BR112019019673A2 - método e agente para alterar um sítio alvejado de um dna em uma célula, complexo, e, ácido nucléico - Google Patents
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Abstract
a presente invenção provê um método para alterar um sítio alvejado de um dna possuído por uma célula, em que o método inclui uma etapa para estimular a célula por um fator que induz uma enzima modificadora de dna endógeno para a célula, e colocar o dna em contato com um complexo no qual um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucléico que especificamente se liga com uma sequência de nucleotídeo alvo no selecionado dna e um módulo que liga enzima modificadora de dna são ligados, assim convertendo um ou mais nucleotídeos no sítio alvejado para outro um ou mais nucleotídeos, deletando o um ou mais nucleotídeos, ou inserir o um ou mais nucleotídeos dentro do sítio alvejado.
Description
MÉTODO E AGENTE PARA ALTERAR UM SÍTIO ALVEJADO DE UM DNA EM UMA CÉLULA, COMPLEXO, E, ÁCIDO NUCLÉICO [Campo Técnico] [001] A presente invenção diz respeito a um método para alterar uma sequência de ácidos nucléicos, que permite a alteração de uma base de ácido nucléico, em uma região particular do DNA intracelular alvo, sem introduzir uma enzima modificadora de DNA exógeno ou um ácido nucléico codificando a mesma dentro da célula, e um complexo de um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA a ser usada para o mesmo.
[Fundamentos da Técnica] [002] Nos anos recentes, a edição genômica está atraindo a atenção como uma técnica para alterar o gene objeto e a região genômica em várias espécies. Convencionalmente, como um método de edição genômica, um método utilizando uma nuclease artificial compreendendo uma molécula tendo uma capacidade de divagem do DNA independente da sequência e uma molécula tendo uma capacidade de reconhecimento da sequência na combinação foi proposto (documento não patentário 1).
[003] Por exemplo, um método para realizar a recombinação em um sítio de gene alvo no DNA em uma célula vegetal ou célula de inseto como um hospedeiro, usando-se uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) em que um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco e um domínio de divagem de DNA não específico são ligados (Documento Patentário 1), um método de clivar ou modificar um gene alvo, em uma nucleotídeo sequência particular ou um sítio adjacente à mesma usando-se TALEN em que um efetor de transcrição semelhante ao ativador (TAL) que é um módulo de ligação ao DNA que a bactéria patogênica vegetal Xanthomonas têm, e um DNA endonuclease são ligados (Documento Patentário 2), um método utilizando um sistema de CRISPR-Cas9, em que a sequência de CRISPR (Repetições
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Palindrômicas Curtas Interespaçadas Regularmente Agrupadas) que funciona em um sistema imunológico adquirido possuído por eubacterium e archaebacterium, e família da proteína de Cas nuclease (associada à CRISPR) tendo uma função importante junto com CRISPR são combinadas (Documento Patentário 3) e semelhantes foram registrados. Recentemente, a Cpfl foi registrada como uma nova endonuclease para um sistema de CRISPR-Cas (documento não patentário 2). Além disso, um método de clivar um gene alvo nas adjacências de uma sequência particular, usando-se a nuclease artificial em que uma proteína de PPR constituída para reconhecer uma sequência de nucleotídeos particular através de uma continuação dos motivos de PPR, cada uma consistindo em 35 aminoácidos e que reconhece uma base de ácido nucléico, e nuclease são ligados (Documento Patentário 4) também foi registrado.
[004] Além disso, os presentes inventores recentemente registraram que uma sequência genômica foi alterada com sucesso, sem DSB, através da conversão da base de ácido nucléico em uma região contendo uma sequência de DNA particular em várias espécies biológicas incluindo levedura e Escherichia coli, usando-se a desaminase que catalisa uma reação de desaminação e introduzindo-se um complexo da desaminase ligada a uma molécula tendo uma capacidade de reconhecimento da sequência de DNA dentro da célula hospedeira (Documento Patentário 5, documento não patentário 3).
[Lista de Documentos] [Documento Patentários]
Documento Patentário 1: JP-B-4968498
Documento Patentário 2: Publicação Nacional do Pedido de Patente Internacional No. 2013-513389
Documento Patentário 3: Publicação Nacional do Pedido de Patente Internacional No. 2010-519929
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Documento Patentário 4: JP-A-2013-128413
Documento Patentário 5: WO 2015/133554 [Documento não patentário]
Documento não patentário 1: Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641
Documento não patentário 2: Bemd Zetsche et al. (2015) Cpfl Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Cell 163: 759-771
Documento não patentário 3: Nishida Keiji et al. (2016) Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems, Science 6: 353(6305) [SUMÁRIO DA INVENÇÃO] [Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção] [005] Embora as técnicas de edição genômica acima mencionadas propostas até agora pressuponham a introdução de uma enzima modificadora de DNA exógeno dentro da célula, estas são associadas com problemas de efeitos colaterais tais como citotoxicidade e semelhantes e a liberação da enzima modificadora de DNA dentro da célula ou sítio de DNA alvo, que são causados pelo uso da enzima modificadora de DNA. Portanto, é um objetivo da presente invenção prover um método de editar novos DNA, particularmente, a edição genômica, capaz de aumentar a segurança utilizando uma enzima modificadora de DNA endógeno celular e evitar a restrição da liberação, e um complexo para o mesmo de um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA.
[Meios para Resolver os Problemas] [006] Os presentes inventores produziram um complexo em que um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos alvejando a sequência
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4/59 de DNA objetivo é concedido com uma função para ligar a uma enzima modificadora de DNA endógeno celular, introduziram o complexo dentro da célula, e cultivaram dentro da célula na presença de um fator que induz a enzima modificadora de DNA. Como resultado, eles introduziram com sucesso uma mutação na sequência de nucleotídeos alvo do gene objetivo e nas adjacências do mesmo sem usar uma enzima modificadora de DNA exógeno.
[007] Os presentes inventores conduziram outros estudos com base nestas descobertas e completaram a presente invenção.
[008] Portanto, a presente invenção é como descrita abaixo.
[009] [1] Um método para alterar um sítio alvejado de um DNA em uma célula, compreendendo uma etapa de estimular a célula com um fator induzindo uma enzima modificadora de DNA endógeno para a célula, e trazendo um complexo de um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos a ligar-se especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo em um dado DNA e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA ligada entre si em contato com o DNA para converter um ou mais nucleotídeos no sítio alvejado a outro um ou mais nucleotídeos ou exclui um ou mais nucleotídeos, ou insere um ou mais nucleotídeos no dito sítio alvejado.
[0010] [2] O método de [1], em que o sítio alvejado acima mencionado é alterado sem clivar pelo menos um dos filamentos do DNA acima mencionado.
[0011] [3] O método de [1] ou [2], em que o módulo acima mencionado que reconhece a sequência de ácidos nucléicos é selecionado a partir do grupo consistindo em um sistema de CRISPR-Cas em que pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA da Cas é inativada, um motivo de dedo de zinco, um efetor TAL e um motivo de PPR.
[0012] [4] O método de qualquer um de [1] a [3], em que o módulo acima mencionado que reconhece a sequência de ácidos nucléicos é um
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5/59 sistema de CRISPR-Cas em que pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA da Cas é inativada.
[0013] [5] O método de qualquer um de [1] a [4], em que o módulo acima mencionado que liga a enzima modificadora de DNA é selecionado a partir do grupo consistindo em um anticorpo contra a enzima modificadora de DNA, um aptâmero peptídico contra a enzima modificadora de DNA e um aptâmero de ácido nucléico contra a enzima modificadora de DNA.
[0014] [6] O método de qualquer um de [1] a [4], em que o módulo acima mencionado que liga a enzima modificadora de DNA é pelo menos um tipo selecionado a partir do grupo consistindo em Vif, proteína Bet, ΤοροΙΙβ, IQGAP2 e ZNF335 e fragmentos dos mesmos.
[0015] [7] O método de qualquer um de [1] a [6], em que uma enzima alvo do módulo acima mencionado que liga a enzima modificadora de DNA é desaminase.
[0016] [8] O método de [7], em que a desaminase acima mencionada é uma proteína que pertence à família APOBEC.
[0017] [9] O método de [7] ou [8], em que o complexo do módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos ligada ao módulo que liga a enzima modificadora de DNA também compreende um inibidor de reparo de excisão de base ligado ao mesmo.
[0018] [10] O método de qualquer um de [1] a [9], em que o fator acima mencionado que induz a enzima modificadora de DNA inclui um ou mais selecionados a partir do grupo consistindo em interferon, um inibidor de ácido succínico desidrogenase e condição hipóxica.
[0019] [11] O método de qualquer um de [1] a [10], em que o DNA acima mencionado e o complexo acima mencionado são comunicados introduzindo-se um ácido nucléico que codifica o complexo dentro da célula acima mencionada e cultiva a célula para causar a expressão do complexo na célula.
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6/59 [0020] [12] O método de qualquer um de [1] a [11], em que a célula é estimulada pelo fator induzindo a enzima modificadora de DNA incubando-se a célula na presença do fator.
[0021] [13] O método de qualquer um de [1] a [12], em que a célula acima mencionada é uma célula de vertebrado.
[0022] [14] O método de [13], em que a célula de vertebrado acima mencionada é uma célula mamífera.
[0023] [15] O método de qualquer um de [1] a [14], em que o DNA acima mencionado é um DNA de filamento duplo.
[0024] [16] Um complexo de um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos a ligar-se especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo em um DNA e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA ligada entre si, em que o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos é um sistema de CRISPR-Cas em que pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA de Cas é inativada, em que o complexo converte um ou mais nucleotídeos no sítio alvejado a outro um ou mais nucleotídeos ou exclui um ou mais nucleotídeos, ou insere um ou mais nucleotídeos no dito sítio alvejado.
[0025] [17] Um ácido nucléico que codifica o complexo de [16].
[0026] [18] Um agente para alterar um sítio alvejado de um DNA compreendendo o complexo de [16] ou o ácido nucléico de [17].
[0027] [19] Um método para alterar um sítio alvejado de um DNA de filamento duplo em uma célula, compreendendo uma etapa de estimular a célula com um fator induzindo uma enzima modificadora de DNA endógeno para a célula, e trazendo um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos a ligar-se especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo em um dado DNA de filamento duplo em contato com o DNA de filamento duplo para converter um ou mais nucleotídeos no sítio alvejado a um outro um ou mais nucleotídeos ou exclui um ou mais nucleotídeos, ou insere um ou mais
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7/59 nucleotídeos no dito sítio alvejado.
[Efeito da Invenção] [0028] De acordo com a edição de DNA da presente invenção, o risco de efeitos colaterais é reduzido visto que um fator exógeno não é usado na reação de modificação de DNA. Além disso, a eficiência da liberação pode ser melhorada visto que o construto usado para a edição do DNA pode ser miniaturizado. Utilizando uma enzima modificadora de DNA endógeno celular, além disso, a atividade pode ser controlada através de uma ação transitória e o risco da ação fora do alvo pode ser reduzida.
[Breve Descrição das Figuras] [0029] A Fig. 1 é uma exibição esquemática do mecanismo do método de alteração do sítio alvejado do DNA usado nos Exemplos da presente invenção. Na Fig. 1, IFN é interferon (que induz o fator, como fator de antivírus, expressão do gene de defesa particular), a desaminase endógena indutível por IFN é um grupo de desaminase antiviral (Apobec etc.) mostrando a expressão induzida por IFN, e dVif (variante de Vif) é uma proteína adaptadora ligada à desaminase endógena.
[0030] A Fig. 2 é uma exibição esquemática do plasmídeo para a edição do DNA usado nos Exemplos.
[0031] A Fig. 3 é uma exibição esquemática do plasmídeo para a edição do DNA usado nos Exemplos.
[Descrição das Modalidades] [0032] A presente invenção provê um método para alterar um sítio alvejado no DNA em uma célula utilizando-se uma enzima modificadora de DNA endógeno para a célula (a ser também referida como “endógena celular” no presente relatório descritivo) para converter a sequência de nucleotídeos alvo e nucleotídeos na adjacência dos mesmos no DNA na célula a outros nucleotídeos (em seguida a ser também referidos como “o método da presente invenção”). Como aqui usado, “endógena para célula”, “endógeno celular”
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8/59 significa a presença nativa na célula.
[0033] O método da presente invenção é distinguido por uma etapa em que a célula é estimulada com um fator induzindo uma enzima modificadora de DNA endógeno celular (em seguida também a ser referida como “indutora da enzima modificadora de DNA”) e um complexo em que um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos que especificamente liga à sequência de nucleotídeos alvo no DNA e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA são ligados entre si (em seguida também referido como “o complexo da presente invenção”) é comunicado com o DNA na célula para converter o sítio alvejado, isto é, a sequência de nucleotídeos alvo e nucleotídeos na adjacência dos mesmos, aos outros nucleotídeos.
[0034] Na presente invenção, a “alteração” de um DNA significa que um nucleotídeo (por exemplo, dC) em um filamento de DNA é convertido a um outro nucleotídeo (por exemplo, dT, dA, dG ou dU), ou excluído, ou um nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeos é inserida entre alguns nucleotídeos em um filamento de DNA. O DNA a ser alterado não é particularmente limitado conforme este é um DNA que a célula possui (ou presente na célula). Este pode ser um DNA endógeno celular (por exemplo, DNA do cromossomo, DNA da mitocôndria, DNA do cloroplasto; em seguida, estes devem ser compreensivamente referidos como “DNA genômico”) ou um DNA exógeno (por exemplo, DNA derivado de uma célula infectada com um vírus). O DNA acima mencionado pode ser um DNA de filamento simples ou um DNA de filamento duplo, preferivelmente um DNA de filamento duplo. Como o DNA de filamento duplo, é preferido o DNA genômico. O “sítio alvejado” de um DNA significa a “sequência de nucleotídeos alvo” completa ou parcial, em que um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos especificamente reconhece e liga à, ou às adjacências da sequência de nucleotídeos alvo (um ou ambos de 5’ à montante
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9/59 e 3’ à jusante). A “sequência de nucleotídeos alvo” significa uma sequência à qual um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos no DNA liga. [0035] Na presente invenção, a “enzima modificadora de DNA” significa uma enzima endógena celular capaz de modificar DNA, e a modificação causa direta ou indiretamente a alteração do DNA. Os exemplos de tal reação de modificação de DNA incluem uma reação para clivar o filamento único ou filamento duplo do DNA (aqui a ser também referido como “reação de clivagem do filamento do DNA”), uma reação para converter um substituinte no anel de purina ou pirimidina de uma base de ácido nucléico a um outro grupo ou átomo, o qual é uma reação que não envolve diretamente o filamento de DNA (em seguida a ser também referido como “reação de conversão da base de ácido nucléico”) (por exemplo, reação de desaminação da base), uma reação para hidrolisar a ligação de Nglicosídeo do DNA (em seguida também a ser referido como “reação de excisão de base”) e semelhantes.
[0036] Na presente invenção, a “enzima modificadora de DNA” significa uma molécula que pode aumentar direta ou indiretamente a expressão da enzima modificadora de DNA endógeno celular e/ou um fator que pode ativar a enzima modificadora de DNA (incluindo molécula, estímulo físico-químico tal como concentração de oxigênio, luz, UV, temperatura, ácido, álcali e semelhantes, e semelhantes). O indutor da enzima modificadora de DNA a ser usado no método da presente invenção não é particularmente limitado contanto que este tenha tal função. Os exemplos dos mesmos incluem proteína (incluindo peptídeo, em seguida, o mesmo) (por exemplo, fator de transcrição, interferon (IFN), interleucina, mitógeno etc.), composto de baixo peso molecular e semelhantes. O indutor da enzima modificadora de DNA usado por ser comercialmente disponível ou ser produzido através de um método bem conhecido.
[0037] O interferon (IFN) é uma proteína secretada pelas células em
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10/59 resposta à invasão de substâncias estranhas tais como patógenos (particularmente, vírus), células tumorais e semelhantes, e o estímulo das células com IFN induz a expressão das proteínas antivirais (por exemplo, as proteínas que pertencem à família APOBEC (semelhante ao polipeptídeo catalítico de enzima que edita mRNA da apolipoproteína B) e semelhantes). O interferon a ser usado na presente invenção não é particularmente limitado e o interferon TIPO I (por exemplo, IFN-a, IFN-β, IFN-ω, IFN-ε, IFN-k), interferon Tipo II (por exemplo, IFN-γ), interferon TIPO III (por exemplo, IFN-λ) e semelhantes podem ser mencionados. Particularmente, o interferon TIPO I é preferível, e IFN-α e IFN-β são preferíveis. O interferon pode ser um gene tipo natural ou um gene tipo recombinante, ou um interferon peguilado em que uma forma macromolecular tal como polietileno glicol (PEG) ou semelhantes é ligado. Quando o interferon é usado, a célula hospedeira e o organismo a partir do qual o interferon é derivado são preferivelmente os mesmos (por exemplo, quando a célula humana é usada, o interferon humano é preferivelmente usado). Um fator de indução à produção de IFN também pode ser usado. Os exemplos de tal fator incluem, (quase)infecção com vírus e semelhantes, vacina, DNA ou RNA exógenos, análogo de RNA de filamento duplo [poli(I:C)J (por exemplo, Trapp Sl, et al., (2009) J. Virol, 83(2):884-895), estimulador do gene de interferon, ligante TANK cinase 1 e semelhantes.
[0038] Os exemplos da interleucina a serem usados na presente invenção incluem IL-2, IL-7, IL-15, IL-27 e semelhantes conhecidos ser capazes de induzir as proteínas que pertencem à família APOBEC (em seguida a ser abreviada como “APOBEC”) (particularmente, as proteínas que pertencem à família APOBEC3 (em seguida abreviada como “APOBEC3”)), a saber, para aumentar a expressão e/ou atividade das proteínas.
[0039] Os exemplos do mitógeno a serem usados na presente invenção incluem éster de forbol (por exemplo, miristato acetato de forbol
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11/59 (PMA), fitohemaglutinina (PHA) etc.) conhecido ser capaz de induzir a APOBEC (particularmente, APOBEC3) (por exemplo, Stopak S. Kim, et al., (2007) J. Biol Chem., 282(6): 3539-3546; Rose KM1, et al., (2004) J. Biol Chem., 279(40):41744-41749) e semelhantes.
[0040] Os exemplos do composto de baixo peso molecular a serem usados na presente invenção incluem os compostos descritos na JP-A-2011231053, inibidores do ácido succínico desidrogenase descritos na WO 2016164889 (por exemplo, Atpenina A5, malonato, diazóxido (DZX), malato e oxaloacetato, ácido 3-nitropropiônico, nitroxila, carboxina, TTFA etc.) e semelhantes conhecidos por serem capazes de induzir APOBEC (particularmente, APOBEC3).
[0041] A enzima modificadora do indutor de DNA não é limitada a estes e aqueles de habilidade comum na técnica podem usar apropriadamente as proteínas e compostos conhecidos, estímulos físico-químicos e semelhantes de acordo com o tipo de enzima modificadora alvo do DNA. Apenas um tipo da enzima modificadora do indutor de DNA pode ser usado ou dois ou mais tipos dos mesmos podem ser usados (por exemplo, uso combinado do interferon e inibidor do ácido succínico desidrogenase, uso combinado de interferon e condição hipóxica e semelhantes).
[0042] O método para estimular uma célula com uma enzima modificadora de indutor de DNA não é particularmente limitado. Por exemplo, um método incluindo incubar a célula na presença de uma enzima modificadora do indutor de DNA pode ser mencionado. Especificamente, isto pode ser realizado adicionando-se uma enzima modificadora do indutor de DNA a um meio ou tampão para incubar as células ou, quando o fator é um estímulo físico-químico tal como hipóxia ou semelhantes, incubando-se as células sob uma condição com a presença do estímulo. Além disso, um método incluindo a introdução de um ácido nucléico codificando uma enzima modificadora do indutor de DNA (preferivelmente DNA) dentro da célula e a
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12/59 expressão do fator na célula pode ser mencionado.
[0043] Além disso, o tempo para iniciar o estímulo da célula com uma enzima modificadora do indutor de DNA não é particularmente limitado. Por exemplo, quando o DNA intracelular alvo e o complexo da presente invenção são comunicados introduzindo-se um ácido nucléico que codifica o complexo dentro da célula, este pode ser antes, depois ou simultaneamente com a etapa de introdução. No método da presente invenção, o período da reação de modificação de DNA pode ser ajustado ajustando-se o período do estímulo das células com uma enzima modificadora do indutor de DNA. Portanto, a edição da sequência alvo pode ser realizada eficazmente enquanto evitando o risco da ação fora do alvo no genoma hospedeiro estimulando-se as células com a enzima modificadora do indutor de DNA para o período de tempo necessário para que a reação de modificação do DNA ocorra e a alteração do sítio alvejado seja fixada. A partir do aspecto de fácil ajuste do período para o estímulo da célula, um método para incubar as células na presença de uma enzima modificadora do indutor de DNA (por exemplo, quando a enzima modificadora do indutor de DNA é uma proteína, um composto de baixo peso molecular ou semelhantes, um método para adicionar o fator a um meio ou tampão) é preferível. O período para a adição ao meio ou tampão varia dependendo do tipo da célula hospedeira, condições de incubação, o tipo da enzima modificadora de DNA a ser alvejado, e semelhantes. Quando o DNA a ser modificado é endógeno para a célula, cerca de 2 a 3 dias são considerados ser necessários, visto que pelo menos várias gerações de divisão celular são geralmente necessárias. Por outro lado, quando o DNA a ser modificado é DNA exógeno, o período pode ser encurtado se comparado com o DNA intracelular, visto que a divisão celular não é geralmente necessária. Aqueles de habilidade comum na técnica podem determinar apropriadamente um período de indução da expressão preferível com base nas condições de cultura e semelhantes a serem usados.
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13/59 [0044] O teor da enzima modificadora do indutor de DNA a ser adicionado ao meio não é particularmente limitado contanto que o DNA alvo seja alterado. Quando o interferon é usado como uma enzima modificadora do indutor de DNA, este é adicionado ao meio em preferivelmente 10 a 100000 IU (unidade internacional), mais preferivelmente de 100 a 20000 IU, ainda mais preferivelmente de 500 a 5000 IU. Quando a Aptenina A5 é usada como uma enzima modificadora do indutor de DNA, esta é adicionada ao meio em preferivelmente 0,5 μΜ a 10 μΜ, mais preferivelmente 1 μΜ a 3 μΜ. Aqueles de habilidade comum na técnica podem determinar apropriadamente um teor preferível, titulador, e semelhantes com base na enzima modificadora do indutor de DNA a ser usada, tipo de célula, condições de cultura e semelhantes.
[0045] Quando uma enzima modificadora do indutor de DNA é um estímulo físico-químico, uma modalidade preferível é uma condição hipóxica. Por exemplo, tem sido registrado que as proteínas que pertencem à família APOBEC podem ser ativadas quando expostas às condições hipóxicas (por exemplo, WO 2016-164889). Os exemplos do método para expor as células às condições hipóxicas incluem um método para incubar as células em uma atmosfera de estado hipóxico e semelhantes. Aqui, o “estado hipóxico” significa que a concentração de oxigênio é menor do que a concentração de oxigênio na atmosfera. Os exemplos de tal concentração de oxigênio incluem não mais do que 15%, preferivelmente não mais do que 10%, mais preferivelmente não mais do que 5%, mais preferivelmente não mais do que 1%, e preferivelmente não menos do que 0,1%.
[0046] Altemativamente, quando um ácido nucléico (preferivelmente DNA) que codifica uma enzima modificadora do indutor de DNA é introduzido em uma célula e o fator é expressado na célula, este pode ser introduzido em uma célula da mesma maneira como um ácido nucléico que codifica o módulo mencionado abaixo que reconhece a sequência de ácidos
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14/59 nucléicos e/ou o módulo que liga a enzima modificadora de DNA. Quando um DNA que codifica uma enzima modificadora do indutor de DNA é usado, o DNA é colocado sob o controle de uma região reguladora indutível, as substâncias capazes de ativar a região reguladora são adicionadas ao e/ou removidas do meio ou tampão em que as células são incubadas para ajustar o período de expressão da enzima modificadora do indutor de DNA na célula, por meio da qual o período durante o qual a reação de modificação de DNA ocorre pode ser ajustado. Como a “região reguladora indutível”, a região reguladora descrita em seguida para a regulação da expressão do ácido nucléico que codifica o complexo da presente invenção pode ser similarmente usada.
[0047] Na presente invenção, o “módulo que reconhece sequência de ácidos nucléicos” significa uma molécula ou um complexo de moléculas tendo uma capacidade de especificamente reconhecer e ligar a uma sequência de nucleotídeos particular (isto é, a sequência de nucleotídeos alvo) em um filamento de DNA. A ligação do módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos a uma sequência de nucleotídeos alvo permite que enzima modificadora de DNA endógeno celular aja especificamente em um sítio alvejado de um DNA por intermédio do módulo que liga a enzima modificadora de DNA ligada ao dito módulo.
[0048] Na presente invenção, o “módulo que liga a enzima modificadora de DNA” significa uma molécula ou complexo de moléculas tendo a capacidade de ligar a uma enzima modificadora de DNA.
[0049] O complexo da presente invenção é um complexo molecular contendo um complexo em que o módulo acima mencionado que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e o módulo que liga a enzima modificadora de DNA são ligados, e providos com uma capacidade de reconhecimento da sequência de nucleotídeos específica e uma enzima modificadora de DNA endógeno celular. O “complexo” aqui abrange não somente aquele constituído
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15/59 de moléculas múltiplas, mas também aquele tendo um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e o módulo que liga a enzima modificadora de DNA em uma molécula única, como uma proteína de fusão.
[0050] Na presente invenção, a enzima modificadora de DNA endógeno celular como um ligando alvo de um módulo que liga a enzima modificadora de DNA (em seguida também a ser referida como “enzima alvo”) não é particularmente limitada. Os exemplos dos mesmos incluem nuclease (por exemplo, endonuclease, exonuclease etc.), recombinase, DNA girase, DNA polimerase, DNA topoisomerase, telomerase, transposase, desaminase, DNA glicosilase e semelhantes. Do ponto de vista da citotoxicidade reduzida, a alteração do DNA é preferivelmente realizada não por uma reação de clivagem da cepa do DNA de filamento duplo, mas através de uma reação que não oliva pelo menos uma cepa de DNA de filamento duplo (por exemplo, a reação de conversão da base de ácido nucléico e a reação de excisão de base no DNA). Os exemplos da enzima modificadora de DNA que catalisa a reação de conversão da base de ácido nucléico e a reação de excisão de base incluem a desaminase que pertence à superfamília do ácido nucléico/nucleotídeo desaminase que catalisa uma reação de desaminação para converter um grupo amino a um grupo carbonila, DNA glicosilase que catalisa a hidrólise da ligação de N-glicosídeo do DNA (por exemplo, timina DNA glicosilase, oxoguanina glicosilase, alquiladenina DNA glicosilase (por exemplo, levedura 3-metiladenina-DNA glicosilase (MAG1)) e semelhantes) e semelhantes. Os Exemplos preferíveis de desaminase incluem citidina desaminase capaz de converter a citosina ou 5-metilcitosina a uracila ou timina, respectivamente, adenosina desaminase capaz de converter adenina a hipoxantina, guanosina desaminase capaz de converter guanina para xantina e semelhantes. Como citidina desaminase, mais preferido é APOBEC. Em seres humanos, APOBEC inclui APOBEC 1, APOBEC2, APOBEC3 (por exemplo, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D(APOBEC3E),
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AP0BEC3F, AP0BEC3G, AP0BEC3H), AP0BEC4, desaminase de citidina induzida pela ativação (AID) que é uma enzima que introduz uma mutação em um gene de imunoglobulina na imunidade adquirida de vertebrados e semelhantes.
[0051] O módulo que liga a enzima modificadora de DNA usado no método da presente invenção não é particularmente limitado contanto que este possa ligar à enzima modificadora de DNA endógeno celular acima mencionada. Os exemplos dos mesmos incluem anticorpo, aptâmero peptídico, aptâmero de ácido nucléico contra a enzima modificadora de DNA alvo, proteínas que ligam a outras enzimas modificadora de DNA e semelhantes. O módulo que liga a enzima modificadora de DNA pode ser apropriadamente selecionado de acordo com o tipo de enzima alvo modificadora de DNA. Conforme este módulo que liga enzima modificadora de DNAs, aqueles conhecidos ligar à enzima modificadora de DNA alvo podem ser usados, ou as moléculas produzidas pelo método descrito abaixo podem ser usadas. O DNA que codifica o módulo que liga a enzima modificadora de DNA pode ser apropriadamente produzido com base na informação da sequência de aminoácidos, a sequência de ácidos nucléicos do módulo objeto que liga a enzima modificadora de DNA.
[0052] O anticorpo usado no método da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal, e a anticorpo também abrange fragmentos de anticorpo (por exemplo, F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv, scFv etc.), o anticorpo pode ser produzido através de um método imunológico bem conhecido. O aptâmero peptídico é um aptâmero composto de um aminoácido e é uma molécula de peptídeo que pode ligar a uma molécula alvo específica, similar aos anticorpos. O aptâmero peptídico pode ser triado por ou produzido com base em um método de divulgação de fago e um método de exibição da camada de superfície celular (por exemplo, Whaley, S.R., et al., (2000), Nature, 405, 665-668). O aptâmero de ácido nucléico é um aptâmero
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17/59 constituído de RNA, DNA, nucleotídeo modificado ou uma mistura dos mesmos. O aptâmero pode ser triado para ou produzido de acordo com métodos bem conhecidos (por exemplo, Ellington et al., (1990), Nature, 346,818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510).
[0053] Os exemplos de proteínas que ligam a uma enzima modificadora de DNA incluem, mas não são limitados a, Vif (Fator de Infectividade de Virion) do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus da imunodeficiência em macacos (SlVmac) conhecidos ligar à APOBEC (particularmente, APOBEC3), Bet (Bromodomínio e extraterminal) proteína do vírus espumoso, ΤοροΙΙβ (Topoisomerase 2-beta), IQGAP2, ZNF335 (também conhecido como: NIF1), CD81, MLL, C-terminal (196° ao 384° resíduos de aminoácido) de APOBEC3G (por exemplo, Schumacher, April Jean, Ph.D., UNIVERSITY OF MINNESOTA, (2008) 199, páginas; 3313466), fragmentos destes (no seguinte, a menos que de outro modo especificado, a proteína abrange os fragmentos dos mesmos) e semelhantes. Estas proteínas podem ser alteradas (proteína alterada é algumas vezes referida como uma “variante” da proteína). Por exemplo, quando Vif é usada, visto que a Vif é conhecida ligar a um complexo de ubiquitina ligase E3 e promover a proteólise de APOBEC3 (por exemplo, Stanley et al. (2008) Journal of virology, 8656-8663; Guo et al. (2014) Nature, 55, 229-233), é preferível aplicar a alteração que causa a falta da capacidade de ligação às proteínas outras que não APOBEC3. Os exemplos de tal alteração incluem a exclusão de várias (por exemplo, 11, 10, 9, 8, 7 etc.) aminoácidos no terminal N da proteína Vif (sequência de referência No.: AAF20197) e a substituição do 145° resíduo de leucina com outro resíduo de aminoácido (por exemplo, resíduo de alanina) e semelhantes, mas estes não são limitados a estas alterações. Mesmo quando uma proteína outra que não Vif é usada, esta pode ser apropriadamente modificada com base na função da proteína, sítio de ligação com a molécula alvo, estrutura tridimensional, e semelhantes. O
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18/59 fragmento de proteína acima mencionado não é particularmente limitado contanto que este tenha uma região de ligando para a enzima modificadora de DNA. Por exemplo, um fragmento excluindo uma região outra que não a região de ligação à enzima modificadora de DNA (por exemplo, região tendo atividade catalítica de proteína) pode ser mencionado. Os exemplos específicos de tal fragmento incluem um peptídeo composto do 452° ao 591° resíduos de aminoácido de ΤοροΙΙβ (sequência de referência No.: NP_001059), um peptídeo composto dos 466° ao 547° resíduos de aminoácido da IQGAP2 (sequência de referência No.: NP_006624), um peptídeo composto dos 745° ao 893° resíduos de aminoácido da ZNF335 (sequência de referência No.: NP_071378) e semelhantes. Estes são meros exemplos, e aqueles habilitados na técnica podem projetar apropriadamente os fragmentos. Como mostrado nos Exemplos mencionados abaixo, o sítio alvejado também é alterado quando IQGAP2 e ZNF335 são combinados (Tabela 2). Portanto, as proteínas que ligam à enzima modificadora de DNA acima mencionadas também podem ser usadas em combinação.
[0054] Na presente invenção, o “reparo de excisão de base” é um dos mecanismos de reparo do DNA dos organismos vivos, e significa um mecanismo para reparar os danos das bases cortando as partes danificadas das bases pelas enzimas e unindo estas. A excisão das bases danificadas é realizada pelo DNA glicosilase, que é uma enzima que hidrolisa a ligação de N-glicosídeo do DNA. Um sítio abásico (sítio apurínico/apirimídico (AP)) resultando da reação abásica pela enzima é tratado por uma enzima à montante do caminho de reparo de excisão de base (BER) tal como AP endonuclease, DNA polimerase, DNA ligase e semelhantes. Os exemplos de tais genes ou proteínas envolvidos no caminho de BER incluem, mas não são limitados a, UNG (NM_003362), SMUG1 (NM_014311), MBD4 (NM-003925), TDG (NM_003211), OGGI (NM.002542), MYH (NM-012222), NTHL1 (NM.002528), MPG (NM.002434), NEIL1
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19/59 (NM-024608), NEIL2 (NM_145043), NEIL3 (NM.018248), ΑΡΕΙ (NM-001641), APE2 (NM.014481), LIG3 (NM.013975), XRCC1 (NM-006297), ADPRT (PARP1) (NM.0016718), ADPRTL2 (PARP2) (NM_005484) e semelhantes (os parênteses indicam o número de sequência de referência em que a informação de sequência de bases de cada gene (cDNA) é registrada).
[0055] Na presente invenção, o “inibidor de reparo de excisão de base” significa uma substância que inibe qualquer estágio do caminho de BER acima mencionado, ou uma substância que eventualmente inibe BER inibindo-se a expressão das moléculas mobilizadas no caminho de BER. Enquanto o inibidor de reparo de excisão de base a ser usado na presente invenção não é particularmente limitado contanto que este consequentemente possa inibir BER, a partir do aspecto de eficiência, um inibidor de DNA glicosilase localizado à montante do caminho de BER é preferível. Os exemplos do inibidor de DNA glicosilase a ser usado na presente invenção incluem, mas não são limitados a um inibidor de tiamina DNA glicosilase, um inibidor de uracila DNA glicosilase, um inibidor de oxoguanina DNA glicosilase, um inibidor alquilguanina DNA glicosilase e semelhantes. Por exemplo, quando a enzima alvo de um módulo que liga a enzima modificadora de DNA é citidina desaminase, é adequado usar um inibidor de uracila DNA glicosilase para inibir o reparo do mal emparelhamento de U:G ou G:U do DNA gerado pela mutação.
[0056] Os exemplos de tal inibidor de uracila DNA glicosilase incluem, mas não são limitados a, um inibidor de uracila DNA glicosilase (Ugi) derivado do bacteriófago Bacillus subtilis, PBS1, e um inibidor de uracila DNA glicosilase (Ugi) derivado do bacteriófago Bacillus subtilis, PBS2 (Wang, Z., e Mosbaugh, D.W. (1988) J. Bacteriol. 170, 1082-1091). O inibidor acima mencionado do reparo do mal emparelhamento do DNA pode ser usado na presente invenção. Particularmente, o derivado de Ugi de PBS2
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20/59 também é conhecido ter um efeito de tomar mais difícil causar a mutação, clivagem e recombinação outra que não T de C no DNA, e deste modo o uso de um derivado Ugi de PBS2 é adequado.
[0057] Como mencionado acima, no mecanismo de reparo de excisão de base (BER), quando uma base é cortada pelo DNA glicosilase, a AP endonuclease coloca um entalhe no sítio abásico (sítio AP), e a exonuclease corta completamente o sítio de AP. Quando o sítio de AP é cortado, a DNA polimerase produz uma nova base usando-se a base do filamento oposto como um modelo, e a DNA ligase finalmente sela o entalhe para completar o reparo. A AP endonuclease mutante que perde a atividade enzimática, mas mantém a capacidade de ligação ao sítio de AP é conhecido inibir competitivamente a BER. Portanto, estas AP endonucleases de mutação também podem ser usadas como o inibidor de reparo de excisão de base na presente invenção. Enquanto a derivação da AP endonuclease mutante não é particularmente limitada, por exemplo, as AP endonucleases derivadas de Escherichia coli, levedura, mamífero (por exemplo, humano, camundongo, suínos, bovinos, cavalos, macacos etc.) e semelhantes podem ser usadas. Por exemplo, UniprotKB No. P27695 pode ser referido para a sequência de aminoácidoss de Apel humano. Os exemplos da AP endonuclease mutante que perdeu a atividade enzimática, mas mantém a capacidade de ligação ao sítio de AP incluem as proteínas tendo um sítio de atividade mutado e sítio de ligação ao Mg mutado (cofator). Por exemplo, E96Q, Y171A, Y171F, Y171H, D210N, D210A, N212A e semelhantes podem ser mencionados para o Apel humano.
[0058] Uma sequência de nucleotídeos alvo em um DNA a ser reconhecida pelo módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos no complexo da presente invenção não é particularmente limitado contanto que o módulo especificamente ligue a, e possa ser qualquer sequência no DNA. O comprimento da sequência de nucleotídeos alvo somente precisa ser
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21/59 suficiente para a ligação específica do módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos. Por exemplo, este é de menos do que 12 nucleotídeos, preferivelmente não menos do que 15 nucleotídeos, mais preferivelmente de não menos do que 18 nucleotídeos, de acordo com o tamanho do DNA alvo. Enquanto o limite superior do comprimento não é particularmente limitado, este é preferivelmente de não mais do que 25 nucleotídeos, mais preferivelmente não mais do que 22 nucleotídeos.
[0059] Como o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos no complexo da presente invenção, o sistema CRISPR-Cas em que pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA de Cas é inativada (em seguida também a ser referida como “CRISPR-Cas mutante”), motivo de dedo de zinco, efetor TAL e motivo de PPR e semelhantes, bem como um fragmento contendo um domínio de ligação ao DNA de uma proteína que especificamente liga ao DNA, tal como enzima de restrição, fator de transcrição, RNA polimerase e semelhantes, e livres de uma capacidade de clivagem do DNA de filamento duplo e semelhantes podem ser usados, mas o módulo não é limitado aos mesmos. Preferivelmente, o CRISPR-Cas mutante, motivo de dedo de zinco, efetor TAL, motivo de PPR e semelhantes podem ser mencionados.
[0060] Um motivo de dedo de zinco é constituído pela ligação de 3 a 6 diferentes unidades de dedo de zinco tipo Cys2His2 (1 dedo reconhece cerca de 3 bases), e pode reconhecer uma sequência de nucleotídeos alvo de 9 a 18 bases. Um motivo de dedo de zinco pode ser produzido através de um método conhecido tal como um método de montagem Modular (Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141), método OPEN (Mol Cell (2008) 31: 294301), método CoDA (Nat Methods (2011) 8: 67-69), método de um-híbrido de Escherichia coli (Nat Biotechnol (2008) 26:695-701) e semelhantes. O Documento Patentário 1 acima mencionado pode ser referido como para o detalhe da produção do motivo de dedo de zinco.
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22/59 [0061] Um efetor TAL tem uma estrutura de repetição de módulo com cerca de 34 aminoácidos como uma unidade, e os 12° e 13° resíduos de aminoácido (chamados de RVD) de um módulo determina a estabilidade de ligação e a especificidade de base. Visto que cada módulo é altamente independente, o efetor TAL específico para uma sequência de nucleotídeos alvo pode ser produzido simplesmente conectando o módulo. Para efetor TAL, um método de produção utilizando um recurso aberto (método REAL (Curr Protoc Mol Biol (2012) Capítulo 12: Unidade 12.15), método de FLASH (Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465), e método de Golden Gate (Nucleic Acids Res (2011) 39: e82) etc.) foram estabelecidos, e um efetor TAL para uma sequência de nucleotídeos alvo pode ser comparativamente projetado de modo conveniente. O Documento Patentário 2 acima mencionado pode ser referido para o detalhe da produção do efetor TAL.
[0062] O motivo de PPR é constituído tal que uma sequência de nucleotídeos particular seja reconhecida por uma continuação de motivos de PPR, cada um consistindo em 35 aminoácidos e que reconhece uma base de ácido nucléico, e reconhece uma base alvo somente em 1, 4 e ii(-2) aminoácidos de cada motivo. O motivo constituinte não tem dependência, e é isento da interferência dos motivos em ambos os lados. Portanto, como efetor TAL, uma proteína de PPR específica à sequência de nucleotídeos alvo pode ser produzida simplesmente conectando os motivos de PPR. O Documento Patentário 4 acima mencionado pode ser referido como para os detalhes da produção do motivo de PPR.
[0063] Quando um fragmento da enzima de restrição, o fator de transcrição, RNA polimerase e semelhantes é usado, visto que os domínios de ligação de DNS DNA das proteínas são bem conhecidos, um fragmento contendo o domínio e livre de uma capacidade de clivagem do filamento duplo do DNA pode ser facilmente projetado e construído.
[0064] Qualquer um dos módulos acima mencionados que
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23/59 reconhecem a sequência de ácidos nucléicos podem ser providos como uma proteína de fusão com o módulo acima mencionado que liga a enzima modificadora de DNA quando esta é uma proteína, ou um domínio de ligação à proteína tal como o domínio SH3, domínio PDZ, domínio GK, domínio GB e semelhantes e um parceiro de ligação do mesmo pode ser fundido com um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA, respectivamente, e provido como um complexo de proteínas por intermédio de uma interação do domínio e um parceiro de ligação do mesmo. Altemativamente, um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA podem ser, cada um, fundidos com inteína, e estes podem ser ligados através da ligação após a síntese proteica.
[0065] O complexo da presente invenção contendo um complexo (incluindo a proteína de fusão) em que um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e o módulo que liga a enzima modificadora de DNA é ligado, é desejavelmente comunicado com um DNA (por exemplo, DNA genômico) introduzindo-se um ácido nucléico que codifica o complexo em uma célula tendo o DNA objeto.
[0066] Portanto, o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e o módulo que liga a enzima modificadora de DNA são preferivelmente preparados como um ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão do mesmo, ou em uma forma capaz de formar um complexo em uma célula hospedeira após a tradução em uma proteína utilizando-se um domínio de ligação, inteína e semelhantes, ou como um ácido nucléico que codifica cada um destes. O ácido nucléico aqui contido pode ser um DNA ou um RNA, preferivelmente DNA. Quando este é um DNA, este é preferivelmente um DNA de filamento duplo, e provido na forma de um vetor de expressão disposto sob a regulação de um promotor funcional em uma célula hospedeira.
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24/59 [0067] O complexo da presente invenção em que um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo de ligação à enzima que modifica o DNA são ligados, permitindo a edição do DNA com baixa toxicidade é possível, e o método de alteração genética da presente invenção pode ser aplicado a uma ampla faixa de materiais biológicos. Portanto, as células a ser introduzidas com ácido nucléico que codifica o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e/ou módulo que liga a enzima modificadora de DNA pode abranger as células de qualquer espécie, da bactéria de Escherichia coli e semelhantes que são procariotas, células de micro-organismos tais como levedura e semelhantes que são eucariotas inferiores, para as células de vertebrados incluindo mamíferos tais como seres humanos e semelhantes, e as células de eucariotas superiores tais como insetos, plantas e semelhantes.
[0068] Um DNA que codifica um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos tal como motivo de dedo de zinco, efetor TAL, motivo de PPR e semelhantes pode ser obtido através de qualquer método mencionado acima para cada módulo. Um DNA que codifica uma sequência que reconhece o módulo da enzima de restrição, fator de transcrição, RNA polimerase e semelhantes pode ser clonado, por exemplo, sintetizando-se um precursor de oligoDNA cobrindo um região que codifica uma parte desejada da proteína (isto é, parte contendo o domínio de ligação de DNA) com base na informação de sequência de cDNA do mesmo, e amplificando através do método de RT-PCR usando, como um modelo, a fração de RNA ou mRNA total preparada a partir das células que produzem proteína.
[0069] Um módulo que codifica o DNA que liga a enzima modificadora de DNA, enzima modificadora do indutor de DNA ou inibidor de reparo de excisão de base também pode ser similarmente clonado sintetizando-se um precursor de oligoDNA com base na informação da sequência de cDNA da proteína e semelhantes a ser usados, e amplificando
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25/59 através do método de RT-PCR using, como um modelo, a fracção de RNA ou mRNA total preparada a partir da proteína e semelhantes. Por exemplo, quando Vif de HIV é usado como um módulo que liga a enzima modificadora de DNA, um DNA que codifica a proteína pode ser clonado projetando precursores adequados para à jusante e à montante das CDS com base na sequência de cDNA (No. de aquisição AF200477) registrado no banco de dados da NCBI, e realizando a clonagem de acordo com o método de RTPCR do RNA extraído de uma célula infectada com HIV.
[0070] O DNA pode ser diretamente clonado, ou após a digestão com uma enzima de restrição quando desejado, ou após a adição de um ligante adequado e/ou um sinal de localização nuclear (cada sinal de localização de organela quando o DNA objeto é um DNA de mitocôndria ou cloroplasto), ligado com um DNA que codifica um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos para preparar um DNA que codifica uma proteína de fusão. Quando ulm módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA são expressados como uma proteína de fusão, por exemplo, um sinal de localização nuclear pode ser adicionado a ambos os terminais da proteína de fusão, ou entre o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e o módulo que liga a enzima modificadora de DNA. O sinal de localização nuclear não é particularmente limitado e, por exemplo, o sinal de localização nuclear derivado de SV40 (por exemplo, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9) pode ser mencionado.
[0071] Altemativamente, um DNA que codifica um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos, e um DNA que codifica um módulo que liga a enzima modificadora de DNA podem ser, cada um, fundidos com um DNA que codifica um domínio de ligação ou um parceiro de ligação do mesmo, ou os respectivos DNAs podem ser fundidos com um DNA que codifica uma inteína de separação, deste modo o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e o módulo que liga a enzima
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26/59 modificadora de DNA são traduzidos em uma célula hospedeira para formar um complexo. Nestes casos, um ligador e/ou um sinal de localização nuclear podem ser ligados a uma posição adequada dos respectivos DNAs quando desejado.
[0072] Um DNA que codifica o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um DNA que codifica o módulo que liga a enzima modificadora de DNA (e um DNA que codifica a enzima modificadora do indutor de DNA quando as células são estimuladas introduzindo-se e expressando o DNA que codifica o indutor na célula; em seguida o mesmo quando indicado em parênteses) pode ser obtido sintetizando quimicamente o filamento de DNA, ou conectando-se os filamentos curtos de oligoDNA de sobreposição parcialmente sintetizados utilizando-se o método de PCR e o método de Montagem de Gibson para construir um DNA que codifica o comprimento total do mesmo. A vantagem de construir um DNA de comprimento total através da síntese química ou uma combinação de método de PCR ou método de Montagem de Gibson é que o códon a ser usado pode ser projetado em CDS de comprimento total de acordo com um hospedeiro no qual o DNA é introduzido. Na expressão de um DNA heterólogo, o nível de expressão proteico é esperado aumentar convertendo-se a sequência de DNA do mesmo para um códon muito frequentemente usado no organismo hospedeiro. Como os dados do códon usam a frequência no hospedeiro a ser usado, por exemplo, o código genético usa o banco de dados de frequências (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) divulgado na página da web da Kazusa DNA Research Institute pode ser usado, ou documentos mostrando a frequência do uso de códons em cada hospedeiro podem ser referidos. Por referência aos dados obtidos e a sequência de DNA a ser introduzida, os códons mostrando baixo uso da frequência no hospedeiro entre aqueles úteis para a sequência de DNA podem ser convertidos a um códon que codifica o mesmo aminoácido e mostrando alta frequência de uso. Por exemplo, quando
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27/59 a célula hospedeira é uma célula humana, um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e/ou uma sequência que codifica um módulo que liga a enzima modificadora de DNA que são/é otimizadas para o uso do códon humano podem ser usadas. Um DNA que codifica um inibidor de reparo de excisão de base também pode ser similarmente construído.
[0073] Um vetor de expressão contendo um DNA que codifica o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e/ou um DNA que codifica o módulo que liga a enzima modificadora de DNA (e/ou um DNA que codifica uma enzima modificadora do indutor de DNA) pode ser produzido, por exemplo, ligando-se o DNA à jusante de um promotor em um vetor de expressão adequado. Além disso, o vetor de expressão acima mencionado também pode ser produzido incluindo um DNA que codifica um inibidor de reparo de excisão de base.
[0074] Como o vetor de expressão, os plasmídeos derivados de Escherichia coli (por exemplo, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); plasmídeos derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, pUBUO, pTP5, pC194); plasmídeos derivados de levedura (por exemplo, pSH19, pSH15); plasmídeos de expressão de célula de inseto (por exemplo, pFast-Bac); plasmídeos de expressão de célula animal (por exemplo, pAl-11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); bacteriófagos tais como Xfago e semelhantes; vetores de vírus de insetos tais como baculovírus e semelhantes (por exemplo, BmNPV, AcNPV); vetores de vírus animais tais como retrovirus, vírus da varíola, adenovirus e semelhantes, e semelhantes são usados.
[0075] Como o promotor, qualquer promotor apropriado para um hospedeiro a ser usado para a expressão genética pode ser usado. Em um método convencional acompanhando o DSB, visto que a taxa de sobrevivência da célula hospedeira às vezes diminui notavelmente devido à toxicidade, é desejável aumentar o número de células no início da indução
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28/59 usando-se um promotor indutivo. Quando uma enzima desacompanhada de DSB é induzida como uma enzima modificadora de DNA endógeno celular, visto que a proliferação celular suficiente também pode ser expressada expressando-se o complexo da presente invenção, um promotor constituinte também pode ser usado sem limitação.
[0076] Por exemplo, quando o hospedeiro é uma célula animal, o promotor de SRa, promotor de SV40, promotor de LTR, promotor CMV (citomegalovírus), promotor de RSV (promotor do vírus do sarcoma de Rous, promotor de MoMuLV (vírus da leucemia em camundongos Moloney) LTR, promotor de HSV-TK (vírus da herpes simples, timidina cinase) e semelhantes são usados. Destes, promotor de CMV, promotor de SRa e semelhantes são preferíveis.
[0077] Quando o hospedeiro é Escherichia coli, o promotor de trp, promotor de lac, promotor de recA, promotor de XPL, promotor de Ipp, promotor de T7 e semelhantes são preferíveis.
[0078] Quando o hospedeiro é do gênero Bacillus, o promotor de SPO1, promotor de SPO2, promotor de penP e semelhantes são preferíveis.
[0079] Quando o hospedeiro é uma levedura, o promotor de Gall/10, promotor de PHO5, promotor de PGK, promotor de GAP, promotor de ADH e semelhantes são preferíveis.
[0080] Quando o hospedeiro é uma célula de inseto, o promotor de polihedrina, promotor de P10 e semelhantes são preferíveis.
[0081] Quando o hospedeiro é uma célula vegetal, o promotor de CaMV35S, promotor de CaMV19S, promotor de NOS e semelhantes são preferíveis [0082] Quando desejado, o vetor de expressão pode conter um terminador (por exemplo, terminador de NOS, terminador de pisum sativum rbcS3A, terminador de proteína aquecida por choque (HSP)17,3 etc.), um intensificador de tradução (por exemplo, região não traduzida da álcool
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29/59 desidrogenase 5’ derivada de arroz (Os ADH-5’UTR), CaMV ou sequência Ω derivada do virus do mosaico do tabaco, etc.), uma região reguladora 3’ (por exemplo, gene de actina derivado do arroz do gene (Actl)3’UTR etc.), sinal poli A adicionado, um marcador de seleção de um gene de resistência ao medicamento (por exemplo, gene de resistência ao G418 (nPtII), gene de resistência à higromicina (hpt) etc.) e semelhantes.
[0083] Um RNA que codifica um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e/ou um RNA que codifica um módulo que liga a enzima modificadora de DNA (e/ou um RNA que codifica a enzima modificadora do indutor de DNA) pode ser preparado, por exemplo, através do sistema de transcrição ao mRNA in vitro conhecido por si usando-se o vetor de expressão acima mencionado contendo um DNA que codifica o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e/ou um DNA que codifica o módulo que liga à enzima modificadora de DNA (e/ou um DNA que codifica a enzima modificadora do indutor de DNA) como um modelo. O RNA que codifica um inibidor de reparo de excisão de base pode ser similarmente preparado.
[0084] Um complexo de um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA pode ser expressado intracelularmente introduzindo-se um vetor de expressão contendo um DNA que codifica um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e/ou um módulo que liga a enzima modificadora de DNA em uma célula hospedeira, e cultivando a célula hospedeira.
[0085] Como o hospedeiro, o gênero Escherichia, gênero Bacillus, levedura, célula de inseto, inseto, célula de animal e semelhantes são usados. [0086] Como o gênero Escherichia, Escherichia coli Kl2 · DH1 [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 60, 160 (1968)], Escherichia coli JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], Escherichia coli JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], Escherichia coli HB101 [Journal of
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Molecular Biology, 41, 459 (1969)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] e semelhantes são usados.
[0087] Como o gênero Bacillus, Bacillus subtilis Mil 14 [Gene, 24, 255 (1983)], Bacillus subtilis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] e semelhantes são usados.
[0088] Como a levedura, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R', NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 e semelhantes são usados.
[0089] Como a célula de inseto quando o vírus é AcNPV, células da linhagem estabelecida derivadas de lagarta do repolho (célula de Spodoptera frugiperda; célula Sf), células MG1 derivadas do intestino médio de Trichoplusia ni, células High Five® derivadas de um ovo de Trichoplusia ni, células derivadas de Mamestra brassicae, células derivadas de Estigmena acrea e semelhantes são usados. Quando o vírus é BmNPV, as células da linhagem estabelecida de derivada de Bombyx mo ri (célula de Bombyx mo ri N; célula BmN) e semelhantes são usadas como células de inseto. Como a célula Sf, por exemplo, célula Sf9 (ATCC CRL1711), célula Sf21 [todas acima, In Vivo, 13, 213-217 (1977)] e semelhantes são usados.
[0090] Como o inseto, por exemplo, larva de Bombyx mori, Drosophila, grilo e semelhantes são usados [Nature, 315, 592 (1985)].
[0091] Como a célula animal, as linhagens celulares tais como célula de macaco COS-7, célula de macaco Vero, célula do ovário de hamster chinês (CHO), célula de CHO deficiente no gene dhfr, célula L de camundongo, célula AtT-20 de camundongo, célula de mieloma de camundongo, célula GH3 de ratos, células derivadas do rim fetal humano (por exemplo, célula HEK293), célula derivada de câncer do fígado humano (por exemplo, HepG2), célula FL humana e semelhantes, células tronco pluripotentes como a célula iPS, célula ES e semelhantes de seres humanos e outros mamíferos, e células primárias cultivadas preparadas a partir de vários tecidos são usados.
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Além disso, embrião de peixe-zebra, Xenopus oocyte e semelhantes também podem ser usados.
[0092] Como a célula vegetal, as células cultivadas em suspensão, calo, protoplasto, segmento de folha, segmento de raiz e semelhantes preparados a partir de várias plantas (por exemplo, grãos tais como arroz, trigo, milho e semelhantes, produtos de safra tais como tomate, pepino, berinjela e semelhantes, plantas de jardins, tais como craveiro, Eustoma russellianum e semelhantes, plantas experimentais tais como tabaco, arabidopsis thaliana e semelhantes, e semelhantes) são usados.
[0093] Todas as células hospedeiras acima mencionados podem ser haplóides (monoplóides), ou poliplóides (por exemplo, diplóide, triplóide, tetraplóide e semelhantes). Nos métodos de introdução de mutação convencionais, a mutação é, a princípio, introduzida apenas em um cromossomo homólogo para produzir um tipo de hetero gene. Portanto, o fenótipo desejado não é expressado a menos que a mutação dominante ocorra, e a característica homozigótica inconveniente demanda trabalho e tempo. Ao contrário, de acordo com a presente invenção, visto que a mutação pode ser introduzida em qualquer alelo no cromossomo homólogo no genoma quando o DNA alvo é alterado pelo método da presente invenção usando um módulo incluindo CRISPR-mutação Cas incluindo a que reconhece a sequência de ácidos nucléicos, o fenótipo desejado pode ser expressado em uma geração simples mesmo no caso da mutação recessiva, que pode resolver o problema do método convencional.
[0094] Um vetor de expressão pode ser introduzido através de um método conhecido (por exemplo, método de lisozima, método competente, método de PEG, método de coprecipitação de CaCb, método de eletroporação, o método de microinjeção, o método de pistola de partícula, método de lipofecção, método de Agrobactéria e semelhantes) de acordo com o tipo de hospedeiro.
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32/59 [0095] A Escherichia coli pode ser transformada de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) e semelhantes.
[0096] O gênero Bacillus pode ser introduzido em um vetor de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) e semelhantes.
[0097] Uma levedura pode ser introduzida em um vetor de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1929 (1978) e semelhantes.
[0098] Uma célula de inseto e um inseto podem ser introduzidos em um vetor de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) e semelhantes.
[0099] Uma célula animal pode ser introduzida em um vetor de acordo com os métodos descritos em, por exemplo, Cell Engineering additional volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (publicado pela Shujunsha), e Virology, 52, 456 (1973).
[00100] Uma célula introduzida com um vetor pode ser cultivada de acordo com um método conhecido de acordo com o tipo de hospedeiro.
[00101] Por exemplo, quando a Escherichia coli ou gênero Bacillus são cultivados, um meio líquido é preferível como um meio a ser usado para a cultura. O meio preferivelmente contém uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, substância inorgânica e semelhantes, necessários para o crescimento do transformante. Os exemplos da fonte de carbono incluem glicose, dextrina, amido solúvel, sacarose e semelhantes; os exemplos da fonte de nitrogênio incluem substâncias inorgânicas ou orgânicas tais como sais de amônio, sais de nitrato, líquido da maceração do milho, peptona, caseína, extrato de carne, torta de feijão-soja, extrato de batata e semelhantes; e os exemplos da substância inorgânica incluem cloreto de cálcio, diidrogeno fosfato de sódio, cloreto de magnésio e semelhantes. O meio pode conter
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33/59 extrato de levedura, vitaminas, fator promotor de crescimento e semelhantes. O pH do meio é preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 8.
[00102] Como um meio para cultivar a Escherichia coli, por exemplo, meio M9 contendo glicose, casaminoácido [Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque 1972] é preferível. Onde necessário, por exemplo, os agentes tais como ácido 33-indolilacrílico podem ser adicionados ao meio para garantir uma função eficiente de um promotor. A Escherichia coli é cultivada geralmente em cerca de 15 a cerca de 43°C. Onde necessário, a aeração e agitação podem ser realizadas.
[00103] O gênero Bacillus é cultivado geralmente em cerca de 30 a cerca de 40°C. Onde necessário, aeração e agitação podem ser realizadas.
[00104] Os Exemplos do meio para cultivar levedura incluem meio de Burkholder mínimo [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 4505 (1980)], meio SD contendo casaminoácido a 0,5% [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 5330 (1984)] e semelhantes. O pH do meio é preferivelmente cerca de 5 a cerca de
8. A cultura é realizada geralmente a cerca de 20°C a cerca de 35°C. Onde necessário, a aeração e agitação podem ser realizadas.
[00105] Como um meio para cultivar uma célula de inseto ou inseto, por exemplo, Meio de Inseto de Grace [Nature, 195, 788 (1962)] contendo um aditivo tal como soro bovino inativado a 10% e semelhantes como apropriado e semelhantes são usados. O pH do meio é preferivelmente de cerca de 6,2 a cerca de 6,4. A cultura é realizada geralmente em cerca de 27°C. Onde necessário, a aeração e agitação podem ser realizadas.
[00106] Como um meio para cultivar uma célula animal, por exemplo, meio essencial mínimo (MEM) contendo cerca de 5 a cerca de 20% de soro bovino fetal [Science, 122, 501 (1952)], meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM) [Virology, 8, 396 (1959)], meio RPMI 1640 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], meio 199
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34/59 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] e semelhantes são usados. O pH do meio é preferivelmente de cerca de 6 a cerca de 8. A cultura é realizada geralmente a cerca de 30°C a cerca de 40°C. Onde necessário, a aeração e agitação podem ser realizadas.
[00107] Como um meio para cultivar uma célula vegetal, por exemplo, meio MS, meio LS, meio B5 e semelhantes são usados. O pH do meio é preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 8. A cultura é realizada em geralmente cerca de 20°C a cerca de 30°C. Onde necessário, a aeração e agitação podem ser realizadas.
[00108] Como mencionado acima, um complexo de um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA, isto é, o complexo da presente invenção, podem ser expressados intracelularmente.
[00109] Um RNA que codifica um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e/ou módulo que liga a enzima modificadora de DNA podem ser introduzidos em uma célula hospedeira através do método de microinjeção, método de lipofecção e semelhantes. A introdução do RNA pode ser realizada uma vez ou repetida múltiplas vezes (por exemplo, de 2 a 5 vezes) em intervalos adequados.
[00110] Quando um complexo de um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA é expressado por um vetor de expressão introduzido dentro da célula, o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos especificamente reconhece e liga a uma sequência de nucleotídeos alvo no DNA (por exemplo, DNA genômico) de interesse. Um módulo que liga a enzima modificadora de DNA ligado ao módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos liga a uma enzima modificadora de DNA endógeno celular induzida pelo estímulo por uma enzima modificadora do indutor de DNA, e o filamento ou base de DNA é modificado no sítio alvejado (sequência de nucleotídeos alvo integral
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35/59 ou parcial ou adjacências da mesma) através da ação da enzima modificadora de DNA.
[00111] Quando o DNA alvo é de filamento duplo, a modificação do DNA ocorre no sentido do filamento ou antis sentido do filamento no sítio alvejado. Quando a modificação do DNA é a clivagem do DNA, várias mutações são introduzidas durante o reparo pelo mecanismo de reparo tal como reparo da excisão de base (BER), reparo da excisão de nucleotídeos (NER), reparo por clivagem de filamento único, junção final não homóloga (NHEJ), recombinação homóloga (HR) e semelhantes. Quando a modificação do DNA não acompanha diretamente a clivagem do filamento de DNA, um mal emparelhamento ou sítio livre da base é produzido no DNA de filamento duplo (porção de AP) (sítio apurínico/apirimídico (AP)), as mutações são introduzidas no processo de reparar o mesmo. Por exemplo, quando um módulo que liga enzima modificadora de DNA capaz de ligar à citidina desaminase tal como APOBEC e semelhantes é usado, a citosina no sentido do filamento ou antis sentido do filamento no sítio alvejado é convertida a uracila para causar o mal emparelhamento de U:G ou G:U). Quando o mal emparelhamento não é corretamente reparado, e quando reparado tal que uma base do filamento oposto forma um par com uma base do filamento convertido (T-A ou A-T no exemplo acima mencionado), ou quando o outro nucleotídeo é novamente substituído (por exemplo, U^A, G) ou quando de uma a várias dúzias de bases são excluídas ou inseridas durante o reparo, várias mutações são introduzidas. Por exemplo, quando um módulo que liga a enzima modificadora de DNA capaz de ligar ao DNA glicosilase é usado, a reação de excisão de base ocorre no sentido do filamento ou antissentido do filamento do sítio alvejado, e um sítio abásico (sítio AP) é produzido em um dos filamentos do DNA de filamento duplo. Depois, o sistema de reparo de excisão de base (BER) na célula opera, a AP endonuclease primeiro reconhece o sítio AP e oliva a ligação de ácido fosfórico em uma das cepas de
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DNA, e a exonuclease remove o nucleotídeo submetido à excisão de base. Depois, o DNA polimerase insere um novo nucleotídeo usando-se o DNA de filamento oposto como um modelo e finalmente o DNA ligase repara a junta. Várias mutações são introduzidas por uma perda de reparo que ocorre em qualquer estágio deste BER.
[00112] Como para o motivo de dedo de zinco, a produção do motivo de dedo de zincos realmente operáveis não é fácil, visto que a eficiência de produção de um dedo de zinco que especificamente liga a uma sequência de nucleotídeos alvo não é alta e a seleção de um dedo de zinco tendo alta especificidade de ligação é complicada. Enquanto o efetor TAL e motivo de PPR têm um alto grau de liberdade do reconhecimento da sequência de ácidos nucléicos alvo se comparado ao motivo de dedo de zinco, um problema permanece na eficácia visto que uma proteína grande precisa ser projetada e construída cada vez de acordo com a sequência de nucleotídeos alvo.
[00113] Ao contrário, visto que o sistema CRISPR-Cas reconhece a sequência de DNA objeto por um RNA guia complementar à sequência de nucleotídeos alvo, qualquer sequência pode ser alvejada simplesmente sintetizando um oligoDNA capaz de formar especificamente um híbrido com a sequência de nucleotídeos alvo.
[00114] Portanto, em uma modalidade mais preferível da presente invenção, um sistema de CRISPR-Cas em que pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA da proteína efetora de Cas é inativada (CRISPR-Cas mutante) é usado como um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos.
[00115] O módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos da presente invenção usando o CRISPR-Cas mutante é provido como um complexo de um CRISPR-RNA (crRNA) contendo uma sequência complementar à sequência de nucleotídeos alvo e, onde necessário, transativando o RNA (tracrRNA) necessário para recrutar a proteína efetora
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37/59 de Cas mutante (quando o tracrRNA é necessário, possivelmente provido como RNA quimérico com crRNA) e proteína efetora de Cas mutante. Uma molécula de RNA consistindo em crRNA sozinha ou um RNA quimérico de crRNA e tracrRNA que constitui um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos em combinação com uma proteína efetora de Cas mutante é coletivamente referida como “RNA guia”. Quando um aptâmero de ácido nucléico é usado como um módulo que liga a enzima modificadora de DNA, o aptâmero de ácido nucléico é desejavelmente ligado ao RNA guia. Um ácido nucléico em que um RNA guia e um aptâmero de ácido nucléico são ligados pode ser produzido através de um método conhecido (por exemplo, Mali etal., (2013), Nat Biotechnol, 31(9), 833-838).
[00116] Enquanto a proteína efetora de Cas a ser usada na presente invenção não é particularmente limitada contanto que esta seja uma proteína efetora que pertence ao sistema de CRISPR classe 2 capaz de formar um complexo com RNA guia e que reconhece e liga à sequência de nucleotídeos alvo no gene objeto e um motivo adjacente protoespaçador (PAM) adjacente à mesma, é preferivelmente Cas9 ou Cpf 1. Os Exemplos de Cas9 incluem, mas não são limitados a, Cas9 (SpCas9) derivado de Streptococcus pyogenes', sequência de PAM (direção 5’—>3’; em, seguida o mesmo) NGG (N é A, G, T ou C, em seguida o mesmo)), Cas9 (StCas9; sequência de PAM NNAGAAW) derivado de Streptococcus thermophilus, Cas9 (MmCas9; sequência de PAM NNNNGATT) derivado de Neisseria meningitidis e semelhantes. E preferido SpCas9 com menos restrição por PAM (substancialmente 2 bases, e pode alvejar teoricamente qualquer local no genoma). Os exemplos de Cpfl incluem, mas não são limitados a, Cpfl derivado de Francisella novicida (FnCpfl; sequência de PAM TTN), Cpfl derivado de Acidaminococcus sp. (AsCpfl; sequência de PAM TTTN), Cpfl derivado de Lachnospiraceae bacterium (LbCpfl; sequência de PAM TTTN) e semelhantes. Como uma proteína efetora de Cas mutante (em seguida às vezes a ser abreviada como
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38/59 “mutação Cas”) a ser usada na presente invenção, qualquer uma da proteína efetora Cas em que a capacidade de clivagem de ambos os filamentos do DNA de filamento duplo é inativada e aquele tendo atividade de nickase em que pelo menos uma capacidade de clivagem de um filamento sozinho é inativada possa ser usada. Por exemplo, no caso de SpCas9, uma mutante D10A em que o 10° resíduo de Asp é convertido a um resíduo de Ala e a capacidade de falta de clivagem de um filamento oposto ao filamento formando um filamento complementar com um RNA guia (deste modo tendo atividade de nickase para um filamento formando o filamento complementar com um RNA guia), ou H840A mutante em que o 840° resíduo de His é convertido a um resíduo de Ala e sem a atividade de clivagem de um filamento formando um filamento complementar para guiar o RNA (deste modo tendo atividade de nickase para um filamento formando o filamento complementar com o RNA guia, ou uma mutante dupla do mesmo (dCas9) pode ser usado. No caso do FnCpfl, uma variante em que o 917° resíduo Asp é convertido ao resíduo de Ala (D917A) ou ao 1006° resíduo de Glu é convertido ao resíduo de Ala (El006A), e sem a capacidade de clivagem ambos os filamentos podem ser usados. Contanto que pelo menos um dos filamentos do DNA de filamento duplo sem a capacidade de clivagem, outra mutante de Cas também pode ser usada similarmente.
[00117] O módulo que liga a enzima modificadora de DNA é provido como um complexo com Cas mutante através de um método similar ao esquema de ligação com o dedo de zinco acima mencionado e semelhantes. Altemativamente, um módulo que liga a enzima modificadora de DNA e Cas mutante também pode ser ligado utilizando-se os aptâmeros de RNA MS2F6, PP7 e semelhantes e estrutura de RNA ligando-se as proteínas ao mesmo. A sequência de alvejamento no RNA guia forma um filamento complementar com a sequência de nucleotídeos alvo, a Cas mutante é recrutada pelo tracrRNA ligado e a Cas mutante reconhece PAM. Um ou ambos os DNAs
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39/59 não podem ser clivados e, devido à ação do módulo que liga a enzima modificadora de DNA ligada à Cas mutante, a conversão de base ocorre no sítio alvejado (apropriadamente ajustado dentro de várias centenas de bases incluindo a sequência de nucleotídeos alvo total ou parcial) e um mal emparelhamento ocorre no DNA de filamento duplo. Quando o mal emparelhamento não é corretamente emparelhado, e quando reparado tal que uma base do filamento oposto forma um par com uma base do filamento convertido, ou quando outro nucleotídeo é novamente convertido ou quando uma ou várias dúzias de bases são excluídas ou inseridas durante o reparo, várias mutações são introduzidas.
[00118] Quando o CRISPR-Cas mutante é usado como um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos, similar a quando o dedo de zinco e semelhantes são usados como um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos, um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA são desejavelmente introduzidos, na forma de um ácido nucléico (preferivelmente DNA) que codifica o mesmo, em uma célula tendo um DNA de interesse.
[00119] Um DNA que codifica a proteína efetora de Cas (por exemplo, Cas9, Cpfl) pode ser clonado em um método similar ao método acima mencionado para um DNA que codifica um módulo que liga a enzima modificadora de DNA, de uma célula que produz a proteína. Um Cas mutante pode ser obtido introduzindo-se uma mutação para converter um resíduo de aminoácido da parte importante para a atividade de clivagem do DNA (por exemplo, 10° resíduo de Asp e 840° resíduo de His para SpCas9, 917° resíduo de Asp, 1006° resíduo de Glu e 1255° resíduo de Asp para FnCpfl e semelhantes, embora não limitados aos mesmos) aos outros aminoácidos, em um DNA que codifica o Cas clonado, por um método de indução de mutação de sítio específico conhecido por si. Além disso, construindo-se o DNA de comprimento total através da síntese química ou em combinação com um
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40/59 método de PCR ou método de Montagem de Gibson, os códons a serem usados também podem ser projetados em um CDS de comprimento total de acordo com o hospedeiro no qual o DNA está introduzido. Por exemplo, como SpCas9 de DNA introduzido com tal mutação e usando um códon adequado para a expressão em células humanas, um DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 4 pode ser mencionado.
[00120] O DNA obtido que codifica um Cas mutante e/ou um DNA que codifica um módulo que liga a enzima modificadora de DNA pode ser inserido a jusante de um promotor de um vetor de expressão similar àquele mencionado acima, de acordo com a célula hospedeira. Como mencionado acima, o vetor de expressão pode conter, quando desejado, marcadores de seleção tal como terminador, intensificador de tradução, região reguladora 3’, sinal de adição poli A, gene de resistência ao medicamento e semelhantes, e semelhantes.
[00121] Por outro lado, um DNA que codifica o RNA guia pode ser obtido projetando-se uma sequência de oligoDNA ligando uma sequência de codificação da sequência de crRNA contendo uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos alvo (também a ser referida como “sequência de alvejamento” no presente relatório descritivo) (por exemplo, quando FnCpfl é recrutado como a proteína efetora de Cas, crRNA contendo SEQ ID NO: 10; AAUUUCUACUGUUGUAGAU no lado 5’ da sequência de alvejando pode ser usado, e as sequências sublinhadas formam pares de base para tomar uma estrutura de haste e alça), ou uma sequência que codifica crRNA e, como necessário, uma sequência que codifica tracrRNA conhecida (por exemplo, como uma sequência que codifica tracrRNA quando o Cas é recrutado como a proteína efetora Cas9, gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtg c; SEQ ID NO: 11) e sintetização química usando um sintetizador de DNA/RNA. Quando o DNA alvo é de filamento duplo, a sequência de crRNA
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41/59 inclui uma sequência de nucleotídeos complementar a um “filamento alvejado” da sequência de nucleotídeos alvo.
[00122] O “filamento alvejado” aqui significa um filamento que forma um híbrido com crRNA da sequência de nucleotídeos alvo, e um filamento oposto do mesmo que se toma de filamento único através da hibridização ao filamento alvejado e crRNA é referido como um “filamento não alvejado”. Visto que a reação de modificação de DNA é geralmente assumida ocorrer frequentemente em um single filamento não alvejado filamentado, quando a sequência de nucleotídeos alvo deve ser expressada por um dos filamentos (por exemplo, quando a sequência de PAM é indicada, quando a relação posicionai da sequência de nucleotídeos alvo e PAM é mostrada etc.), é representada por uma sequência do filamento não alvejado.
[00123] Enquanto o comprimento da sequência de alvejamento não é particularmente limitada contanto que esta possa especificamente ligar a uma sequência de nucleotídeos alvo, por exemplo, esta é de 15 a 30 nucleotídeos, preferivelmente de 18 a 25 nucleotídeos. A seleção da sequência de nucleotídeos alvo é restrita pela presença de um PAM adjacente no sítio 3’ (no caso de Cas9) ou lado 5’ (no caso de Cpfl) da sequência. De acordo com a descoberta na levedura e semelhantes, em um sistema em que o CRISPRCas mutado e a citidina desaminase são combinados, C em uma posição entre os 7 nucleotídeos da terminação 5’ do mesmo para a direção 3’ do mesmo é facilmente substituído sem relação com o comprimento da sequência de nucleotídeos alvo. Portanto, determinando-se apropriadamente o comprimento da sequência de nucleotídeos alvo (sequência de alvejamento como um filamento complementar do mesmo), o sítio de uma base em que uma mutação pode ser introduzida por ser trocado. Como um resultado, a restrição por PAM (NGG em SpCas9) pode ser removida pelo menos parcialmente, e o grau de liberdade da introdução da mutação é esperado ser maior.
[00124] Quando o Cas9 é usado como uma proteína efetora de Cas,
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42/59 uma sequência de alvejamento pode ser projetada, por exemplo, usando um sítio da web de projeto de RNA guia aberto ao público (CRISPR Design Tool, CRISPRdirect etc.) listando-se as sequências de 20 mer tendo PAM (por exemplo, NGG no caso de SpCas9) adjacente ao lado 3’ das sequências de CDS do gene objeto, e selecionando uma sequência que faz com que um aminoácido mude na proteína codificada pelo gene alvo quando C dentro dos 7 nucleotídeos da terminação 5’ do mesmo para direção 3’ é convertido para T. Além disso, uma sequência tendo C que similarmente, quando o comprimento da sequência de alvejamento é mudado, por exemplo, dentro da faixa de 18 a 25 nucleotídeos, faz com que um aminoácido mude pela conversão da base para T dentro de 7 nucleotídeos da terminação 5’ do mesmo para a direção 3’, é selecionada. Uma sequência candidata tendo um pequeno número de sítios fora do alvo no genoma do hospedeiro pode ser usada como uma sequência de alvejamento. Quando o suporte lógico de projeto de RNA guia a ser usado não têm uma função para procurar sítios fora do alvo do genoma do hospedeiro, por exemplo, os sítios fora do alvo podem ser procurados aplicando uma pesquisa Blast ao genoma do hospedeiro, por exemplo, de 8 a 12 nucleotídeos no lado 3’ da sequência candidata (sequência de sementes com alta capacidade de discriminação da sequência de nucleotídeos alvo).
[00125] Um DNA que codifica o RNA guia (por exemplo, quimera de crRNA ou de crRNA-tracrRNA) pode ser obtido projetando-se uma sequência de oligoDNA ligando uma sequência complementar ao filamento alvo da sequência de nucleotídeos alvo e uma sequência de tracrRNA conhecida (quando Cas9 é recrutado) ou uma sequência de repetição direta do crRNA (quando o Cpfl é recrutado) e quimicamente sintetizado usando um sintetizador de DNA/RNA. Enquanto um DNA que codifica o RNA guia também pode ser inserido em um vetor de expressão similar àquele mencionado acima, como o promotor, o promotor do sistema pol III (por
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43/59 exemplo, promotor de SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U3, U6, Hl etc.) e terminador (por exemplo, sequência Te; tttttt etc.) são preferivelmente usados. [00126] O DNA que codifica o Cas mutante, o DNA que codifica o módulo que liga a enzima modificadora de DNA, um DNA que codifica o RNA guia podem ser introduzidos em uma célula hospedeira através de um método similar ao acima, de acordo com o hospedeiro.
[00127] Na edição genômica usando um complexo de desaminase e um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos (em seguida às vezes a ser referido como “AID Alvo”) (Documento Patentário 5), os presentes inventores compararam os efeitos de dois tipos de Cas tendo mutante tendo atividade de nickase de clivar diferentes filamentos e registraram que os sítios mutados coletados próximos ao centro da sequência de nucleotídeos alvo em um destes e várias mutações foram aleatoriamente introduzidas na região de várias centenas de bases da sequência de nucleotídeos alvo do outro, e deste modo, efeitos similares também podem ser esperados na presente invenção. Além disso, selecionando-se um filamento a ser clivado pela nickase, uma mutação pode ser introduzida em um nucleotídeo particular ou região de nucleotídeo em uma localização exata, ou várias mutações podem ser aleatoriamente introduzidas em uma faixa amplamente comparativa, que pode ser apropriadamente adotada de acordo com o objetivo. Por exemplo, quando a técnica anterior é aplicado à célula de iPS de doença genética, um agente para a terapia de transplante de célula com um risco reduzido de rejeição reparando-se a mutação do gene patogênico nas células de iPS preparadas a partir das próprias células dos pacientes e depois as diferenciando nas células somáticas desejadas, pode ser produzido.
[00128] No AID alvo, os presentes inventores também confirmaram usar uma levedura de enxerto que quando os módulos que reconhecem a sequência são produzidos correspondendo à sequência de nucleotídeos alvo múltipla adjacente, e simultaneamente usados, a eficácia da introdução da
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44/59 mutação aumenta mais drasticamente do que usando uma sequência de nucleotídeos única como um alvo, e os efeitos similares também podem ser esperados na presente invenção. Quando o DNA alvo é um DNA de filamento duplo, este pode ocorrer quando as sequências de nucleotídeos alvos estão na mesma direção (isto é, os filamentos alvejados estão no mesmo filamento), e quando estes são opostos (isto é, ambos os filamentos de DNA de filamento duplo são filamentos alvejados).
[00129] Além disso, a modificação das regiões de DNA múltiplos em posições completamente diferentes como alvos também pode ser realizada. Portanto, em uma modalidade preferível da presente invenção, dois ou mais tipos de módulos que reconhecem a sequência de ácidos nucléicos que especificamente ligam às diferentes sequências de nucleotídeo alvo (que, quando o DNA alvo é DNA endógeno celular, pode estar presente em um gene objeto, ou dois ou mais diferentes genes objetos) podem ser usados. Neste caso, cada um destes módulos que reconhecem as sequências de ácidos nucléicos e um módulo que liga a enzima modificadora de DNA formam um complexo. Aqui, um módulo comum que liga à enzima modificadora de DNA pode ser usado. Por exemplo, quando o sistema de CRISPR-Cas é usado como um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos, um complexo comum de proteína efetora de Cas e módulo que liga a enzima modificadora de DNA (incluindo a proteína de fusão) é usado, e dois ou mais RNAs guias contendo dois ou mais crRNAs que respectivamente formam um filamento complementar com uma sequência de nucleotídeos alvo diferente são produzidos e podem ser usados como RNA guia. Por outro lado, quando o motivo de dedo de zinco, o efetor TAL e semelhantes são usados como módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos, por exemplo, um módulo que liga a enzima modificadora de DNA pode ser fundido com um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos que especificamente liga a um nucleotídeo alvo diferente.
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45/59 [00130] Para expressar o complexo da presente invenção em uma célula hospedeira, como mencionado acima, um vetor de expressão contendo um DNA que codifica um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos e um DNA que codifica um módulo que liga a enzima modificadora de DNA (ambos os DNAs podem estar em vetores separados ou em um vetor único) ou RNAs que codificam os respectivos módulos são introduzidos em uma célula hospedeira. Para a introdução eficaz da mutação, é desejável manter uma expressão do complexo da presente invenção em um dado nível ou acima por não menos do que um dado período. A partir de tal aspecto, é garantido introduzir um vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo, etc.) autonomamente replicável em uma célula hospedeira. Contudo, visto que o plasmídeo etc. são DNAs estranhos, estes são, de modo preferível, removidos rapidamente após a introdução de sucesso da mutação. Portanto, embora sujeito à mudança dependendo do tipo da célula hospedeira e semelhantes, por exemplo, o plasmídeo introduzido é desejavelmente removido da célula hospedeira após um lapso de 6 horas a 2 dias a partir da introdução de um vetor de expressão usando-se vários métodos de remoção de plasmídeos bem conhecidos na técnica.
[00131] Os exemplos dos meios para remover o DNA externo incorporado no DNA hospedeiro genômico incluem um método usando um sistema de Cre-loxP, um método usando transposon e semelhantes.
[00132] Altemativamente, contanto que a expressão do complexo da presente invenção, que é suficiente para a introdução da mutação, seja obtida, é preferível introduzir a mutação no DNA objeto através da expressão transitória usando-se um vetor de expressão ou RNA sem capacidade de replicação autônoma em uma célula hospedeira (por exemplo, vetor etc. Sem a origem da replicação que funciona dentro da célula hospedeira e/ou gene que codifica a proteína necessária para a replicação).
[00133] Altemativamente, a edição do DNA hospedeiro pode ser
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46/59 realizada eficazmente enquanto evitando o risco de ação fora do alvo causando-se uma reação de modificação de DNA em um estágio desejado, e expressando transitoriamente o complexo da presente invenção em uma célula hospedeira por um período necessário para fixar a alteração do sítio alvejado. Durante um período necessário para a reação de modificação de DNA, a fixação da alteração do sítio alvejado pode ser apropriadamente determinada similarmente ao período acima mencionado para estimular as células com uma enzima modificadora do indutor de DNA. O período de indução da expressão de um ácido nucléico que codifica o complexo da presente invenção pode ser estendido além do período acima mencionado contanto que a célula hospedeira seja isenta de efeitos colaterais não preferíveis.
[00134] Como um meio para expressar transitoriamente o complexo da presente invenção em um estágio desejado por um período desejado, um método incluindo produzir um construto (vetor de expressão) contendo um DNA que codifica o complexo [isto é, DNA que codifica o módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos (DNA que codifica um RNA e DNA guia que codifica um Cas mutante no sistema de CRISPR-Cas), e o DNA que codifica o módulo que liga a enzima modificadora de DNA (no sistema de CRISPR-Cas, um DNA que codifica um módulo que liga a enzima modificadora de DNA pode ser ligado a um DNA que codifica um Cas mutante ou um DNA que codifica um RNA guia, respectivamente, dependendo de o módulo é uma proteína ou RNA)] em uma forma que permite o controle do período de expressão do complexo e introduzindo o mesmo dentro da célula hospedeira podem ser mencionados. A “forma capaz de controlar o período de expressão” é especificamente, por exemplo, um DNA que codifica o complexo da presente invenção colocado sob a regulação de uma região reguladora indutível. Enquanto a “região reguladora indutível” não é particularmente limitada, esta é, por exemplo, um operon de um repressor de mutação sensível à temperatura (ts) e um operador regulado deste
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47/59 modo nas células microbianas, tal como bactéria (por exemplo, Escherichia coli), levedura e semelhantes. Os exemplos do repressor de mutação ts incluem, mas não são limitados a mutação ts do repressor de cl derivado de Xfago. No caso repressor de cl derivado de Xfago (ts), este é ligado a um operador para inibir a expressão do gene à jusante em não mais do que 30°C (por exemplo, 28°C). Em uma alta temperatura de não menos do que 37°C (por exemplo, 42°C), este é dissociado do operador para permitir a indução da expressão genética. Portanto, o período quando a expressão do gene alvo é inibido pode ser minimizado cultivando-se uma célula hospedeira introduzida com um DNA que codifica o complexo da presente invenção, geralmente em não mais do que 30°C, elevando a temperatura a não menos do que 37°C em um estágio apropriado, realizando a cultura por um dado período para causar a expressão do complexo da presente invenção e uma reação de modificação de DNA através de uma enzima modificadora de DNA endógeno celular recriada pelo complexo e, após a introdução da mutação no gene alvo, rapidamente diminuindo a temperatura a não mais do que 30°C. Deste modo, mesmo quando um gene essencial para a célula hospedeira é alvejado, este pode ser eficazmente editado enquanto inibindo os efeitos colaterais.
[00135] Quando a mutação sensível à temperatura é utilizada, por exemplo, uma mutante sensível à temperatura de uma proteína necessária para a replicação autônoma de um vetor é montada em um vetor contendo um DNA que codifica o complexo da presente invenção. Como um resultado, a replicação autônoma não pode ocorrer rapidamente após a expressão do complexo, e o vetor naturalmente cai com a divisão célula. Os exemplos de tais proteínas mutantes sensíveis à temperatura incluem, mas não são limitados a uma variante sensível à temperatura de ReplOl ori necessária para a replicação de pSClOl ori. A não mais do que 30°C (por exemplo, 28°C), ReplOl ori (ts) age em pSClOl ori para permitir a replicação autônoma do plasmídeo. A não menos do que 37°C (por exemplo, 42°C), pSClOl ori perde
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48/59 sua função e o plasmídeo não pode replicar autonomamente. Portanto, um uso combinado com o repressor de cl (ts) do Xfago acima mencionado simultaneamente permite a expressão transiente do complexo da presente invenção, e a remoção do plasmídeo.
[0078] Quando uma célula eucariótica superior, tal como uma célula animal, célula de inseto, célula vegetal ou semelhantes é uma célula hospedeira, um DNA que codifica o complexo da presente invenção é introduzido dentro da célula hospedeira sob o controle de um promotor de indução (por exemplo, promotor de metalotioneina (induzido por íon de metal pesado), promotor de proteína por choque de calor (induzido pelo choque de calor), sistema promotor de Tet-ON/Tet-OFF (induzido pela adição ou remoção da tetraciclina ou um derivado da mesma), promotor responsivo a esteroides (induzido pelo hormônio esteroide ou um derivado do mesmo) etc.), uma substância de indução é adicionada ao (ou removida do) meio em um tempo apropriado para induzir a expressão do complexo, as células são cultivadas por um certo período para causar uma reação de modificação de DNA através da enzima modificadora de DNA endógeno celular recrutada ao complexo, e a substância de indução acima mencionada é removida do meio após a mutação ser introduzida no gene alvo, por meio do qual uma expressão transitória do complexo da presente invenção pode ser realizada.
[00136] Um promotor de indução pode ser utilizado nas células procarióticas tais como Escherichia coli e semelhantes. Os exemplos de tal promotor de indução incluem, mas não são limitados ao promotor de lac (induzido por IPTG), promotor de cspA (induzido por choque frio), promotor de araBAD (induzido por arabinose) e semelhantes.
[00137] Altemativamente, o promotor de indução acima mencionado também pode ser utilizado como um mecanismo de remoção do vetor quando uma célula eucariótica superior tal como uma célula animal, célula de inseto, célula vegetal ou semelhantes é a uma célula hospedeira. Isto é, um vetor é
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49/59 carregado com uma origem de replicação que funciona dentro da célula hospedeira e um ácido nucléico que codifica uma proteína necessária para a replicação (por exemplo, SV40 ori e antígeno T grande, oriP e EBNA-1 e semelhantes para as células animais) e a expressão do ácido nucléico que codifica a proteína é controlada pelo promotor de indução acima mencionado. O vetor é autonomamente replicável na presença da substância de indução, mas não pode replicar autonomamente quando a substância de indução é removida, e o vetor cai espontaneamente junto com a divisão celular (o vetor Tet-OFF não pode replicar autonomamente quando a tetraciclina ou doxiciclina é adicionada).
[00138] De acordo com os estudos conduzidos pelos presentes inventores, uma vez que a expressão e a atividade de uma enzima modificadora de DNA endógeno celular é suficientemente aumentada usando uma enzima modificadora do indutor de DNA, o DNA alvo pode ser modificado em alguns casos sem usar um módulo que liga a enzima modificadora de DNA, mas usando apenas um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos. Enquanto não desejando estar ligado por qualquer teoria, um mecanismo possível é que uma enzima modificadora de DNA presente em uma quantidade suficiente mais frequentemente comunica a distorção da estrutura de hélice dupla no sítio alvo seja causada pela ligação do módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos, age no sítio alvo e altera o DNA alvo.
[00139] Portanto, em uma outra modalidade da presente invenção, um método para alterar um sítio alvejado de um DNA em uma célula, compreendendo uma etapa de estimular a célula com um fator induzindo uma enzima modificadora de DNA endógeno para a célula, e trazendo um módulo que reconhece a sequência de ácidos nucléicos a ligar-se especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo em um dado DNA de filamento duplo em contato com o DNA de filamento duplo para converter um ou mais
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50/59 nucleotídeos no sítio alvejado a outros um ou mais nucleotídeos ou excluir um ou mais nucleotídeos, ou inserir um ou mais nucleotídeos no dito sítio alvejado é provido.
[00140] A presente invenção é explicada no seguinte referindo se aos Exemplos, que não devem ser interpretados como limitantes.
[Exemplos]
1. Construção do Vetor
1-1. Vetor de expressão Cas9, nCas9, nCas9-dVif, dVif-nCas9 ou nCas9PmCDAl [00141] O esboço do vetor de plasmídeo para a edição de DNA usado nos Exemplos é mostrado na Fig. 1. Usando o vetor pNeo como uma base, um vetor plasmídeo para o transgene do gene foi construído através da transfecção nas células derivadas do rim fetal humano (células HEK293T). Como o vetor plasmídeo, 1907c (Cas9), 1907n (nCas9-PmCDAl), 1907ncugi (nCas9-PmCDAl-UGI), 1921 (nCas9), 1923 (nCas9-dVif), 1924 (dVifnCas9) alvejando Exonó do gene de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT) foram usados e pNeo foi usado como um controle. 1907c (Cas9), 1907n (nCas9-PmCDAl), 1907n-cugi (nCas9-PmCDAl-UGI) e 1921 (nCas9) foram construídos com base no vetor usado no documento não patentário 3 e mudando-se a sequência alvo do RNA guia para a sequência do 24° ao 43° (aatgcagactttgctttcct: SEQ ID NO: 12) (sítio 3) do ponto de início do éxon 6 do gene de HPRT. Como um DNA que codifica nCas9 (D10A), um DNA consistindo na sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 4 foi usado. 1923 (nCas9-dVif) e 1924 (dVif-nCas9) foram produzidos como segue. Primeiro, o vetor 1922 (SEQ ID NO: 13) foi construído pela adição de um sítio de enzima de restrição ao e remoção da sequência desnecessária de 1921 (nCas9). Como para o fragmento de dVif do HIV, referência foi feita ao GenBank: AF200477.1 que é uma sequência de Vif do banco de dados. De 28 a 576 bases de ORF da sequência acima mencionada, as bases de 433° a 435°
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51/59 (CTA) foram alteradas para GCT para sintetizar um gene artificial introduzido com a mutação de L145A (a sequência de bases é mostrada na SEQ ID NO: 1, a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 2. Uma sequência de bases em que o sítio de reconhecimento de Avrll foi adicionado ao lado 5’ e o sítio de reconhecimento Nhel foi adicionado ao lado 3 ’ é mostrada na SEQ ID NO: 3), e o gene artificial foi inserido em 1922 através da divagem e ligação da enzima de restrição para produzir 1923 (nCas9-dVif) e 1924 (dVif-nCas9). A Fig. 2 mostra um desenho esquemático dos vetores 1923 (nCas9-dVif) e 1924 (dVif-nCas9) produzidos.
[00142] Os vetores acima mencionados foram introduzidos nas células HEK293T e expressados nas células para formar um complexo de crRNAtracrRNA, e Cas9, nCas9, nCas9-dVif, dVif-nCas9 ou nCas9-PmCDAl.
1-2. Vetores de expressão de UGI-nCas9-dVif, dVif-nCas9-UGI, ΤορΒν2(ΤοροΙΙβ isoforma 2)-nCas9, nCas9-IQGAP2466-547-ZNF3 3 5 745-893 ou nCas9-PmCDAl-UGI [00143] Se referindo ao procedimento de 1-1., o vetor 1923-2 (UGInCas9-dVif: SEQ ID NO: 28), vetor 1924-2 (dVif-nCas9-UGI: SEQ ID NO: 29), vetor 1931 (TopBv2452-59i-nCas9: SEQ ID NO: 30) e vetor 1932 (nCas9IQGAP2466-547-ZNF335745-893: SEQ ID NO: 31) foram produzidos, cada um alvejando uma região particular do gene de HPRT (sequência alvo (sítio 1): tcgagatgtgatgaaggaga; SEQ ID NO: 27). Além disso, o vetor 1907 (nCas9PmCDAl-UGI: SEQ ID NO: 32) foi produzido para o teste comparativo. As sequências de bases que codificam os fragmentos de TopBv2, IQGAP2 e ZNF335 foram projetados por referência para as sequências de referência No: NM_001068, NM_006633 e NM_022095, cada uma das quais sendo uma sequência do banco de dados. A Fig. 3 mostra um desenho esquemático dos vetores 1923-2, 1924-2, 1931 e 1932 produzidos. A sequência de bases que codifica UGI e a sequência de aminoácidos de UGI são respectivamente mostradas na SEQ ID NO: 19 e 20, a sequência de bases que codifica
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TopBv2452-59i e a sequência de aminoácidos de TopBv2452-59i são respectivamente mostradas na SEQ ID NO: 21 e 22, a sequência de bases que codifica IQGAP2466-547 e a sequência de aminoácidos de IQGAP2466-547 são respectivamente mostradas na SEQ ID NO: 23 e 24, e a sequência de bases que codifica ZNF3 3 5745-893 e a sequência de aminoácidos de ZNF335745-893 são respectivamente mostradas nas SEQ ID NOs: 25 e 26.
2. Linhagem celular, cultura, transformação, indução da expressão
2-1. Introdução do sistema de vetor de 1-1 [00144] O experimento usando o vetor do 1-1 acima mencionado foi realizado através do seguinte procedimento. As células derivadas do rim fetal humano (células HEK293T) foram usadas. As células foram cultivadas em um meio de DME-glutamax (Thermo Fisher Scientific, EUA) adicionadas com 100 pg/ml de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e 10% de soro bovino fetal (FBS) (Biosera, Nuaille, França) sob 37°C, condições de CO2 a 5%. As células foram recuperadas usando 5% de tripsina.
[00145] As células HEK293T conservadas em um congelador profundo foram dissolvidas em um banho de água a 37°C e semeadas em um frasco de 75 T a 5xl06 células. Após cultivar por de 1 a 3 dias, as células foram recuperadas e semeadas em cada poço de uma placa de 24 poços a 0,5 x 105 células/poço. Após cultivar por 1 a 3 dias, cerca de 1 pg de cada um dos DNAs de plasmídeos acima mencionados foi transfectado em 60 a 80% de células confluentes em cada poço usando-se 3 μΐ de Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Carlsbad, EUA). Após 5 horas de transfecção, o meio foi substituído com aquele contendo G418 (0,125 mg/mL) (InvivoGen, EUA) e interferon a (IFNa) (2000 IU) (Takara Bio) ou interferon γ (2000 IU) (PeproTech, Inc.). Como um controle, um meio contendo G418 sozinho foi usado.
2-2. Sistema de introdução do vetor de 1-2
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53/59 [00146] O experimento usando o vetor do 1-2 acima mencionado foi realizado através do seguinte procedimento. As células (HEK293 ou HepG2) foram semeadas em cada poço de uma placa de 24 poços a IxlO5 células/poço e cultivadas durante a noite. Depois, a transfecção (DNA 1 pg/poço, FugeneHD 1,5 μΐ/poço) foi realizada usando FugeneHD (Promega) e o meio foi substituído 16 h mais tarde. No caso de HEK293, OPTI-MEM foi substituído com DMEM + 10% de FBS + P/S (penicilina-estreptomicina) + Puromicina (1 pg/ml) +/- IFNa (10000 U/ml). No caso de HepG2, OPTIMEM foi substituído com DMEM + 10% de FBS + P/S + 1% de NEAA (aminoácido não essencial) + Puromicina (1 pg/ml) +/- IFNa (10000 U/ml). A seleção por puromicina foi continuada por 6 dias. Neste caso, o meio foi substituído a cada 48 horas.
3. Análise de Sequência
3-1. Sistema de introdução do vetor de 1-1 [00147] O DNA genômico foi extraído pelo seguinte procedimento das células recuperadas do 2-1 mencionado acima e a sequência foi analisada. Para a análise de sequência, cada célula foi recuperada 3 dias após a cultura e o DNA genômico foi extraído. Usando o DNA genômico extraído como um modelo e precursor avançado (5’ATTCCAGAATATCTCCATGTAGATTTTGGT-3’: SEQ ID NO: 14) e precursor reverso (5’-AATTCCAGGAGGTCCAGATCTTCA-GGGCCC-3’: SEQ ID NO: 15) alvejando o Exon 6 do gene HPRT, a região alvo foi amplificada. Usando o fragmento de DNA amplificado como um modelo e o precursor avançado (5’TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATTCCAGAATATCTCCATGTAGATTTTGGT-3’: SEQ ID NO: 16) e precursor reverso (5’GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTAGGCAAGGAA GTGACTGTAATTATGAGC-3’: SEQ ID NO: 17), uma amplificação de
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54/59 fragmento de cerca de 300 pares de base adicionais com um adaptador para análise de NGS foi obtida. Uma sequência de índice foi adicionada a cada amostra e o sequenciamento profundo com terminação emparelhada foi realizada usando o Reagente MiSeq Kit v3 e o sistema de sequenciamento MiSeq (Illumina). CLC Genomics Workbench 7.0 (Filgen) foi usado para a análise, os resultados são mostrados na Tabela 1. Na Tabela, o índice mostra a inserção e exclusão e o número mostra uma taxa de substituição de nucleotídeo (%). Quando as células expressando um complexo de nCas9 e dVif foram cultivadas na presença do interferon, as inserções, deleções e/ou substituições de base ocorreram, e a substituição de base foi principalmente a substituição da citosina para timina. A razão da inserção, deleção e substituição de base foi do mesmo nível que aquele como no método convencional (Alvo-AID) usando desaminase exógena. Muitas substituições das bases são observadas no 19° T e 20° C da base de ácidos nucléicos na Tabela. Estas mutações são consideradas ser os erros de sequência porque a substituição é, frequentemente, muitas vezes também vista em pNeo.
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IFN+dVif dVif IFN Controle
Alvo-AID
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3-2. Sistema de introdução do vetor de 1-2 [00148] O DNA genômico foi extraído das células coletadas no 2,2 mencionado e a sequência foi analisada. As células HEK293 foram coletadas no dia 6, as células HepG2 foram coletadas após a recuperação da cultura por 48 horas, e o DNA genômico foi extraído usando NucleoSpin Tissue XS (Takara Bio Inc.). Io PCR (DNA polimerase: KOD FX NEO (Toyobo), conjunto de precursores: precursor avançado (5’-TTTGGTACTTGTTCAGCTTTATTCAAGTGG-3’: SEQ ID NO: 33); precursor reverso (5’-ACAATAGCTCTTCAGTCTGATAAAATCTAC-3’: SEQ ID NO: 34)) foi realizado, a banda foi confirmada por eletroforese, e o produto de PCR foi purificado usando Exo/Sap (Thermo Fisher Scientific) para prover um fragmento de amplificação de 1100 bp. Depois, usando o produto de PCR após a purificação como um modelo, o 2o PCR (DNA polimerase: KOD FX NEO, conjunto de precursores: precursor avançado (5’TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAGGACTGAACGTCTTG CTC-3’: SEQ ID NO: 35); precursor reverso (5’GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGTCATAGGAA TGGATCTATCAC-3’: SEQ ID NO: 36)) foi realizado, a banda foi confirmada por eletroforese, e o produto de PCR foi purificado usando Exo/Sap para prover um fragmento de amplificação de 220 bp. Além disso, usando o produto de PCR após a purificação como um modelo, o 3o PCR (Q5 DNA polimerase (New England Biolabs), conjunto de precursores: SEQ ID NO: 14 e 15) foi realizado, e o produto de PCR foi purificado usando AMPure XP (Beckman Coulter) para prover um fragmento de amplificação de cerca de 150 pares de base adicionado com um adaptador para a análise de NGS. A banda das amostras após a purificação usando AMPure XP foi confirmada por Multina (SHIMADZU Corporation). As amostras foram reunidas se referindo às bandas (concentrações) obtidas por Multina e a concentração das amostras foi medida usando Qubit (Thermo Fisher
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Scientific). As amostras foram diluídas até 10 nM e confirmadas por Qubit ser de 10 nM. As samples de 10 nM foram diluídas até 1 nM e as amostras de 1 nM foram alteradas. Portanto, as amostras foram diluídas até 1,5 pM. 4 nM de PhiX (Illumina) foi alterado e diluído até 1,5 pM. 500 μί da amostra (1,5 pM) e 100 μί de PhiX (1.5 pM) foram misturados e aplicados a um cartucho. Miniseq (Illumina) foi iniciado para realizar o sequenciamento. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Na Tabela, o indel mostra a inserção e deleção (indel não foi detectado na Tabela 2) e o número mostra a taxa de substituição (%) do nucleotídeo. Quando as células HEK293 feitas para expressar um complexo de UGI, nCas9 e dVif foram cultivadas na presença do interferon, a substituição de base da citosina para timina ocorreu. Similarmente, quando as células feitas para expressar um complexo de nCas9 e TopBv2 ou IQGAP2 e ZNF335 foram cultivados na presença de interferon, a substituição de base da citosina para timina ocorreu. Além disso, quando as células de HepG2 feitas para expressar um complexo de UGI, nCas9 e dVif foram cultivados na presença do interferon, substituição de base da citosina para timina ocorreu. Quando as células HepG2 foram usadas, a taxa da substituição de base foi do mesmo nível que o método convencional usando a desaminase exógrena (Alvo-AID).
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58/59 [Tabela 2]
Céhih HEK293 Sítio 1 de HPRT
1923-2 : UGI-nQas9-Vff
3 i | so | M) | í-7 | l.S | 1« | 14 | 12 | 32 | 11 | W | ?! | s | 7 | 0 | ft | 4 | s | .2 | .....PAM..... | ||||
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Célda HepG2 Sífo 1 de HPRT
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[00149] Este pedido tem base em um Pedido de Patente No. 2017Petição 870190104554, de 16/10/2019, pág. 65/73
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056727 depositado no Japão (data de depósito: 22 de março de 2017), conteúdos os quais são aqui completamente incorporados.
[Aplicabilidade Industrial] [00150] De acordo com a presente invenção, a edição do DNA que é segura devido ao não uso de uma enzima exógena em uma reação de alteração do DNA e melhorada na eficácia de liberação através da miniaturização de um construto usado para a edição do DNA se tornou possível, e a presente invenção é extremamente útil.
Claims (19)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para alterar um sítio alvejado de um DNA em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de estimular a célula com um fator que induz uma enzima modificadora de DNA endógeno para a célula, e levando um complexo de um módulo que reconhece sequência de ácido nucléico a ligar-se especificamente a uma sequência de nucleotídeo alvo em um dado DNA e um módulo que liga enzima modificadora de DNA ligados entre si em contato com o DNA para converter um ou mais nucleotídeos no sítio alvejado para outro um ou mais nucleotídeos ou deletar um ou mais nucleotídeos, ou inserir um ou mais nucleotídeos dentro do dito sítio alvejado.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito sítio alvejado é alterado sem clivar pelo menos um dos filamentos do dito DNA.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito módulo que reconhece sequência de ácido nucléico é selecionado a partir do grupo consistindo em um sistema CRISPR-Cas em que pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA de Cas é inativada, um motivo de dedo de zinco, um efetor TAL e um motivo PPR.
- 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a3, caracterizado pelo fato de que o dito módulo que reconhece sequência de ácido nucléico é um sistema CRISPR-Cas em que pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA de Cas é inativada.
- 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a4, caracterizado pelo fato de que o dito módulo que liga enzima modificadora de DNA é selecionado a partir do grupo consistindo em um anticorpo contra a enzima modificadora de DNA, um aptâmero peptídico contra a enzima modificadora de DNA e um aptâmero de ácido nucléico contra a enzima modificadora de DNA.Petição 870190104554, de 16/10/2019, pág. 67/732/3
- 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito módulo que liga enzima modificadora de DNA é pelo menos um tipo selecionado a partir do grupo consistindo em Vif, proteína Bet, ΤοροΙΙβ, IQGAP2 e ZNF335 e fragmentos das mesmas.
- 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma enzima alvo do dito módulo que liga enzima modificadora de DNA é desaminase.
- 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita desaminase é uma proteína pertencente à família APOBEC.
- 9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o complexo do módulo que reconhece sequência de ácido nucléico ligada ao módulo que liga enzima modificadora de DNA compreende adicionalmente um inibidor do reparo da excisão de base ligado ao mesmo.
- 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o dito fator que induz a enzima modificadora de DNA inclui um ou mais selecionados a partir do grupo consistindo em interferon, um inibidor da ácido succínico desidrogenase e condição hipóxica.
- 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito DNA e o dito complexo são contatados pela introdução de um ácido nucléico codificando o complexo dentro da dita célula e cultivando a célula para causar a expressão do complexo na célula.
- 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 all, caracterizado pelo fato de que a célula é estimulada pelo fator que induz a enzima modificadora de DNA pela incubação da célula na presença do fator.
- 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1Petição 870190104554, de 16/10/2019, pág. 68/733/3 a 12, caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula de vertebrado.
- 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a dita célula de vertebrado é uma célula de mamífero.
- 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito DNA é um DNA de filamento duplo.
- 16. Complexo, caracterizado pelo fato de ser um módulo que reconhece a sequência de ácido nucléico a ligar-se especificamente a uma sequência de nucleotídeo alvo em um DNA e um módulo que liga enzima modificadora de DNA ligados entre si, em que o módulo que reconhece sequência de ácido nucléico é um sistema CRISPR-Cas em que pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA de Cas é inativada, em que o complexo converte um ou mais nucleotídeos no sítio alvejado a outro um ou mais nucleotídeos ou deleta um ou mais nucleotídeos, ou insere um ou mais nucleotídeos dentro do dito sítio alvejado.
- 17. Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que codifica o complexo como definido na reivindicação 16.
- 18. Agente para alterar um sítio alvejado de um DNA, caracterizado pelo fato de que compreende o complexo como definido na reivindicação 16 ou o ácido nucléico como definido na reivindicação 17.
- 19. Método para alterar um sítio alvejado de um DNA de filamento duplo em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de estimular a célula com um fator que induz uma enzima modificadora de DNA endógeno para a célula, e levando um módulo que reconhece sequência de ácido nucléico a ligar-se especificamente a uma sequência de nucleotídeo alvo em um dado DNA de filamento duplo em contato com o DNA de filamento duplo para converter um ou mais nucleotídeos no sítio alvejado para outro um ou mais nucleotídeos ou deletar um ou mais nucleotídeos, ou inserir um ou mais nucleotídeos dentro do dito sítio alvejado.
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