CN109580563A - 一种纳米传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN109580563A CN201811407809.0A CN201811407809A CN109580563A CN 109580563 A CN109580563 A CN 109580563A CN 201811407809 A CN201811407809 A CN 201811407809A CN 109580563 A CN109580563 A CN 109580563A
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    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Abstract

本发明提供了一种可同时且实时监测葡萄糖和氧的纳米传感器及其制备方法和应用，所述纳米传感器为具有核壳结构的纳米传感器；其中，所述纳米传感器具有葡萄糖探针、氧探针和参比探针。本发明提供的纳米传感器可同时实现葡萄糖和氧气的比率型检测，且不相互干扰；并且本发明提供的纳米传感器分散液在没有沉淀剂的情况下可稳定存在至少半年以上；同时，本发明提供的传感器尺寸相对较小，可达100nm以下，其具有良好的细胞渗透性和低细胞毒性，可用于细胞内传感并且可实时监测细胞内葡萄糖和氧。

Description

一种纳米传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于传感器技术领域，涉及一种纳米传感器及其制备方法和应用，特别是一种可同时且实时监测葡萄糖和氧的纳米传感器及其制备方法和应用。
背景技术
细胞代谢过程是细胞功能、刺激反应和生存的核心。许多复杂的疾病，包括癌症，都与不同水平的代谢途径调节的改变直接相关；细胞代谢的改变被认为是癌症的特征之一。尽管我们对与疾病状态相关的代谢变化的理解有了显著的进展，但对于代谢过程的动力学，尤其是在单细胞水平上动力学的机理却缺乏更进一步的认识。因此，监测细胞内代谢的方法已成为一个亟待解决的科学问题。葡萄糖和氧的浓度是与细胞新陈代谢密切相关的两个重要参数；监测细胞内葡萄糖和氧浓度就成为了监测细胞代谢的有效方法。
氧是生物系统中最关键的作用之一，因为几乎所有生物都利用它来产生能量和呼吸。细胞内氧含量与多种细胞活动密切相关，如细胞呼吸、细胞器功能、细胞代谢和癌症进展。氧含量的变化对了解细胞功能，尤其是细胞代谢具有重要意义。迄今为止，对于氧气浓度的测量方法主要分为Winkler滴定法，电化学分析法和光化学发光法。Winkler滴定法又称为化学法或碘量法，国际上在一定范围内将其作为测量氧气浓度的标准方法，我国则作为国标中指定的氧气浓度检测方法，其优点是测量精确度高且重复性好；但是，碘量法只适用于清洁水样，当水中含有其他离子如铁离子、游离态的氯离子和亚硝酸盐时会对测试结果产生干扰；更重要的是，该方法滴定耗时长，使用化学试剂繁多导致程序繁琐，而且会不断的消耗氧气，现场测试的要求无法满足，这些缺陷极大的限制了碘量法的使用。其次是电化学分析即Clark电极法；电化学方法操作简单，可以实现连续测量，并能够满足现场测样，由于存在选择性透过的聚四氟乙烯的薄膜，因此对于样品的要求较低，但是由于其特殊的结构和检测原理，使用前需要预热几分钟以保持电压的稳定；温度和薄膜上的污垢会直接影响Clark电池测试效果，因此需要及时清理电极和薄膜上的污垢，如果使用频繁，最好在一个月内就替换薄膜；且由于电池可以实现连续测量，并且在测试过程中发生化学反应，电极和电解液的损耗不容忽视；在测量之前，需要去不断的校准，一旦使用时间长，需要更换电解液；在使用电化学方法测量氧浓度的同时，消耗氧的缺陷依然没有改善，此缺陷仍旧限制了电化学方法的使用范围。CN1037968A公开了一种多功能组织细胞测氧器，由组织测氧室、细胞测氧室、恒温水池、传感器构成，其将组织测氧室和细胞测氧室设计在一个装置上，可用于生物组织、细胞氧耗的测定，但是其并没有办法兼顾氧气与葡萄糖的同时测定。
葡萄糖不仅是维持细胞生命活动的主要能源，而且为细胞增殖提供必需的生物量。体葡萄糖浓度异常可以导致糖尿病，另外糖尿病患者血液中的高葡萄糖浓度引起体内多种物质代谢紊乱，机体的电解质平衡也常因此导致失衡，因此导致了许多糖尿病并发症。因此，检测葡萄糖水平对于监测细胞与氧同等的代谢至关重要。迄今为止，各种类型的葡萄糖传感器被开发出来。其中分为硼酸基传感器与酶基传感器；硼酸基传感器是基于葡萄糖分子与硼酸之间的配位相互作用实现葡萄糖的检测，而酶基传感器是通过葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶与葡萄糖相互作用，检测其氧化还原的产物或电信号，由于酶会在pH 2以下和pH 8以上迅速失去活性，在超过40℃的温度下不可逆地损坏，还受表面活性剂的影响，湿度不稳定也会严重影响传感器；总之，最常见和最严重的问题是酶传感器的稳定性问题。由于在葡萄糖的消耗过程中同时消耗氧气，许多氧气传感器在葡萄糖氧化酶的帮助下间接用于监测葡萄糖。大多数葡萄糖传感器设计用于检测细胞外葡萄糖的浓度变化，并没有涉及到检测细胞内葡萄糖浓度的方法。CN108088881A公开了一种基于聚合物-碳纳米管无酶葡萄糖传感器的制备方法，其基于双亲性聚合物改性的碳纳米管杂化体为载体，负载金属纳米催化剂粒子，并将其应用于制作葡萄糖传感器的方法。该方法利用双亲性大分子组装驱动力实现大分子与碳纳米管一步共组装，制备出聚合物-碳纳米管杂化体，从而得到稳定性好的无酶葡萄糖传感器，但是其仍旧不能兼顾葡糖糖和氧的测量。
现有的大多数葡萄糖和氧传感器都是单独使用的，然而，葡萄糖和氧水平在细胞代谢过程中密切相关，同时且实时监测细胞内葡萄糖及氧水平对研究细胞代谢、诊断癌症、了解细胞功能及某些疾病的发病机制等都具有十分重要的意义，因此，开发一种可同时监测细胞内葡萄糖和氧水平的传感器十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米传感器及其制备方法和应用。本发明提供的纳米传感器具有良好的水分散性、低细胞毒性和良好的生物相容性，其对氧和葡萄糖具有很高的灵敏度，响应时间较快，且能够同时不互相干扰地实现氧和葡萄糖的比率型识别；并且其具有好的细胞渗透性，能够应用到细胞内成像与细胞内的氧和葡萄糖的灵敏检测。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种纳米传感器，所述纳米传感器为具有核壳结构的纳米传感器；
其中，所述纳米传感器具有葡萄糖探针、氧探针和参比探针。
本发明选用的纳米传感器上具有葡萄糖探针、氧探针和参比探针，其可同时实现对葡萄糖和氧的监测。该参比探针可以对传感器的局部浓度、生物背景和环境的影响进行校正以实现对葡萄糖和氧的高精度监测；其不响应葡萄糖或氧。
优选地，所述葡萄糖探针具有式I结构：
该葡萄糖探针为具有蓝色发光性质的硼酸修饰蒽衍生物。
优选地，所述氧探针具有式II结构：
优选地，所述参比探针具有式III结构：
优选地，所述核壳结构为以疏水性聚合物为核，以亲水性聚合物为壳。
优选地，所述疏水性聚合物的聚合单体为带有双键结构的疏水性单体，进一步优选苯乙烯和/或甲基丙烯酸甲酯，更进一步优选苯乙烯。
优选地，所述亲水性聚合物的聚合单体为带有双键结构的亲水性单体，进一步优选丙烯酰胺。
优选地，所述具有核壳结构的纳米传感器以聚苯乙烯为核，以聚丙烯酰胺为壳。
优选地，所述葡萄糖探针位于所述纳米传感器的壳结构上。
优选地，所述葡萄糖探针以酰胺化学键合的方式接枝在所述壳结构上。
优选地，所述氧探针和参比探针均位于所述纳米传感器的核结构上。
优选地，所述氧探针和参比探针均以双键加成聚合的形式连接在所述核结构上。
优选地，以所述纳米传感器的质量为100％计，所述葡萄糖探针的质量百分含量为0.1-0.2％，例如0.12％、0.14％、0.15％、0.16％、0.18％等。
以所述纳米传感器的质量为100％计，所述氧探针的质量百分含量为0.2-0.3％，例如0.22％、0.24％、0.25％、0.26％、0.28％等。
以所述纳米传感器的质量为100％计，所述参比探针的质量百分含量为0.05-0.08％，例如0.06％、0.07％等。
第二方面，本发明提供了根据第一方面所述的纳米传感器的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将疏水性单体、氧探针和参比探针混合，然后加入引发剂进行聚合反应；
(2)将亲水性单体的水溶液加入步骤(1)的反应体系中进行交联反应，然后与葡萄糖探针进行酰胺化接枝，得到所述纳米传感器。
优选地，所述疏水性单体、氧探针和参比探针的质量比为1000:(2-5):(0.5-1)，例如1000:2:0.5、1000:2.5:0.6、1000:3:0.7、1000:3.5:0.8、1000:4:0.9、1000:4.5:1、1000:5:1等。
优选地，步骤(1)所述混合在含有乳化剂的双蒸馏水中进行。
优选地，在所述双蒸馏水中，所述疏水性单体的浓度为20-25g/L，例如21g/L、22g/L、23g/L、24g/L等。
优选地，所述乳化剂为十二烷基硫酸钠。
优选地，所述乳化剂的浓度为0.37-0.38g/L，例如0.372g/L、0.375g/L、0.378g/L等。
优选地，步骤(1)所述混合为先搅拌20-30min，例如22min、25min、28min等，然后在0℃下超声20-30min，例如22min、24min、26min、28min等。
优选地，步骤(1)所述聚合反应在氮气环境下进行。
优选地，步骤(1)所述聚合反应在搅拌的条件下进行。
优选地，所述搅拌的速率为600-800rpm，例如650rpm、700rpm、750rpm等。
优选地，步骤(1)所述引发剂为过硫酸铵。
优选地，步骤(1)所述聚合反应的温度为60-65℃，例如61℃、62℃、63℃、64℃等，时间为2-3h，例如2.2h、2.4h、2.5h、2.8h等。
优选地，步骤(2)所述水溶液中包括亲水性单体、6-氨基己基甲基丙烯酰胺和交联剂。
优选地，所述亲水性单体、6-氨基己基甲基丙烯酰胺和交联剂的质量比为80:(3-5):(1-2)，例如80:3:1、80:4:1.5、80:4.5:1.8等。
优选地，所述交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。
优选地，所述疏水性单体和亲水性单体的质量比为10:(4-5)，例如10:4.2、10:4.5、10:4.7等。
优选地，步骤(2)所述交联反应的温度为60-65℃，例如61℃、62℃、63℃、64℃等，时间为2-3h，例如2.2h、2.4h、2.5h、2.8h等。
优选地，步骤(2)还包括在交联反应之后除去未反应单体，然后再与葡萄糖探针进行酰胺化接枝。
优选地，所述除去未反应单体的方法为通过透析膜与纯水透析3天。
优选地，步骤(2)所述接枝反应的催化剂为4-二甲氨基吡啶。
优选地，步骤(2)所述接枝反应的温度为室温，时间为24-26h，例如24.5h、25h、25.5h等。
优选地，步骤(2)所述葡萄糖探针与6-氨基己基甲基丙烯酰胺的质量比为(2-6):1，例如2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1等。
作为优选技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将疏水性单体、氧探针和参比探针在含有乳化剂的双蒸馏水中先搅拌20-30min，然后在0℃下超声20-30min，然后在氮气环境下，600-800rpm的搅拌速率下加入引发剂，在60-65℃下进行聚合反应2-3h；
(2)将包括亲水性单体、6-氨基己基甲基丙烯酰胺和交联剂的水溶液加入步骤(1)的反应体系中在60-65℃下进行交联反应2-3h，通过透析膜与纯水透析3天以除去未反应单体，然后与葡萄糖探针在室温下进行酰胺化接枝反应24-26h，得到所述纳米传感器。
第三方面，本发明提供了根据第一方面所述纳米传感器在同时且实时监测细胞内葡萄糖和氧含量的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明选用的纳米传感器上具有葡萄糖探针、氧探针和参比探针，其可同时实现对葡萄糖和氧的监测。该参比探针可以对传感器的局部浓度、生物背景和环境的影响进行校正以实现对葡萄糖和氧的高精度监测；其不响应葡萄糖或氧；
(2)本发明提供的纳米传感器可同时实现葡萄糖和氧气的比率型检测，且不相互干扰；并且本发明提供的纳米传感器分散液在没有沉淀剂的情况下可稳定存在至少半年以上；同时，本发明提供的传感器尺寸相对较小，可达100nm以下，其具有良好的细胞渗透性和低细胞毒性，可用于细胞内传感并且可实时监测细胞内葡萄糖和氧。
附图说明
图1是实施例1提供的纳米传感器的结构示意图。
其中，1-核结构；101-氧探针；102-参比探针；2-壳结构；201-葡萄糖探针。
图2是实施例1提供的纳米传感器的扫描电镜照片。
图3是实施例1提供的纳米传感器的透射电镜照片。
图4是实施例1提供的聚苯乙烯核与纳米传感器的zeta电位图。
图5是实施例1提供的纳米传感器对不同葡萄糖浓度的响应图。
图6是实施例1提供的纳米传感器对不同氧浓度的响应图。
图7是葡萄糖探针与参比探针发光强度的比值随葡萄糖浓度变化的示意图图。
图8是氧探针与参比探针发光强度的比值随氧浓度变化的示意图
图9是实施例1提供的纳米传感器对葡萄糖响应时间测试图。
图10是实施例1提供的纳米传感器对氧响应时间测试图。
图11是pH对实施例1提供的纳米传感器检测葡萄糖的影响图。
图12是pH对实施例1提供的纳米传感器检测氧的影响图。
图13是实施例1提供的纳米传感器对Hela细胞毒性测试结果。
图14A是纳米传感器与HeLa细胞共孵育24h后的共聚焦发光图像，标尺25μm。
图14B是图14A中三通道发光图像合并后的发光图像，标尺25μm。
图14C是图14A中蓝色与黄色发光图像合并后的发光图像，标尺25μm。
图14D是图14A中红色与黄色发光图像合并后的发光图像，标尺25μm。
图15A是在空气(21％O2)无糖培养基中培养24小时后的Hela细胞的共焦发光图像(λex＝405nm)以及叠加图像，标尺50μm。
图15B是0％O2分压无糖培养基中培养24小时后的Hela细胞的共焦发光图像(λex＝405nm)以及叠加图像，标尺50μm。
图15C是在空气(21％O2)有糖培养基中培养24小时后的Hela细胞的共焦发光图像(λex＝405nm)以及叠加图像，标尺50μm。
图15D是在0％O2分压有糖培养基中培养24小时后的Hela细胞的共焦发光图像(λex＝405nm)以及叠加图像，标尺50μm。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种纳米传感器，如图1所示，具有核壳结构且具有葡萄糖探针201、氧探针101和参比探针102。
其中，纳米传感器以聚苯乙烯为核，以聚丙烯酰胺为壳；葡萄糖探针201位于聚丙烯酰胺的壳结构2上，氧探针101和参比探针102位于聚苯乙烯的核结构1上。
其中，葡萄糖探针具有式I结构：
氧探针具有式II结构：
所述参比探针具有式III结构：
制备方法如下：
(1)将1.0g苯乙烯、2.0mg氧探针和0.5mg参比探针在含有十二烷基硫酸钠的双蒸馏水中先搅拌20min，然后在0℃下超声20min，然后在氮气环境下，600rpm的搅拌速率下加入过硫酸铵25mg，在60℃下进行聚合反应2h；
(2)将含有丙烯酰胺400mg、6-氨基己基甲基丙烯酰胺15mg和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺5mg的水溶液加入步骤(1)的反应体系中在60℃下进行交联反应2h，通过透析膜与纯水透析3天以除去未反应单体，然后与葡萄糖探针在室温下进行酰胺化接枝反应24h，最后通过透析工艺得到纳米传感器。
性能测试
对实施例提供的纳米传感器进行性能测试，方法如下：
(1)电镜表征：对纳米传感器进行扫描电镜表征和透射电镜表征；
图2为实施例1提供的纳米传感器的扫描电镜照片，图3为实施例1提供的纳米传感器的透射电镜照片，由图可知，本发明制备得到的纳米传感器绝大部分为球形结构并且分散性良好；并且，由图可知，本发明提供的纳米传感器粒径在100nm以下；且由于颗粒尺寸较小，其具有被细胞内部感应的潜力。
(2)电位表征：对实施例1提供的聚苯乙烯核以及最后得到的纳米传感器表征其Zeta电位；
图4为实施例1提供的聚苯乙烯核与纳米传感器的zeta电位图，由图可知，聚苯乙烯核和纳米传感器的电位分别为-40.6mV和-28.3mV；zeta电位的这种差异可以证明在聚苯乙烯和外侧包覆了一层聚丙烯酰胺壳，得到了纳米传感器。
(3)与葡萄糖及氧的响应浓度：利用发射光谱测量纳米传感器对葡萄糖和氧气的响应性质；
图5为实施例1提供的纳米传感器对不同葡萄糖浓度的响应图，在图中，随着箭头的方向葡萄糖浓度逐渐递增，由图可知，当葡萄糖加入到纳米传感器分散体中时，随着葡萄糖浓度的增加，葡萄糖探针在440nm处的发射强度逐渐增加；同时来自参比探针595nm和来自氧探针658nm的发射没有改变，表明参比探针和氧探针对葡萄糖没有响应。
图6为实施例1提供的纳米传感器对不同氧浓度的响应图，在图中，随着箭头的方向氧浓度逐渐递增，由图可知，随着氧浓度的增加，658nm处的发射强度逐渐降低，而参比探针(595nm)和葡萄糖探针(440nm)的发射强度没有变化。
图5和图6观察表明，采用合适的参比探针，纳米传感器可以同时实现葡萄糖和氧气的比率型检测，且这两种识别通道互不干扰。
图7为葡萄糖探针与参比探针发光强度的比值随葡萄糖浓度变化的示意图图，在图7中，通过比较在440nm和595nm处的发射的比率变化可以得到葡萄糖响应的滴定曲线。由图可知，纳米传感器对葡萄糖的响应范围为0.01-8.0mM，灵敏检测的范围为0.01-5.0mM；而我们所知，一般细胞内的葡萄糖浓度为0.1-5mM，说明本发明提供的纳米传感器可以测量正常范围内的细胞内葡萄糖浓度。
图8为氧探针与参比探针发光强度的比值随氧浓度变化的示意图，由图可知，纳米传感器的发射强度比率I595nm/I658nm与氧浓度呈线性关系，表明纳米传感器对溶解氧浓度的响应范围为0.05-39.3mM。
(4)与葡萄糖及氧的响应时间：通过荧光光谱仪监测当加入葡萄糖时，纳米传感器中的葡萄糖探针发光强度随时间变化的趋势；通过荧光光谱仪监测当通入氧气或氮气时，纳米传感器中的氧探针的发光强度随时间的变化趋势。
图9为实施例1提供的纳米传感器对葡萄糖响应时间测试图，由图可知，纳米传感器对葡萄糖的响应时间在3-4秒之内。
图10为实施例1提供的纳米传感器对氧响应时间测试图，由图可知，氧的检测是动态可逆的，从饱和N2条件到饱和O2条件完成总发光强度变化的95％的响应时间为44s，从饱和O2条件到饱和N2条件完成总发光强度变化的95％的响应时间为25s。
(5)pH对纳米传感器的影响：通过荧光光谱仪监测纳米传感器中的葡萄糖探针在有无葡萄糖存在时不同pH值下的发光强度；通过荧光光谱仪监测纳米传感器中的氧探针在有无氧存在时不同pH值下的发光强度。
图11为pH对实施例1提供的纳米传感器检测葡萄糖的影响图，图12为pH对实施例1提供的纳米传感器检测氧的影响图，由图可知，纳米传感器的没有发生显著的荧光比变化，因此，pH对本发明提供的纳米传感器的影响较小，本发明提供的纳米传感器可以适用于pH值从5-10的变化范围。
(6)纳米传感器对细胞毒性测试：HeLa细胞和J774A.1细胞在添加10％胎牛血清青霉素(100单位/mL)和链霉素(100mg/Ml)的Dlbecco改良DMEM培养基中37℃在5％CO2气氛中培养；细胞培养基每48h更换一次。
在细胞毒性测试中，细胞用不同浓度的纳米传感器孵育6和24h，使用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)试验评价纳米传感器的细胞毒性；
图13为实施例1提供的纳米传感器对Hela细胞毒性测试结果，由图可知，纳米传感器对Hela细胞仅表现出微弱的细胞毒性，在传感器浓度低于0.5mg/mL时，传感器细胞毒性极低。
(7)纳米传感器在单细胞尺度的葡萄糖和氧气的细胞光学成像检测：将细胞接种于培养皿中，密度为10000细胞/皿，在37℃下DMEM培养1天，然后与纳米传感器(0.5mg/mL)共培养；24h后，用无葡萄糖的PBS洗涤细胞三次，以去除细胞表面任何潜在的非特异性吸附的纳米传感器；然后，用共聚焦荧光显微镜进行细胞成像；激发波长为405nm；蓝色发射通道波长在430-480nm之间，黄色发射通道为560-620nm，红色发射通道为640-690nm；使用ImageJ软件获得伪彩色图像。为了证明细胞内氧和葡萄糖生物分析的可行性，我们在此测试中研究了传感器与人宫颈癌HeLa细胞的细胞内化。
图14A为纳米传感器与HeLa细胞共孵育24h后的共聚焦发光图像，由图可知，所有的三色荧光都可以在细胞质中观察到，其中，蓝色代表葡萄糖探针，黄色代表参比探针，红色代表氧探针；结果表明，纳米传感器具有细胞渗透性，定位于细胞质区域。
图14B为图14A中三通道发光图像合并后的发光图像，由图可知，三种颜色在某些亚细胞区域没有完全重叠，这可能是由于细胞内葡萄糖和氧的非均匀分布造成的。
图14C为图14A中蓝色与黄色发光图像合并后的发光图像，图14D为图14A中红色与黄色发光图像合并后的发光图像，由图可知，在比率伪彩色图像中，细胞内的葡萄糖和氧的浓度不是非常均匀，纳米传感器的比值图像可以显示细胞内葡萄糖和氧的精确分布，即表明纳米传感器可以应用于单细胞尺度中对葡萄糖和氧的分析。
(8)纳米传感器对细胞内氧及葡萄糖的实时监测性质：用HeLa细胞研究纳米传感器对细胞内葡萄糖和氧的发光响应，为了评价纳米传感器在细胞内的葡萄糖响应行为，我们采用了两种培养基(无糖DMEM、含糖DMEM)；为了评价细胞对氧的反应，将细胞在两种不同的氧气条件(21％、0％)下在37℃下培养30min，在培养基顶部添加矿物油，以防止氧气在培养基中与空气交换；然后用显微镜对不同环境下的细胞进行即时检测。
图15A是在空气(21％O2)无糖培养基中培养24小时后的Hela细胞的共焦发光图像(λex＝405nm)以及叠加图像，其中，蓝色发射通道波长在430-480nm之间，黄色发射通道为560-620nm，红色发射通道为640-690nm。在图15A中，基本观察不到蓝光和红光发射。图15B是0％O2分压无糖培养基中培养24小时后的Hela细胞的共焦发光图像(λex＝405nm)以及叠加图像，在图中可观察到黄光以及红光发射，基本观察不到蓝光，表明细胞内氧浓度在减小。图15C是在空气(21％O2)有糖培养基中培养24小时后的Hela细胞的共焦发光图像(λex＝405nm)以及叠加图像，其中，可观察到较强的蓝色发射，表明细胞内葡萄糖浓度增加。图15D是在0％O2分压有糖培养基中培养24小时后的Hela细胞的共焦发光图像(λex＝405nm)以及叠加图像，其中，可观察到较强的蓝色、黄光和红光发射。由图15A-15D的对比可知，黄光基本保持不变，说明本发明提供的参比探针适合细胞内分析应用，并且本发明提供的纳米传感器适合细胞内葡萄糖和氧的实时监测。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的纳米传感器及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米传感器，其特征在于，所述纳米传感器为具有核壳结构的纳米传感器；
其中，所述纳米传感器具有葡萄糖探针、氧探针和参比探针。
2.根据权利要求1所述的纳米传感器，其特征在于，所述葡萄糖探针具有式I结构：
优选地，所述氧探针具有式II结构：
优选地，所述参比探针具有式III结构：
3.根据权利要求1或2所述的纳米传感器，其特征在于，所述核壳结构为以疏水性聚合物为核，以亲水性聚合物为壳；
优选地，所述疏水性聚合物的聚合单体为带有双键结构的疏水性单体，进一步优选苯乙烯和/或甲基丙烯酸甲酯，更进一步优选苯乙烯；
优选地，所述亲水性聚合物的聚合单体为带有双键结构的亲水性单体，进一步优选丙烯酰胺；
优选地，所述具有核壳结构的纳米传感器以聚苯乙烯为核，以聚丙烯酰胺为壳。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的纳米传感器，其特征在于，所述葡萄糖探针位于所述纳米传感器的壳结构上；
优选地，所述葡萄糖探针以酰胺化学键合的方式接枝在所述壳结构上；
优选地，所述氧探针和参比探针均位于所述纳米传感器的核结构上；
优选地，所述氧探针和参比探针均以双键加成聚合的形式连接在所述核结构上。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的纳米传感器，其特征在于，以所述纳米传感器的质量为100％计，所述葡萄糖探针的质量百分含量为0.1-0.2％；
以所述纳米传感器的质量为100％计，所述氧探针的质量百分含量为0.2-0.3％；
以所述纳米传感器的质量为100％计，所述参比探针的质量百分含量为0.05-0.08％。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的纳米传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将疏水性单体、氧探针和参比探针混合，然后加入引发剂进行聚合反应；
(2)将亲水性单体的水溶液加入步骤(1)的反应体系中进行交联反应，然后与葡萄糖探针进行酰胺化接枝，得到所述纳米传感器。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述疏水性单体、氧探针和参比探针的质量比为1000:(2-5):(0.5-1)；
优选地，步骤(1)所述混合在含有乳化剂的双蒸馏水中进行；
优选地，在所述双蒸馏水中，所述疏水性单体的浓度为20-25g/L；
优选地，所述乳化剂为十二烷基硫酸钠；
优选地，所述乳化剂的浓度为0.37-0.38g/L；
优选地，步骤(1)所述混合为先搅拌20-30min，然后在0℃下超声20-30min；
优选地，步骤(1)所述聚合反应在氮气环境下进行；
优选地，步骤(1)所述聚合反应在搅拌的条件下进行；
优选地，所述搅拌的速率为600-800rpm；
优选地，步骤(1)所述引发剂为过硫酸铵；
优选地，步骤(1)所述聚合反应的温度为60-65℃，时间为2-3h。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述水溶液中包括亲水性单体、6-氨基己基甲基丙烯酰胺和交联剂；
优选地，所述亲水性单体、6-氨基己基甲基丙烯酰胺和交联剂的质量比为80:(3-5):(1-2)；
优选地，所述交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺；
优选地，所述疏水性单体和亲水性单体的质量比为10:(4-5)；
优选地，步骤(2)所述交联反应的温度为60-65℃，时间为2-3h；
优选地，步骤(2)还包括在交联反应之后除去未反应单体，然后再与葡萄糖探针进行酰胺化接枝；
优选地，所述除去未反应单体的方法为通过透析膜与纯水透析3天；
优选地，步骤(2)所述接枝反应的催化剂为4-二甲氨基吡啶；
优选地，步骤(2)所述接枝反应的温度为室温，时间为24-26h；
优选地，步骤(2)所述葡萄糖探针与6-氨基己基甲基丙烯酰胺的质量比为(2-6):1。
9.根据权利要求6-8中的任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将疏水性单体、氧探针和参比探针在含有乳化剂的双蒸馏水中先搅拌20-30min，然后在0℃下超声20-30min，然后在氮气环境下，600-800rpm的搅拌速率下加入引发剂，在60-65℃下进行聚合反应2-3h；
(2)将包括亲水性单体、6-氨基己基甲基丙烯酰胺和交联剂的水溶液加入步骤(1)的反应体系中在60-65℃下进行交联反应2-3h，通过透析膜与纯水透析3天以除去未反应单体，然后与葡萄糖探针在室温下进行酰胺化接枝反应24-26h，得到所述纳米传感器。
10.根据权利要求1-5中的任一项所述纳米传感器在同时且实时监测细胞内葡萄糖和氧含量的应用。
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