数计算获得细胞在未受作用力时细胞表面形貌。本发明提出的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,具有较高精度,较高时间分辨率等特点。
Description
技术领域
本发明涉及细胞研究领域的形貌表征方法,且特别涉及一种活体细胞表面形貌原子力显微镜快速精确表征方法。
背景技术
细胞作为生命体的最小功能单位,其本身的性质(如表面形貌、体积等)与生命过程直接相关,这些细胞性质的检测研究具有重要的生物学与临床意义。
原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM),一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定,另一端的微小针尖接近样品,这时它将与其相互作用,作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时,利用传感器检测这些变化,就可获得作用力分布信息,从而以纳米级分辨率获得表面形貌结构信息及表面粗糙度信息。
原子力显微镜(AFM)作为近年来发展起来的一种纳米级成像与力学测量手段,不仅具有纳米级的空间分辨率,同时原子力显微镜还可以在溶液(如细胞培养液、生理缓冲液等)中进行测量,可以充分保证被测量细胞的活性。因此,原子力显微镜已成为研究活体细胞表面形貌的有力工具。
但是原子力显微镜在细胞学研究中也存在着一些不足之处,其中之一是当原子力显微镜在对细胞进行扫描时,探针与细胞表面间作用力会引起细胞膜形变,使所获得的细胞形貌偏离其真实形貌。由于细胞表面非常柔软,所以即使成像作用力控制在皮牛量级,仍将引起细胞膜显著形变。虽然已有研究通过记录细胞表面每一点的原子力显微镜力曲线与高度信息,然后通过计算获得了理论上零作用力情况下的细胞形貌图像。但是该类方法往往纪录数据时间较长,导致测量时间分辨率过低,不适合细胞快速变化过程的研究。
发明内容
本发明提出一种活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,具有较高精度,较高时间分辨率等特点。
为了达到上述目的,本发明提出一种活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,包括如下步骤:
步骤一:使用原子力显微镜获取细胞表面弹性值基本稳定的作用力范围,及其对应杨氏模量值;
步骤二:使用原子力显微镜获得活体细胞在设定成像力下的来回扫描高度图像;
步骤三:对探针与细胞间相互作用进行受力分析,将两者间相互作用分解为竖直成像力与水平侧向力;
步骤四:根据成像力大小、在此力下细胞表面形貌、细胞表面弹性系数计算获得细胞在未受作用力时细胞表面形貌。
进一步的,所述步骤一为使用原子力显微镜获取细胞顶部处的力曲线,获得不同作用力下细胞弹性模量。
进一步的,所述细胞表面弹性值基本稳定的作用力范围为10-1000pN。
进一步的,所述步骤二为使用原子力显微镜接触模式,调节成像力至步骤一所获作用力范围,测得活体细胞的高度及摩擦力的来回扫描图像。
进一步的,所述步骤二为使用原子力显微镜接触模式,调节成像力至930pN,对活体细胞进行高度成像,成像速率为2Hz,记录来回扫描图像。
进一步的,所述步骤三中细胞实际表面上一点(x0,y0)在探针作用下,在第一次扫描时移动至(x1,y1),在第二次扫描时移动至(x2,y2),当δ1、δ2分别为细胞表面法向形变时,则上述变量关系如公式1:
同时δ1、δ2又必须满足赫兹模型,即公式2:
细胞表面所受水平侧向力与该点竖直高度成线性比例,即公式3:
使用迭代法联解公式1-3,可得到校正后各接近实际情况的细胞形状,其中所述θ为细胞剖面的切向角,F为成像力,v为细胞泊松比,E为细胞杨氏模量,α为原子力显微镜探针尖的开放角,p为比例常数。
进一步的,所述活体细胞为贴壁培养活体细胞。
进一步的,所述活体细胞按照如下方法培养:
将细胞培养瓶中的培养液除尽,向细胞培养瓶中加入4ml 0.025%胰酶溶液,晃动培养瓶以确保培养瓶底部所有区域均被胰酶溶液所覆盖;
立即从培养瓶中吸出3ml胰酶溶液,将培养瓶置于培养箱中1-5分钟;
在倒置显微镜下观察细胞形态,当观察到细胞形态变圆后,轻敲培养瓶使细胞从瓶壁脱落;
向培养瓶中加入3ml培养液中止胰酶,并将培养瓶中全部溶液转移到15ml无菌离心管中,再向培养瓶中加入3ml培养液,并用吸管吹打底面数次,然后将溶液移入上述离心管中;
180x g离心7分钟,弃去上清,并向离心管中加入4ml培养液,吹散沉淀形成新的细胞悬浮液;
根据实验时样品细胞生长密度要求,移出一定量悬浮液至无菌培养皿或放有无菌玻片的培养皿中;
向培养皿中再加入4ml培养液,将培养皿置于37℃,5%CO2培养箱中培养;
培养12至48小时后取出,对活体细胞进行原子力显微镜成像。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:与传统原子力显微镜细胞表面形貌表征相比,修正了成像力造成的细胞表面形变,本发明的方法具有精度高的特点;与记录细胞表面每一点的原子力显微镜力曲线与高度信息,然后通过计算获得了理论上零作用力情况下的细胞形貌图像的方法相比,本发明的方法具有测量、计算量少、可快速获得细胞表面形貌、时间分辨率高的特点,更加适用于快速变化过程的细胞表面形貌研究。
附图说明
图1所示为本发明较佳实施例的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法流程图。
图2所示为内皮细胞顶部以及培养皿基底表面获得的原子力显微镜力曲线示意图。
图3所示为人脐静脉内皮细胞原子力显微镜成像获得的高度形貌图。
图4和图5所示为原子力显微镜扫描成像时细胞受到的竖直成像力与水平侧向力受力分析示意图。
图6所示为基于同一细胞剖面trace和retrace高度曲线的校正前后曲线示意图。
具体实施方式
以下结合附图给出本发明的具体实施方式,但本发明不限于以下的实施方式。根据下面说明和权利要求书,本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是,附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比率,仅用于方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
请参考图1,图1所示为本发明较佳实施例的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法流程图。本发明提出一种活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,包括如下步骤:
步骤一S100:使用原子力显微镜获取细胞表面弹性值基本稳定的作用力范围,及其对应杨氏模量值;
步骤二S200:使用原子力显微镜获得活体细胞在设定成像力下的来回扫描高度图像;
步骤三S300:对探针与细胞间相互作用进行受力分析,将两者间相互作用分解为竖直成像力与水平侧向力;
步骤四S400:根据成像力大小、在此力下细胞表面形貌、细胞表面弹性系数计算获得细胞在未受作用力时细胞表面形貌。
根据本发明较佳实施例,所述步骤一为使用原子力显微镜获取细胞顶部处的力曲线,获得不同作用力下细胞弹性模量。随着探测作用力增大,细胞形变增大,在最初一定范围内测得的杨氏模量主要为细胞表面弹性,其值基本稳定,随着探针更深的压入细胞,细胞核、基底等对测得杨氏模量值的贡献逐渐增大,测得杨氏模量值也会随之增加。因此通过测量获得细胞表面弹性值基本稳定的作用力范围,及其对应杨氏模量值。
使用原子力显微镜接触模式力曲线测试模块分别测量人脐静脉内皮细胞顶部以及培养皿基底表面力曲线(如附图1所示),其作用力范围从0至1.2nN连续增加;使用赫兹模型计算不同作用力下细胞表面弹性值,获得细胞表面弹性值基本稳定的作用力范围为10-1000pN,在此范围内其杨氏模量稳定在5.2kPa左右。
所述步骤二为使用原子力显微镜接触模式,调节成像力至步骤一所获作用力范围,测得活体细胞的高度及摩擦力的来回扫描(trace和retrace)图像。进一步的,所述步骤二为使用原子力显微镜接触模式,调节成像力至930pN,对活体细胞进行高度成像,成像速率为2Hz,记录来回扫描图像(如附图2所示)。本发明可在5分钟内获得细胞表面无外力作用下的形貌图像,其图像像素点为512X512。
请参考图4和图5,图4和图5所示为原子力显微镜扫描成像时细胞受到的竖直成像力与水平侧向力受力分析示意图。所述步骤三中细胞实际表面上一点(x0,y0)在探针作用下,在第一次扫描时移动至(x1,y1),在第二次扫描时移动至(x2,y2),当δ1、δ2分别为细胞表面法向形变时,则上述变量关系如公式1:
同时δ1、δ2又必须满足赫兹模型,即公式2:
细胞表面所受水平侧向力与该点竖直高度成线性比例,即公式3:
使用迭代法联解公式1-3,可得到校正后各接近实际情况的细胞形状,其中所述θ为细胞剖面的切向角,F为成像力,v为细胞泊松比,E为细胞杨氏模量,α为原子力显微镜探针尖的开放角,p为比例常数。
根据本发明较佳实施例,所述活体细胞为贴壁培养活体细胞。进一步的,所述活体细胞按照如下方法培养:
将细胞培养瓶中的培养液除尽,向细胞培养瓶中加入4ml 0.025%胰酶溶液,晃动培养瓶以确保培养瓶底部所有区域均被胰酶溶液所覆盖;
立即从培养瓶中吸出3ml胰酶溶液,将培养瓶置于培养箱中1-5分钟;
在倒置显微镜下观察细胞形态,当观察到细胞形态变圆后,轻敲培养瓶使细胞从瓶壁脱落;
向培养瓶中加入3ml培养液中止胰酶,并将培养瓶中全部溶液转移到15ml无菌离心管中,再向培养瓶中加入3ml培养液,并用吸管吹打底面数次,然后将溶液移入上述离心管中;
180x g离心7分钟,弃去上清,并向离心管中加入4ml培养液,吹散沉淀形成新的细胞悬浮液;
根据实验时样品细胞生长密度要求,移出一定量悬浮液至无菌培养皿或放有无菌玻片的培养皿中;
向培养皿中再加入4ml培养液,将培养皿置于37℃,5%CO2培养箱中培养;
培养12至48小时后取出,对活体细胞进行原子力显微镜成像。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者,在不脱离本发明的精神和范围内,当可作各种的更动与润饰。因此,本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。
Claims (8)
1.一种活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:使用原子力显微镜获取细胞表面弹性值基本稳定的作用力范围,及其对应杨氏模量值;
步骤二:使用原子力显微镜获得活体细胞在设定成像力下的来回扫描高度图像;
步骤三:对探针与细胞间相互作用进行受力分析,将两者间相互作用分解为竖直成像力与水平侧向力;
步骤四:根据成像力大小、在此力下细胞表面形貌、细胞表面弹性系数计算获得细胞在未受作用力时细胞表面形貌。
2.根据权利要求1所述的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,其特征在于,所述步骤一为使用原子力显微镜获取细胞顶部处的力曲线,获得不同作用力下细胞弹性模量。
3.根据权利要求1所述的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,其特征在于,所述细胞表面弹性值基本稳定的作用力范围为10-1000pN。
4.根据权利要求1所述的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,其特征在于,所述步骤二为使用原子力显微镜接触模式,调节成像力至步骤一所获作用力范围,测得活体细胞的高度及摩擦力的来回扫描图像。
5.根据权利要求4所述的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,其特征在于,所述步骤二为使用原子力显微镜接触模式,调节成像力至930pN,对活体细胞进行高度成像,成像速率为2Hz,记录来回扫描图像。
6.根据权利要求1所述的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,其特征在于,所述步骤三中细胞实际表面上一点(x0,y0)在探针作用下,在第一次扫描时移动至(x1,y1),在第二次扫描时移动至(x2,y2),当δ1、δ2分别为细胞表面法向形变时,则上述变量关系如公式1:
同时δ1、δ2又必须满足赫兹模型,即公式2:
细胞表面所受水平侧向力与该点竖直高度成线性比例,即公式3:
使用迭代法联解公式1-3,可得到校正后各接近实际情况的细胞形状,其中所述θ为细胞剖面的切向角,F为成像力,v为细胞泊松比,E为细胞杨氏模量,α为原子力显微镜探针尖的开放角,p为比例常数。
7.根据权利要求1所述的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,其特征在于,所述活体细胞为贴壁培养活体细胞。
8.根据权利要求1所述的活体细胞原子力显微镜快速精确表征方法,其特征在于,所述活体细胞按照如下方法培养:
将细胞培养瓶中的培养液除尽,向细胞培养瓶中加入4ml 0.025%胰酶溶液,晃动培养瓶以确保培养瓶底部所有区域均被胰酶溶液所覆盖;
立即从培养瓶中吸出3ml胰酶溶液,将培养瓶置于培养箱中1-5分钟;
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GR01 | Patent grant | ||
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