JP6280869B2 - 工業的な医薬用途に適合する拡張可能なレンチウイルスベクター製造システム - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子療法および／またはＤＮＡワクチン接種などの治療への応用、臨床試験における使用、および／または、商業用途のための十分な材料を製造するための、組換えレンチウイルスベクター製造の工業化に関する。

発明の背景
組換えウイルスベクターの、遺伝子療法およびＤＮＡワクチン接種用途のための使用における進歩は、遺伝物質の転送のために臨床グレードのウイルスベクターの大規模な製造の必要性を作りだした。そのようなウイルスベクターのファミリーのひとつは、ウイルスのレトロウイルスファミリー中のレンチウイルス属である。

遺伝子療法用途で使用されるレンチウイルスベクターは、通常、レンチウイルス構成ＤＮＡ系で、培地にウシ胎仔血清を必要とする付着細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションで製造される（Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２２（３）：３４３−５６）。培地における、この動物由来の組成の存在は、方法のＧＭＰコンプライアンスを制限する安全性リスクを構成する。さらに、この製造方法は、規模拡大の面で厳しく制限され、遺伝子療法の治療的、商業的および／または工業的応用に必要な多量のベクター粒子の製造に適合しない。例えば、現在の伝統的な方法は、精製の前に、ｍＬあたり約１×１０^７から３×１０^７の機能的ベクター粒子の力価での２４から４８Ｌの、レンチウイルスベクター懸濁の生成を１回の実行で可能にし、標準精製収率２０％で、最良で、最終産物において３×１０^１１粒子を生成するであろう。これに対し、フェーズＩ臨床試験は少なくとも５×１０^１１の機能的なレンチウイルスベクター粒子を必要とするであろう（ＭｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １２：２０２８−２０２９）。したがって、今日において、患者当たりで多量のベクターが要求されるとき、あるいは多数の患者が治療を必要とするときのいずれか、またはより一般的にコストをリーズナブルなレベルに維持することおよび良好な製造基準（ＧＭＰ）コンプライアンスを維持するため、治療的ベクターの十分な量の必要性に対応する、工業的レンチウイルスベクターの生物学的生産方法が必要とされている。

改良のための１つの可能性への道は、ＦＢＳの使用に関連した安全性リスクだけでなく、従来法の拡張性を欠く主要な原因となる細胞培養容器の必要性をも克服する、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）がない化学的コンディション培地において増殖する浮遊状態（ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）での細胞培養物の使用である。例えば、血清なしで、浮遊培養における一過的な（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）導入によるウイルスベクターの製造が最近、説明された。特に、Ａｎｓｏｒｇｅらは、灌流培養における、浮遊増殖しているＨＥＫ２９３ＳＦ−３Ｆ６細胞の一過的な導入によるレンチウイルス製造のための方法を提案した（Ａｎｓｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ， １１： ８６８−８７６）。しかしながら、提案された方法は、複雑かつ規模が制限される。実に、Ａｎｓｏｒｇｅ他の方法はいくつかの回収段階および複雑な制御措置を必要とする灌流培養で実行される。さらに、その研究で提案された製造は、３リットル容量に制限される。Ｓｅｇｕｒａらも、浮遊培養の一過的な導入によるレンチウイルスベクターの製造のための過程を提案した（Ｓｅｇｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ９８ （４）： ７８９−７９９）。それでもなお、提案された方法は、トランスフェクション後の３、４、および５日での全培地交換および複雑な制御措置があるいくつかの回収段階を必要とするため、複雑である。さらに、ウイルスベクター生産は３リットル容量のみに制限され、ウイルスベクター生産ではない組換えタンパク質生産でのみ６０Ｌ規模まで拡張できることが報告されている。したがって、これらの報告にもかかわらず、商業規模のレンチウイルスベースのワクチンおよび／または遺伝子療法製品に課される質的および量的な課題に対応する浮遊細胞培養からのレンチウイルスベクター生産のための簡単な工業的方法の開発の必要性が残っている。

発明の概要
本発明は医薬グレードの組換えレンチウイルスベクターの工業規模での製造のための方法に関する。以下に示す結果は、発明者が、付着細胞を使用する既存のＧＭＰ製造方法よりも生産性および品質が、同程度、またはより良く、はるかに大きい製造拡張性の可能性がある方法を提供することを可能にした。

したがって、第一の態様において、本発明は：
−無血清培地で浮遊状態で、レンチウイルスベクターの製造に適合した少なくとも１つのプラスミドでトランスフェクトされた哺乳類細胞を培養することであって、培養は少なくとも５Ｌの容量で実施される；
−製造された組換えレンチウイルスベクターを培地から回収すること、
を含む、組換えレンチウイルスベクター、レンチウイルスおよび偽ウイルスの製造方法に関する。

好ましい実施形態において、哺乳類細胞は、無血清条件下の浮遊状態で増殖できるヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔまたは２９３Ｔ細胞とも称される）である。これらの細胞は、発明者らによって、療法、特に遺伝子療法、臨床試験および市場への応用における質および量の両方を満たす、多量の組換えレンチウイルスベクターの製造の工業化のために特に好適であることが見出された。

特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、トランスフェクション後３６時間と７２時間の間、好ましくは４８時間後に回収される。さらなる実施形態において、培養は少なくとも１０Ｌ規模、または好ましくは少なくとも５０Ｌ規模、さらにより好ましくは少なくとも１００Ｌ規模で実行され、特に少なくとも１０^７の感染力があるゲノムＩＧ／ｍＬを回収することを許容するレンチウイルスベクターの工業的製造に適合できる。本発明の方法は、工業的なレンチウイルス生産を可能にし、実験部分で示された１００ｍＬから５０Ｌまでの直線的な規模拡大を示すことを達成するであろうウイルスベクターの非常に高いレベルを達成した真に最初のものである。したがって、非常に高いレベルのウイルスベクターはこの方法（例えば１０００Ｌの規模で）を実行することによって、達成可能になるであろう。他の好ましい実施形態において、回収段階は１回のレンチウイルス回収からなる。発明者らの知見によると、１回の回収で実行される大規模でのレンチウイルスベクター製造の最初の報告である。この実施形態には、できるだけ少ない段階を必要とし、コストの制御を許容する直接的方法を提供する利点を有する。

さらに、本発明はまた、哺乳類細胞のトランスフェクションが一過的な導入であり、回収段階がトランスフェクション後４８および７２時間の間で実行される単一の回収からなる上記の方法に関する。

本発明はさらに、レンチウイルス製造のための細胞培養前のトランスフェクション工程における最適化を開示する。特定の実施形態において、細胞はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびプラスミドの混合物でトランスフェクトされる。具体的な実施形態において、上記方法は細胞がＰＥＩおよびプラスミドのそのような混合物でトランスフェクトされるトランスフェクション段階を含む。特定の変異において、トランスフェクションは少なくとも１．５μｇ／１０^６細胞の全プラスミドＤＮＡ量で実施される。他の特定の変異において、ＰＥＩは２０〜２５ｋＤの直鎖ＰＥＩである。さらなる特定の変異において、本発明で提供される最適化は、混合物のそれぞれの成分の相対的な量に関連する。特に、本発明の特定の変異において、ＰＥＩおよびプラスミドは、Ｎ／Ｐがオリゴヌクレオチドリン酸あたりのＰＥＩの窒素原子の数をいうところの、１０未満のＮ／Ｐ比に従って、ＰＥＩおよびプラスミドがトランスフェクションの前に混合される。好ましい変異において、Ｎ／Ｐ比は約６である。さらなる特定の変異において、細胞培養への追加の前のＰＥＩおよびプラスミドの間の接触時間もまた調査され、５〜３０分間の間、特に約１０分の接触時間、に含まれ得る。

本発明の製造方法は、トランスフェクションの２４時間後に、培地を変えずに、酪酸ナトリウムを加えることによって有利に最適化できる。好ましくは、酪酸ナトリウムは２ｍＭと１０ｍＭの間、または５ｍＭと１２ｍＭの間（例えば約５、８または１２ｍＭ）の最終濃度、より好ましくは最終濃度５ｍＭで培地に添加される。

本発明の方法のさらなる実施形態において、細胞にトランスフェクトされるプラスミドは、問題のレンチウイルスに由来し得るが、他のエンベロープウイルス由来でもあり得る、エンベロープタンパク質をコードするプラスミド（Ｅｎｖプラスミド）、レンチウイルスＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするプラスミド（Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミド）、レンチウイルスＲｅｖタンパク質をコードするプラスミド（Ｒｅｖプラスミド）およびレンチウイルス３’−ＬＴＲおよびレンチウイルス５’−ＬＴＲの間の対象の導入遺伝子（ＴＯＩ）発現カセットを含むプラスミド（ＴＯＩプラスミド）を含む４つのプラスミドを含む。

さらなる態様において、本発明は細胞培養装置（または、バイオリアクター）を提供し、該培養装置は、レンチウイルスベクターの製造に適応された少なくとも１つのプラスミドでトランスフェクトされた、該培養装置で浮遊状態で増殖する哺乳類細胞を含む、少なくとも５Ｌ容量の無血清培地を含む。特定の実施形態において、無血清培地中の細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。

他の態様において、本発明は、培養の培地を変えずに、トランスフェクション後２４時間で培地に酪酸ナトリウムを添加することを含む、製造に必要なプラスミドでトランスフェクトされた、無血清培地で浮遊状態で増殖する哺乳類細胞によるレンチウイルスベクター製造の最適化のための方法に関する。好ましくは、酪酸ナトリウムは最終濃度５ｍＭで添加される。

発明の詳細な説明
本発明は医薬グレードの組換えレンチウイルスベクターの工業規模製造のための方法に関する。製造されたベクターは、それを必要とする動物対象、特に哺乳動物、より具体的にヒトにおける、症状の処置に有用であり得る。

レンチウイルス製造のためのプラスミド
レンチウイルスは、哺乳動物の外来性レトロウイルスであり、レトロウイルス科の１つの属を形成する。レンチウイルスベクター（ＬＶ）はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１または−２、または様々なサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などの多くの霊長類レンチウイルス、またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、またはヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などの非霊長類レンチウイルスに由来する。

組換えレンチウイルスベクターの製造に有用なレンチウイルスの構成要素は当分野で知られている。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：８７１−８７５およびＤｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２（１１）：８４６３−８４７１を参照。「第二世代」のレンチウイルスベクターシステムは、例えばアクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆの１つが欠失または不活性であるような、機能的なアクセサリー遺伝子を欠く包装システム（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）をいう（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ｃｉｔｅｄ ｓｕｐｒａ）。「第三世代」のレンチウイルスベクターシステムは、第二世代ベクターシステムの特性を有し、さらにｔａｔ遺伝子の１つが欠失または不活性であるような、機能的なｔａｔ遺伝子を欠くレンチウイルス包装システムをいう。典型的に、Ｒｅｖをコードする遺伝子は別々の発現構築物場で提供される（例えば、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， ｃｉｔｅｄ ｓｕｐｒａを参照）。また、組換えレンチウイルスベクターの製造に使用できるレンチウイルスベクター系の、より最近の概要に関して、Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ａｎｄ Ｍｅｒｔｅｎ， ２０１０， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０（６）， ４７４−４８６、最も具体的に、ｐａｒｔ ２．２ （”ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ”）を参照。ＳｃｈｗｅｉｚｅｒおよびＭｅｒｔｅｎは、工業化不可の方法を報告する。

レンチウイルスベクターの製造に必要な異なる機能は、あらゆるプラスミドによって、細胞に提供できる。特に、これらの機能は少なくとも１、２、３または４つのプラスミドによって提供され得る。本発明の特定の実施形態において、レンチウイルスベクターの製造に必要な異なる機能は、哺乳類細胞（特に無血清条件下で浮遊状態で増殖する２９３Ｔ細胞）に、レンチウイルスベクター製造に適合した４つのプラスミドでのトランスフェクション、特に一過的な導入で提供され、ここで１つのプラスミドはエンベロープタンパク質をコードし（Ｅｎｖプラスミド）、１つのプラスミドはレンチウイルスＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードし（Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミド）、１つのプラスミドはレンチウイルスＲｅｖタンパク質をコードし（Ｒｅｖプラスミド）および１つのプラスミドはレンチウイルス３’−ＬＴＲおよびレンチウイルス５’−ＬＴＲの間の対象の導入遺伝子（ＴＯＩ）発現カセットを含む（ＴＯＩプラスミド）。

各々の機能（または構成要素）はいかなる好適なレンチウイルス由来とできる。しかしながら、好ましい実施形態において、ｇａｇ−ｐｏｌ、ｒｅｖおよびレンチウイルスゲノム（３’−ＬＴＲおよび５’ＬＴＲ）はＨＩＶウイルス、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２由来である。

さらに、組換えレンチウイルスベクターは、改変されたエンベロープタンパク質、異なるウイルス由来のエンベロープタンパク質またはキメラエンベロープタンパク質を含む、偽型ベクターでもよい。したがって、当業者が他のｅｎｖ遺伝子を採用し得ることを理解するであろうが、例えばＥｎｖプラスミドはＶＳＶ−Ｇ Ｅｎｖタンパク質をコードできる。

もちろん、プラスミドで使用されるＴＯＩは、レンチウイルスベクターの特定の使用用途によるであろう。限定ではなく、例示のためのＴＯＩの例は、治療ＲＮＡ（例えば、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＴＯＩ）をコードするＴＯＩ、疾病対象で損傷または欠失するタンパク質をコードする遺伝子療法ＴＯＩ、およびＤＮＡワクチン接種に使用されるワクチンＴＯＩ、すなわちその発現が、該タンパク質に対して受容生物のワクチンを誘導するであろうタンパク質をコードする、を含む。

哺乳類浮遊細胞
レンチウイルス製造のための哺乳類細胞は当分野で知られている。そのような細胞の代表的な例は、無血清条件下で浮遊状態で増殖する能力のために選択された、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞およびその派生物（例えば、２９３ＳＦ−３Ｆ６株）を含み、それらは理想的に高くトランスフェクト可能である。他の細胞型は、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＫＢ細胞、ＣＫＴ１細胞、ＮＩＨ／ｓＴ３細胞、ベロ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはレンチウイルス生活環を補助するいかなる真核細胞を含むが、これらに限定されるわけではない。

特定の実施形態において、細胞は、当分野でよく知られた２９３Ｔ細胞である。２９３Ｔは多くの供給者から商業的に利用可能である。これらの細胞は、増殖のために牛胎児血清を必要とする、ＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞に由来する細胞株に相当する。特に、ＨＥＫ２９３細胞株は元々、Ａｄ形質転換の多くの特性を示す細胞の選択を通じた、機械的にせん断された５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ５）の断片でトランスフェクトされたヒト胎児腎臓細胞に由来する。ヒトアデノウイルスの形質転換領域は、その産物がＡｄによる哺乳類細胞形質転換に必要且つ十分な、２つの転写ユニットＥ１ａおよびＥ１ｂからなる、初期領域１（Ｅ１）を含む。これらの２９３細胞は、より高いウイルス収率（おそらくアデノウィルス）、およびより良い細胞増殖のために選択された、元々のＦｒａｎｋ Ｇｒａｈａｍ２９３細胞のサブクローンである（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ， １９７７， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ， ３６， ５９−７４）。２９３Ｔ細胞は、ＨＥＫ２９３細胞から、ＳＶ−４０ Ｔ抗原およびネオマイシン耐性遺伝子をコードする遺伝子でのトランスフェクションにより、Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｃａｌｏｓ研究室（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で作製された。

付着性２９３Ｔ細胞は以前からレンチウイルス製造のために使用されている。しかしながら、本発明者らは、レンチウイルスベクターの工業規模での製造のために適合された無血清の浮遊状態での培養条件に適合されたこれらの細胞からレンチウイルスベクターを製造する効率的な方法を最初に提案するものである。実に、本願の実施例では、発明者らは、１００ｍＬから５０Ｌに直線的に規模拡大したレンチウイルスベクターを製造する方法を初めて示す。したがって、非常に高いレベルのウイルスベクター（例えば１０００Ｌのスケールで）は本方法を実行することによって、達成可能となるであろう。

細胞は、使用される特定の細胞に関して選択され、レンチウイルスベクターの製造が可能である、無血清培地で培養される。無血清培地は、治療用途に適したレンチウイルスベクターの製造を許容する。無血清培地のレビューに関して、Ｃｈａｐｔｅｒ ９ （ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ） ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ； Ｅｄ． Ｆｒｅｓｈｅｎ， ＲＩ， ２０００， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｐｓ， ｐｐ． ８９−１０４ ａｎｄ １０５−１２０を参照。一般に、無血清培地は、培養において、以下のいずれか：分泌細胞タンパク質、拡散性栄養素（ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔ）、アミノ酸、有機および／または無機塩、ビタミン、微量金属、糖、および脂質ならびに成長促進因子（例えば、サイトカイン）などの他の化合物、の含有の可能性をもって、それぞれの細胞株の増殖を高めるため操作されるであろう。そのような培地が、本明細書に開示されるように、グルタミンまたはＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）などのグルタミン代替物を補足されることもまた好ましい。そのような培地は商業的に利用可能であり、本発明に関するさらなる知識で、当業者は哺乳類宿主細胞に関して適切なものを選択できるであろう。培地は、懸濁培地のせん断力を調節するために使用される、プルロニック（登録商標）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ．２４０４０−０３２）などの、非イオン界面活性剤、抗凝集剤（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ．００１００５７ＡＥ）およびＬ−グルタミンまたはＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド、例えばＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ３５０５０−０３８）などのＬ−グルタミンの代替を補足され得る。本発明に使用される培地および添加物は、有利にＧＭＰに対応する。例えば、浮遊状態で２９３Ｔ細胞を増殖させるために使用できる代表的な商業的に利用可能な無血清培地は、Ｆ１７培地（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＥｘ−Ｃｅｌｌ２９３（登録商標）（ＳＡＦＣ）を含む。特に、細胞凝集の形成を防ぐ添加物が補足された、カスタマイズされたＦ１７培地（登録商標）で２９３Ｔ細胞を増殖させることができる。特に、本発明の方法は、Ｆ１７培地（登録商標）が、０．０５％から０．１％の間、より具体的に０．０８％のプルロニック（登録商標）Ｆ６８、０．０１％から０．１％の間、より具体的に０．０１％のＧＩＢＣＯ（登録商標）Ａｎｔｉ−Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、および２から６ｍＭの間、より具体的に４ｍＭの最終濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）で補足されると改良されることが本明細書で示されている。本明細書で提供された量で使用されるこれらの添加物は、２９３Ｔ細胞凝集を最適に防止するので、有利である。

有利には、本発明で使用される培地および添加物は無血清であり、動物成分を含まないので、ＧＭＰを遵守し、その結果、動物、特にヒトにおける、治療での使用のためのレンチウイルスベクターの工業的製造を許容する。

特定の実施形態において、細胞は０．８から１．３×１０^６細胞／ｍＬを含む細胞密度で使用できる。

一過性のトランスフェクション
本発明の方法において、哺乳類細胞、特に上記された２９３Ｔ細胞が、レンチウイルスベクター製造に適合された１つ以上のプラスミドでトランスフェクトされる。好ましくは、トランスフェクションは一過性のトランスフェクションである。

当分野で知られている様々な技術は、細胞に核酸分子を挿入するために使用され得る。そのような技術は、リン酸カルシウム、陽イオン性脂質、カチオン性ポリマーなどの化合物を使用する、化学物質促進性トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子衝突、顕微注入などの非化学的手法、および対象の核酸分子を含むウイルスでの感染（時々、「形質導入」と呼ばれる）、を含む。

しかしながら、本発明の好ましい実施形態によると、一過性トランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して実施される。ＰＥＩは、多くの細胞株で、低細胞毒性を示しながら、高い遺伝子転移活性を有し、費用対効果に優れ、したがって、工業規模製造への適用に適合性がある。このポリマーは、広い範囲の分子量および多分散度で、直鎖および分枝異性体の両方で利用可能であり、物理化学パラメータが効率的な遺伝子転移活性に重要である（Ｇｏｄｂｅｙ Ｗ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ， ６０，１４９１６０ （１９９９））。特定の実施形態において、本発明に使用されるＰＥＩは、２０〜２５ｋＤの直鎖ＰＥＩである。例えば、特定の実施形態において、本発明に使用されるＰＥＩは、ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）またはＰＥＩＰｒｏ（登録商標）（ともにＰｏｌｙＰｌｕｓから利用可能）である。ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）およびＰＥＩＰｒｏ（登録商標）トランスフェクション試薬は、直鎖ポリエチレンイミン誘導体であり、動物由来の成分がなく、高効率および再現可能な遺伝子送達を提供する。それらに構造が類似した、細胞のトランスフェクションのための他のＰＥＩまたはカチオン性ポリマーは、米国特許番号６，０１３，２４０および欧州特許番号０７７０１４０に開示される。

プラスミドおよびＰＥＩは、培地に添加する前に混合される。

Ｎ／Ｐ比は複合体のイオンバランスの基準である。ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）またはＰＥＩＰｒｏ（登録商標）の実施の場合、それはオリゴヌクレオチドリン酸塩あたりのＪｅｔＰＥＩ（登録商標）の窒素残基の数について言及する。好ましくは、Ｎ／Ｐ比は１０未満である。特定の実施形態において、この比率は約６である。この比率を最適化すると、限られた毒性に関連する形質転換細胞によって生産されるレンチウイルスベクターの最適収量が得られる。

プラスミドおよびＰＥＩがトランスフェクション段階そのものの前に接触している間の時間もまた、ＰＥＩ分子へプラスミドＤＮＡを複合させるための重要なパラメータである。本発明者らは、プラスミドをＰＥＩに５〜３０分間接触させると、非常に良いトランスフェクション能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を有する混合物がもたらされることを示した。好ましくは、接触時間は、トランスフェクション複合体の構成を最適化するために、約１０分となるであろう。

レンチウイルスを製造するために使用される異なるプラスミド間のモル比も、この生産の規模拡大のために最適化できる。本明細書で提供された結果のおかげで、当業者は、興味のあるレンチウイルスを生産するために使用する特定のプラスミドにこのパラメ−タを適合させることができる。例えば、本発明者らが本明細書で、実施例で示されるレンチウイルスについて、１：１：２：１（Ｅｎｖプラスミド：Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミド：Ｒｅｖプラスミド：ＴＯＩプラスミド）の比率が、より強いトランスフェクションおよび満足できるレンチウイルス生産をもたらすことを示す。もちろん、当業者はこの比率を、生産が求められる特定のレンチウイルスに適合できる。比は、各々の新しい状況（例えばトランスフェクションに用いられる各々特定のプラスミドに関して）のために、本発明の教示（以下の実施例参照）および組換えレンチウイルス製造の分野での周知技術を基に、容易に決定できる。特に、プラスミドのモル比は、これらのプラスミド各々の量を最適化するために考慮されるであろう。本発明の分野では、ウイルスベクターの製造に必要とされる各々のプラスミドの量を決定するために重量比が一般的に使用されるので、重量比よりもむしろモル比を使用するこの概念は明白ではない。

当業者は実施される特定の細胞培養に、トランスフェクション方法を適合させることができる。特に、総ＤＮＡ量（特に組換えレンチウイルス製造に必要な４つのプラスミドを含む）を変化できる。しかしながら、本発明の特定の実施形態において、この量は少なくとも１．５μｇ／１０^６細胞となるであろう。特定の実施形態において、量は、少なくとも２μｇ／１０^６細胞、特に少なくとも２．５μｇ／１０^６細胞である。好ましい実施形態において、総ＤＮＡ量は約２μｇ／１０^６細胞である。

細胞培養
トランスフェクション後、例えばＤＮＡおよびＰＥＩの混合物を細胞培養物に添加した後、細胞培養物は、トランスフェクション後、３６から７２時間の間、特に４８時間後まで増殖させられる。

特定の実施形態において、細胞培養に用いられる培地は、該細胞をトランスフェクトするために用いられるものと同じである。例えば、ＰＥＩおよびプラスミドの混合物でトランスフェクションする場合、混合がＦ１７培地（登録商標）で行われ、細胞はまたトランスフェクション後に該Ｆ１７培地（登録商標）で増殖され得る。

培養は、浮遊状態での細胞培養に適合したバイオリアクターのような多数の培養機器内で実施され得る。バイオリアクターは１回の使用（使い捨て）、または、再利用可能なバイオリアクターであり得る。バイオリアクターは例えば、培養容器またはバッグ、タンク式リアクターから選択され得る。限定的ではない代表的なバイオリアクターは、ガラスバイオリアクター（例えば、Ｂ−ＤＣＵ（登録商標）２Ｌ−１０Ｌ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ウェーブバイオリアクター（例えば、Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＲＭ（登録商標）１０Ｌ−２５Ｌ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）などのロッキング運動撹拌を利用する１回使用のバイオリアクター、１回使用の攪拌タンクバイオリアクター（Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＳＴＲ（登録商標）５０Ｌ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、またはステンレスタンクバイオリアクターを含む。増殖は、制御条件下（例えば、本明細書の実施例で報告された２９３Ｔ細胞の培養のために、ｐＨ＝７．２、ｐＯ２＝５０％、３７℃および系に応じた特定の攪拌）、で行われる。

特定の態様によると、本発明はそれゆえ、レンチウイルスベクター製造のために適合された少なくとも１つのプラスミドを含む、少なくとも５Ｌ容量の無血清培地を含む細胞培養装置（すなわち、バイオリアクター）にも関し、該細胞は、該培養装置で浮遊状態で増殖するように適合されている。好ましい実施形態において、細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。特定の実施形態において、培養装置は、上記で定義されるように、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２００Ｌまたは少なくとも１０００Ｌ容量の無血清培地を含む。他の実施形態において、無血清培地、トランスフェクション条件、培養条件、および細胞は上記の定義のとおりである。

レンチウイルスはその後、１つ以上の回収段階で回収（または収集）され得る。好ましい実施形態において、細胞培養物中に存在するレンチウイルスの１つの回収段階が実施される。これは従来技術を超える本発明の重要な前進であり、利用可能な報告では一般に、多数の培地の変更に伴う培養物の数回の回収を勧めている。ここで、バイオリアクターに播いてから回収まで培地を変更しない、１つの回収を含む好ましい実施形態は、簡単で、費用対効果に優れた、工業上適した方法である。さらなる特定の実施形態において、１つの回収がトランスフェクション後４８時間で実施される。結果、生産されたレンチウイルス粒子は、次いで当業者に周知の方法で回収および精製できる。

上述のとおり、血清が存在する付着細胞系におけるレンチウイルス生産の誘導物質として知られる、２ｍＭから１０ｍＭの酪酸ナトリウムを培地に追加できる。予期しないことに、本明細書で実施された条件（無血清培地および浮遊培養）の観点から、本発明者らは、酪酸ナトリウムがトランスフェクション後２４時間で培地に添加され、特にそれが５ｍＭの濃度で用いられるとき、無血清の浮遊培養における最適化された製造が得られることを示した。

更なる目的：
本発明はまた、
−組換えレンチウイスルベクターの製造に適したプラスミドおよびＰＥＩの混合物での浮遊増殖できる哺乳細胞の一過性トランスフェクション；
−少なくとも５Ｌ容量のバッチ培地中の無血清培地でトランスフェクトされた細胞を培養すること；および
−生産された組換えレンチウイルスベクターを培地から回収すること、
を含む、組換えレンチウイスルベクターの大規模製造のための方法にも関する。

この方法の特定の実施形態において、プラスミドはエンベロープタンパク質をコードするプラスミド（Ｅｎｖプラスミド）、レンチウイルスＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするプラスミド（Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミド）、レンチウイルスＲｅｖタンパク質をコードするプラスミド（Ｒｅｖプラスミド）およびレンチウイルス３’−ＬＴＲおよびレンチウイルス５’−ＬＴＲの間の対象の導入遺伝子（ＴＯＩ）発現カセットを含むプラスミド、を含む。特定の変異において、トランスフェクションは少なくとも１．５μｇ／１０^６細胞の総ＤＮＡ量で実施される。好ましい細胞は、浮遊増殖に適合された２９３Ｔ細胞である。さらに、特定の実施形態において、細胞はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびＤＮＡの混合物でトランスフェクトされ、そこでは、ＰＥＩは２０〜２５ｋＤの直鎖ＰＥＩである。特定の変異において、ＰＥＩおよびプラスミドはトランスフェクションの前に１０未満のＮ／Ｐ比（例えば、約６の比）に従って混合され、ここで、Ｎ／Ｐ比とは、オリゴヌクレオチドリン酸塩当たりのＰＥＩの窒素原子の数のことをいう。培地に添加する前のＰＥＩおよびプラスミド間の接触時間は調整できるが、具体的には５〜３０分間の間、例えば約１０分間であり得る。酪酸ナトリウムは、細胞培養物に、例えば、トランスフェクション後２４時間、培地を変えずに添加され得る。培地における酪酸ナトリウムの最終濃度は２ｍＭから１０ｍＭの間を含む。細胞の回収は、１つの回収として、より具体的にはトランスフェクション後４８時間から７２時間の間の１つの回収として実施され得る。本発明の方法は、少なくとも１０Ｌ以上の規模で行われ得る。この方法は、少なくとも１０^７の感染性ゲノム／ｍＬ、好ましくは少なくとも３×１０^７ＩＧ／ｍＬを回収できるレンチウイルスベクターの高スケールでの生産のための方法に特に関連し得る。

本発明は、さらに以下の非限定的な実施例によって詳述される。

図１は、実施例で示された研究で使用される４つのプラスミドのグラフ表示である。 図２は、１００ｍＬスピナーフラスコ中のＨＥＫ２９３Ｆ細胞での異なるトランスフェクション条件およびフローサイトメトリーによるＧＦＰ陽性細胞の測定の試験を示すグラフである。 図３は、１００ｍＬスピナーフラスコ中のＨＥＫ２９３Ｆ細胞での異なるトランスフェクション条件およびｐ２４ ＥＬＩＳＡ試験によるｐ２４ ＨＩＶカプシド抗原量の測定の試験を示すグラフである。 図４は、１００ｍＬスピナーフラスコ中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞での異なるトランスフェクション条件およびフローサイトメトリーによるＧＦＰ陽性細胞の測定の試験を示すグラフである。 図５は、１００ｍＬスピナーフラスコ中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞での異なるトランスフェクション条件およびｐ２４ ＥＬＩＳＡ試験によるｐ２４ ＨＩＶカプシド抗原量の測定の試験を示すグラフである。 図６は、トランスフェクション複合体の生成のための２つの異なるＳＦＭ培地（Ｆ１７培地（登録商標）およびＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ（登録商標））の生産収率への効果を表すグラフである。 図７は、異なるサイズを有する異なる２つの産物（異なるＴＯＩ）の生産についてのプラスミドの最適モル比（１：１：２：１）でのトランスフェクションを示すグラフである。アッセイは、最適なトランスフェクション条件下での１００ｍＬスピナーフラスコで実施された。 図８は、浮遊状態のｐ２４濃度の測定での、生産性に対する酪酸ナトリウム添加戦略の影響を示すグラフである。 図９は、浮遊状態の感染性ゲノム（ＩＧ）濃度の測定での、生産性に対する酪酸ナトリウム添加戦略の影響を示すグラフである。 図１０は、浮遊状態の物理性粒子／感染性粒子（ＰＰ／ＩＰ）比の測定での、生産性に対する酪酸ナトリウム添加戦略の影響を示すグラフである。 図１１は、培地中で５ｍＭの最終濃度で２４ｈｐｔでの酪酸ナトリウム添加での１００ｍＬのスピナーフラスコのＨＩＶ−ＶＳＶＧ−ＷＡＳｐｔの６つの産物の平均を示すグラフである。 図１２は、ＨＩＶ−ＶＳＶＧ−ＷＡＳＰレンチウイルスベクターの製造のためのセルファクトリー（Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）の１０の積み重ねに関する、無血清培地で浮遊状態で増殖したＨＥＫ２９３Ｔでの１００ｍＬでの浮遊プロトコルおよび標準との比較、４８ｈｐｔで上清のＩＧ結果およびＰＰ／ＩＰ比を示すグラフである。 図１３は、異なる細胞培養機器（スピナー、ウェーブおよび撹拌タンク）における異なる規模（１００ｍＬから５０Ｌ）での本発明の浮遊工程の評価および血清を使用する従来の付着細胞プロセスとの比較を表すグラフである。

本研究の目的は、無血清培地で浮遊状態のバイオリアクターにおける、工業用途での規模に適合するレンチウイルスベクター製造である。有利には、工程は５０Ｌまで開発され、容易に少なくとも１００Ｌ、２００Ｌ、さらには少なくとも１０００Ｌのバイオリアクター規模に容易に適用できる。

組換えレンチウイルス製造のため、我々は４つのプラスミドを使用した（図１の戦略を参照）。

材料および方法
細胞培養：
全てのベクター生産および細胞培養を、足場依存性ＨＥＫ２９３Ｔワーキング・セル・バンク（ＷＣＢ）、最初はウシ胎仔血清の存在下で増殖するが、無血清培地での懸濁増殖に適合させ、新たなワーキング・セル・バンクを確立した、で行った。細胞をプルロニック（登録商標）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ａｎｔｉ−Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）を補足した、改変Ｆ１７培地（登録商標）で培養した。記載されたプロセス開発のために、制御された条件下で異なる培養容器を用いた：
−制御された条件下（３７℃、１２０ｒｐｍ）での１００ｍＬ規模のためのスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｅ、ＵＫ）、
−大規模のための：制御された条件下（ｐＨ＝７．２、ｐＯ２＝５０％、３７℃および系による特定の攪拌）での、ガラスバイオリアクター（Ｂ−ＤＣＵ（登録商標）２Ｌ〜１０Ｌ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ウェーブバイオリアクター（Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＲＭ（登録商標）１０Ｌ〜２５Ｌ、Ｓａｒｔｒｉｕｓ）、１回使用攪拌タンクバイオリアクター（Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＳＴＲ（登録商標）５０Ｌ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）。

ベクターおよびプラスミド：
（Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．； １６（５）：６０５−１９）に記載されるＷ１．６−ｈｕＷＡＳＰ−ＷＰＲＥｍｕｔ６−Ｋベクターを、それぞれＨＩＶ−１ ｇａｇ−ｐｏｌ、ｒｅｖ遺伝子および非関連水疱性口内炎ウイルスＧグリコプロテインをコードする、ＧａｇＰｏｌ、ＶＳＶ−Ｇ、Ｒｅｖプラスミドと組み合わせられたｐＣＣＬ Ｗ１．６−ｈｕＷＡＳＰ−ＷＰＲＥｍｕｔ６−Ｋ伝達プラスミドからなる４つのプラスミドを用いて２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションすることにより作製した。全てのプラスミドがカナマイシン耐性遺伝子を含む。さらなる詳細は、上記で引用されたＭｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．で提供される。

ＨＩＶ−ＶＳＶＧ−ＧＦＰベクターは、ｐＲＲＬＳＩＮｃＰＰＴ−ＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥである導入遺伝子プラスミド以外は同じ試薬を使用して作製された。

酪酸ナトリウム
酪酸ナトリウムは商業的に利用可能である（酪酸ナトリウム≧９８．５％（ＧＣ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。原液を、カスタマイズされたＦ１７培地（登録商標）中で５００ｍＭで調製し、０．２２ろ過した。

培地
Ｆ１７培地（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．０８％のプルロニック（登録商標）Ｆ６８、０．０１％のＧＩＢＣＯ（登録商標）Ａｎｔｉ−Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、および４ｍＭ最終濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）を補足してカスタマイズした。

レンチウイルスベクター生産
浮遊培養容器またはバッグに０．２×１０^６細胞／ｍＬで播種した。トランスフェクションを、播種後７２時間で実施した。細胞密度はトランスフェクション時点で０．８から１．３×１０^６細胞／ｍＬの間であった。

ＷＡＳｐ生産の実施例（最良の形態）
この研究で使用される４つのプラスミドを、図１に示す。異なる量の総ＤＮＡが試験された。異なる濃度が試験されたが、最適の条件において、総ＤＮＡが約２μｇ／１０^６細胞の量で使用された。使用されるトランスフェクション試薬は、Ｎ／Ｐ比が約６のＪｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔ）であった。ＤＮＡおよびＪｅｔＰＥＩ（登録商標）を、約１０分間の穏やかな混合の前に、培地でそれぞれ希釈した。この混合は、直接細胞培養物に添加される、トランスフェクション複合体の形成につながった。トランスフェクションの２４時間後に、酪酸ナトリウムを約５ｍＭの最終濃度で添加した。レンチウイルスベクター粒子を含む馴化培地を、トランスフェクションの７２時間後に分析目的のために回収した。

滴定：
生産された物理的粒子を、特異的ＥＬＩＳＡキットを使用してｐ２４（ＨＩＶカプシドタンパク質）の量を測定することによって、定量した。感染粒子を、レンチウイルスベクター感染に感受性の細胞株の感染後に、以前にＭｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｓｕｐｒａ）に記載されるように、ｑＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）を使用して滴定した。

結果
Ａ−無血清既知組成培地における浮遊培養へのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の順応の説明
−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の源：
細胞は、付着性、１０％ＦＢＳのＤＭＥＭで培養されたＧＭＰマスター（ワーキング）２９３Ｔセルバンク由来である。

−無血清培地での浮遊状態への適合：
細胞をＴ７５組織培養フラスコ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で解凍した。Ｔ１７５組織培養フラスコでの２回の継代培養および増幅の後、我々はＤＭＥＭを改変Ｆ１７培地（登録商標）に置き換えて、付着細胞で完全培地変更を行った。培地変更の４８時間後、全ての細胞は支持体から取り外され、生存力はまだ約９０％であった。細胞をＴ１７５組織培養フラスコ中のＦ１７で継続的に培養した。Ｆ１７での３回の継代培養およびＴ２２５組織培養フラスコでの増幅の後、細胞をスピナーフラスコ（１回使用スピナーフラスコ、Ｃｏｒｎｉｎｇを使用）に５０ｍＬの浮遊状態で播種した。浮遊状態で２９３Ｔ細胞の５４バイアルのセルバンク（５０×１０^６細胞／バイアル）を８回の継代で生成した。

セルバンクの生成
凍結保存のための組成は：８０％Ｆ１７、１０％ＤＭＳＯおよび１０％メチルセルロース１％。

Ｂ−古典的ＨＥＫ２９３Ｆ対ＨＥＫ２９３Ｔにおける緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスベクターの作製
我々の研究の目的の１つは、産業応用のための無血清浮遊培養でのレンチウイスルベクター製造のための方法を確立することであった。

初めに、実験はＨＥＫ２９３Ｆ細胞株、無血清浮遊培養に適合した商業的に利用可能な細胞株、で行われた。

（Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．； １６（５）：６０５−１９）に記載される４−プラスミドトランスフェクション系でＨＩＶ−ＧＦＰレンチウイルスベクターを生成するために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を１００ｍＬスピナーフラスコに１Ｅ＋０６細胞／ｍＬで播種した。異なるトランスフェクション条件を１００ｍＬ規模で試験した：可変パラメータは：１×１０^６細胞当たり使用される総ＤＮＡ量、ならびに１Ｅ＋０６細胞当たりの４プラスミドの間のモル比であった。トランスフェクション試薬（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標））への複合体形成の接触時間（１０分間）およびＤＮＡ／ＰＥＩ比（Ｎ／Ｐ＝６）は、変更できる可能性はあるが、レンチウイルス作製の最適条件で固定した。

ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体は、１０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、既知組成培地で生成した。１０分の接触の後に、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体ミックスを直接培地に添加した。

トランスフェクションの効率を算定するため、細胞培養物を、緑色蛍光タンパク質発現を測定するフローサイトメトリーで分析した。

さらに、細胞培養上清を、レンチウイルス粒子の存在を示すＨＩＶ ｐ２４カプシド抗原の濃度を測定するためにｐ２４ＥＬＩＳＡ試験に供した。

結果を図２および３に示す。

トランスフェクション後４８時間のトランスフェクション効率
結果は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞が、あるＤＮＡ濃度および比（それぞれ、２．５μｇ、１：１：１：１および１：１：１：２）の条件で効率的にトランスフェクトされても、非常にわずか（＜５０ｎｇ／ｍＬ）のｐ２４抗原しか検出できなかった。１５０ｎｇ／ｍＬを超えるｐ２４量は、効率的なレンチウイルス生産を示す一方で、より低い数値は本質的にｐ２４がないことになる。我々は、物理的粒子の量でこの情報：１ｎｇ ｐ２４＝１．２×１０^７ＰＰ、を与えるＥＬＩＳＡキット（Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＩＶ−１Ｐ２４ ＡＮＴＩＧＥＮ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（４８０Ｔｅｓｔ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ｐ２４の量を相関できる。

Ｃ−ＨＥＫ２９３ＴからのＨＩＶ−ＧＦＰの作製
レンチウイスルベクターＨＩＶ−ＧＦＰの作製を、同様の条件で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて実施した。トランスフェクションの効率および細胞培養上清中のｐ２４抗原濃度を、トランスフェクション後４８時間で測定した。

結果を図４および５に示す。

結果は、同様のトランスフェクション効率（２および２．５μｇＤＮＡで〜９０％、比１：１：２：１）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞がＨＥＫ２９３Ｆより、ｐ２４抗原生成、それゆえＨＩＶレンチウイルスベクター粒子生成でより効率的（１９８ｎｇ／ｍＬおよび３１４ｎｇ／ｍＬ）であることを示す。

結論として、これらの実験で、我々はＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で小規模でレンチウイスルベクターを生成させる効率的な条件を決定できた。それらの条件は、工業用途とできる規模での無血清で浮遊状態でレンチウイルスベクターを生産するための実行可能性を評価するためにさらに調査された。

Ｄ−ウシ胎仔血清なしで浮遊状態でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるレンチウイルスベクター製造工程の最適化
Ｄ１−ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体生成のためのＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ（登録商標）培地の除去 工程を簡略化するために、我々は、異なる培地（ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ（登録商標））の使用を避けるために、Ｆ１７培地（登録商標）で直接的にＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を生成させる可能性を調査した。

レンチウイルスベクター生産を、以前の実験で決定されたトランスフェクション条件、すなわち、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、プラスミドモル比１：１：２：１および２．５μｇ総ＤＮＡ／１×１０^６細胞の使用、を用いて、スピナーフラスコ中で１００ｍＬの規模で実施した。細胞および上清を試験のために回収し、結果を図６に示す。

結果は、Ｏｐｔｉｐｒｏ培地対Ｆ１７において複合体化されたＰＥＩ／ＤＮＡから生成した場合、ｐ２４濃度について大きな違いがないことを示す。工程を通じてＦ１７培地のみを使用することは、２つの異なる型の培地を使用するよりも、工程を工業規模に適用させることへの主要な改良となる。

Ｄ２−生産系におけるプラスミド（ＤＮＡ）質量比の代わりにプラスミドモル比を用いることの重要性−モル比を使用することによる工程の順応性：
現在の実験での生産に使用されるレンチウイルスベクター系は４つのプラスミドに関する。これらの内の３つ（Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミド、ＶＳＶ−ＧプラスミドおよびＲｅｖプラスミド）は、それらが、レンチウイルス粒子自身の形成に必要なトランス作用機能、すなわち、構造要素（ベクターカプシド、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ）、酵素タンパク質（逆転写酵素、インテグラーゼ）、および発現の調節因子（Ｒｅｖタンパク質）、をコードするものとして全てのレンチウイルスベクターに共通である。変化する唯一の要素は、ベクターゲノムをコードするプラスミドである。ベクターゲノムプラスミドによってコードされた導入遺伝子の発現カセットが、異なるサイズ（異なるプロモーター、ｃＤＮＡ）に入ることができるので、機能性粒子の生成に必要なプラスミドの最終的な量は異なる発現カセットで、ベクターによって変化できる。

したがって、モル比１：１：２：１（Ｅｎｖプラスミド：Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミド：ＴＯＩプラスミド）が最適の結果を与えるということを考えると、我々はモル比を完全に維持することにより、我々はプラスミドのサイズが変化しても、レンチウイルス製造収率を再現可能に維持できるであろうことを検証したいと考えた。各々のプラスミド分子の数を、それらの塩基対（すなわち、それらの重量）のサイズと完全に独立して維持する、このモル比のおかげで、我々は製品にかかわらず最適のトランスフェクション条件を保証できる。

図７は、我々がＧＦＰタンパク質ｃＤＮＡをコードするレンチウイルスベクター（プラスミドの総サイズ＝７３８８ｂｐ）と、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈタンパク質（ＷＡＳ）ｃＤＮＡをコードするレンチウイルスベクター（プラスミドの総サイズ＝９７８０ｂｐ）とを比較した実施例を示す。

結果は、分子の数（使用する個々のプラスミドの量に逆に影響する）の観点に等しいプラスミドの比を維持することにより、レンチウイルスベクターの収率が無傷で維持されることを示す。これらの結果は、モル比１：１：２：１、総量２．５μｇ／１Ｅ＋０６細胞での無血清で浮遊状態でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるレンチウイルスベクターの生産方法が、サイズにかかわらず異なるベクターに使用できることを示唆する。もちろん、最適であるが、当業者が所望のレンチウイルスベクターの生産に使用される特定の細胞およびプラスミドにパラメータを適合させることができるように、これらの条件は、これらの値から変化し得る。

Ｄ３−生産性の改良：酪酸ナトリウムの使用
酪酸ナトリウムは、付着細胞系でレンチウイルスベクター生産を促進することが報告されている（Ｇａｓｍｉ ｅｔ ａｌ Ｍａｒ． １９９９）。我々は、そのような浮遊培養で酪酸ナトリウムが有用かどうか決定したいと考えた。しかしながら、もしそうであれば、最優先事項は工程が工業用途で利用できることであり、酪酸ナトリウムの使用が工程をより面倒にすることがあってはならない。したがって、我々は、培地変更のないトランスフェクション後の酪酸ナトリウムの添加が以前に確立された条件（ＨＥＫ２９３Ｔ、浮遊培養、無血清、１：１：２：１の比の２．５μｇ／ｍＬプラスミド）で、レンチウイルスベクター収率に肯定的な影響を与えるかどうかを試験することとした。

実験を、１００ｍＬ規模で、スピナーフラスコで実施した。酪酸ナトリウムを、カスタマイズしたＦ１７培地（登録商標）で調製し、最終濃度５ｍＭでトランスフェクション後に添加した。レンチウイスルベクター産生への効果を、ＥＬＩＳＡによるｐ２４抗原の測定、およびｑＰＣＲ（ＴａＱｍａｎ）を使用する感染性粒子の濃度の測定によって、評価した。両方のパラメータの測定が、レンチウイスルベクター調製の品質の指標であるＰＰ／ＩＰ比（感染性粒子に対する粒子の総数）の計算を可能にする。ＰＰ／ＩＰ比が１００〜２５０の間にあるとき、製造の品質は許容できるとみなされる（ＧＥＮＥＴＨＯＮでのＧＭＰ製造で一般に観察された結果）。

まず、我々は１００ｍＬスピナーフラスコ中に添加される酪酸ナトリウムについて２つの異なる戦略を試験した。１つの戦略は、トランスフェクション後６時間で、培地に直接添加するというものであった。他方の戦略は、トランスフェクション後２４時間で完全培地変更を行い、細胞を再懸濁するための新鮮な培地に酪酸ナトリウムを添加するというものであった。最終的に、最良の結果を示した戦略は、酪酸ナトリウムを、培地変更なしでトランスフェクション後２４時間で酪酸ナトリウムを直接添加することであった。

注：培地変更の間、新鮮なＦ１７に再懸濁される前に、細胞は５００ｇで５分間遠心分離される。

我々は、以前の実験を確認するために、３つのスピナーフラスコで平行して実験を行った。結果は図８、９、および１０にある。

結果は、最終濃度５ｍＭ、トランスフェクション後２４時間での酪酸ナトリウムの添加が、感染性粒子に関して３〜４倍の間、ベクター生産性を増加し、ｐ２４の生産量もまた増加することを示す。

図１０は、我々がこの実験で得たＰＰ／ＩＰ比を示す。

このグラフは、酪酸ナトリウムが生産性の向上だけでなく、ＰＰ／ＩＰ比を許容可能な範囲（１００〜２５０）で与えることにより、産物の許容可能な品質を保つことも示す。

この戦略のロバスト性は、６つのスピナーで実施することにより評価された。結果を図１１に示す。

これらの実験は、４８ｈｐｔでのＩＧ濃度およびＩＩ／ＩＰ比に関する生産の品質に従って、より良い回収時間が４８ｈｐｔであることを確認する。

Ｅ−規模拡大
Ｅ１−無血清での浮遊増殖細胞におけるレンチウイルスベクター生産が、血清存在下の付着細胞における従来のレンチウイルスベクター生産系と同様の結果を与えることの実証。

一般的に，調査または臨床目的のレンチウイルスベクターの大規模生産は、血清存在下のＨＥＫ２９３付着細胞のトランスフェクションを用いて実施される。ベクター力価の理由から、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が最も一般的に使用される細胞である。製造プロトコルは、本質的に２つのスタックまたは１０のスタックのセルファクトリーまたは同等の「マルチトレイ」システムに基づく。Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ａｎｄ Ｍｅｒｔｅｎ， ２０１０ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０（６）， ４７４−４８６、特にｐａｒｔ ２．３ （”ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ， Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ”）を参照。

この付着細胞ベースのプロトコルは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を無血清で浮遊状態で増殖させ、モル比１：１：２：１のプラスミドで２．５μｇＤＮＡ／１×１０^６細胞でトランスフェクトし、培地変更なしで２４ｈｐｔで５ｍＭにて酪酸ナトリウムを添加する、上記で定義された最適化された方法と比較された。

図１２は、１００ｍＬでのＨＥＫ２９３Ｔでの浮遊プロトコルおよびＨＩＶ−ＶＳＶＧ−ＷＡＳレンチウイスルベクター生産のための１０スタックのセルファクトリーでの標準の比較を示す。

結果は、本発明の無血清下浮遊状態でのレンチウイルスベクター生産システムが、規模拡大でき、工業用途に適用できることを実証する。

Ｅ２−本発明の無血清下浮遊状態でのレンチウイルスベクター生産システムを規模拡大して、工業用途に適用できることの実証。

上述したレンチウイルス生産の最適化工程（無血清下浮遊状態でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞および２．５μｇ／ｍＬ ＤＮＡ／１ｅ６細胞、プラスミド比１：１：２：１および酪酸ナトリウム）の拡張可能性を、レンチウイルスベクターＨＩＶ−ＶＳＶＧ−ＷＡＳｐの場合に、粒子の収率（ｐ２４ ＥＬＩＳＡ）および感染性粒子（ｑＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ）について様々な容量の培地で評価した。前述したＰＰ／ＩＰ比を、各々の規模で計算し、血清存在下、付着細胞における従来の生産方法で得られた結果と比較して、図１３に示されたヒストグラムにプロットした。

結果は、レンチウイルスベクター生産の新しいシステムのベクター生産性（感染性ゲノムの数、ＩＧ）および品質（ＰＰ／ＩＰ）が、幅広い培地容量で維持され、血清含有培地で増殖した付着細胞で実施される従来の製造方法で得られるものと比較して好ましい（全ての規模で同様の品質および生産性であり、セルファクトリーでの工程と競合する）ことを示す。

これらの結果は、浮遊状態でのレンチウイルスベクター生産の新しい工程が効率性と実用性を結合するものであり、したがって、レンチウイルスベクターの工業規模適用に使用できることを示す。

Claims (20)

1. −無血清培地で浮遊状態で、レンチウイルスベクターの製造に適合した少なくとも１つのプラスミドでトランスフェクトされた、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である哺乳類細胞を培養することであって、培養は少なくとも５０Ｌの容量で実施される；
   −製造された組換えレンチウイルスベクターを培地から回収すること、
   を含む、組換えレンチウイルスベクターの製造方法。
2. 回収段階が、１回のレンチウイルス回収からなる、請求項１に記載の方法。
3. トランスフェクションが一過的なトランスフェクションであり、１回の回収段階がトランスフェクション後４８から７２時間の間で実行される、請求項２に記載の方法。
4. 細胞がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびプラスミドでトランスフェクトされる、トランスフェクション段階を含む、請求項１または２に記載の方法。
5. ＰＥＩが、２０〜２５ｋＤの直鎖ＰＥＩである、請求項４に記載の方法。
6. トランスフェクションが、少なくとも１．５μｇ／１０^６細胞の総ＤＮＡ量で実施される、請求項４または５に記載の方法。
7. １０未満のＮ／Ｐ比に従って、ＰＥＩおよびプラスミドがトランスフェクションの前に混合される請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法であって、Ｎ／Ｐがプラスミド中のリン酸基の数あたりのＰＥＩの窒素原子の数を示す、方法。
8. Ｎ／Ｐ比が６である、請求項７に記載の方法。
9. 細胞培養への添加の前のＰＥＩおよびプラスミドの間の接触時間が、５〜３０分間の間である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 細胞培養への添加の前のＰＥＩおよびプラスミドの間の接触時間が１０分である、請求項９に記載の方法。
11. 培地を変えずに、トランスフェクション後２４時間で培地に酪酸ナトリウムを添加する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 酪酸ナトリウムが２ｍＭから１２ｍＭの間の最終濃度で培地に添加される、請求項１１に記載の方法。
13. 酪酸ナトリウムが２ｍＭから１０ｍＭの間の最終濃度で培地に添加される、請求項１２に記載の方法。
14. 酪酸ナトリウムが最終濃度５ｍＭで培地に添加される、請求項１２または１３に記載の方法。
15. エンベロープタンパク質をコードするプラスミド（Ｅｎｖプラスミド）、レンチウイルスＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするプラスミド（Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミド）、レンチウイルスＲｅｖタンパク質をコードするプラスミド（Ｒｅｖプラスミド）およびレンチウイルス３’−ＬＴＲおよびレンチウイルス５’−ＬＴＲの間の対象の導入遺伝子（ＴＯＩ）発現カセットを含むプラスミド、を含む４つのプラスミドで細胞がトランスフェクトされる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 少なくとも１０^７の感染性ゲノム／ｍＬが製造される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. −細胞が２９３Ｔ細胞であり；
    −細胞のトランスフェクションがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびＤＮＡの混合物で実施され；
    −酪酸ナトリウムが、トランスフェクション後２４時間で、培地を変えずに添加され；および
    −生産されたレンチウイルスベクターの１回の回収が行われる、
    請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. レンチウイルスベクターの製造に適応された少なくとも１つのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む、少なくとも５０Ｌ容量の無血清培地を含む、細胞培養装置であって、該細胞は該培養装置で浮遊状態で増殖する、細胞培養装置。
19. 培養の培地を変えずに、トランスフェクション後２４時間で培地に酪酸ナトリウムを添加することを含む、製造に必要なプラスミドでトランスフェクトされた、無血清培地で浮遊状態で増殖するＨＥＫ２９３Ｔ細胞によるレンチウイルスベクター製造の最適化のための方法。
20. 酪酸ナトリウムが最終濃度５ｍＭで添加される、請求項１９に記載の方法。

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