JPWO2018174097A1 - 細胞内在性のｄｎａ修飾酵素を利用して標的化したｄｎａの核酸塩基を特異的に変換する、細胞の核酸配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体 - Google Patents

細胞内在性のｄｎａ修飾酵素を利用して標的化したｄｎａの核酸塩基を特異的に変換する、細胞の核酸配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体 Download PDF

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Abstract

本発明は、細胞の有するDNAの標的化された部位を改変する方法であって、該細胞に内在するDNA修飾酵素を誘導する因子で該細胞を刺激すること、及び選択されたDNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体を、該DNAと接触させることにより、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法を提供する。

Description

本発明は、外因性のDNA修飾酵素及びそれをコードする核酸の細胞内への導入を行わずに、細胞内の標的DNAの特定領域内の核酸塩基の改変を可能とする、核酸配列の改変方法及びそれに用いる核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとの複合体に関する。
近年、様々な生物種において目的の遺伝子・ゲノム領域を改変する技術として、ゲノム編集が注目されている。従来、ゲノム編集の手法としては、配列非依存的なDNA切断能を有する分子と配列認識能を有する分子とを組み合わせた人工ヌクレアーゼを利用する方法が提案されている（非特許文献１）。
例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメインと非特異的なDNA切断ドメインとを連結した、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用い、宿主の植物細胞又は昆虫細胞にDNA中の標的遺伝子座において組換えを行う方法（特許文献１）、植物病原菌キサントモナス属が有するDNA結合モジュールである転写活性化因子様（TAL）エフェクターと、DNAエンドヌクレアーゼとを連結したTALENを用いて、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断・修飾する方法（特許文献２）、あるいは、真正細菌や古細菌が持つ獲得免疫システムで機能するDNA配列CRISPR（Clustered Regularly interspaced short palindromic repeats）と、CRISPRとともに重要な働きを持つヌクレアーゼCas（CRISPR-associated）タンパク質ファミリーとを組み合わせたCRISPR-Cas9システムを利用する方法（特許文献３）などが報告されている。また最近、CRISPR-Casシステムの新たなエンドヌクレアーゼとしてCpf1が報告された（非特許文献２）。さらには、35個のアミノ酸からなり1個の核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されたPPRタンパク質と、ヌクレアーゼとを連結した人工ヌクレアーゼを用い、該特定配列の近傍で標的遺伝子を切断する方法（特許文献４）も報告されている。
さらに、最近、本発明者らは、脱アミノ化反応を触媒するデアミナーゼを用い、これとDNA配列認識能のある分子とを連結させた複合体を宿主細胞に導入することにより、酵母や大腸菌を含む種々の生物種において、DSBを伴うことなく、特定のDNA配列を含む領域における核酸塩基変換によるゲノム配列の改変に成功したことを報告している（特許文献５、非特許文献３）。
特許第4968498号公報 特表2013-513389号公報 特表2010-519929号公報 特開2013-128413号公報 国際公開第2015/133554号
Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641 Bernd Zetsche et al. (2015) Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Cell 163: 759-771 Nishida Keiji et al. (2016) Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems, Science 6: 353(6305)
しかしながら、これまで提案されてきた上記ゲノム編集技術は、外因性のDNA修飾酵素を細胞に導入することを前提としているが、該DNA修飾酵素を用いることに起因する、細胞毒性などの副作用や、該DNA修飾酵素の細胞内や標的DNA部位へのデリバリーの課題がある。従って、本発明の目的は、細胞内在性のDNA修飾酵素を利用することで安全性を高め、またデリバリーの制約を回避することができる、新規なDNA編集、特にゲノム編集の手法、並びにそのための核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとの複合体を提供することである。
本発明者らは、目的のDNA配列を標的化する核酸配列認識モジュールに、細胞内在性のDNA修飾酵素と結合する機能を持たせた複合体を作製して、細胞内に導入し、その細胞を該DNA修飾酵素を誘導する因子の存在下で培養した。その結果、外因性のDNA修飾酵素を用いることなく、目的遺伝子の標的ヌクレオチド配列及びその近傍に変異を導入することに成功した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］細胞の有するDNAの標的化された部位を改変する方法であって、該細胞に内在するDNA修飾酵素を誘導する因子で該細胞を刺激すること、及び選択されたDNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体を、該DNAと接触させることにより、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法。
［２］前記標的化された部位の改変が、前記DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく行われる、［１］記載の方法。
［３］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記DNA修飾酵素結合モジュールが、DNA修飾酵素に対する抗体、ペプチドアプタマー及び核酸アプタマーからなる群より選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記DNA修飾酵素結合モジュールが、Vif、Betタンパク質、TopoIIβ、IQGAP2及びZNF335並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［７］前記DNA修飾酵素結合モジュールの標的酵素がデアミナーゼである、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記デアミナーゼがAPOBECファミリーに属するタンパク質である、［７］記載の方法。
［９］核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体が、さらに塩基除去修復のインヒビターを結合したものである、［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］前記DNA修飾酵素を誘導する因子がインターフェロン、コハク酸デヒドロゲナーゼ阻害剤及び低酸素条件からなる群より選択される１以上である、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記DNAと前記複合体との接触が、前記細胞に該複合体をコードする核酸を導入し、該細胞を培養して該複合体を細胞内で発現させることにより行われる、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］DNA修飾酵素を誘導する因子で細胞を刺激することが、該細胞を該因子の存在下でインキュベートすることにより行われる、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］前記細胞が脊椎動物細胞である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記脊椎動物細胞が哺乳類動物細胞である、［１３］記載の方法。
［１５］前記DNAが二本鎖DNAである、［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体であって、該核酸配列認識モジュールは、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムであり、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換し又は欠失させ、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、複合体。
［１７］［１６］記載の複合体をコードする核酸。
［１８］［１６］記載の複合体又は［１７］記載の核酸を含有してなる、DNAの標的化された部位の改変剤。
［１９］細胞の有する二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、該細胞に内在するDNA修飾酵素を誘導する因子で該細胞を刺激すること、及び選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールを、該二本鎖DNAと接触させることにより、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法。
本発明のDNA編集によれば、DNAの修飾反応に外来因子を用いないため、副作用リスクが低減される。また、DNA編集に用いるコンストラクトを小型化することができ、デリバリー効率の向上が可能となる。さらに、細胞に内在するDNA修飾酵素を利用することにより、一過的作用による活性の調節が可能となり、オフターゲット作用のリスクを低減することが可能となる。
図１は、実施例で用いた本発明のDNAの標的化部位の改変方法のメカニズムの模式図を示す。図１中、IFNはインターフェロン（抗ウイルス因子として特定の防御遺伝子発現を誘導する因子である）を、IFN 誘導型の内在性デアミナーゼはIFNにより発現誘導される抗ウイルス性のデアミナーゼ群（Apobec等）を、dVif(Vifの変異体)は内在性デアミナーゼと結合するアダプタータンパク質を示す。 図２は、実施例で用いたDNA編集用プラスミドの模式図を示す。 図３は、実施例で用いたDNA編集用プラスミドの模式図を示す。
本発明は、細胞に内在する（本明細書中、「細胞内在性の」ともいう）DNA修飾酵素を利用することで、該細胞内のDNA中の標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換等し、該DNAの該標的化された部位を改変する方法（以下、「本発明の方法」ともいう）を提供する。ここで「細胞に内在する」、「細胞内在性の」とは、その細胞が生来的に有することを意味する。
本発明の方法は、細胞内在性のDNA修飾酵素を誘導する因子（以下、「DNA修飾酵素誘導因子」ともいう）で該細胞を刺激すること、及び該DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体（以下、「本発明の複合体」ともいう）を、該細胞内で該DNAと接触させることにより、該標的化された部位、即ち、標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを、他のヌクレオチドに変換等する工程を含むことを特徴とする。
本発明において、DNAの「改変」とは、DNA鎖上のあるヌクレオチド（例えば、dC）が、他のヌクレオチド（例えば、dT、dA、dG又はdU）に変換されるか、欠失すること、あるいはDNA鎖上のあるヌクレオチド間にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入されることを意味する。ここで、改変されるDNAは、細胞が有する（即ち、細胞内に存在する）DNAであれば特に制限されず、細胞内在性のDNA（例えば、染色体DNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA；以下、これらを包括して「ゲノムDNA」ともいう）であってもよく、あるいは外来のDNA（例えば、細胞に感染したウイルス由来のDNA）であってもよい。また、前記DNAは一本鎖DNA、二本鎖DNAのどちらでもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。二本鎖DNAとしては、好ましくはゲノムDNAが挙げられる。また、DNAの「標的化された部位」とは、核酸配列認識モジュールが特異的に認識して結合する「標的ヌクレオチド配列」の全部もしくは一部、又はそれと該標的ヌクレオチド配列の近傍（5’上流及び3’下流のいずれか一方又は両方）を意味する。また、「標的ヌクレオチド配列」とは、DNA中の核酸配列認識モジュールが結合する配列を意味する。
本発明において「DNA修飾酵素」とは、DNAを修飾し得る細胞内在性の酵素を意味し、該修飾により、直接的又は間接的にDNAの改変が生じる。このようなDNAの修飾反応としては、DNAの一本鎖又は二本鎖を切断する反応（以下、「DNA鎖切断反応」ともいう）や、DNA鎖の切断を直接伴わない反応である、核酸塩基のプリン又はピリミジン環上の置換基を他の基又は原子に変換する反応（以下、「核酸塩基変換反応」ともいう）（例：塩基の脱アミノ化反応）、DNAのN-グリコシド結合を加水分解する反応（以下、「脱塩基反応」ともいう）などが挙げられる。
本発明において「DNA修飾酵素誘導因子」とは、直接的もしくは間接的に細胞内在性のDNA修飾酵素の発現を上昇させ得る分子、及び／又は該DNA修飾酵素を活性化し得る因子（分子の他、酸素濃度、光、紫外線、温度、酸、アルカリ等の物理化学的刺激等を含む）を意味する。このような機能を有する限り、本発明の方法に用いられるDNA修飾酵素誘導因子に特に制限はなく、例えば、タンパク質（ペプチドを含む、以下同様。）（例：転写因子、インターフェロン（IFN）、インターロイキン、マイトジェン(Mitogen)等）、低分子化合物などが挙げられる。DNA修飾酵素誘導因子は、市販のものを用いてもよく、周知の方法により作製したものを用いてもよい。
インターフェロン（IFN）とは、動物体内で病原体（特にウイルス）や腫瘍細胞などの異物の侵入に反応して細胞が分泌するタンパク質であり、細胞をIFNで刺激することにより、抗ウイルスタンパク質（例：APOBEC (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like)ファミリーに属するタンパク質等）の発現が誘導される。本発明に用いるインターフェロンとしては、特に限定されないが、I型インターフェロン（例：IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-κ）、II型インターフェロン（例：IFN-γ）、III型インターフェロン（例：IFN-λ）などが挙げられ、特にI型インターフェロンが好ましく、中でもIFN-α及びIFN-βが好ましい。インターフェロンは、天然型であっても遺伝子組換え型であってもよく、ポリエチレングリコール（ペグ）などの高分子体を結合させたペグ化インターフェロンであってもよい。インターフェロンを用いる場合には、宿主細胞とインターフェロンの由来となる生物は、同一であることが好ましい（例えば、ヒト細胞を用いる場合には、ヒトインターフェロンを用いることが好ましい）。また、IFNの産生を誘導する因子を用いてもよい。かかる因子としては、ウイルスなどの（疑似的）感染、ワクチン、外来のDNAやRNA、二本鎖RNAアナログ（double stranded RNA analog）［poly(I:C)］（例えば、Trapp S1, et al., (2009) J. Virol, 83(2):884-895）、インターフェロン遺伝子の刺激因子（stimulator）、TANK結合キナーゼ1（TANK-binding kinase 1）などが挙げられる。
本発明に用いるインターロイキンとしては、例えば、APOBECファミリーに属するタンパク質（以下「APOBEC」と略記する。）（特に、APOBEC3ファミリーに属するタンパク質（以下「APOBEC3」と略記する。））を誘導し得る、即ち、該タンパク質の発現及び／又は活性を上昇させ得ることが知られているIL-2、IL-7，IL-15，IL-27などが挙げられる。
本発明に用いるマイトジェンとしては、例えば、APOBEC（特に、APOBEC3）を誘導し得ることが知られているホルボールエステル（例：ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィトヘマグルチニン(PHA)等）（例えば、Stopak S. Kim, et al., (2007) J. Biol Chem., 282(6): 3539-3546；Rose KM1, et al., (2004) J. Biol Chem., 279(40):41744-41749）などが挙げられる。
本発明に用いる低分子化合物としては、例えば、APOBEC（特に、APOBEC3）を誘導し得ることが知られている、特開2011-231053号公報に記載の化合物や、国際公開第2016-164889号公報に記載のコハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤（例：Atpenin A5、マロン酸塩、ジアゾキシド（DZX）、リンゴ酸塩及びオキサロ酢酸塩、3-ニトロプロピオン酸、ニトロキシル、カルボキシン、TTFA等）などが挙げられる。
DNA修飾酵素誘導因子は、これらに限定されず、当業者は、標的とするDNA修飾酵素の種類に応じて、公知のタンパク質や化合物、物理化学的刺激等を適宜用いることができる。DNA修飾酵素誘導因子は、１種類のみ用いてもよいし、２種類以上用いてもよい（例えば、インターフェロンとコハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤とを併用する、インターフェロンと低酸素条件とを併用する等）。
DNA修飾酵素誘導因子で細胞を刺激する方法としては、特に制限されないが、例えば、細胞をDNA修飾酵素誘導因子の存在下でインキュベートする方法が挙げられる。具体的には、細胞をインキュベートするための培地又は緩衝液中に、DNA修飾酵素誘導因子を添加したり、あるいは該因子が低酸素等の物理化学的刺激である場合には、当該刺激が存在する条件下で細胞をインキュベートすることにより行うことができる。あるいは、DNA修飾酵素誘導因子をコードする核酸（好ましくはDNA）を細胞内に導入し、該細胞内で該因子を発現させる方法も挙げられる。
DNA修飾酵素誘導因子での細胞の刺激を開始するタイミングにも特に制限はなく、例えば、細胞内の標的DNAと本発明の複合体との接触を、該細胞に該複合体をコードする核酸を導入することにより行う場合、該導入工程の前、後、及び同時のいずれであってもよい。本発明の方法は、DNA修飾酵素誘導因子で細胞を刺激する期間を調整することで、DNAの修飾反応が起こる期間を調整することができる。従って、DNAの修飾反応が起こり、標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間だけDNA修飾酵素誘導因子で細胞を刺激することにより、宿主ゲノムにおけるオフターゲット作用のリスクを回避しつつ、標的配列の編集を効率よく実現することができる。細胞を刺激する期間の調整の容易性の観点から、該細胞をDNA修飾酵素誘導因子の存在下でインキュベートする方法（例えば、DNA修飾酵素誘導因子がタンパク質や低分子化合物等の場合は、培地又は緩衝液中に該因子を添加する方法）が好ましい。培地又は緩衝液中に添加する期間は、宿主細胞の種類やインキュベーション条件、標的とするDNA修飾酵素の種類等によっても異なるが、改変されるDNAが細胞内在性のDNAの場合には、通常少なくとも数世代の細胞分裂を経る必要があるため、2-3日程度は必要であると考えられる。一方で、改変されるDNAが外来のDNAの場合には、通常細胞分裂を経る必要がないため、細胞内在性のDNAの場合と比較して、期間を短縮することができる。当業者は、使用する培養条件等に基づいて、好適な発現誘導期間を適宜決定することができる。
培地に添加するDNA修飾酵素誘導因子の含有量は、標的DNAの改変が行われる限り特に制限されない。DNA修飾酵素誘導因子としてインターフェロンを用いる場合には、好ましくは10〜100000IU（国際単位）、より好ましくは100〜20000IU、さらに好ましくは500〜5000IUとなるように培地に添加することができる。また、DNA修飾酵素誘導因子としてApteninA5を用いる場合には、好ましくは、0.5 μΜ〜10 μΜ、より好ましくは1 μΜ〜3 μΜとなるように培地に添加することができる。当業者は、使用するDNA修飾酵素誘導因子や細胞の種類、培養条件等に基づいて、好適な含有量や力価などを適宜決定することができる。
一方、DNA修飾酵素誘導因子が物理化学的刺激である好ましい一例として、低酸素条件が挙げられる。例えば、APOBECファミリーに属するタンパク質は、低酸素条件に曝露された場合に活性化し得ることが報告されている（例えば、国際公開第2016-164889号公報）。細胞を低酸素条件に曝露する方法としては、例えば、低酸素状態の雰囲気下で細胞をインキュベートする方法などが挙げられる。ここで「低酸素状態」とは、大気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度であることを意味する。かかる酸素濃度としては、例えば15%以下、好ましくは10%以下、より好ましくは5%以下、さらに好ましくは1%以下であり、また、好ましくは0.1%以上である。
あるいは、DNA修飾酵素誘導因子をコードする核酸（好ましくはDNA）を細胞内に導入し、該細胞内で該因子を発現させる場合、後述する核酸配列認識モジュール及び／又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードする核酸と同様にして、細胞内に導入することができる。DNA修飾酵素誘導因子をコードするDNAを用いる場合、該DNAを誘導性の調節領域の制御下におくことにより、細胞をインキュベートする培地又は緩衝液中に、該調節領域を活性化し得る物質を添加及び／又は除去することで、該細胞内でのDNA修飾酵素誘導因子の発現期間を調整し、それによってDNAの修飾反応が起こる期間を調整することができる。該「誘導性の調節領域」としては、本発明の複合体をコードする核酸の発現調節に関して後述する調節領域を同様に使用することができる。
本発明において「核酸配列認識モジュール」とは、DNA鎖上の特定のヌクレオチド配列（即ち、標的ヌクレオチド配列）を特異的に認識して結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。核酸配列認識モジュールが標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該モジュールに連結されたDNA修飾酵素結合モジュールを介して、細胞内在性のDNA修飾酵素がDNAの標的化された部位に特異的に作用することを可能にする。
本発明において「DNA修飾酵素結合モジュール」とは、DNA修飾酵素と結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。
本発明の複合体は、上記核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとが連結された複合体を含んでなる、特定のヌクレオチド配列認識能及び細胞内在性のDNA修飾酵素との結合能が付与された分子複合体である。ここで、「複合体」は複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとを単一の分子内に有するものも包含される。
本発明において、DNA修飾酵素結合モジュールが結合の標的とする細胞内在性のDNA修飾酵素（以下、「標的酵素」ともいう）としては、特に制限はなく、例えば、ヌクレアーゼ（例：エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ等）、リコンビナーゼ、DNAジャイレース、DNAポリメラーゼ、DNAトポイソメラーゼ、テロメラーゼ、トランスポザーゼ、デアミナーゼ、DNAグリコシラーゼなどが挙げられる。細胞毒性の軽減の観点からは、DNAの改変は、二本鎖DNA鎖の切断反応ではなく、二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断しない反応（例：DNA上の核酸塩基変換反応や脱塩基反応）によって行うことが好ましい。核酸塩基変換反応や脱塩基反応を触媒するDNA修飾酵素としては、例えば、アミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒する、核酸／ヌクレオチドデアミナーゼスーパーファミリーに属するデアミナーゼや、DNAのN-グリコシド結合の加水分解を触媒するDNAグリコシラーゼ（例：チミンDNAグリコシラーゼ、オキソグアニングルコシラーゼ、アルキルアデニンDNAグリコシラーゼ（例：酵母3-メチルアデニン-DNAグリコシラーゼ（MAG1））等）などが挙げられる。好ましいデアミナーゼとしては、シトシン又は5-メチルシトシンをそれぞれウラシル又はチミンに変換し得るシチジンデアミナーゼ、アデニンをヒポキサンチンに変換し得るアデノシンデアミナーゼ、グアニンをキサンチンに変換し得るグアノシンデアミナーゼ等が挙げられる。シチジンデアミナーゼとして、より好ましくは、APOBECが挙げられる。ヒトにおいて、APOBECとしては、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3（例：APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D(APOBEC3E)、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H）、APOBEC4や、脊椎動物の獲得免疫においてイムノグロブリン遺伝子に変異を導入する酵素である活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）などが含まれる。
本発明の方法に用いられるDNA修飾酵素結合モジュールは、上記したような細胞内在性のDNA修飾酵素と結合し得るものであれば特に制限はなく、例えば、標的とするDNA修飾酵素に対する抗体、ペプチドアプタマー、核酸アプタマーや、その他のDNA修飾酵素に結合するタンパク質などが挙げられる。DNA修飾酵素結合モジュールは、標的とするDNA修飾酵素の種類に応じて、適宜選択することができる。これらのDNA修飾酵素結合モジュールは、標的とするDNA修飾酵素と結合することが公知のものを利用してもよく、あるいは、下述の方法により作製した分子を利用してもよい。DNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNAは、目的とするDNA修飾酵素結合モジュールのアミノ酸配列や核酸配列の情報を基に、適宜作製することができる。
本発明の方法に用いられる抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよく、抗体には、抗体断片（例：F（ab’）2、Fab’、Fab、Fv、scFv等）も包含される。抗体は、周知の免疫学的手法により作製することができる。ペプチドアプタマーは、アミノ酸で構成されるアプタマーで、抗体と同様に、特定の標的分子に結合し得るペプチド分子である。ペプチドアプタマーは、ファージディスプレイ法や細胞表層ディスプレイ法（例えば、Whaley, S.R., et al., (2000), Nature, 405, 665-668）に基づいてスクリーニングや作製をすることができる。核酸アプタマーは、RNA、DNA、修飾ヌクレオチド又はそれらの混合物で構成されるアプタマーである。アプタマーは、周知の方法（例えば、Ellington et al.,（1990）, Nature， 346，818-822；Tuerk et al., （1990）Science， 249，505-510）に従って、スクリーニングや作製をすることができる。
DNA修飾酵素に結合するタンパク質としては、例えば、APOBEC（特に、APOBEC3）に結合することが知られているヒト免疫不全ウイルス(HIV)やサル免疫不全ウイルス（SIVmac）のVif（Virion Infectivity Factor)、フォーミーウイルスのBet （Bromodomain and extra-terminal）タンパク質、TopoIIβ（Topoisomerase 2-beta）、IQGAP2、ZNF335（別称：NIF1）、CD81、MLL、APOBEC3GのC末端（196-384番目のアミノ酸残基）（例えば、Schumacher, April Jean, Ph.D., UNIVERSITY OF MINNESOTA, (2008) 199, pages; 3313466）や、これらのフラグメント（以下では、特に断らない限り、タンパク質にはそのフラグメントも包含されるものとする）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらのタンパク質は、改変が施されてもよい（改変されたタンパク質を、タンパク質の「変異体」と称することがある）。例えば、Vifは、E3ユビキチンリガーゼ複合体と結合し、APOBEC3のタンパク質分解を促進することが知られているため（例えば、Stanley et al. (2008) Journal of virology, 8656-8663;Guo et al. (2014) Nature, 55, 229-233）、Vifを用いる場合には、APOBEC3以外のタンパク質への結合性を欠損させる改変を施すことが好ましい。このような改変としては、例えば、Vifタンパク質(refseq番号: AAF20197)のN末端の数個（例えば、11個、10個、9個、8個、7個等）のアミノ酸を欠失させ、かつ145番目のロイシン残基を他のアミノ酸残基（例えば、アラニン残基）に置換することなどが挙げられるが、これらの改変に限定されない。Vif以外のタンパク質を用いる場合であっても、タンパク質の機能、標的分子との結合部位や立体構造等に基づき、適宜改変を施すことができる。上記タンパク質のフラグメントとしては、DNA修飾酵素への結合領域を有する限り特に制限されないが、例えば、DNA修飾酵素への結合領域以外の領域（例えば、タンパク質の触媒活性を有する領域）を除いたフラグメントなどが挙げられる。かかるフラグメントとしては、具体的には、TopoIIβ(refseq番号: NP_001059)の452〜591番目のアミノ酸残基からなるペプチド、IQGAP2(refseq番号: NP_006624)の466〜547番目のアミノ酸残基からなるペプチド、ZNF335(refseq番号: NP_071378)の745〜893番目のアミノ酸残基からなるペプチドなどが挙げられるが、これらは単なる例示であり、当業者であれば適宜フラグメントを設計することができる。また、後述の実施例で示す通り、IQGAP2とZNF335とを組み合わせた場合にも、標的化された部位が改変されることを示しているため（表２）、上述のDNA修飾酵素に結合するタンパク質を組み合わせて用いることもできる。
本発明において「塩基除去修復」とは、生物が有するDNA修復機構の1つであり、塩基が損傷した部分を酵素によって切り取って再びつなぎ合わせることで、塩基の損傷を修復する機構を意味する。損傷のある塩基の除去は、DNAのN-グリコシド結合を加水分解する酵素であるDNAグリコシラーゼにより行われ、該酵素による脱塩基反応の結果生じた塩基の無い部位(apurinic/apyrimidic (AP) site)は、APエンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ等の塩基除去修復(BER)経路の下流の酵素によって処理される。これらBER経路に関与する遺伝子又はタンパク質として、UNG(NM_003362)、SMUG1(NM_014311)、MBD4(NM_003925)、TDG(NM_003211)、OGG1(NM_002542)、MYH(NM_012222)、NTHL1(NM_002528)、MPG(NM_002434)、NEIL1(NM_024608)、NEIL2(NM_145043)、NEIL3(NM_018248)、APE1(NM_001641)、APE2(NM_014481)、LIG3(NM_013975)、XRCC1(NM_006297)、ADPRT(PARP1)(NM_0016718)、ADPRTL2（PARP2）（NM_005484）などが挙げられるが（括弧内はそれぞれの遺伝子（cDNA）の塩基配列情報が登録されたrefseq番号を示す。）、これらに制限されない。
本発明において「塩基除去修復のインヒビター」とは、上記BER経路のいずれかの段階を阻害するか、あるいは該BER経路に動員される分子の発現自体を阻害することで、結果的にBERを阻害する物質を意味する。本発明に用いられる塩基除去修復のインヒビターは、結果的にBERを阻害するものであれば特に制限はないが、効率の観点からは、BER経路の上流に位置するDNAグリコシラーゼの阻害剤が好ましい。本発明で用いられるDNAグリコシラーゼの阻害剤としては、チミンDNAグリコシラーゼの阻害剤、ウラシルDNAグリコシラーゼの阻害剤、オキソグアニンDNAグリコシラーゼの阻害剤、アルキルグアニンDNAグリコシラーゼの阻害剤などが挙げられるが、これらに制限されない。例えば、DNA修飾酵素結合モジュールの標的酵素がシチジンデアミナーゼである場合には、変異により生じたDNAのU:G又はG:Uミスマッチの修復を阻害するため、ウラシルDNAグリコシラーゼの阻害剤を使用することが適している。
そのようなウラシルDNAグリコシラーゼの阻害剤としては、枯草菌（Bacillus subtilis）バクテリオファージであるPBS1由来のウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤(UGI)又は枯草菌バクテリオファージであるPBS2由来のウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤(UGI)が挙げられるが（Wang, Z., and Mosbaugh, D. W. (1988) J. Bacteriol. 170, 1082-1091）、これらに制限されず、上記DNAのミスマッチの修復阻害剤であれば、本発明に用いることができる。特に、PBS2由来のUGIは、DNA上のCからT以外の変異や切断、及び組み換えを起こさせにくくするとの効果も知られていることから、PBS2由来のUGIを使用することが適している。
上述のように、塩基除去修復（BER）機構において、DNAグリコシラーゼによって塩基が除去されると、APエンドヌクレアーゼが無塩基部位（AP部位）にニックを入れ、さらにエキソヌクレアーゼによってAP部位は完全に除去される。AP部位が除去されると、DNAポリメラーゼが反対鎖の塩基を鋳型に新しく塩基を作り、最後にDNAリガーゼがニックを埋めて修復が完了する。酵素活性を失っているがAP部位への結合能を保持している変異APエンドヌクレアーゼは、競合的にBERを阻害することが知られている。従って、これらの変異APエンドヌクレアーゼも、本発明の塩基除去修復のインヒビターとして用いることができる。変異APエンドヌクレアーゼの由来は特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）など由来のAPエンドヌクレアーゼを用いることができる。例えば、ヒトApe1のアミノ酸配列は、UniprotKB No. P27695として参照することができる。酵素活性を失っているがAP部位への結合能を保持している変異APエンドヌクレアーゼの例としては、活性サイトや補因子であるMg結合サイトが変異したタンパク質が挙げられる。例えば、ヒトApe1の場合、E96Q、Y171A、Y171F、Y171H、D210N、D210A、N212A等が挙げられる。
本発明の複合体の核酸配列認識モジュールにより認識される、DNA中の標的ヌクレオチド配列は、該モジュールが特異的に結合し得る限り特に制限されず、DNA中の任意の配列であってよい。標的ヌクレオチド配列の長さは、核酸配列認識モジュールが特異的に結合するのに十分であればよく、標的DNAのサイズに応じて、例えば12ヌクレオチド以上、好ましくは15ヌクレオチド以上、より好ましくは18ヌクレオチド以上である。長さの上限は特に制限されないが、好ましくは25ヌクレオチド以下、より好ましくは22ヌクレオチド以下である。
本発明の複合体の核酸配列認識モジュールとしては、例えば、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム（以下、「CRISPR-変異Cas」ともいう）、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフ等の他、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のDNAと特異的に結合し得るタンパク質のDNA結合ドメインを含み、DNA二重鎖切断能を有しないフラグメント等が用いられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、CRISPR-変異Cas、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等が挙げられる。
ジンクフィンガーモチーフは、Cys2His2型の異なるジンクフィンガーユニット（1フィンガーが約3塩基を認識する）を3〜6個連結させたものであり、9〜18塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、Modular assembly法（Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141）、OPEN法（Mol Cell (2008) 31: 294-301）、CoDA法（Nat Methods (2011) 8: 67-69）、大腸菌one-hybrid法（Nat Biotechnol (2008) 26:695-701）等の公知の手法により作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、上記特許文献１を参照することができる。
TALエフェクターは、約34アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、1つのモジュールの12及び13番目のアミノ酸残基（RVDと呼ばれる）によって、結合安定性と塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、モジュールを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なTALエフェクターを作製することが可能である。TALエフェクターは、オープンリソースを利用した作製方法（REAL法(Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15)、FLASH法(Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465)、Golden Gate法(Nucleic Acids Res (2011) 39： e82)等）が確立されており、比較的簡便に標的ヌクレオチド配列に対するTALエフェクターを設計することができる。TALエフェクターの作製の詳細については、上記特許文献２を参照することができる。
PPRモチーフは、35アミノ酸からなり1つの核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されており、各モチーフの1、4及びii（-2）番目のアミノ酸のみで標的塩基を認識する。モチーフ構成に依存性はなく、両脇のモチーフからの干渉はないので、TALエフェクター同様、PPRモチーフを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なPPRタンパク質を作製することが可能である。PPRモチーフの作製の詳細については、上記特許文献４を参照することができる。
また、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のフラグメントを用いる場合、これらのタンパク質のDNA結合ドメインは周知であるので、該ドメインを含み、且つDNA二重鎖切断能を有しない断片を容易に設計し、構築することができる。
上記いずれかの核酸配列認識モジュールは、上記DNA修飾酵素結合モジュールがタンパク質である場合、それとの融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、SH3ドメイン、PDZドメイン、GKドメイン、GBドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとにそれぞれインテイン（intein）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。
核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体（融合タンパク質を含む。）を含んでなる本発明の複合体と、DNAとの接触は、目的のDNA（例、ゲノムDNA）を有する細胞に、該複合体をコードする核酸を導入することにより実施されることが望ましい。
従って、核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製することが好ましい。ここで核酸は、DNAであってもRNAであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。
核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとが結合した本発明の複合体は、毒性の低いDNA編集が可能であり、本発明の遺伝子改変方法は幅広い生物材料に適用することができる。従って、核酸配列認識モジュール及び/又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードする核酸が導入される細胞は、原核生物である大腸菌などの細菌や下等真核生物である酵母などの微生物の細胞から、ヒト等の哺乳動物を含む脊椎動物、昆虫、植物など高等真核生物の細胞にいたるまで、あらゆる生物種の細胞をも包含し得る。
ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等の核酸配列認識モジュールをコードするDNAは、各モジュールについて上記したいずれかの方法により取得することができる。制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等の配列認識モジュールをコードするDNAは、例えば、それらのcDNA配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分（即ち、DNA結合ドメインを含む部分）をコードする領域をカバーするようにオリゴDNAプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。
DNA修飾酵素結合モジュール、DNA修飾酵素誘導因子又は塩基除去修復のインヒビターをコードするDNAも、同様に、使用するタンパク質等のcDNA配列情報をもとにオリゴDNAプライマーを合成し、当該タンパク質等を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、DNA修飾酵素結合モジュールとしてHIVのVifを用いる場合、該タンパク質をコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列（accession No. AF200477）をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、HIVに感染した細胞から抽出したRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。
クローン化されたDNAは、そのまま、又は所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカー及び／又は核移行シグナル（目的のDNAがミトコンドリアや葉緑体DNAの場合は、各オルガネラ移行シグナル）を付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとを融合タンパク質として発現させる場合、例えば、融合タンパク質の両末端、又は核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとの間に核移行シグナルを付加することができる。核移行シグナルとしては、特に制限はないが、例えばSV40由来の核移行シグナル(例：配列番号７、配列番号９)が挙げられる。
あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、DNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNAとに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするDNAを融合させるか、それぞれのDNAに分離インテインをコードするDNAを融合させることにより、核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとが、宿主細胞内で翻訳された後に複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合も、所望によりそれぞれのDNAの適当な位置に、リンカー及び／又は核移行シグナルを連結することができる。
核酸配列認識モジュールをコードするDNA及びDNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNA（及びDNA修飾酵素誘導因子による細胞の刺激を、該因子をコードするDNAを該細胞内に導入し、発現させることにより行う場合は、該因子をコードするDNA；以下、括弧書きで記載する場合において同様。）は、化学的にDNA鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、その全長をコードするDNAを構築することも可能である。化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで全長DNAを構築することの利点は、該DNAを導入する宿主に合わせて使用コドンをCDS全長にわたり設計できる点にある。異種DNAの発現に際し、そのDNA配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公財）かずさDNA研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いることができ、又は各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。入手したデータと導入しようとするDNA配列を参照し、該DNA配列に用いられているコドンの中で宿主において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに変換すればよい。例えば、宿主細胞がヒト細胞の場合、ヒトのコドン使用に最適化された核酸配列認識モジュール及び／又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードする配列を使用することができる。塩基除去修復のインヒビターをコードするDNAも同様に構築することができる。
核酸配列認識モジュールをコードするDNA及び／又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNA（及び／又はDNA修飾酵素誘導因子をコードするDNA）を含む発現ベクターは、例えば、該DNAを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。さらに、前記発現ベクターは、塩基除去修復のインヒビターをコードするDNAを含むようにして製造することもできる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。DSBを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、細胞内在性のDNA修飾酵素としてDSBを伴わない酵素を誘導する場合には、本発明の複合体を発現させても十分な細胞増殖が期待されるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主が大腸菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
宿主が植物細胞である場合、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーターなどが好ましい。
発現ベクターは、所望によりターミネーター（例、NOSターミネーター、エンドウrbcS3Aターミネーター、熱ショックタンパク質（HSP）17.3ターミネーター等）、翻訳エンハンサー（例、イネ由来アルコールデヒドロゲナーゼ5’非翻訳領域（Os ADH-5’UTR）、CaMVやタバコモザイクウイルス（TMV）由来Ω配列等）、3’調節領域（例、イネ由来アクチン遺伝子（Act1）3’UTR等）、ポリA付加シグナル、薬剤耐性遺伝子（例、G418耐性遺伝子（nPtII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hpt）等）の選択マーカーなどを含有することができる。
核酸配列認識モジュールをコードするRNA及び／又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードするRNA（及び／又はDNA修飾酵素誘導因子をコードするRNA）は、例えば、上記した核酸配列認識モジュールをコードするDNA及び／又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNA（及び／又はDNA修飾酵素誘導因子をコードするDNA）を含む発現ベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。塩基除去修復のインヒビターをコードするRNAも同様に調製することができる。
核酸配列認識モジュール及び／又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって、核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとの複合体を細胞内で発現させることができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，60，160 (1968)〕，エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic Acids Research，9，309 (1981)〕，エシェリヒア・コリJA221〔Journal of Molecular Biology，120，517 (1978)〕，エシェリヒア・コリHB101〔Journal of Molecular Biology，41，459 (1969)〕，エシェリヒア・コリC600〔Genetics，39，440 (1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114〔Gene，24，255 (1983)〕，バチルス・サブチルス207-21〔Journal of Biochemistry，95，87 (1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913，NCYC2036，ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞〔以上、In Vivo, 13, 213-217 (1977)〕などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫、ショウジョウバエ、コオロギなどが用いられる〔Nature，315，592 (1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットGH3細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞（例：HEK293細胞）、ヒト肝癌由来細胞（例：HepG2）、ヒトFL細胞などの細胞株、ヒト及び他の哺乳動物のiPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞、種々の組織から調製した初代培養細胞が用いられる。さらには、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。
植物細胞としては、種々の植物（例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物、トマト、キュウリ、ナス等の商品作物、カーネーション、トルコギキョウ等の園芸植物、タバコ、シロイヌナズナ等の実験植物など）から調製した懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉切片、根切片などが用いられる。
上記いずれの宿主細胞も、半数体（一倍体）であってもよいし、倍数体（例、二倍体、三倍体、四倍体など）であってもよい。従来の変異導入手法では、原則として相同染色体の一本にのみしか変異が導入されず、ヘテロな遺伝子型になるため、優性変異でなければ所望の形質は発現せず、ホモ化するには手間と時間がかかり、不都合が多かった。これに対し、本発明によれば、標的DNAの改変をCRISPR-変異Casをはじめとする核酸配列認識モジュールを用いる本発明の方法によって行う場合には、ゲノム内の相同染色体上の対立遺伝子すべてに変異を導入することができる可能性があるので、劣性変異であっても当代で所望の形質を発現させることができ、従来法の問題点を克服し得る。
発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、PEG法、CaCl2共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法など）に従って実施することができる。
大腸菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69，2110 (1972)やGene，17，107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168，111 (1979)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology，194，182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75，1929 (1978)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
昆虫細胞及び昆虫は、例えば、Bio/Technology,6，47-55 (1988)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、Virology，52，456 (1973)に記載の方法に従ってベクター導入することができる。
ベクターを導入した細胞の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、大腸菌又はバチルス属菌を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機又は有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。
大腸菌を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。大腸菌の培養は、通常約15〜約43℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
バチルス属菌の培養は、通常約30〜約40℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77，4505 (1980)〕や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81，5330 (1984)〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約35℃で行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
昆虫細胞又は昆虫を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium〔Nature，195，788 (1962)〕に非働化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122，501 (1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology，8，396 (1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association，199，519 (1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
植物細胞を培養する培地としては、MS培地、LS培地、B5培地などが用いられる。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約30℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとの複合体、即ち本発明の複合体を細胞内で発現させることができる。
核酸配列認識モジュール及び／又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードするRNAの宿主細胞への導入は、マイクロインジェクション法、リポフェクション法等により行うことができる。RNA導入は1回もしくは適当な間隔をおいて複数回（例えば、2〜5回）繰り返して行うことができる。
細胞内に導入された発現ベクターから、核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとの複合体が発現すると、該核酸配列認識モジュールが目的のDNA（例、ゲノムDNA）内の標的ヌクレオチド配列を特異的に認識して結合する。そして、該核酸配列認識モジュールに連結されたDNA修飾酵素結合モジュールが、DNA修飾酵素誘導因子による刺激を受けて誘導された細胞内在性のDNA修飾酵素と結合し、該DNA修飾酵素の作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部又はそれらの近傍）でDNA鎖又は塩基の修飾が起こると考えられる。
標的DNAが二本鎖の場合には、標的化された部位のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖でDNAの修飾が起こる。DNAの修飾がDNA鎖の切断である場合には、塩基除去修復（BER）、ヌクレオチド除去修復（NER）、一本鎖切断修復、非相同末端結合（NHEJ）、相同組換え（HR）などの修復機構により修復される際に、種々の変異が導入される。DNAの修飾がDNA鎖の切断を直接伴わない場合には、二本鎖DNA内にミスマッチや塩基の無い部位（AP部位）(apurinic/apyrimidic (AP) site)が生じ、これを修復する過程で変異が導入される。例えば、APOBECなどのシチジンデアミナーゼに結合し得るDNA修飾酵素結合モジュールを用いた場合、標的化された部位のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖上のシトシンがウラシルに変換され、U:GもしくはG:Uミスマッチを生じる。このミスマッチが正しく修復されずに、反対鎖の塩基が、変換した鎖の塩基と対形成するように修復されたり（上記の例では、T-AもしくはA-T）、修復の際にさらに他のヌクレオチドに置換（例えば、U→A、G）、あるいは1ないし数十塩基の欠失もしくは挿入を生じることにより、種々の変異が導入される。また、例えば、DNAグリコシラーゼに結合し得るDNA修飾酵素結合モジュールを用いた場合、標的化された部位のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖で脱塩基反応が起こり、二本鎖DNAの一方の鎖に無塩基部位（AP部位）が生じる。すると、細胞内の塩基除去修復（BER）系が作動し、まずAPエンドヌクレアーゼがAP部位を認識してDNA片鎖のリン酸結合を切断し、エキソヌクレアーゼが脱塩基されたヌクレオチドを除去する。次にDNAポリメラーゼが反対鎖DNAを鋳型として新たにヌクレオチドを挿入し、最後にDNAリガーゼが繋ぎ目を修復する。このBERのいずれかの段階で修復ミスが起こることにより、種々の変異が導入される。
ジンクフィンガーモチーフは、標的ヌクレオチド配列に特異的に結合するジンクフィンガーの作製効率が高くなく、また、結合特異性の高いジンクフィンガーの選別が煩雑なため、実際に機能するジンクフィンガーモチーフを多数作製するのは容易ではない。TALエフェクターやPPRモチーフは、ジンクフィンガーモチーフに比べて標的核酸配列認識の自由度が高いが、標的ヌクレオチド配列に応じて巨大なタンパク質をその都度設計し、構築する必要があるので、効率面で問題が残る。
これに対し、CRISPR-Casシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAにより目的のDNAの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴDNAを合成するだけで、任意の配列を標的化することができる。
従って、本発明のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Casエフェクタータンパク質の少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-CasシステムであるCRISPR-変異Casが用いられる。
CRISPR-変異Casを用いた本発明の核酸配列認識モジュールは、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列を含むCRISPR-RNA（crRNA）と、必要に応じて変異Casエフェクタータンパク質のリクルートに必要なtrans-activating RNA（tracrRNA）と（tracrRNAが必要な場合は、crRNAとのキメラRNAとして提供され得る）、変異Casエフェクタータンパク質との複合体として提供される。変異Casエフェクタータンパク質と組み合わせて核酸配列認識モジュールを構成する、crRNA単独あるいはcrRNAとtracrRNAとのキメラRNAからなるRNA分子を「ガイドRNA」と総称する。DNA修飾酵素結合モジュールとして核酸アプタマーを用いる場合には、核酸アプタマーは、ガイドRNAと結合することが望ましい。ガイドRNAと核酸アプタマーとが結合した核酸は、周知の方法（例えば、Mali et al., (2013), Nat Biotechnol, 31(9), 833-838）により作製することができる。
本発明で使用されるCasエフェクタータンパク質は、ガイドRNAと複合体を形成して、目的遺伝子中の標的ヌクレオチド配列とそれに隣接するprotospacer adjacent motif（PAM）を認識し結合し得るclass 2 CRISPRシステムに属するエフェクタータンパク質である限り、特に制限はないが、好ましくはCas9又はCpf1である。Cas9としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9（SpCas9; PAM配列（5’→3’方向；以下同じ）NGG(NはA、G、T又はC。以下同じ)）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のCas9（StCas9; PAM配列NNAGAAW）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のCas9（MmCas9; PAM配列NNNNGATT）等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはPAMによる制約が少ないSpCas9である（実質2塩基であり、理論上ゲノム上のほぼどこでも標的化することができる）。また、Cpf1としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のCpf1（FnCpf1; PAM配列TTN）、アシダミノコッカス sp.（Acidaminococcus sp.）由来のCpf1（AsCpf1;PAM配列TTTN）、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のCpf1（LbCpf1; PAM配列TTTN）等が挙げられるが、それらに限定されない。本発明で用いられる変異Casエフェクタータンパク質（以下、「変異Cas」と略記する場合がある）としては、Casエフェクタータンパク質の二本鎖DNAの両方の鎖の切断能が失活したものと、一方の鎖の切断能のみを失活したニッカーゼ活性を有するものの、いずれも使用可能である。例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基がAla残基に変換した、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能を欠く（従って、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖に対するニッカーゼ活性を有する）D10A変異体、あるいは、840番目のHis残基がAla残基で変換した、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の切断能を欠く（従って、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖に対するニッカーゼ活性を有する）H840A変異体、さらにはその二重変異体（dCas9）を用いることができる。また、FnCpf1の場合、917番目のAsp残基がAla残基（D917A）に、あるいは1006番目のGlu残基がAla残基（E1006A）に変換した、両方の鎖の切断能を欠く変異体を用いることができる。二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖の切断能を欠く限り、他の変異Casも同様に用いることができる。
DNA修飾酵素結合モジュールは、上記ジンクフィンガー等との連結様式と同様の手法により、変異Casとの複合体として提供される。あるいは、DNA修飾酵素結合モジュールと変異Casとを、RNAアプタマーであるMS2F6、PP7等とそれらとの結合タンパク質によるRNA scaffoldを利用して結合させることも出来る。ガイドRNA中のターゲッティング配列が標的ヌクレオチド配列と相補鎖を形成し、ガイドRNA中の他の領域（即ち、crRNA中のターゲッティング配列以外の配列、あるいはcrRNAに続くtracrRNA）に変異CasがリクルートされてPAMを認識するが、一方あるいは両方のDNAを切断することができず、変異Casに連結されたDNA修飾酵素結合モジュールがDNA修飾酵素と結合し、該DNA修飾酵素の作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）で修飾が起こり、DNA鎖が切断されたり、標的DNAが二本鎖DNAの場合には、DNA内にミスマッチやAP部位が生じる。これらのDNA鎖の切断、ミスマッチ又はAP部位が正しく修復されずに、反対鎖の塩基が、変換した鎖の塩基と対形成するように修復されたり、修復の際にさらに他のヌクレオチドに変換、あるいは1ないし数十塩基の欠失もしくは挿入を生じることにより、種々の変異が導入される。
CRISPR-変異Casを核酸配列認識モジュールとして用いる場合でも、ジンクフィンガー等を核酸配列認識モジュールとして用いる場合と同様に、核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとは、それらをコードする核酸（好ましくはDNA）の形態で、目的のDNAを有する細胞に導入することが望ましい。
Casエフェクタータンパク質（例、Cas9、Cpf1）をコードするDNAは、DNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、該タンパク質を産生する細胞からクローニングすることができる。また、変異Casは、クローン化されたCasをコードするDNAに、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、DNA切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基や840番目のHis残基、FnCpf1の場合、917番目のAsp残基、1006番目のGlu残基や1255番目のAsp残基等が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。また、化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで全長DNAを構築することにより、該DNAを導入する宿主に合わせて使用コドンをCDS全長にわたり設計することもできる。例えば、このような変異が導入された、ヒト細胞での発現に適したコドン使用を有するSpCas9 DNAとして、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するDNAが挙げられる。
得られた変異CasをコードするDNA及び／又はDNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNAは、宿主細胞に応じて、上記と同様の発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することができる。発現ベクターには、上述のように、所望によりターミネーター、翻訳エンハンサー、3’調節領域、ポリA付加シグナル、薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーなどを含有することができる。
一方、ガイドRNAをコードするDNAは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列（本明細書中、「ターゲッティング配列（targeting sequence）」ともいう）を含む、crRNA配列（例えば、Casエフェクタータンパク質としてFnCpf1をリクルートする場合、ターゲッティング配列の5’側に配列番号１０；AAUUUCUACUGUUGUAGAU を含むcrRNAを用いることができ、下線部の配列同士が塩基対を形成しステム-ループ構造をとる）のコード配列、あるいは、crRNAコード配列と必要に応じて既知のtracrRNAコード配列（例えば、Casエフェクタータンパク質としてCas9をリクルートする場合のtracrRNAコード配列として、gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc; 配列番号１１）とを連結したオリゴDNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。標的DNAが二本鎖の場合には、crRNA配列は、標的ヌクレオチド配列の「標的鎖（targeted strand）」に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。
ここで「標的鎖」とは、標的ヌクレオチド配列のcrRNAとハイブリッド形成する方の鎖を意味し、その反対鎖で標的鎖とcrRNAとのハイブリッド形成により一本鎖状になる鎖を「非標的鎖（non-targeted strand）」と呼ぶこととする。また、DNAの修飾反応は通常、一本鎖状になった非標的鎖上で起こる場合が多いと推定されるので、標的ヌクレオチド配列を片方の鎖で表現する場合（例えばPAM配列を表記する場合や、標的ヌクレオチド配列とPAMとの位置関係を表す場合等）、非標的鎖の配列で代表させるものとする。
ターゲッティング配列の長さは、標的ヌクレオチド配列に対して特異的に結合し得る限り特に制限はないが、例えば15〜30ヌクレオチド、好ましくは18〜25ヌクレオチドである。標的ヌクレオチド配列の選択は、該配列の3’側（Cas9の場合）もしくは5’側（Cpf1の場合）に隣接するPAMの存在により制限されるが、酵母等の知見に依れば、CRISPR-変異Cas9とシチジンデアミナーゼとを組み合わせたシステムにおいては、標的ヌクレオチド配列の長さに拘わらず、その5’端から3’方向に7ヌクレオチド以内の位置にあるCが置換され易いという規則性があるので、標的ヌクレオチド配列の長さを適宜選択することにより、変異を導入できる塩基の部位をシフトさせる可能性がある。これにより、PAM（SpCas9においてはNGG）による制約を少なくとも部分的に解除することができ、変異導入の自由度がさらに高くなることが期待される。
ターゲッティング配列の設計は、例えば、Casエフェクタータンパク質としてCas9を用いる場合、公開のガイドRNA設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPRdirect等）を用いて、目的遺伝子のCDS配列の中からPAM（例えば、SpCas9の場合、NGG）を3’側に隣接する20mer配列をリストアップし、その5’端から3’方向に7ヌクレオチド以内のCをTに変換した場合に、目的遺伝子がコードするタンパク質にアミノ酸変化を生じるような配列を選択することにより行うことができる。さらに、ターゲッティング配列の長さを、例えば18〜25ヌクレオチドの範囲で変化させた場合に、同様に、その5’端から3’方向に7ヌクレオチド以内にTへの塩基変換によりアミノ酸変化を生じるCが存在する配列を選択する。これらの候補の中から、宿主のゲノム中のオフターゲットサイト数が少ない候補配列をターゲッティング配列として用いることができる。使用するガイドRNA設計ソフトウェアに宿主のゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補配列の3’側の8〜12ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いseed配列）について、宿主のゲノムに対してBlast検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。
ガイドRNA（例えば、crRNA又はcrRNA-tracrRNAキメラ）をコードするDNAは、標的ヌクレオチド配列の標的鎖に対して相補的な配列と、既知のtracrRNA配列（Cas9をリクルートする場合）又はcrRNAのダイレクトリピート配列（Cpf1をリクルートする場合）とを連結したオリゴRNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。ガイドRNAをコードするDNAも、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、pol III系のプロモーター（例、SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U3、U6、H1プロモーター等）及びターミネーター（例、ポリT配列（T6配列;tttttt 等））を用いることが好ましい。
変異CasをコードするDNA、DNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNA、ガイドRNAをコードするDNAは、宿主に応じて、上記と同様の方法により宿主細胞に導入することができる。
本発明者らは、デアミナーゼと核酸配列認識モジュールとの複合体を用いたゲノム編集（以下、「Target AID」と称する場合がある。）（特許文献５）において、異なる鎖を切断する2種のニッカーゼ活性を有する変異Casの効果を比較した結果、一方では、変異部位が標的ヌクレオチド配列の中央付近に集中したのに対し、他方では、標的ヌクレオチド配列から数百塩基にわたる領域に多様な変異がランダムに導入されたことを報告しており、本発明においても同様の効果が期待できる。従って、ニッカーゼが切断する鎖を選択することにより、特定のヌクレオチド又はヌクレオチド領域にピンポイントに変異を導入したり、あるいは比較的広い範囲に多様な変異をランダムに導入したりすることが可能となり、目的に応じて使い分けることもできる。例えば、前者の技術を遺伝子疾患iPS細胞に応用すれば、患者自身の細胞から作製したiPS細胞において病原遺伝子の変異を修復した後、目的の体細胞に分化させることで、拒絶のリスクがより低減された細胞移植療法剤を作製することが可能となる。
本発明者らはまた、Target AIDにおいて、近接する複数の標的ヌクレオチド配列に対して配列認識モジュールを作製し、同時に用いることにより、単独のヌクレオチド配列を標的とするよりも、変異導入効率が大幅に上昇することを、出芽酵母を用いて確認しており、本発明においても同様の効果が期待できる。その効果は、両標的ヌクレオチド配列の一部が重複するような場合から、両者が600bp程度離れている場合でも同様に変異誘導が実現する。また、標的DNAが二本鎖DNAの場合には、標的ヌクレオチド配列が同じ方向である（即ち、標的鎖が同一鎖上にある）場合と、対向する（即ち、二本鎖DNAの両方の鎖が標的鎖となる）場合のどちらでも起こり得る。
また、全く異なる位置の複数のDNA領域を標的として改変することも可能である。従って、本発明の好ましい一実施態様においては、異なる標的ヌクレオチド配列（例えば、標的DNAが細胞内在性のDNAの場合には、１つの目的遺伝子内であってもよいし、異なる２以上の目的遺伝子内にあってもよい。）とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることができる。この場合、これらの核酸配列認識モジュールの各々１つと、DNA修飾酵素結合モジュールとが、複合体を形成する。ここでDNA修飾酵素結合モジュールは共通のものを使用することができる。例えば、核酸配列認識モジュールとしてCRISPR-Casシステムを用いる場合、Casエフェクタータンパク質とDNA修飾酵素結合モジュールとの複合体（融合タンパク質を含む）は共通のものを用い、ガイドRNAとして、異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ相補鎖を形成する2以上のcrRNAの各々を含む2種以上のガイドRNAを作製して用いることができる。一方、核酸配列認識モジュールとしてジンクフィンガーモチーフやTALエフェクターなどを用いる場合には、例えば、異なる標的ヌクレオチドと特異的に結合する各核酸配列認識モジュールに、DNA修飾酵素結合モジュールを融合させることができる。
本発明の複合体を宿主細胞内で発現させるためには、上述のように、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、DNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNAとを含む発現ベクター（両DNAは別個のベクター上にあってもよいし、単一のベクター上にあってもよい）や、各モジュールをコードするRNAを宿主細胞に導入するが、効率よく変異を導入するためには、一定期間以上、一定レベル以上で本発明の素複合体の発現が維持されるのが望ましい。かかる観点からは、宿主細胞内で自律複製可能な発現ベクター（例えば、プラスミド等）を導入することが確実であるが、該プラスミド等は外来DNAであるため、首尾よく変異導入が達成された後は、速やかに除去されることが好ましい。従って、宿主細胞の種類等によって変動するが、例えば、発現ベクター導入から６時間〜２日間経過後に、当該技術分野で周知の種々のプラスミド除去法を用いて、宿主細胞から導入したプラスミドを除去することが望ましい。
一方、宿主ゲノムDNAに組み込まれた外来DNAを除去するための手段としては、Cre-loxP系を用いる方法やトランスポゾンを用いる方法等が挙げられる。
あるいは、変異導入に十分な本発明の複合体の発現が得られる限り、宿主細胞内での自律複製能を有しない発現ベクター（例えば、宿主細胞で機能する複製起点及び／又は複製に必要なタンパク質をコードする遺伝子を欠くベクター等）や、RNAを用いて、一過的発現により目的のDNAに変異を導入することもまた好ましい。
あるいは、所望の時期にDNAの修飾反応が起こり、標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間だけ、一過的に本発明の複合体を宿主細胞内で発現させることにより、オフターゲット作用のリスクを回避しつつ宿主DNAの編集を効率よく実現することができる。DNAの修飾反応が起こり、標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間は、上記したDNA修飾酵素誘導因子で細胞を刺激する期間と同様に適宜決定することができる。本発明の複合体の発現誘導期間は、宿主細胞に好ましくない副作用を生じさせない範囲で、上記の期間を超えて延長されてもよい。
本発明の複合体を、所望の時期に所望の期間、一過的に発現させる手段としては、該複合体をコードするDNA［即ち、核酸配列認識モジュールをコードするDNA（CRISPR-Casシステムにおいては、ガイドRNAをコードするDNAと、変異CasをコードするDNAとを意味する）、及びDNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNA（CRISPR-Casシステムにおいては、DNA修飾酵素結合モジュールをコードするDNAは、該モジュールがタンパク質であるかRNAにより、それぞれ変異CasをコードするDNA又はガイドRNAをコードするDNAと連結され得る）］を、該複合体の発現期間を制御可能な形態で含むコンストラクト（発現ベクター）を作製し、宿主細胞内に導入する方法が挙げられる。「発現期間を制御可能な形態」としては、具体的には、本発明の複合体をコードするDNAを、誘導性の調節領域の制御下においたものが挙げられる。「誘導性の調節領域」は特に制限されないが、例えば、細菌（例、大腸菌）や酵母などの微生物細胞では、温度感受性（ts）変異リプレッサーとこれに制御されるオペレーターとのオペロンが挙げられる。ts変異リプレッサーとしては、例えばλファージ由来のcIリプレッサーのts変異体が挙げられるが、これに限定されない。λファージcIリプレッサー(ts)の場合、30℃以下（例、28℃）ではオペレーターに結合して下流の遺伝子発現を抑制しているが、37℃以上（例、42℃）の高温ではオペレーターから解離するために、遺伝子発現が誘導される。従って、本発明の複合体をコードするDNAを導入した宿主細胞を、通常は30℃以下で培養し、適切な時期に温度を37℃以上に上げて一定期間培養して本発明の複合体を発現させ、該複合体にリクルートされた細胞内在性のDNA修飾酵素によりDNAの修飾反応を行わせ、標的遺伝子に変異が導入された後は、速やかに30℃以下に戻すことにより、標的遺伝子の発現が抑制される期間を最短にすることができる。そのため、宿主細胞にとって必須遺伝子を標的化する場合でも、副作用を押さえつつ効率よく編集することができる。
温度感受性変異を利用する場合、例えば、ベクターの自律複製に必要なタンパク質の温度感受性変異体を、本発明の複合体をコードするDNAを含むベクターに搭載することにより、該複合体の発現後、速やかに自律複製が出来なくなり、細胞分裂に伴って該ベクターは自然に脱落する。このような温度感受性変異タンパク質としては、pSC101 oriの複製に必要なRep101 oriの温度感受性変異体が挙げられるが、これに限定されない。Rep101 ori (ts)は30℃以下（例、28℃）では、pSC101 oriに作用してプラスミドの自律複製を可能にするが、37℃以上（例、42℃）になると機能を失い、プラスミドは自律複製できなくなる。従って、上記λファージのcIリプレッサー(ts)と併用することで、本発明の複合体の一過的発現と、プラスミド除去とを、同時に行うことができる。
一方、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の高等真核細胞を宿主細胞とする場合には、本発明の複合体をコードするDNAを、誘導プロモーター（例、メタロチオネインプロモーター（重金属イオンで誘導）、ヒートショックタンパク質プロモーター（ヒートショックで誘導）、Tet-ON／Tet-OFF系プロモーター（テトラサイクリン又はその誘導体の添加又は除去で誘導）、ステロイド応答性プロモーター（ステロイドホルモン又はその誘導体で誘導）等）の制御下において宿主細胞内に導入し、適切な時期に培地に誘導物質を添加（又は培地から除去）して該複合体の発現を誘導し、一定期間培養して、該複合体にリクルートされた細胞内在性のDNA修飾酵素によりDNAの修飾反応を行わせ、標的遺伝子に変異が導入された後、前記誘導物質を培地から除去（又は培地に添加）することにより、本発明の複合体の一過的発現を実現することができる。
尚、大腸菌などの原核細胞でも、誘導プロモーターを利用することができる。そのような誘導プロモーターとしては、例えば、lacプロモーター（IPTGで誘導）、cspAプロモーター（コールドショックで誘導）、araBADプロモーター（アラビノースで誘導）等が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、上記の誘導プロモーターを、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の高等真核細胞を宿主細胞とする場合の、ベクター除去機構として利用することもできる。即ち、ベクターに宿主細胞で機能する複製起点とその複製に必要なタンパク質をコードする核酸（例えば、動物細胞であれば、SV40 oriとラージT抗原、oriPとEBNA-1等）を搭載させ、該タンパク質のコードする核酸の発現を上記誘導プロモーターにより制御することにより、誘導物質存在下ではベクターは自律複製可能であるが、誘導物質を除去すると自律複製できなくなり、細胞分裂に伴って、ベクターは自然に脱落する（Tet-OFF系ベクターでは、逆にテトラサイクリンやドキシサイクリンの添加により自律複製できなくなる）。
本発明者らの研究によれば、DNA修飾酵素誘導因子を用いて細胞内在性のDNA修飾酵素の発現や活性を十分に上昇させれば、DNA修飾酵素結合モジュールを用いずとも、核酸配列認識モジュールのみを用いて、標的DNAを改変することができる場合があり得る。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、可能性のあるメカニズムとして、核酸配列認識モジュールが結合することにより生じる標的部位の二重らせん構造のひずみに、十分な量で存在する該DNA修飾酵素が接触できる頻度が増し、標的部位に作用して目的のDNAを改変することが考えられる。
従って、本発明の別の態様において、細胞内在性のDNA修飾酵素を誘導する因子で該細胞を刺激すること、及び選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールを、該二本鎖DNAと接触させることにより、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む方法が提供される。
以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．ベクター構築
１−１． Cas9、nCas9、nCas9-dVif、dVif-nCas9又はnCas9-PmCDA1発現ベクター
実施例で用いたDNA編集用プラスミドベクターの概要図を図１に示した。pNeoベクターをベースとして、ヒト胎児腎臓由来細胞（HEK293Ｔ細胞）へのトランスフェクションにより遺伝子導入を行うプラスミドベクターを構築した。プラスミドベクターとして、hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase (HPRT) 遺伝子のExon6を標的とした1907c (Cas9), 1907n (nCas9-PmCDA1), 1907n-cugi (nCas9-PmCDA1-UGI), 1921 (nCas9), 1923 (nCas9-dVif), 1924 (dVif-nCas9)及びコントロールとしてpNeoを用いた。1907c (Cas9), 1907n (nCas9-PmCDA1), 1907n-cugi (nCas9-PmCDA1-UGI)及び1921 (nCas9)は、非特許文献３にて用いられたベクターを基に、ガイドRNAの標的配列を、HPRT遺伝子のエクソン6の開始点から24番目〜43番目の配列（aatgcagactttgctttcct：配列番号１２）(site 3)に変更することにより構築した。nCas9(D10A)をコードするDNAとして、配列番号４で示される塩基配列からなるDNAを用いた。1923 (nCas9-dVif), 1924 (dVif-nCas9)については、次のように作製した。まず、1921 (nCas9)に対して制限酵素サイトの追加と不要な配列の除去を行ったベクター1922を構築した（配列番号１３）。HIVのdVif断片は、データベース上のVif配列であるGenBank: AF200477.1を参照した。前記配列のORFの28-576塩基について、433-435番目の塩基(CTA)をGCTに改変することにより、L145A変異が導入された人工遺伝子（塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。また、5’側にAvrIIの認識部位を付加し、3’側にNheIの認識部位を付加した塩基配列を配列番号３に示す。）を合成し、1922に対して制限酵素切断とライゲーションにより挿入することで、1923 (nCas9-dVif)及び1924 (dVif-nCas9)を作製した。図２に、作製したベクター1923 (nCas9-dVif)及び1924 (dVif-nCas9)の模式図を示す。
前記ベクターをHEK293T細胞に導入し、細胞内にて発現させることで、crRNA-tracrRNAと、Cas9、nCas9、nCas9-dVif、dVif-nCas9又はnCas9-PmCDA1との複合体を形成させた。
１−２． UGI-nCas9-dVif、dVif-nCas9-UGI、TopBv2（TopoIIβ isoform 2）-nCas9、nCas9-IQGAP2 466-547 -ZNF335 745-893 又はnCas9-PmCDA1-UGI発現ベクター
１−１．の手順を参考にして、HPRT遺伝子の特定領域を標的とした(標的配列（site 1）：tcgagatgtgatgaaggaga；配列番号２７)、ベクター1923-2(UGI-nCas9-dVif：配列番号２８）、ベクター1924-2(dVif-nCas9-UGI：配列番号２９)、ベクター1931（TopBv2452-591-nCas9：配列番号３０）及びベクター1932(nCas9-IQGAP2466-547-ZNF335745-893：配列番号３１)を作製し、また比較実験用にベクター1907(nCas9-PmCDA1-UGI：配列番号３２)を作製した。TopBv2、IQGAP2及びZNF335のフラグメントをコードする塩基配列は、それぞれデータベース上の配列であるrefseq番号: NM_001068、NM_006633及びNM_022095を参照して設計した。図３に、作製したベクター1923-2、1924-2、1931及び1932の模式図を示す。UGIをコードする塩基配列及びUGIのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１９及び２０に、TopBv2452-591をコードする塩基配列及びTopBv2452-591のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２１及び２２に、IQGAP2466-547をコードする塩基配列及びIQGAP2466-547のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２３及び２４に、ZNF335745-893をコードする塩基配列及びZNF335745-893のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２５及び２６に示す。
２．細胞株・培養・形質転換・発現誘導
２−１． １−１のベクターの導入系
上記１−１のベクターを用いた実験は、次の手順により行った。ヒト胎児腎臓由来細胞（HEK293Ｔ細胞）を用いた。細胞を、100μg/mL ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）及び10%胎仔ウシ血清（FBS）(Biosera, Nuaille, France)を添加したDME-glutamax培地(Thermo Fisher Scientific, USA)を用いて、37℃、5% CO2条件で培養を行った。細胞の回収には5%トリプシンを用いた。
ディープフリーザーで保存したHEK293T細胞を37℃のウォーターバスにて溶解し、5x106 cellsになるように75 T-flaskに播種した。1-3日間培養後に細胞を回収し、0.5x105cells/wellになるように24ウェルプレートの各ウェルに播種した。1-3日培養後に60-80%コンフルエント状態の各ウェルの細胞に対して、約1 μgの上記の各プラスミドDNAを3 μlのLipofectamine 2000(Life Technologies, Carlsbad, USA)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション5時間後にG418 (0.125 mg/mL) (InvivoGen, USA)とインターフェロンα(IFNα) (2000 IU)（Takara Bio） 又はインターフェロンγ (2000 IU)（PeproTech, Inc.）を含む培地に交換した。コントロールとして、G418のみを含む培地を用いた。
２−２． １−２のベクターの導入系
上記１−２のベクターを用いた実験では、次の手順により行った。細胞(HEK293あるいはHepG2)を1x105cells/wellとなるように24ウェルプレートの各ウェル播種し、一晩培養した。次に、FugeneHD（Promega）を利用してトランスフェクション(DNA 1μg/well, FugeneHD 1.5 μl/well)し、16時間後に培地を交換した。この際、HEK293の場合は、OPTI-MEMから、DMEM+10%FBS+P/S(ペニシリン-ストレプトマイシン)+Puromycin (1 μg/ml) +/- IFNα(10000 U/ml)に交換し、HepG2の場合は、OPTI-MEMから、DMEM+10%FBS+P/S+1% NEAA(非必須アミノ酸)+Puromycin (1 μg/ml)+/-IFNa (10000U/ml)に交換した。6日間 puromycinによるセレクションを継続した。この際、48時間毎に培地を交換した。
３．配列解析
３−１． １−１のベクターの導入系
上記２−１により回収した細胞は、次の手順によりゲノムDNAを抽出し、配列解析を行った。配列解析のため、培養3日後に各細胞を回収し，ゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型としてHPRT遺伝子のExon6を標的としたフォワードプライマー(5’-ATTCCAGAATATCTCCATGTAGATTTTGGT-3’：配列番号１４) 及びリバースプライマー (5’-AATTCCAGGAGGTCCAGATCTTCAGGGCCC-3’：配列番号１５)を用いて標的領域を増幅した。増幅したDNA断片を鋳型としてフォワードプライマー(5’-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATTCCAGAATATCTCCATGTAGATTTTGGT-3’：配列番号１６) 及びリバースプライマー(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTAGGCAAGGAAGTGACTGTAATTATGAGC-3’：配列番号１７) を用いて、NGS解析用のアダプターを付加した約300 bpの増幅断片を得た。各サンプルにインデックス配列を付加した後に、MiSeq Reagent Kit v3及びMiSeq sequencing system（イルミナ）を用いてペアエンドによるディープシークエンシングを行った。解析にはCLC Genomics Workbench 7.0（フィルジェン）を用いた。結果を表１に示す。表中、indelは挿入欠失を示し、数字はヌクレオチドの置換割合（％）を示す。nCas9とdVifとの複合体を発現させた細胞を、インターフェロンの存在下で培養した場合に、挿入欠失及び／又は塩基置換が生じ、塩基置換の大部分は、シトシンからチミンへの置換であった。また、挿入欠失及び塩基置換の割合は、外因性のデアミナーゼを用いた従来法（Target-AID）と同程度であった。なお、表中の核酸塩基の19番目のTと20番目のCにおいて、塩基の置換が多く認められるが、pNeoにおいても置換が高頻度で認められるため、これらの変異はシークエンスのエラーであると考えられる。
３−２． １−２のベクターの導入系
上記２．２により回収した細胞は、次の手順によりゲノムDNAを抽出し、配列解析を行った。HEK293細胞は、6日目時点で回収し、HepG2細胞は48時間の回復培養後に回収し、NucleoSpin Tissue XS（タカラバイオ）を使用して、ゲノムDNAを抽出した。1st PCR (DNAポリメラーゼ：KOD FX NEO（東洋紡）、プライマーセット：フォワードプライマー(5’-TTTGGTACTTGTTCAGCTTTATTCAAGTGG-3’：配列番号３３)；リバースプライマー(5’-ACAATAGCTCTTCAGTCTGATAAAATCTAC-3’：配列番号３４)）を行い、電気泳動でバンド確認し、Exo/Sap (Thermo Fisher Scientific)を用いて精製し、1100 bpの増幅断片を得た。次に、精製後のPCR産物を鋳型として、2nd PCR (DNAポリメラーゼ：KOD FX NEO、プライマーセット：フォワードプライマー(5’-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGGACTGAACGTCTTGCTC-3’：配列番号３５)；リバースプライマー(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT CAGTCATAGGAATGGATCTATCAC-3’：配列番号３６)）を行い、電気泳動でバンド確認し、Exo/Sapを用いて精製し、220 bpの増幅断片を得た。さらに、精製後のPCR産物を鋳型として、3rd PCR (Q5 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、プライマーセット：配列番号１４及び１５)を行い、AMPure XP（Beckman Coulter）を用いて精製し、NGS解析用のアダプターを付加した約150 bpの増幅断片を得た。AMPure XPを用いて精製した後のサンプルを、Multina(島津)でバンド確認した。サンプルを、Multinaで得たバンド(濃度)を参考にプールし、Qubit (Thermo Fisher Scientific)を利用してサンプルの濃度を測定し、サンプルを、10 nMとなるように希釈し、10 nMであることをQubitで確認した。10 nMのサンプルを1 nMに希釈し、1 nMのサンプルを変性処理した。その後、1.5 pMとなるように希釈した。4 nM PhiX (Illumina）を変性処理し、その後1.5 pMとなるように希釈した。500 μl のサンプル(1.5 pM)と100 μlのPhiX (1.5 pM)を混合し、カートリッジにアプライした。Miniseq (Illumina）をスタートし、シークエンシングを行った。結果を表２に示す。表中、indelは挿入欠失を示し（ただし、表２ではindelは検出されなかった）、数字はヌクレオチドの置換割合（％）を示す。UGI、nCas9及びdVifの複合体を発現させたHEK293細胞を、インターフェロンの存在下で培養した場合に、シトシンからチミンへの塩基置換が生じた。同様に、nCas9と、TopBv2又はIQGAP2及びZNF335との複合体を発現させた細胞を、インターフェロンの存在下で培養した場合に、シトシンからチミンへの塩基置換が生じた。また、UGI、nCas9及びdVifの複合体を発現させたHepG2細胞を、インターフェロンの存在下で培養した場合に、シトシンからチミンへの塩基置換が生じた。HepG2細胞を用いた場合には、塩基置換の割合は、外因性のデアミナーゼを用いた従来法（Target-AID）と同程度であった。
本出願は、日本で出願された特願２０１７−０５６７２７（出願日：２０１７年３月２２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
本発明により、DNAの改変反応において外来の酵素を用いないため安全で、しかもDNA編集に用いるコンストラクトの小型化によりデリバリー効率が向上したDNA編集が可能となり、極めて有用である。

Claims (19)

  1. 細胞の有するDNAの標的化された部位を改変する方法であって、該細胞に内在するDNA修飾酵素を誘導する因子で該細胞を刺激すること、及び選択されたDNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体を、該DNAと接触させることにより、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法。
  2. 前記標的化された部位の改変が、前記DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく行われる、請求項１記載の方法。
  3. 前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記DNA修飾酵素結合モジュールが、DNA修飾酵素に対する抗体、ペプチドアプタマー及び核酸アプタマーからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記DNA修飾酵素結合モジュールが、Vif、Betタンパク質、TopoIIβ、IQGAP2及びZNF335並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記DNA修飾酵素結合モジュールの標的酵素がデアミナーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記デアミナーゼがAPOBECファミリーに属するタンパク質である、請求項７記載の方法。
  9. 核酸配列認識モジュールとDNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体が、さらに塩基除去修復のインヒビターを結合したものである、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 前記DNA修飾酵素を誘導する因子がインターフェロン、コハク酸デヒドロゲナーゼ阻害剤及び低酸素条件からなる群より選択される１以上である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記DNAと前記複合体との接触が、前記細胞に該複合体をコードする核酸を導入し、該細胞を培養して該複合体を細胞内で発現させることにより行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. DNA修飾酵素を誘導する因子で細胞を刺激することが、該細胞を該因子の存在下でインキュベートすることにより行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記細胞が脊椎動物細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記脊椎動物細胞が哺乳類動物細胞である、請求項１３記載の方法。
  15. 前記DNAが二本鎖DNAである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、DNA修飾酵素結合モジュールとが結合した複合体であって、該核酸配列認識モジュールは、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムであり、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換し又は欠失させ、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、複合体。
  17. 請求項１６記載の複合体をコードする核酸。
  18. 請求項１６記載の複合体又は請求項１７記載の核酸を含有してなる、DNAの標的化された部位の改変剤。
  19. 細胞の有する二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、該細胞に内在するDNA修飾酵素を誘導する因子で該細胞を刺激すること、及び選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールを、該二本鎖DNAと接触させることにより、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法。
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