JP2022095633A - ヌクレアーゼ非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】標的化された遺伝子編集のためのシステムおよびその関連した用途を提供する。
【解決手段】（ｉ）配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）（ａ）標的核酸の配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含む核酸標的化モチーフ、（ｂ）前記配列標的化タンパク質に結合可能なＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（ｃ）リクルーティングＲＮＡモチーフを含むＲＮＡスキャホールドまたはこれをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉｉ）（ａ）前記リクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能なＲＮＡ結合ドメイン、（ｂ）リンカー、および（ｃ）ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の酵素活性を有するエフェクタードメインを含む非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、を含む、宿主細胞を提供する。
【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１５年７月１５日に出願された米国仮出願第６２／１９２，８７６号
の優先権を主張するものである。当該出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み
込まれている。

政府の利益
本明細書に開示された発明の少なくとも一部は、国務省フルブライト留学生プログラム
からの政府支援（グラントＮｏ．１５１３０８１６）を受けてなされたものである。した
がって、米国政府は本発明についてある種の権利を有する。

発明の分野
本発明は、標的化された遺伝子編集のためのシステムおよびその関連した用途に関する
。

標的化された遺伝子の編集は、真核細胞、胚および動物を遺伝的に操作する強力なツー
ルである。これによれば、標的化されたゲノムの位置および／または特定の染色体の配列
を削除し、不活性化し、または修飾することができる。現状のいくつかの方法は、亜鉛フ
ィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔ
ＡＬＥＮ）のような人工的なヌクレアーゼ酵素の使用に依拠している。これらのキメラヌ
クレアーゼは、プログラム可能な、非特異的ＤＮＡ切断ドメインに連結した配列特異的Ｄ
ＮＡ結合モジュールを有している。それぞれの新たなゲノム標的が生じると、新規な配列
特異的ＤＮＡ結合モジュールを有する新たなＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを設計する必要があ
ることから、カスタム設計によるこれらのヌクレアーゼの調製は高価かつ時間のかかるも
のとなりがちである。また、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性はオフターゲットの切断を
媒介しうるものである。近年開発されたゲノム修飾技術は、細菌の、ＲＮＡガイド化ＤＮ
Ａエンドヌクレアーゼである、規則間隔短鎖反復回文配列クラスター（ＣＲＩＳＰＲ；ｃ
ｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐ
ａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を利用してＤＮ
Ａ標的部位における特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導している。このＲＮＡ－Ｃａｓ
９複合体はその同族ＤＮＡを認識し、これと塩基対合することでＤＳＢを形成して標的を
切断する。

しかしながら、未解決の主要な問題の１つは、体細胞における遺伝子変異をいかにして
収集するかということである。今のところ、現状の技術における共通のエフェクターはヌ
クレアーゼであり、これはＤＮＡのＤＳＢをもたらし、これがさらに相同組み換えや非相
同末端結合といった細胞の経路の不活性化を引き起こす。このプロセスは多くの主要な欠
点を抱えている。第１に、末端結合による末端生成物の予期せぬ性質により、ＤＳＢが確
率論的で予期できないようなインフレーム変異およびフレームシフト変異の双方を引き起
こし、このことが直接的な臨床適用の用途を制限している。第２に、ＤＳＢは染色体転座
のような非局所的な変異原性イベント（これはこの手法の望ましくない結果である）を生
じる可能性を秘めている。インビボではこれらの変化は潜在的に有害なものでありうる。
第３に、修復または修正には通常、ＤＳＢ媒介性の相同組み換えが必要とされるが、ほと
んどの体組織／体細胞（そこでの治療が最も問題となる）においてその活性は低いか、ま
たは存在しない。

このように、ヌクレアーゼを利用した現状の技術では遺伝子編集への適用の可能性が限
られており、二本鎖切断を引き起こすヌクレアーゼ活性に依拠しない標的化遺伝子修飾の
技術が求められている。

本発明は、標的化された遺伝子編集システムおよびその関連した用途を提供することに
より、上記の要求に対処するものである。

具体的に、本発明の一形態によれば、
（ｉ）配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ＲＮＡスキャホールドまたはこれをコードするＤＮＡポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌ
クレオチドと、
を含むシステムが提供される。上記ＲＮＡスキャホールドは、（ａ）標的核酸の配列に相
補的なガイドＲＮＡ配列を含む核酸標的化モチーフ、（ｂ）前記配列標的化タンパク質に
結合可能なＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（ｃ）リクルーティングＲＮＡモチーフを含む
。上記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質は、（ａ）前記リクルーティングＲＮ
Ａモチーフに結合可能なＲＮＡ結合ドメイン、（ｂ）リンカー、および（ｃ）エフェクタ
ードメインを含む。また、上記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質は酵素活性を
有する。

上記システムについて、上記配列標的化タンパク質はＣＲＩＳＰＲタンパク質でありう
る。好ましくは、上記配列標的化タンパク質はヌクレアーゼ活性を有していないものであ
る。上記配列標的化タンパク質の例としては、化膿連鎖球菌、Ｂ群溶血性連鎖球菌、黄色
ブドウ球菌、サーモフィルス菌、サーモフィルス菌、髄膜炎菌およびトレポネーマ・デン
ティコラからなる群から選択される種のｄＣａｓ９が挙げられる。

上記ＲＮＡスキャホールドにおいて、上記リクルーティングＲＮＡモチーフおよび上記
ＲＮＡ結合ドメインは、以下のものからなる群から選択される対でありうる：
（１）テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質またはそのＲＮＡ結合部位；
（２）テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質またはそのＲＮＡ結合部
位；
（３）ＭＳ２ファージオペレーターステムループおよびＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ
）またはそのＲＮＡ結合部位；
（４）ＰＰ７ファージオペレーターステムループおよびＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ
）またはそのＲＮＡ結合部位；
（５）ＳｆＭｕファージＣｏｍステムループおよびＣｏｍＲＮＡ結合タンパク質またはそ
のＲＮＡ結合部位；並びに、
（６）非天然のＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドまたはそのＲＮＡ結
合部位。

上記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質において、上記リンカーの配列の長さ
は０～１００（例えば、１～１００、５～８０、１０～５０および２０～３０）のアミノ
酸長でありうる。上記酵素活性は、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デ
メチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性
、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トラ
ンスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ
活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性でありうる。ある実施形態では、上
記酵素活性は脱アミノ化活性（例えば、シトシン脱アミノ化活性もしくはアデノシン脱ア
ミノ化活性）、メチルトランスフェラーゼ活性またはデメチラーゼ活性である。上記ＲＮ
Ａ結合ドメインは、Ｃａｓ９、その機能的等価物およびそのＲＮＡ結合ドメインのいずれ
でもない。

上述したシステムの構成要素（ｉ）～（ｉｉｉ）の１つ以上をコードする単離された核
酸、当該核酸を含む発現ベクター、または当該核酸を含む宿主細胞もまた、提供される。

第２の形態として、本発明によれば、部位特異的な標的ＤＮＡの修飾方法が提供される
。この方法は、上記標的核酸を、上記システムの構成要素（ｉ）～（ｉｉｉ）に接触させ
ることを含む。当該標的核酸は、細胞中に存在するものでありうる。当該標的核酸は、Ｒ
ＮＡであってもよいし、染色体外のＤＮＡであってもよいし、染色体上のゲノムＤＮＡで
あってもよい。当該細胞は、古細菌の細胞、細菌の細胞、真核細胞、真核の単細胞生物、
体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物の細胞、藻の細胞、動物の細胞、無脊椎動物の細胞、脊
椎動物の細胞、魚の細胞、カエルの細胞、トリの細胞、哺乳動物の細胞、ブタの細胞、ウ
シの細胞、ヤギの細胞、ヒツジの細胞、齧歯動物の細胞、ラットの細胞、マウスの細胞、
非ヒト霊長類の細胞およびヒトの細胞からなる群から選択されうる。

上記細胞は、ヒトまたは非ヒトの被験体中のものであるか、これ由来のものでありうる
。当該ヒトまたは非ヒトの被験体は、遺伝子の遺伝子変異を有している。ある実施形態で
は、上記被験体は当該遺伝子変異に起因する障害または当該障害を有するリスクを抱えて
いるものである。この場合、上記部位特異的な修飾は、上記遺伝子変異を修正するか、ま
たは上記遺伝子の発現を不活性化する。他の実施形態では、上記被験体は病原体を有して
いるか、または当該病原体に曝露されるリスクを抱えているものであり、上記部位特異的
な修飾は、上記病原体の遺伝子を不活性化する。

本発明はさらに、上述したシステムまたはその１つ以上の構成要素を含むキットをも提
供する。当該システムは、再構成および／または希釈のための試薬、並びに核酸またはポ
リペプチドを宿主細胞中に導入するための試薬からなる群から選択される１つ以上の構成
要素をさらに含んでもよい。

以下、本発明の１つ以上の実施形態の詳細について記載する。当該記載および特許請求
の範囲の記載から、本発明の他の特徴、目的および利点については明らかとなるものと思
われる。

図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄおよび図１Ｅは、インビボでの標的化された遺伝子編集のための例示的なヌクレアーゼ非依存的なＣａｓＲｃｕｒｅまたはＣＲＣプラットフォームの一連の概略図である。図１Ａ：当該プラットフォームの構成要素を示し、左から右へ、（１）配列標的化成分であるｄＣａｓ９、（２）（配列標的化のための）ガイドＲＮＡモチーフを含むＲＮＡスキャホールド、（ｄＣａｓ９への結合のための）ＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（エフェクター－ＲＮＡ結合タンパク質融合物をリクルートするための）リクルーティングＲＮＡモチーフ、並びに、（３）エフェクター－ＲＮＡ結合ドメイン融合タンパク質である。このシステムは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（右）の特定のヌクレオチドを標的化するようにプログラムされうる。 図１Ｂ：上記エフェクタータンパク質がモノマーとして機能する場合、当該システムは、標的部位の上流（左）または下流（右）のいずれかにおける単一の部位を標的とすることができる。 図１Ｃ：エフェクタータンパク質が適切な触媒作用のために二量化を必要とする場合には、標的部位の上流および下流の配列を同時に標的とするように当該システムを多重化させることができ、これによってエフェクタータンパク質の二量化を可能とする（右）。あるいは、単一部位へとエフェクタータンパク質を動員するだけで、隣接するエフェクタータンパク質に対するその親和性を上昇させて二量化を促進させるには十分かもしれない（右）。 図１Ｄ：標的部位に動員され配置された四量体エフェクター酵素の例であり、これは二重の標的化（左）または単一の標的化（右）により達成されうる。 図１Ｅ：ＲＮＡである標的を編集するのに（例えば、レトロウイルスの不活性化に）用いられうるシステムである。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆおよび図２Ｇは、ＡＩＤの標的化された動員によってヌクレオチド変換の部位特異的な変換が可能であることを示す。図２Ａ：大腸菌ｒｐｏＢ遺伝子のＲＲＤＲクラスターＩ（配列番号：２３および配列番号：２４）に沿った標的領域の概要である。図２Ａには、（上段）ＤＮＡ配列（配列番号：２３）にＰＡＭ（四角囲み）および変異可能な位置（矢印）を示したもの、（中段）これらの実験に用いられるｇＲＮＡ（すべてのｇＲＮＡはテンプレート鎖（ＴＳ、－）を標的化するようにプログラムされていた）の結合部位、（下段）タンパク質配列（配列番号：２５）にリファンピシン耐性に関与する決定的なアミノ酸（矢印）を示したもの、が記載されている。 図２Ｂ：大腸菌ＭＧ１６５５細胞を所定のｇＲＮＡで処理し、１２０μＭのリファンピシンを含有するプレート上で選択した。 図２Ｃ：図２Ｂの上段パネルから算出された変異頻度である。 図２Ｄ：ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ ｇＲＮＡを用いた^ＡＩＤＣＲＣ処理（上段、配列番号：２６）および未処理の細胞（中段、配列番号：２７）からの代表的な配列決定の結果である。Ｃ１５９２＞Ｔ変異により、タンパク質配列におけるＳ５３１Ｆの変化が生じており（下段、配列番号：２８および配列番号：２９）、この変異はＲｉｆを誘導することが知られている（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ－Ｍａｈｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４１８， ９９－１０４ （２００２）， Ｘｕ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８７， ２７８３－２７９２， ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．１８７．８．２７８３－２７９２．２００５ （２００５）， ａｎｄ Ｚｅｎｋｉｎ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４９， １５８７－１５９０， ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．４９．４．１５８７－１５９０．２００５ （２００５））。ここで、修飾されたヌクレオチドおよびアミノ酸残基を、ＣおよびＳ（野生型）並びにＴおよびＦ（変異体）と示す。 図２Ｅ：ｒｐｏＢ＿３、ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４およびスクランブルのそれぞれのｇＲＮＡ（配列番号：３０～配列番号：４１）を用いた^ＡＩＤＣＲＣ処理による変異の分布である。 図２Ｆ：これらのデータから、ＣＲＣは、選択的に５’末端により近い側で、対を形成していない鎖（プロトスペーサー）上に位置する標的シトシン残基を能動的に脱アミノ化することが示唆される。 図３Ａおよび図３Ｂは、ＣＲＣシステムのモジュラリティを示す：標的化モジュールのエンジニアリングにより変異の頻度が増加する。図３Ａ：標的化モジュールをｄＣａｓ９からｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａに改変することで、ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ ｇＲＮＡを用いて標的化したときのリファンピシンプレート上での生存画分の観点でのシステムの効率は、対コントロール比で１８倍（^ＡＩＤＣＲＣ）から４３倍（^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ）に増加した。 図３Ｂ：標的としてｒｐｏＢ＿ＴＳ－４（配列番号：３０～配列番号：３２）を用いた^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ処理の変異の分布である。Ｃ１５９２は１００％のクローンで改変され、そのうち７５％がＣからＴへ変異し、２５％がＣからＡへ変異した。 図４Ａおよび図４Ｂは、ＣＲＣシステムのモジュラリティを示す：エフェクターモジュールのエンジニアリングにより変異の頻度が増加する。図４Ａ：ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（^{ＡＰＯ３Ｇ}ＣＲＣ_Ｄ１０Ａ）およびＡＰＯＢＥＣ１（^{ＡＰＯ３Ｇ}ＣＲＣ_Ｄ１０Ａ）について、プロトタイプシステムである^ＡＩＤＣＲＣと共存させてエフェクターとして試験した。ＡＰＯＢＥＣ１を用いて処理すると、ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ ｇＲＮＡを用いて標的化したときの変異の頻度は^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａに対して増加した。^{ＡＰＯ３Ｇ}ＣＲＣ_Ｄ１０Ａの活性は^ＡＩＤＣＲＣよりも低かった。 図４Ｂ：標的としてｒｐｏＢ＿ＴＳ－４（配列番号：３０～配列番号：３２）を用いた^Ａｐｏ１ＣＲＣ_Ｄ１０Ａ処理の変異の分布（％）である。Ｃ１５９２＞Ｔの変換は１００％のクローンで観察された。また、分析したクローンのうち２５％は二重変異を有しており、Ｃ１５９０＞Ｔに変異していた（アミノ酸の変化はなし）。 図５Ａおよび図５Ｂは、ＣＲＣシステムのモジュラリティを示す：ＲＮＡ動員スキャホールドの数を増やすと変異の頻度が増加する。図５Ａ：同じ位置を標的化したまま動員スキャホールドの数を増やすと、変異の効率は対応するスクランブルｇＲＮＡコントロールに対して５０倍（ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ １×ＭＳ２）から１４０倍（ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ ２×ＭＳ２）に増加した。 図５Ｂ：標的としてｒｐｏＢ＿ＴＳ－４＿２×ＭＳ２（配列番号：３０～配列番号：３２）を用いた^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ処理の変異の分布（％）である。Ｃ１５９２は１００％のクローンで改変され、そのうち６２．５％がＣからＴへ変異し、３７．５％がＣからＡへ変異した。 図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄは、ＣＲＣシステムにより哺乳動物の細胞の染色体外ＤＮＡにおける標的ヌクレオチドを修飾してタンパク質の機能を回復させることができることを示す。図６Ａ：これらの実験で用いられるコンストラクトの概要図である。（上段）システムの２つのタンパク質構成要素の化学量論的な濃度を保証するため、タンパク質をコードする遺伝子を、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）の制御下、多シストロン性コンストラクトとしてクローニングした。（下段）５’－Ｇまたは５’－Ａを有する標的を発現させるため、それぞれＵ６プロモーターまたはＨ１プロモーターの制御下でキメラｇＲＮＡ＿ＭＳ２コンストラクトをクローニングした。 図６Ｂ：_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ欠損フルオロフォアの周辺の標的領域の概要図である。図６Ｂには、（上段）これらの実験に用いられるｇＲＮＡ（すべてのｇＲＮＡは非テンプレート鎖（ＮＴ、＋）を標的化するようにプログラムされていた）の結合部位、（中段）ＤＮＡ配列（配列番号：４２および配列番号：４３）にＰＡＭ（四角囲み）および変異可能な位置（矢印）を示したもの、（下段）タンパク質配列（配列番号：４４）にＥＧＦＰフルオロフォアを無効化する変異アミノ酸（矢印）を示したもの、が記載されている。 図６Ｃ：２９３Ｔ細胞における_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃの標的化である。_{ｎ ｆ}ＥＧＦＰ^Ｙ６６ＣＮＴ－１および_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６ＣＮＴ－２（より低い効率であった）を用いた処理ではＥＧＦＰシグナルが誘導されたが、スクランブルｇＲＮＡを用いた場合にはシグナルは検出されなかった。また、ＣＲＣプラットフォームを、動員のためにはシチジンデアミナーゼタンパク質のＣａｓ９タンパク質への直接的な融合を必要とし、効率の改善のためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）の共発現を必要とする別の遺伝子編集システム（ＢＥ３）と比較した。ＢＦ、明野。 図６Ｄ：標的化ｇＲＮＡとして_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６ＣＮＴ－１を用いた^{Ａ ＩＤ}ＣＲＣ_Ｄ１０ＡシステムおよびＢＥ３システムからのＧＦＰ陽性細胞の定量（％）である。 図７Ａおよび図７Ｂは、ＣＲＣシステムによる処理によって哺乳動物の細胞における内在性の遺伝子での部位特異的なヌクレオチド変換が引き起こされうることを示す。図７Ａ：チャイニーズハムスターのＨＰＲＴ遺伝子のエクソン３上の標的領域の概要図である。図７Ａには、（上段）ＤＮＡ配列（配列番号：４５および配列番号：４６）にＰＡＭ（四角囲み）および変異可能な位置（矢印）を示したもの、（中段）これらの実験に用いられるｇＲＮＡ（当該ｇＲＮＡはテンプレート鎖（ＴＳ、－）を標的化するようにプログラムされていた）の結合部位、（下段）タンパク質配列（配列番号：４７）にＨＰＲＴタンパク質の不安定化に関与する決定的なアミノ酸（矢印）を示したもの、が記載されている。 図７Ｂ：^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０ＡまたはＢＥ３を用いたＨＰＲＴの標的化後の、あるいは処理していない６－ＴＧ耐性Ｖ７９－４細胞の定量である。未処理の細胞と比較すると、^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａ処理における生存画分は未処理の細胞よりも１４０倍増加したが、ＢＥ３処理では４０倍しか増加しなかった。

現状の遺伝子特異的な編集技術は、そのほとんどがヌクレアーゼ誘導性のＤＮＡのＤＳ
Ｂと、これによるＤＳＢ誘導性の相同組み換えに基づくものである。ほとんどの体細胞に
おいて相同組み換えの活性は低いかまたは存在しないことから、ほとんどの疾患において
、体組織での病理学的な遺伝子変異の治療的な修正のためのこれらの技術の用途は制限さ
れている。

本明細書に記載されているように、本発明の少なくとも一部は、ＤＮＡ配列に標的化さ
れた遺伝子またはＲＮＡ転写物の編集を可能とするプラットフォームまたはシステムに基
づくものである。このシステムはヌクレアーゼ活性に基づくものではなく、ＤＳＢを生成
するものでもなく、ＤＳＢ媒介性の相同組み換えに依拠するものでもない。さらに、当該
プラットフォームのＲＮＡスキャホールドの設計はモジュラー式であり、これによって任
意の所望のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を極めてフレキシブルで簡便な方式により標的化
することが可能となる。本質的に、このアプローチによれば、幹細胞などの体細胞におけ
る実質的にいかなるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列に対しても、ＤＮＡまたはＲＮＡの編集
酵素を導くことが可能である。標的のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を正確に編集すること
を通じて、当該酵素は、遺伝子疾患においては変異した遺伝子を修正し、ウイルス感染細
胞においてはウイルスゲノムを不活性化し、神経変性疾患においては疾患の原因タンパク
質の発現を防止し、がんにおいてはがん原性タンパク質をサイレンシングすることができ
る。また、このアプローチは生体外で幹細胞または前駆細胞のゲノムを編集することによ
る細胞ベースの治療にも用いられうる。治療用途のほかにも、上記システムは、強力な研
究ツールとして任意の有機体のゲノムの標的化された修飾に広く適用可能である。

遺伝子編集プラットフォーム
本発明の一形態によれば、遺伝子編集プラットフォームが提供され、これによって現状
のヌクレアーゼおよびＤＳＢ依存的なゲノム工学技術および遺伝子編集技術における上述
したような制限が克服される。当該プラットフォームはＣａｓＲｃｕｒｅシステムまたは
ＣＲＣシステムと称されるが、３つの機能的な構成要素を備えている：（１）配列の標的
化のために設計された、ヌクレアーゼを含まないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのモジュー
ル；（２）当該プラットフォームを標的配列へと導くとともに修正モジュールを動員する
ｍためのＲＮＡスキャホールドベースのモジュール；および（３）シトシンデアミナーゼ
類（例えば、活性化誘導シトシンデアミナーゼ（ＡＩＤ）等）などの、エフェクター修正
モジュールとしての非ヌクレアーゼＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素、である。ＣａｓＲｃｕｒｅ
システムによれば、これらが一体となって、特定のＤＮＡ／ＲＮＡ配列へのアンカリング
、フレキシブルかつモジュラー式のエフェクターＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素の特定配列への
動員、および遺伝子情報（特に、点変異）を修正するための体細胞において活性な細胞経
路の誘導、が可能となる。

図１に、例示的なＣａｓＲｃｕｒｅシステムの概要図を示す。より具体的に、当該シス
テムは、図１Ａに示される３つの構造的および機能的な構成要素を備えている：（１）配
列標的化モジュール（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質）；（２）配列の認識およびエフェ
クターの動員のためのＲＮＡスキャホールド（ガイドＲＮＡモチーフ、ＣＲＩＳＰＲ Ｒ
ＮＡモチーフおよびリクルーティングＲＮＡモチーフを含むＲＮＡ分子）；並びに（３）
エフェクター（リクルーティングＲＮＡモチーフに結合する小タンパク質に融合した、Ａ
ＩＤなどの非ヌクレアーゼＤＮＡ修飾酵素）、である。これらの３つの構成要素は、単一
の発現ベクター中に、または２つもしくは３つの異なる発現ベクター中に構築されうる。
これらの３つの特定の構成要素の全体性および組み合わせにより、技術的なプラットフォ
ームが構成される。

本明細書に開示されているように、動員メカニズムには多くの明確な違いが存在する：
ＲＮＡスキャホールド媒介性の動員システム（ＣＲＣ）に対し、Ｃａｓ９のエフェクター
タンパク質への直接的な融合（ＢＥ３）。後述する実施例に示されている結果から、ＲＮ
Ａスキャホールド媒介性の動員は、直接的な融合と比較して、染色体外の標的（図６Ｃお
よび図６Ｄ）並びに内在性の遺伝子（図７Ｂ）の双方においてより効率的であることがわ
かる。また、上記ＣＲＣシステムはＤＮＡ修復酵素であるＵＮＧの阻害に依拠していない
のに対し、ＢＥ３は強力なＵＮＧ阻害剤ペプチド（ＵＧＩ）を用いるものである。広範囲
のまたは局所的なＤＮＡ修復の阻害は、望ましくない、制御不能な、潜在的に有害な結果
をもたらす可能性がある。そして、ＣＲＣシステムのモジュラー式の設計によれば、フレ
キシブルなシステムの構築が可能となる。モジュールは互換性を有しており、異なるモジ
ュールの多数の組み合わせも容易に達成可能である。これに対して、直接的な融合の場合
、新たなモジュールを構築するには常に新たな融合プロセスを必要とする。さらに、ＲＮ
Ａスキャホールド媒介性の動員によれば、エフェクタータンパク質のオリゴマー化を促進
しやすいのに対し、直接的な融合では立体障害のためにオリゴマーの形成は不可能である
。

ａ．配列標的化モジュール
上記システムの配列標的化のための構成要素は、細菌の種に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
ａｓシステムに基づくものである。本来の機能的な細菌のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
は３つの構成要素を必要とする：ヌクレアーゼ活性を提供するＣａｓタンパク質と、ＣＲ
ＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称
される２つの短い非コードＲＮＡ種であり、この２つのＲＮＡ種はいわゆるガイドＲＮＡ
（ｇＲＮＡ）を形成する。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲは最もよく特徴付けられているシス
テムの１つであり、４つの連続したステップにより標的化されたＤＮＡの二本鎖切断を引
き起こす。第１に、２つの非コードＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ
）がＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ－ｃｒＲ
ＮＡ分子の繰り返し領域にハイブリダイズし、独自のスペーサー配列を有する成熟ｃｒＲ
ＮＡ分子へのｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ分子の成熟を媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒ
ａｎｃｒＲＮＡ複合体（すなわち、いわゆるｇＲＮＡ）がＣａｓヌクレアーゼ（Ｃａｓ９
など）に対し、ｃｒＲＮＡ上の上記スペーサー配列と標的ＤＮＡ（これは３ヌクレオチド
（ｎｔ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する）上のプロトスペーサー配
列の相補鎖との間のワトソン－クリック塩基対を介したＤＮＡの標的化を指示する。ＰＡ
Ｍ配列はＣａｓ９の標的化に必須である。最後に、Ｃａｓのヌクレアーゼが標的ＤＮＡの
切断を媒介することにより、標的部位内において二本鎖切断を引き起こす。その本来の文
脈において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、度重なるウイルス感染から細菌を保護す
る適応免疫機構として機能し、ＰＡＭ配列は自己／非自己の認識シグナルとして作用し、
Ｃａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ活性を有している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは
、インビトロおよびインビボの双方において、遺伝子編集のための非常に大きな可能性を
有することが判明している。

本明細書に開示された発明においても、配列の認識機構は同様にして達成可能である。
すなわち、変異体Ｃａｓタンパク質（例えば、そのヌクレアーゼ触媒ドメインに変異を有
することでヌクレアーゼ活性を持たないｄＣａｓ９タンパク質、または触媒ドメインの１
つに部分的に変異を有することでＤＳＢを生成するためのヌクレアーゼ活性を持たないｎ
Ｃａｓ９など）は、短い（典型的には２０ヌクレオチド長の）スペーサー配列を含みＣａ
ｓタンパク質をその標的であるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列へと導く非コードＲＮＡスキ
ャホールド分子を特異的に認識する。後者は３’ＰＡＭの横に位置している。

種々のＣａｓタンパク質が本発明において用いられうる。Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳ
ＰＲ関連タンパク質またはＣＲＩＳＰＲタンパク質との語は互換的に使用可能であり、Ｒ
ＮＡによりガイドされるＤＮＡ結合を伴うＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓのタイプＩシステム、タ
イプＩＩシステムまたはタイプＩＩＩシステムの、またはこれ由来のタンパク質を意味す
る。適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非制限的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ
４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃ
ａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０
、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓ
ｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、
Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃ
ｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃ
ｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ
１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃ
ｓｆ４およびＣｕ１９６６が挙げられる。例えば、ＷＯ２０１４／１４４７６１、ＷＯ２
０１４／１４４５９２、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＵＳ２０１４／０２７３２２６お
よびＵＳ２０１４／０２７３２３３が参照され、これらの内容はその全体が参照により本
明細書に組み込まれる。

一実施形態において、Ｃａｓタンパク質はタイプＩＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム由
来のものである。例示的な実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質で
あるか、またはこれ由来のものである。当該Ｃａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌、サー
モフィルス菌、ストレプトコッカス・エスピー、ノカルジオプシス・ダソンヴィレイ、ス
トレプトマイセス・プリスチネスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、
ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランジウム・ロセウム、スト
レプトスポランジウム・ロセウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス
・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、エクシグオバクテリウム ・
シビリクム、ラクトバチルス・デルブリッキィ、ラクトバチルス・サリバリウス、ミクロ
シラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、
ポラロモナス・エスピー、クロコスファエラ・ワトソニー、シアノセイス・エスピー、ミ
クロシスティス アエルギノーサ、シネチョコッカス・エスピー、アセトハロビウム・ア
ラビティカム、アモニフェクス・デジェンシー、カルディセルロシルプター・ベスシー、
カンジダトゥス・デスルホルディス、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、
フィネゴルディア・マグナ、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマキュラム
・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フ
ェロオキシダンス、アロクロマティウム・ビノサム、マリノバクター・エスピー、ニトロ
ソコッカス・ハロフィルス、ニトロソコッカス・ワトソニー、シュードアルテロモナス・
ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガ
ータム、アナベナ・バリアビリス、ノデュラリア・スピミゲナ、ノストック・エスピー、
アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ・エスピー
、リングビア・エスピー、ミクロコレウス・クソノプラステス、オスキアトリア・エスピ
ー、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌスまたはアカリオクロリス・マリ
ナ由来のものでありうる。一般に、Ｃａｓタンパク質は少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメ
インを含む。当該ＲＮＡ結合ドメインはガイドＲＮＡと相互作用する。Ｃａｓタンパク質
は野生型のＣａｓタンパク質であってもよいし、ヌクレアーゼ活性を有しない修飾型であ
ってもよい。Ｃａｓタンパク質は、核酸に対する結合親和性および／もしくは特異性を増
大させ、酵素活性を変化させ、並びに／または当該タンパク質の他の特性を変化させるこ
とを目的として修飾されうる。例えば、当該タンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮ
アーゼ、ＲＮアーゼ）ドメインは、修飾され、除去され、または不活性化されうる。ある
いは、当該タンパク質は、その機能に必須ではないドメインを除去する目的で短鎖化され
うる。当該タンパク質はまた、エフェクタードメインの活性を最適化する目的で、単鎖化
または修飾されうる。

ある実施形態において、Ｃａｓタンパク質は野生型Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９など）
の変異体またはその断片でありうる。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は変異型
Ｃａｓタンパク質に由来するものであってもよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ
酸配列は、当該タンパク質の１つ以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定
性など）を変化させる目的で改変されうる。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＡ標的
化に関与しないドメインが当該タンパク質から除去されてもよく、これによって修飾型Ｃ
ａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも短くなる。ある実施形態において、
本発明のシステムは、細菌中でコードされる、または哺乳動物の細胞での発現のためにコ
ドンが最適化された、化膿連鎖球菌由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。

変異型Ｃａｓタンパク質とは、野生型タンパク質のポリペプチド誘導体（例えば、１つ
以上の点変異、挿入、欠失、切断を含むタンパク質、融合タンパク質またはこれらの組み
合わせ）を意味する。この変異体は、ＲＮＡガイド化ＤＮＡ結合活性もしくはＲＮＡガイ
ド化ヌクレアーゼ活性の少なくとも一方、またはこれらの双方を有している。一般に、修
飾型は、後述する配列番号：１のような野生型タンパク質に対して、少なくとも５０％（
例えば、５０％～１００％（両端含む）の間の任意の数（例えば、５０％、６０％、７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および９９％））の同一性を有する。

Ｃａｓタンパク質（本発明において記載されている他のタンパク質構成成分）は、組み
換えポリペプチドとして得られうる。組み換えポリペプチドを調製するには、これをコー
ドする核酸が、融合相手をコードする他の核酸（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）、６×－ＨｉｓエピトープタグまたはＭ１３遺伝子３タンパク質）と
連結されうる。得られた融合核酸は、適当な宿主細胞中で融合タンパク質を発現し、これ
は本技術分野において公知の手法により単離されうる。上記融合相手を除去して本発明の
組み換えタンパク質を得る目的で、単離された融合タンパク質は、例えば酵素消化によっ
てさらに処理されうる。あるいは、上記タンパク質は化学的に合成されてもよいし（例え
ば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， ”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，” Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．
， ＮＹ， １９８３を参照）、本明細書に記載の組み換えＤＮＡ技術によって製造され
てもよい。さらなる指針として、当業者はＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ２００３；およびＳａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ２００１を参照しうる。

本明細書に記載されているＣａｓタンパク質は、精製または単離された形態で提供され
てもよいし、組成物の一部であってもよい。好ましくは、組成物中の場合、当該タンパク
質はまずある程度（より好ましくは高い純度レベル（例えば、約８０％、９０％、９５％
もしくは９９％またはそれ以上）へと）精製される。本発明に係る組成物は、所望の任意
のタイプの組成物でありうるが、典型的にはＲＮＡによりガイドされる標的化のための組
成物としての使用に（またはこれに含まれるのに）適した水性組成物である。本技術分野
の当業者は、このようなヌクレアーゼ反応のための組成物に含まれうる種々の成分を熟知
している。

本明細書に開示されているように、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（例えば化膿連鎖
球菌由来のｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ・Ｈ８４０Ａ変異体タンパク質、図１Ａ）、またはヌク
レアーゼ活性のないニッカーゼＣａｓ９（例えば化膿連鎖球菌由来のｎＣａｓ９、Ｄ１０
Ａ変異体タンパク質、図１Ａおよび図２Ｆ）が用いられうる。ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ
９は、種々の他の細菌種由来のものであってもよい。ｄＣａｓ９の非制限的な例とそれに
対応するＰＡＭ要求性の一覧を表１に示す。

ｂ．配列認識のためのＲＮＡスキャホールドおよびエフェクターの動員
本明細書に記載のプラットフォームの第２の構成要素はＲＮＡスキャホールドであり、
これは３つのサブ構成要素：プログラム可能なガイドＲＮＡモチーフ、ＣＲＩＳＰＲ Ｒ
ＮＡモチーフ、およびリクルーティングＲＮＡモチーフ、を備えている。このスキャホー
ルドは、単一のＲＮＡ分子であってもよいし、複数のＲＮＡ分子の複合体であってもよい
。本明細書に開示されているように、プログラム可能なガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ Ｒ
ＮＡおよびＣａｓタンパク質は、一緒になって配列の標的化および認識のためのＣＲＩＳ
ＰＲ／Ｃａｓベースのモジュールを形成する。一方、ＲＮＡ－タンパク質結合対を介した
リクルーティングＲＮＡモチーフはタンパク質エフェクターを動員し、このタンパク質エ
フェクターが遺伝子の修正を行う。このように、当該第２の構成要素は、修正モジュール
と配列認識モジュールとを連結するものである。

プログラム可能なガイドＲＮＡ
重要なサブ構成要素の１つは、プログラム可能なガイドＲＮＡである。その単純さと効
率性から、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは種々の有機体の細胞において遺伝子編集を行
うのに用いられてきた。このシステムの特異性は標的ＤＮＡとカスタム設計されたガイド
ＲＮＡとの間での塩基対形成によって決定される。ガイドＲＮＡの塩基対形成の特性を設
計・調整することにより、標的配列中にＰＡＭ配列が存在する限り、所望の任意の配列を
標的化することが可能である。

本明細書に記載のＲＮＡスキャホールドのサブ構成要素のうち、ガイド配列が標的化の
特異性を担っている。このガイド配列は、予め選択された所望の標的部位に対して相補的
でこれに対してハイブリダイゼーション可能な領域を含んでいる。種々の実施形態におい
て、このガイド配列は約１０から約２５超のヌクレオチドを含みうる。例えば、ガイド配
列とこれに対応する標的部位の配列との間の塩基対形成の領域のヌクレオチド長は、約１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、２５、または２５超でありうる。例示的な実施形態において、ガイド配列は約１
７～２０ヌクレオチド長（例えば、２０ヌクレオチド長）である。

適切な標的核酸を選択する１つの要件は、当該核酸が３’ＰＡＭ部位／配列を有するこ
とである。各標的配列およびこれに対応するＰＡＭ部位／配列は、本明細書ではＣａｓ標
的化部位と称される。最もよく特徴付けられているシステムの１つであるタイプＩＩ Ｃ
ＲＩＳＰＲシステムは、標的を切断するのにＣａｓ９タンパク質および標的配列に相補的
なガイドＲＮＡのみを必要とする。化膿連鎖球菌のタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは
Ｎ１２－２０ＮＧＧを有する標的部位を利用しているが、ＮＧＧとは化膿連鎖球菌由来の
ＰＡＭ部位を意味し、Ｎ１２－２０とはＰＡＭ部位の５’側に位置する１２～２０ヌクレ
オチドを意味する。他の細菌種に由来する他のＰＡＭ部位の配列としては、ＮＧＧＮＧ、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、ＮＮＡＧＡＡＷおよびＮＡＡＡＡＣが挙げられる。例
えば、ＵＳ２０１４０２７３２３３、ＷＯ２０１３１７６７７２、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ
．，（２０１２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３、Ｊｉｎｅｋ
ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１
、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ，（２０１３），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３
－８２６、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０９（３９）：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ
．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，２３０－２３２、
Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓ
ｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４－９、Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９ Ｍａｒ；１５５（Ｐｔ３）：７３３－４０およびｗｗｗ．
ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ＣＲＩＳＰＲ／を参照のこと。これらの文献の内容はその全体
が参照により本明細書に引用されている。

標的核酸の鎖は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ上の二本鎖のいずれかでありうる。このよう
なゲノムｄｓＤＮＡの例としては、必ずしもこれらに限定されないが、宿主細胞の染色体
、ミトコンドリアＤＮＡおよび安定的に保持されたプラスミドが挙げられる。しかしなが
ら、本発明に係る方法は、宿主細胞のｄｓＤＮＡの性質にかかわらずＣａｓ標的化部位が
存在する限り、宿主細胞中に存在する他のｄｓＤＮＡ（例えば、不安定なプラスミドＤＮ
Ａ、ウイルスＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ）に対しても実施可能であることに留意すべき
である。本発明に係る方法は、ＲＮＡに対しても実施可能である。

ＣＲＩＳＰＲモチーフ
上述したガイド配列に加えて、本発明のＲＮＡスキャホールドはさらに他の活性または
不活性なサブ構成要素を含む。一例において、当該スキャホールドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ
活性を有するＣＲＩＳＰＲモチーフを備えている。例えば、当該スキャホールドは、天然
のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模したものとして、上述したプログラム可能な
ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡに融合されてなるハイブリッドＲＮＡ分子でありうる。
例示的なハイブリッドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃＲＮＡであるｓｇＲＮＡ配列は以下のとおり
である：５’－（２０ｎｔガイド）－ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ－３’（配列番号：４
；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｄｅｃ １９；１５５（７）：１４７９
－９１）。種々のｔｒａｃｒＲＮＡ配列が本技術分野において公知であり、一例として、
以下のｔｒａｃｒＲＮＡおよびその活性部分が挙げられる。本明細書で用いられる場合、
ｔｒａｃｒＲＮＡの活性部分はＣａｓ９またはｄＣａｓ９などのＣａｓタンパク質と複合
体を形成する能力を保持している。例えば、ＷＯ２０１４１４４５９２を参照のこと。ｃ
ｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドＲＮＡを作製する方法は本技術分野において公
知である。例えば、ＷＯ２０１４０９９７５０、ＵＳ２０１４０１７９００６およびＵＳ
２０１４０２７３２２６を参照のこと。これらの文献の内容は、その全体が参照により本
明細書に引用されている。

ある実施形態においては、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性とガイド配列とは２つの異なるＲＮＡ
分子であり、これらがともにガイドＲＮＡおよび関連するスキャホールドを形成する。こ
の場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有する分子はガイド配列を有する分子と（通常は塩基対
形成によって）相互作用することができなくてはならない。

リクルーティングＲＮＡモチーフ
ＲＮＡスキャホールドの第３のサブ構成要素は、リクルーティングＲＮＡモチーフであ
り、これは修正モジュールと配列認識モジュールとを連結する。この連結は本明細書に記
載のプラットフォームにとって重要なものである。

エフェクター／ＤＮＡ編集酵素を標的配列に動員する１つの方法は、エフェクタータン
パク質をｄＣａｓ９に直接融合することである。配列認識に必要なタンパク質（例えば、
ｄＣａｓ９）へのエフェクター酵素（「修正モジュール」）の直接的な融合は、配列特異
的な転写の活性化または抑制によって可能であるが、タンパク質－タンパク質の融合の設
計によって空間的な障害が発生する可能性があり、活性を発揮するためには多量化複合体
を形成する必要がある酵素にとってこのことは理想的であるとは言えない。実際に、ほと
んどのヌクレオチド編集酵素（例えば、ＡＩＤまたはＡＰＯＢＥＣ３Ｇなど）は、ＤＮＡ
編集の触媒活性を発揮するのに二量体、三量体またはより高次のオリゴマーの形成を必要
とする。所定のコンホメーションでＤＮＡに対してアンカリングするｄＣａｓ９への直接
的な融合は、正しい位置での多量体の機能的な酵素複合体の形成にとって障害となりうる
。

これに対し、本明細書に記載のプラットフォームは、ＲＮＡスキャホールドが媒介する
エフェクタータンパク質の動員に基づくものである。より具体的に、当該プラットフォー
ムは、種々のＲＮＡモチーフ／ＲＮＡ結合タンパク質の結合対の利点を活用するものであ
る。この目的に向けて、ＲＮＡスキャホールドはＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＳ２
コートタンパク質、ＭＣＰ）に特異的に結合するＲＮＡモチーフ（例えば、ＭＳ２オペレ
ーターモチーフ）がｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲスキャホールドに連結されるように設計され
る（図１Ａ）。

その結果、本明細書に記載の当該プラットフォームのこのＲＮＡスキャホールド構成要
素は、設計されたＲＮＡ分子であり、特異的なＤＮＡ／ＲＮＡの配列認識のためのｇＲＮ
Ａモチーフ（すなわち、ｄＣａｓ９結合のためのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡモチーフ）のみな
らず、エフェクターの動員のためのリクルーティングＲＮＡモチーフをも備えている（図
１Ａ）。このようにして、動員されたエフェクタータンパク質融合物は、そのリクルーテ
ィングＲＮＡモチーフへの結合能を通じて標的部位へと動員されうる。ＲＮＡスキャホー
ルドが媒介する動員のフレキシビリティにより、機能的な単量体、並びに二量体、三量体
またはオリゴマーが標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列の近傍で比較的容易に形成され
やすい。立体配置の例を図１Ｂ～図１Ｅに示す。これらのＲＮＡリクルーティングモチー
フ／結合タンパク質の対は、天然源（例えば、ＲＮＡファージまたは酵母テロメラーゼ）
に由来するものであってもよいし、人工的に設計されたもの（例えば、ＲＮＡアプタマー
およびこれに対応する結合タンパク質リガンド）であってもよい。ＣａｓＲｃｕｒｅシス
テムにおいて用いられうるリクルーティングＲＮＡモチーフ／ＲＮＡ結合タンパク質の対
の例の非制限的な一覧を表２に示す。

上述した結合対のための配列を以下に示す。

ＲＮＡスキャホールドは、単一のＲＮＡ分子であってもよいし、複数のＲＮＡ分子の複
合体であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲモチーフおよびリクルーティ
ングＲＮＡモチーフが、１つの長い単一のＲＮＡ分子の３つのセグメントであってもよい
。あるいは、これらの１つ、２つまたは３つが別々の分子に存在していてもよい。後者の
場合、当該３つの構成要素は、共有結合または、例えばワトソン－クリック塩基対結合な
どの非共有結合を介して互いに連結されてスキャホールドを形成しうる。

一例において、ＲＮＡスキャホールドは２つの異なるＲＮＡ分子を含みうる。第１のＲ
ＮＡ分子は、プログラム可能なガイドＲＮＡと、自身と相補的な領域とともにステム二本
鎖構造を形成しうる領域とを含みうる。そして第２のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲモチー
フおよびリクルーティングＲＮＡモチーフに加えて、上述した相補的な領域を含みうる。
このステム二本鎖構造を介することで、第１および第２のＲＮＡ分子は本発明のＲＮＡス
キャホールドを形成する。一実施形態において、第１および第２のＲＮＡ分子はそれぞれ
他の配列との間で塩基対を形成する（約６～約２０ヌクレオチドの）配列を含む。同様に
して、ＣＲＩＳＰＲモチーフおよびリクルーティングＲＮＡモチーフもまた、異なるＲＮ
Ａ分子に存在していてもよいし、他のステム二本鎖構造を用いて一体化されてもよい。

本発明のＲＮＡおよび関連するスキャホールドは、細胞ベースの発現、インビトロでの
転写、および化学合成などの本技術分野において公知の種々の方法により作製されうる。
ＴＣ－ＲＮＡ化学を利用することで相対的に長い（２００マーまたはそれ以上の）ＲＮＡ
を化学的に合成することが可能であり、基本的な４つのリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇお
よびＵ）により作製されるＲＮＡよりも優れた特別な機能を備えたＲＮＡを作製すること
ができる。

Ｃａｓタンパク質－ガイドＲＮＡスキャホールド複合体は、本技術分野において公知の
宿主細胞系またはインビトロでの翻訳－転写系を利用した組み換え技術を用いて作製され
うる。これらのシステムおよび技術の詳細については、例えば、ＷＯ２０１４１４４７６
１、ＷＯ２０１４１４４５９２、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＵＳ２０１４０２７３２２
６およびＵＳ２０１４０２７３２３３が参照され、その内容は全体が参照により本明細書
に引用されている。この複合体は、少なくともある程度、当該複合体が作製された細胞を
構成する細胞物質またはインビトロでの翻訳－転写系から、単離または精製されてもよい
。

ＲＮＡスキャホールドは、１つまたはそれ以上の修飾を含みうる。このような修飾とし
ては、少なくとも１つの非天然のヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチド、またはそれら
の類似体を含めることが挙げられる。修飾ヌクレオチドは、リボース部分、リン酸部分お
よび／または塩基部分において修飾されうる。修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル類
似体、２’－デオキシ類似体または２’－フルオロ類似体を含みうる。核酸の骨格が修飾
されてもよく、例えばホスホロチオエート骨格が用いられてもよい。ロックト核酸（ＬＮ
Ａ）または架橋核酸（ＢＮＡ）を使用することも可能である。修飾塩基のさらなる例とし
ては、以下に制限されないが、２－アミノプリン、５－ブロモウリジン、シュードウリジ
ン、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられる。これらの修飾は、ＣＲＩＳＰＲシス
テムの任意の構成要素に適用されうる。好ましい実施形態において、これらの修飾はＲＮ
Ａ構成要素（例えば、ガイドＲＮＡ配列）に対してなされる。

ｃ．エフェクター：非ヌクレアーゼＤＮＡ修飾酵素
本発明に記載のプラットフォームの第３の構成要素は、非ヌクレアーゼエフェクターで
ある。このエフェクターはヌクレアーゼではなく、いかなるヌクレアーゼ活性をも有して
いないが、ＤＮＡ修飾酵素の他の類型の活性を有していてもよい。酵素活性の例としては
、以下に制限されないが、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラー
ゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリ
ン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザ
ーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フ
ォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性が挙げられる。ある実施形態では、エフェク
ターが、シトシンデアミナーゼ（例えば、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）、アデノシンデア
ミナーゼ（例えば、ＡＤＡ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、およびＤＮＡデメチラ
ーゼの活性を有する。

好ましい実施形態において、この第３の構成要素はＲＮＡ結合ドメインおよびエフェク
タードメインを有する共役体または融合タンパク質である。これらの２つのドメインは、
リンカーを介して結合されうる。

ＲＮＡ結合ドメイン
本発明では種々のＲＮＡ結合ドメインが用いられうるが、Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９
など）またはその変異体（ｄＣａｓ９など）のＲＮＡ結合ドメインを用いてはならない。
上述したように、所定のコンホメーションでＤＮＡに対してアンカリングするｄＣａｓ９
への直接的な融合は、正しい位置での多量体の機能的な酵素複合体の形成にとって障害と
なりうる。その代わりに、本発明では種々の他のＲＮＡモチーフ－ＲＮＡ結合タンパク質
の結合対を利用するのである。その例としては、表２に記載のものが挙げられる。

このように、ＲＮＡ結合ドメインがリクルーティングＲＮＡモチーフに結合する能力を
介してエフェクタータンパク質が標的部位へと動員されうる。ＲＮＡスキャホールド媒介
性の動員のフレキシビリティにより、機能的な単量体、並びに二量体、四量体またはオリ
ゴマーが標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列の近傍で比較的容易に形成されうる。

エフェクタードメイン
エフェクター構成要素は、活性を有する部分（すなわち、エフェクタードメイン）を含
むものである。ある実施形態では、エフェクタードメインは非ヌクレアーゼタンパク質（
例えば、デアミナーゼ）の天然の活性部分を含む。また別の実施形態では、エフェクター
ドメインは非ヌクレアーゼタンパク質の天然の活性部分の修飾アミノ酸配列（例えば、置
換、欠失、挿入）を含む。エフェクタードメインは酵素活性を有する。この活性の例とし
ては、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復
活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性
、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビ
ナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、
グリコシラーゼ活性、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化活性またはヒストンメチル化
活性が挙げられる。

リンカー
上述した２つのドメイン並びに本明細書に記載の他のドメインは、これらに限定されな
いが、化学修飾、ペプチドリンカー、化学リンカー、共有結合もしくは非共有結合、また
はタンパク質融合、あるいは当業者に公知の任意の手段などのリンカーによって連結され
うる。この連結は非可逆的でも可逆的であってもよい。例えば、米国特許第４６２５０１
４号、第５０５７３０１号および第５５１４３６３号、米国特許出願公開第２０１５０１
８２５９６号および第２０１０００６３２５８号、並びにＷＯ２０１２１４２５１５を参
照のこと（これらの内容はその全体が参照により本明細書に引用される）。ある実施形態
では、共役体中の各リンカーおよび各タンパク質ドメインの所望の特性を利用するため、
いくつかのリンカーが含まれうる。例えば、柔軟なリンカーと共役体の溶解性を高めるリ
ンカーが単独でまたは他のリンカーとともに用いられる。ペプチドリンカーは、当該リン
カーをコードするＤＮＡを発現させることにより、共役体中の１つ以上のタンパク質ドメ
インに連結されうる。リンカーは、酸により開裂するものであってもよいし、光により開
裂するものであってもよいし、熱に対して感受性のものであってもよい。共役の方法は当
業者によく知られており、本発明での使用に包含される。

ある実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインは、ペプチド
リンカーによって連結されうる。ペプチドリンカーは、これら２つのドメインとリンカー
とをインフレームでコードする核酸を発現させることによって連結されうる。場合により
、リンカーペプチドはこれらのドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端の一方または
双方で連結されうる。いくつかの例では、リンカーは免疫グロブリンのヒンジ領域のリン
カーであり、この技術は米国特許第６，１６５，４７６号、第５，８５６，４５６号、米
国特許出願公開第２０１５０１８２５９６号および第２０１０／００６３２５８号、並び
に国際出願ＷＯ２０１２／１４２５１５号に開示されており、これらの内容はその全体が
参照により本明細書に引用される。

他のドメイン
エフェクター融合タンパク質は他のドメインを含みうる。ある実施形態において、エフ
ェクター融合タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含みうる。一
般に、ＮＬＳは一続きの塩基性アミノ酸を含む。各局在化シグナルは本技術分野において
公知である（例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７
，２８２：５１０１－５１０５を参照）。ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末
端に位置してもよいし、内部の領域に位置していてもよい。

ある実施形態において、融合タンパク質は、当該タンパク質の標的細胞中への送達を促
進するために少なくとも１つの細胞透過ドメインを含みうる。一実施形態において、細胞
透過ドメインは細胞透過ペプチド配列でありうる。種々の細胞透過ペプチド配列が本技術
分野において公知であり、その例としては、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＨＢＶ
のＴＬＭ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２のものや、ポリアルギニンペプチド配列が挙げられる。

さらに他の実施形態において、融合タンパク質は少なくとも１つのマーカードメインを
含みうる。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグおよび
エピトープタグが挙げられる。ある実施形態では、マーカードメインは蛍光タンパク質で
ありうる。他の実施形態では、マーカードメインは精製タグおよび／またはエピトープタ
グでありうる（例えば、米国特許出願第２０１４０２７３２３３号を参照）。

一実施形態では、当該システムがどのように作動するかを説明するための例としてＡＩ
Ｄを用いた。ＡＩＤは、ＤＮＡまたはＲＮＡとの関連でシトシンの脱アミノ化反応を触媒
するシチジンデアミナーゼである。標的部位まで運ばれると、ＡＩＤはＣ塩基をＵ塩基に
変換する。分裂細胞において、これはＣからＴへの点変異を引き起こしうる。あるいは、
ＣからＵへの変換は細胞のＤＮＡ修復経路（主に切除による修復経路）を誘導し、これに
よってＵ－Ｇ塩基対のミスマッチを除去し、Ｔ－Ａ、Ａ－Ｔ、Ｃ－ＧまたはＧ－Ｃ対で置
換しうる。その結果、標的であるＣ－Ｇ部位において点変異が生じうる。切除による修復
経路はすべてではないもののほとんどの体細胞に存在することから、標的部位へのＡＩＤ
の動員によりＣ－Ｇ塩基対が他の対へと修正されうる。この場合、Ｃ－Ｇ塩基対が体細胞
において潜在的に疾患の原因となっている遺伝子変異である場合には、上述のアプローチ
は変異を修正することによって疾患を治療するために用いられうる。

同様にして、潜在的に疾患の原因となっている遺伝子変異が特定部位のＡ－Ｔ塩基対で
ある場合には、同様のアプローチを採用して当該特定部位にアデノシンデアミナーゼを動
員し、これによってＡ－Ｔ塩基対を他の対へと修正することができる。他のエフェクター
酵素は、塩基対形成における他のタイプの変換を生じることが予想される。ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ修飾酵素の非制限的な例の一覧を表３に示す。

上述した特定の３つの構成要素は技術的なプラットフォームを構成する。各構成要素に
ついては、表１～３に記載の一覧からそれぞれ選択することができ、これによって特定の
治療／有用性の目標が達成される。

一例として、（ｉ）配列標的化タンパク質としての化膿連鎖球菌由来のｄＣａｓ９、（
ｉｉ）ガイドＲＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡモチーフおよびＭＳ２オペレーターモチ
ーフを含むＲＮＡスキャホールド、並びに（ｉｉｉ）ＭＳ２オペレーター結合タンパク質
ＭＣＰに融合したヒトＡＩＤを含むエフェクター融合物を用いて、ＣａｓＲｃｕｒｅシス
テムを構築した。各構成要素の配列を以下に示す。

上述したＣａｓタンパク質と同様、非ヌクレアーゼエフェクターもまた、組み換えポリ
ペプチドとして得られうる。組み換えポリペプチドの作製技術は本技術分野において公知
である。例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａ
ｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆
Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ，２００３；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参照
のこと。

本明細書に記載のプラットフォーム／システムの上述した３つの構成要素は、１～３個
の発現ベクターを用いて発現させることができる。当該システムは、実質的にいかなるＤ
ＮＡ配列またはＲＮＡ配列をも標的化するようにプログラムされうる。

発現系
上述したプラットフォームを用いるには、タンパク質およびＲＮＡの１つ以上の構成要
素を、これらをコードする核酸から発現させることが好ましい。これは種々の方法で実施
されうる。例えば、ＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質をコードする核酸を１つ以上
の中間体ベクターにクローニングし、これを原核細胞または真核細胞に導入して複製およ
び／または転写させることが可能である。ＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質を製造
するための、ＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質をコードする核酸の貯蔵または操作
の点で、中間体ベクターは、典型的には原核生物のベクター（例えば、プラスミド、シャ
トルベクター、昆虫ベクター）である。当該核酸はまた、植物細胞、動物細胞（好ましく
は、哺乳動物細胞またはヒト細胞）、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞への投与の
ために１つ以上の発現ベクターにクローニングされてもよい。よって、本発明は、上述し
たＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質の任意のものをコードする核酸を提供する。好
ましくは、当該核酸は単離および／または精製されている。

本発明はまた、上述したＲＮＡスキャホールドまたはタンパク質の１つ以上をコードす
る配列を有する組み換え構築物またはベクターをも提供する。当該構築物の例としては、
ベクター（プラスミドまたはウイルスベクターなど）に本発明の核酸配列がフォワード方
向またはリバース方向で挿入されたものが挙げられる。好ましい実施形態において、当該
構築物は、当該配列に作動的に連結されたプロモーターなどの制御配列を含む。適切なベ
クターおよびプロモーターは当業者にとって数多く知られており、市販もされている。原
核宿主および真核宿主での使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅ
ｓｓ）にも記載されている。

ベクターとは、自身が連結された他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する
。ベクターは、自己を複製し、または宿主ＤＮＡへ取り込まれる能力を有している。ベク
ターの例としては、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターが挙げられる。本発明
のベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で当該核酸を含む。好ましくは、
ベクターは発現されるべき核酸配列に作動的に連結された１つ以上の制御配列を含む。「
制御配列」としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例え
ば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列としては、ヌクレオチド配列の構
成的な発現を指示するものだけでなく、誘導性の制御配列であってもよい。発現ベクター
の設計は、形質転換され、形質導入され、または感染させられる宿主細胞、所望のＲＮＡ
またはタンパク質の発現レベルなどの選択といった因子に依存しうる。

発現ベクターの例としては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、合成ＤＮＡ配列
、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドと
ファージＤＮＡとの組み合わせ由来のベクター、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ジフ
テリアウイルスおよび仮性狂犬病ウイルス等のウイルスＤＮＡが挙げられる。しかしなが
ら、宿主中で複製可能であって生存可能である限り、他の任意のベクターが用いられても
よい。適当な核酸配列は、種々の方法によってベクター中に挿入されうる。一般に、上述
したＲＮＡまたはタンパク質の１つをコードする核酸配列が、本技術分野において公知の
手法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されうる。かような手法および関連
するサブクローニングの手法は当業者の知見の範囲内のものである。

ベクターは、発現を増幅するための適当な配列を含みうる。また、発現ベクターは、好
ましくは１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有することで、真核細胞の培養でのジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性、あるいは大腸菌でのアンピシリン
耐性といった、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を提供することがで
きる。

ＲＮＡを発現するベクターは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、ＨＩプ
ロモーター、Ｕ６プロモーターまたは７ＳＫプロモーター）を含むことでＲＮＡの発現を
促進することができる。これらのヒトプロモーターによれば、哺乳動物細胞におけるＲＮ
Ａの発現およびその後のプラスミドのトランスフェクションが可能となる。あるいは、イ
ンビトロでの転写のためにＴ７プロモーターが用いられてもよく、ＲＮＡはインビトロで
転写されて精製されてもよい。

上述した適当な核酸配列を含有するベクターおよび適当なプロモーター配列または制御
配列は、適当な宿主を形質転換し、これにトランスフェクションされ、または感染して、
当該宿主に上述したＲＮＡまたはタンパク質を発現させることができる。適当な発現宿主
の例としては、細菌細胞（例えば、大腸菌、放線菌、ネズミチフス菌）、真菌細胞（酵母
）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ、ヨトウガ（Ｓｆ９））、動物細胞（例えば、
ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＨＥＫ２９３）、アデノウイルス、および植物細胞が挙げられる。
適当な宿主の選択は、当業者の知見の範囲内のものである。ある実施形態において、本発
明は、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の１つをコードするヌクレオチド配列を含
む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、これにトランスフェクションし、これに
感染させることによる上述したＲＮＡまたはタンパク質の製造方法を提供する。宿主細胞
は次いで、適当な条件下で培養され、これによってＲＮＡまたはタンパク質の発現が可能
となる。

外来のヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための本技術分野において公知の任意の
手法が用いられうる。例としては、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ポリ
ブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソ
ーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベ
クター（エピソーマルおよび組み込み型の双方）、並びに、クローニングされたゲノムＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の
任意の周知の方法が挙げられる。

方法
本発明の他の形態は、細胞、胚、ヒトまたは非ヒト動物における標的ＤＮＡ配列（例え
ば、染色体の配列）または標的ＲＮＡ配列の修飾方法に関するものである。当該方法は、
上述した（ｉ）配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ
）ＲＮＡスキャホールドまたはこれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ
ｉ）非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチ
ドを細胞または胚に導入することを含む。ＲＮＡスキャホールドは、配列標的化タンパク
質および融合タンパク質を標的部位における標的ポリヌクレオチドへとガイドし、融合タ
ンパク質のエフェクタードメインがその配列を修飾する。本明細書に記載のように、ｃａ
ｓ９タンパク質などの配列標的化タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を失うように修
飾されている。

ある実施形態において、エフェクタータンパク質は単量体として機能する。この場合、
本発明のシステムは、図１Ｂに示すように、標的部位の上流（左）または下流（右）のい
ずれかの単一の部位に標的化される。他の実施形態では、適切な触媒作用のためにエフェ
クタータンパク質は二量化を必要とする。この目的に向けて、当該システムは多量化され
て標的部位の上流および下流の標的配列を同時に標的化され、これによってエフェクター
タンパク質の二量化を可能とすることができる（図１Ｃ、左）。あるいは、単一部位へエ
フェクタータンパク質が動員されるだけでも、隣接するエフェクタータンパク質に対する
その親和性を増大させて二量化を促進するのに十分であることもある（図１Ｃ、右）。さ
らに他のある実施形態では、図１Ｄに示すように、三量体のエフェクター酵素が標的部位
に動員されて配置されうる。これは、二重の標的化（図１Ｄ、左）または単一の標的化（
図１Ｄ、右）によって達成されうる。本発明に開示されているシステムは、ＲＮＡの標的
を編集するのに用いられてもよい（例えば、レトロウイルスの不活性化）。図１Ｅを参照
のこと。この場合、エフェクタータンパク質が機能性オリゴマーの集合体を必要とするの
であれば、図１Ｃおよび図１Ｄの右パネルのように、ＲＮＡ分子への単一の標的化によっ
てオリゴマー化が促進されうる。

標的ポリヌクレオチドについて、ＰＡＭ配列がその直後（下流または３’）に存在する
こと以外は配列の制限はない。ＰＡＭ配列の例としては、これらに限定されないが、ＮＧ
Ｇ、ＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡＡＷ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドと定義され、Ｗ
はＡまたはＴと定義される）が挙げられる。ＰＡＭ配列の他の例は上述したとおりであり
、当業者であれば所定のＣＲＩＳＰＲタンパク質とともに用いるための他のＰＡＭ配列を
同定することができるであろう。標的部位は、遺伝子のコード領域中、遺伝子のイントロ
ン中、遺伝子間の制御領域中などに存在しうる。当該遺伝子は、タンパク質をコードする
遺伝子であってもよいし、ＲＮＡをコードする遺伝子であってもよい。

標的ポリヌクレオチドは、細胞にとって内因性または外因性の任意のポリヌクレオチド
でありうる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオ
チドでありうる。また、標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）を
コードする配列であってもよいし、非コード配列（例えば、制御ポリヌクレオチド）であ
ってもよい。

本発明に係るシステムのタンパク質構成要素は、単離されたタンパク質として細胞また
は胚の内部へ導入されうる。一実施形態において、各タンパク質は少なくとも１つの細胞
透過ドメインを含むことができ、これによってタンパク質の細胞への取り込みが促進され
る。他の実施形態において、タンパク質またはタンパク質類をコードするｍＲＮＡ分子ま
たはＤＮＡ分子が細胞または胚の内部へ導入されてもよい。タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列は一般に、所望の細胞または胚の内部で機能するプロモーター配列に作動的に連結
されている。ＤＮＡ配列は線状であってもよいし、ＤＮＡ配列はベクターの一部であって
もよい。さらに他の実施形態において、タンパク質は、当該タンパク質および上述したＲ
ＮＡスキャホールドを含むＲＮＡ－タンパク質複合体として細胞または胚の内部へ導入さ
れてもよい。

別の実施形態において、当該タンパク質をコードするＤＮＡは、ＲＮＡスキャホールド
の構成要素をコードする配列または配列群を含みうる。タンパク質およびＲＮＡスキャホ
ールドをコードするＤＮＡ配列は一般に、細胞または胚の内部において、当該タンパク質
およびＲＮＡスキャホールドのそれぞれの発現を可能とする適当なプロモーター制御配列
に作動的に連結されている。当該タンパク質およびＲＮＡスキャホールドをコードするＤ
ＮＡ配列は、追加の発現をコントロールする配列、制御配列、および／またはプロセシン
グ配列をさらに含みうる。当該タンパク質およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は
、線状であってもよいし、ベクターの一部であってもよい。

ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を介して当該ＲＮＡを細胞中へ導入する実施形態では、
ＲＮＡをコードする配列は真核細胞におけるガイドＲＮＡの発現のためのプロモーター制
御配列に作動的に連結されていてもよい。例えば、ＲＮＡをコードする配列は、ＲＮＡポ
リメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動的に連
結されていてもよい。適切なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、これらに限定さ
れないが、哺乳動物のＵ６またはＨ１プロモーターが挙げられる。例示的な実施形態にお
いて、ＲＮＡをコードする配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに連結される。
他の例示的な実施形態において、ＲＮＡをコードする配列は、マウスまたはヒトのＨ１プ
ロモーターに連結される。

タンパク質および／またはＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、線状または環状でありう
る。ある実施形態では、ＤＮＡ配列はベクターの一部であってもよい。適切なベクターと
しては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポ
ゾン、およびウイルスベクターが挙げられる。例示的な実施形態において、タンパク質お
よび／またはＲＮＡをコードするＤＮＡは、プラスミドベクター中に存在する。適切なプ
ラスミドベクターの非制限テイナ例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔおよびこれらの変異体が挙げられる。ベクターは、追加の発現制御配列（
例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終止配列など）
、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製の起点などを含みうる
。

本発明に係る本システムのタンパク質構成要素（またはこれをコードする核酸）および
ＲＮＡ構成要素（またはこれをコードするＤＮＡ）は、種々の手段によって細胞または胚
中に導入されうる。典型的に、胚は所望の種の単細胞段階の受精胚である。ある実施形態
において、細胞または胚はトランスフェクションされている。トランスフェクションの適
切な方法としては、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクション、ヌクレオフェクシ
ョン（またはエレクトロポレーション）、カチオン性ポリマートランスフェクション（例
えば、ＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルストランスダクショ
ン、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトラ
ンスフェクション、、カチオン性リポソームトランスフェクション、イムノリポソームト
ランスフェクション、非リポソーム性脂質トランスフェクション、デンドリマートランス
フェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクシ
ョン、遺伝子銃による送達、インパレフェクション、ソノポレーション、光学トランスフ
ェクション、および専売薬剤で促進される核酸の取り込みが挙げられる。トランスフェク
ションの方法は、本技術分野において周知である（例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３または“Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１を
参照）。他の実施形態において、分子はマイクロインジェクションによって細胞または胚
中に導入される。例えば、分子は単細胞の胚の前核中にインジェクションされうる。

本発明に係る本システムのタンパク質構成要素（またはこれをコードする核酸）および
ＲＮＡ構成要素（またはこれをコードするＤＮＡ）は、細胞または胚中に同時または逐次
的に導入されうる。ＲＮＡ（または当該ＲＮＡをコードするＤＮＡ）に対するタンパク質
（またはこれをコードする核酸）の比率は通常、これらがＲＮＡ－タンパク質複合体を形
成できるようにほぼ化学量論的なものである。同様に、２つの異なるタンパク質（または
これをコードする核酸）の比率もまた、ほぼ化学量論的なものである。一実施形態におい
て、タンパク質構成要素およびＲＮＡ構成要素（またはこれをコードするＤＮＡ配列）は
、同一の核酸またはベクター内で一緒に送達される。

この方法は、ガイドＲＮＡがエフェクタータンパク質を標的配列の標的部位へとガイド
し、エフェクタードメインが標的配列を修飾することができるように、細胞または胚を適
切な条件下で維持することをさらに含む。

一般に、細胞は細胞の増殖および／または維持のために適切な条件下で維持されうる。
適切な細胞培養条件は本技術分野において周知であり、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ
ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３または“Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１
）、Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００８） ＰＮＡＳ １０５：５８０９－５８
１４；Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ １０４：３０５５－３０６０
；Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６－６５１；お
よびＬｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ２５：１２９８－１３０６に記載されている。当業者であれば、細胞培養の方法が
本技術分野において公知であって細胞のタイプによって変動しうるものであることを理解
している。すべての場合において、特定の細胞のタイプに最適な技術を決定するのに通常
の最適化がなされうる。

胚はインビトロで培養されうる（例えば、細胞培養）。典型的には、胚は適切な温度で
、かつ適切な（必要に応じてタンパク質およびＲＮＡスキャホールドの発現を可能とする
のに必要なＯ_２／ＣＯ_２比の）培地中で培養される。適切な培地の非制限的な例としては
、Ｍ２、Ｍ１６、ＫＳＯＭ、ＢＭＯＣおよびＨＴＦ培地が挙げられる。当業者であれば、
培養条件が胚の種によって変動しうるものであることを理解している。すべての場合にお
いて、特定の胚の種に最適な技術を決定するのに通常の最適化がなされうる。場合によっ
ては、インビトロで培養された胚から細胞株が得られてもよい（例えば、胚性幹細胞株）
。

あるいは、胚は雌の宿主の子宮中に移されることにより、インビボで培養されてもよい
。一般的に言えば、雌の宿主は上記胚と同一または類似の種から選ばれる。好ましくは、
当該雌の宿主は偽妊娠のものである。偽妊娠の雌の宿主を作製する手法は本技術分野にお
いて公知である。さらに、胚を雌の宿主中に移す手法も公知である。胚をインビボで培養
することで当該胚を発育させ、当該胚に由来する動物を出産させることが可能である。こ
のような動物は、体のすべての細胞において修飾された染色体配列を含んでいる。

種々の真核細胞が、この方法において適切に用いられる。例えば、当該細胞はヒトの細
胞、ヒトではない哺乳動物の細胞、哺乳動物ではない脊椎動物の細胞、無脊椎動物の細胞
、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞の真核有機体でありうる。種々の胚もま
た、この方法において適切に用いられる。例えば、当該胚は、１細胞、２細胞または４細
胞の、ヒトのまたは非ヒト哺乳動物の胚でありうる。単細胞の胚を含む例示的な哺乳動物
の胚としては、これらに限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、齧歯動物、ウサ
ギ、ネコ科動物、イヌ科動物、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマおよび霊長類の胚が挙げられる
。さらに他の実施形態において、当該細胞は幹細胞である。適切な幹細胞としては、これ
らに限定されないが、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児の幹細胞、成人の幹細胞、多能性
幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、寡能性幹細胞、単分化能幹細胞などが挙げ
られる。例示的な実施形態においては、当該細胞が哺乳動物の細胞であるか、または当該
胚が哺乳動物の胚である。

有用性および用途
本明細書に開示のシステムおよび方法は、非常に多くのタイプの細胞における標的ポリ
ヌクレオチドを修飾し、編集する（例えば、不活性化および活性化する）といった広範な
有用性を有するものである。このように、本システムおよび方法は、例えば研究および治
療において広範な用途のスペクトルを有している。

ヒトにおける重篤な疾患の多くは、１つの共通の原因、遺伝子の変化または変異、を有
している。患者において疾患を引き起こす変異は、自身の親からの継承により獲得される
か、または環境要因によって引き起こされる。これらの疾患としては、これに限定されな
いが、以下のようなカテゴリーが挙げられる。第一に、いくつかの遺伝子障害は生殖系列
細胞の変異によって引き起こされる。その一例は嚢胞性線維症であり、これは親から受け
継がれるＣＦＴＲ遺伝子における変異によって引き起こされる。第二に、慢性のウイルス
感染性疾患などのいくつかの疾患は、外因性の環境要因によって引き起こされ、遺伝子の
変化を生じる。その一例はＡＩＤＳであり、これはヒトＨＩＶウイルスのゲノムが感染し
たＴ細胞のゲノム中に挿入されることによって引き起こされる。第三に、いくつかの神経
変性疾患が遺伝子の変化に関係している。その一例はハンチントン病であり、これは罹患
した患者のハンチンチン遺伝子においてＣＡＧの３つのヌクレオチドが伸長することによ
って引き起こされる。最後に、がんはがん細胞中に蓄積した種々の体細胞の変異によって
引き起こされる。したがって、疾患の原因となる遺伝子変異を修正するか、またはその配
列を機能的に修正すれば、これらの疾患を治療するための魅力的な治療機会が提供される
。

体細胞の遺伝子編集は、多くのヒト疾患に対する魅力的な治療戦略である。治療的な遺
伝子編集を成功裡に達成するには、（ｉ）いかにして配列特異的な認識を達成するか（「
配列認識モジュール」）；（ｉｉ）いかにして根本的な変異を修正するか（「修正モジュ
ール」）；および（ｉｉｉ）いかにして「修正モジュール」を「配列認識モジュール」と
一緒になるように連結して配列特異的な修正を達成するか、の３つの重要な因子を考慮す
る必要がある。これらの個々の課題を達成する方法は数多く存在する。しかしながら、現
状のプラットフォームまたは技術はいずれも、最適かつ実用的な体細胞の遺伝子編集を達
成することはできていない。より詳細に、現状の遺伝子特異的な編集技術は、そのほとん
どがヌクレアーゼ誘導性のＤＮＡ ＤＳＢとそれによって誘導される相同組み換えを利用
したものであるが、ほとんどの体細胞においてその活性は低いかまたは存在しない。よっ
て、ほとんどの疾患で、体細胞組織における病理学的な遺伝子変異の治療的な修正に対す
るこれらの技術の用途は限定されている。

これに対し、本発明により開示されているシステムおよび方法によれば、ヌクレアーゼ
活性に依拠することなく、遺伝子またはＲＮＡ転写物をＤＮＡ配列特異的に編集すること
が可能である。当該システムおよび方法はＤＳＢを生成せず、またＤＳＢ媒介性の相同組
み換えに依拠することもない。さらに、本システムのこのような設計はモジュラー式であ
ることから、所望の任意のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を標的化するための極めてフレキ
シブルで簡便な方法が提供される。すなわち、このアプローチによればＤＮＡまたはＲＮ
Ａを編集する酵素を、事実上、幹細胞などの体細胞中の任意のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配
列へとガイドすることができる。標的となるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の正確な編集に
より、当該酵素は遺伝子障害における変異した遺伝子を修正し、感染した細胞においては
ウイルスゲノムを不活性化し、神経変性疾患においては疾患の原因となるタンパク質の発
現を抑制し、あるいはがんにおいてはがん原性のタンパク質をサイレンシングすることが
できる。したがって、本発明において開示される当該システムおよび方法は、上述した遺
伝子障害、慢性の感染性疾患、神経変性疾患およびがんなどの疾患における根本的な遺伝
子の変化を修正するのに用いられうる。

遺伝子疾患
６０００超の遺伝子疾患が既知の遺伝子変異によって引き起こされていると推定されて
いる。病理学的な組織／器官における疾患の原因となる根本的な変異を修正すれば、当該
疾患の緩和または治癒がもたらされうる。例えば、嚢胞性線維症は米国において３０００
人に１人が罹患している。この疾患はＣＦＴＲ遺伝子の変異が遺伝することによって引き
起こされており、７０％の患者が同一の変異（５０８位のフェニルアラニンの欠損をもた
らす３ヌクレオチドの欠損（ΔＰｈｅ５０８と称される））を有している。ΔＰｈｅ５０
８はＣＦＴＲの誤配置および分解をもたらす。本発明に開示された本システムおよび方法
は、罹患した組織（肺）においてＶａｌ５０９残基（ＧＴＴ）をＰｈｅ５０９（ＴＴＴ）
に変換するのに用いられ、これによってΔＰｈｅ５０８変異を機能的に修正することがで
きる。

慢性の感染性疾患
本発明に開示された本システムおよび方法はまた、ヒトの細胞／組織中に導入されたウ
イルスゲノムにおける任意の遺伝子を特異的に不活性化するのに用いられうる。例えば、
本発明に開示された本システムおよび方法によれば、ウイルスにとって必須の遺伝子の翻
訳を早期に終止させるためのストップコドンを作製することができ、これによって慢性か
つ消耗性の感染性疾患を改善または治癒することができる。例えば、ＡＩＤＳの現在の治
療法はウイルス量を低減させることはできるものの、潜伏しているＨＩＶを陽性Ｔ細胞か
ら完全に除去することはできない。本明細書に開示の本システムおよび方法は、１つ以上
のストップコドンを導入することにより、ヒトＴ細胞において、統合されたＨＩＶゲノム
中の１つ以上のＨＩＶの必須の遺伝子の発現を永久に不活性化するのに用いられうる。他
の例は、Ｂ型肝炎ウイルスである。本明細書に開示の本システムおよび方法は、ヒトゲノ
ム中に導入された１つ以上のＨＢＶの必須の遺伝子を特異的に不活性化し、ＨＢＶのライ
フサイクルをサイレンシングするのに用いられうる。

神経変性疾患
神経変性疾患の中には、機能獲得型変異によって引き起こされるものがある。例えば、
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進展をもたらす。本発明に開示され
た本システムおよび方法は、ストップコドンを導入するか、またはスプライシング部位を
変化させることにより、変異を修正し、または変異型タンパク質の発現を抑制するのに用
いられうる。

がん
がんの進展には多くの遺伝子（がん抑制遺伝子、がん遺伝子、およびＤＮＡ修復遺伝子
など）が関与している。これらの遺伝子が変異すると種々のがんを引き起こすことがよく
ある。本発明に開示された本システムおよび方法を用いることで、これらの変異を特異的
に標的化し、修正することが可能である。その結果、触媒部位またはスプライシング部位
に点変異が導入されることで、がんの原因となるタンパク質が機能的に無害化され、ある
いはその発現が抑制されうる。

幹細胞の遺伝的修飾
ある実施形態においては、本発明に開示される本システムおよび方法を用いて、幹細胞
または前駆細胞が遺伝的に修飾されうる。適切な細胞としては、例えば、幹細胞（成人の
幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞など）および前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、神経前
駆細胞など）が挙げられる。適切な細胞としては、例えば、齧歯動物の幹細胞、齧歯動物
の前駆細胞、ヒトの幹細胞、ヒトの前駆細胞などの哺乳動物の幹細胞および前駆細胞が挙
げられる。適切な宿主細胞としては、単離された宿主細胞などのインビトロの宿主細胞が
挙げられる。

ある実施形態において、本発明は、エクスビボで組織を標的として正確に遺伝的に修飾
するのに用いられ、根本的な遺伝的欠陥を修正することができる。エクスビボでの修正の
後、組織は患者に戻されてもよい。また、本技術は遺伝子疾患を修正するための細胞ベー
スの治療法に広範に用いられうる。

動物および植物における遺伝子編集
上述した本システムおよび方法は、１つ以上の所望の遺伝子修飾を有する非ヒトトラン
スジェニック動物またはトランスジェニック植物を作製するのに用いられうる。ある実施
形態において、非ヒトトランスジェニック動物は当該遺伝子修飾についてホモ接合性であ
る。ある実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は当該遺伝子修飾についてヘテロ
接合性である。ある実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は脊椎動物（例えば、
魚類（ゼブラフィッシュ、金魚、フグ、洞窟魚など）、両生類（カエル、サンショウウオ
など）、鳥類（ニワトリ、七面鳥など）、爬虫類（ヘビ、トカゲなど）、哺乳類（有蹄動
物（ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）；ウサギ目の動物（ウサギなど）；齧歯動物（ラッ
ト、マウスなど）；非ヒト霊長類など））である。

本発明は、上述したようなヒトにおける疾患を治療する方法と同様の方法で動物におけ
る疾患を治療するのにも用いられうる。あるいは、本発明は、研究、薬剤の開発および標
的の評価のための特定の遺伝子変異を有するノックイン動物疾患モデルを作製するのに用
いられうる。上述のシステムおよび方法はまた、家畜および穀物の品質を改良および改善
する目的で、種々の有機体のＥＳ細胞または胚に点変異を導入するのにも用いられうる。

外因性の核酸を植物細胞中に導入する方法は本技術分野において周知である。適切な方
法としては、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルスなど）、トランスフェクション、接合
、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシ
ウム沈殿、直接的なマイクロインジェクション、炭化ケイ素ウィスカー技術、アグロバク
テリウム媒介性の形質転換などが挙げられる。これらの方法の選択は通常、形質転換され
る細胞のタイプや形質転換を行う状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはイン
ビボ）に依存する。

キット
本発明はさらに、ＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓによりガイドされる標的への結合または修正の
反応を含む上述した方法を実施するための試薬を含有するキットをも提供する。この目的
に向けて、本明細書に記載の方法のための１つ以上の反応成分（例えば、ＲＮＡ、Ｃａｓ
タンパク質、融合エフェクタータンパク質および関連する核酸）が使用のためのキットの
形態で供給されうる。一実施形態において、当該キットはＣＲＩＳＰＲタンパク質または
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、エフェクタータンパク質、上述したＲＮＡスキャホ
ールドの１つ以上、上述したＲＮＡ分子のセットを含む。他の実施形態において、当該キ
ットは１つ以上の他の反応成分を含んでもよい。このようなキットにおいては、１つ以上
の反応成分の適量が、１つ以上の容器中で提供され、または基板上に保持される。

当該キットの追加の成分の例としては、以下に限定されないが、１つ以上の宿主細胞、
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための１つ以上の試薬、ＲＮＡもしくはタン
パク質の発現を検出し、または標的核酸の状態を確認するための１つ以上の試薬（例えば
、プローブまたはＰＣＲプライマー）、および反応のための（１Ｘまたは濃縮形態の）緩
衝液または培地が挙げられる。当該キットはまた、以下の成分の１つ以上をも含みうる：
支持体、終止試薬、修飾試薬または消化試薬、浸透圧調節物質および検出用装置。

用いられる反応成分は、種々の形態で提供されうる。例えば、当該成分（例えば、酵素
、ＲＮＡ、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液中に懸濁されるか、またはフ
リーズドライまたは凍結乾燥された粉末、ペレットまたはビーズでありうる。後者の場合
、これらの成分は再構成されると、アッセイに用いるための成分の完全な混合物を生じる
。本発明のキットは任意の適切な温度で提供されうる。例えば、液体中のタンパク質成分
またはその複合体を含有するキットの貯蔵のため、キットを０℃未満（好ましくは－２０
℃以下）で、あるいは凍結状態で提供して維持することが好ましい。

キットまたはシステムは、本明細書に記載の成分の任意の組み合わせを、少なくとも１
回のアッセイに十分な量で含有することができる。ある用途においては、１つ以上の反応
成分を予め測定された単回使用量で個々のチューブまたは同様の容器中で、典型的には使
い捨てのものとして提供してもよい。このように準備しておくと、標的核酸または当該標
的核酸を含有するサンプルもしくは細胞を直接個々のチューブに添加することで、ＲＮＡ
によりガイドされる反応が実施されうる。キット中に供給される成分の量は、任意の適切
な量であればよく、当該製品が向けられる対象となる市場に依存しうる。これらの成分が
供給される容器は、供給された形態を保持できる従来の任意の容器であればよく、例えば
、遠心チューブ、マイクロタイタープレート、アンプル、瓶または内蔵された検査デバイ
ス（流体デバイス、カートリッジ、ラテラルフローもしくは他の類似のデバイス）であり
うる。

当該キットはまた、容器または容器の組み合わせを保持する包装材料をも含みうる。こ
のようなキットおよびシステムのための典型的な包装材料としては、反応成分または検出
プローブを種々の任意の配置で（例えば、バイアル中で、マイクロタイタープレートのウ
ェル中で、マイクロアレイ中で）保持する固体のマトリックス（例えば、ガラス、プラス
チック、紙、箔、マイクロパーティクルなど）が挙げられる。当該キットは、上記の成分
の使用のために有形の形式で記録された指示書をさらに含んでもよい。

定義
核酸またはポリヌクレオチドとは、ＤＮＡ分子（例えば、以下に限定されないが、ｃＤ
ＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ分子（例えば、以下に限定されないが、ｍＲＮ
Ａ）を意味し、ＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体を含む。ＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似
体は、ヌクレオチド類似体から合成されうる。ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、修飾され
た塩基、修飾された主鎖、ＲＮＡ中のデオキシリボヌクレオチドなどの天然には存在しな
い部分を含んでもよい。核酸分子は、一本鎖または二本鎖でありうる。

核酸分子またはポリペプチドについて言及する際の「単離された」との語は、当該核酸
分子またはポリペプチドが、自然界においては自身が会合しているかまたは一緒になって
いることが観察される少なくとも１つの他の成分を実質的に含有していないことを意味す
る。

本明細書で用いられる場合、「ガイドＲＮＡ」との語は一般に、ＣＲＩＳＰＲタンパク
質に結合して当該ＣＲＩＳＰＲタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化すること
ができるＲＮＡ分子（またはＲＮＡ分子の包括的な群）を意味する。ガイドＲＮＡは、Ｄ
ＮＡ標的化ガイドセグメントおよびタンパク質結合セグメントの２つのセグメントを含み
うる。ＤＮＡ標的化セグメントは、標的配列に対して相補的な（または少なくともストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズしうる）ヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合
セグメントは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９関連ポリペプチドなどのＣＲＩＳＰＲタンパク質
と相互作用する。これらの２つのセグメントは同一のＲＮＡ分子中に位置していてもよい
し、２つ以上の異なるＲＮＡ分子中に存在していてもよい。これらの２つのセグメントが
別のＲＮＡ分子中に存在する場合、ＤＮＡ標的化ガイドセグメントを含む分子はＣＲＩＳ
ＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と称され、タンパク質結合セグメントを含む分子はトランス
活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称されることがある。

本明細書で用いられる場合、「標的核酸」または「標的」との語は、標的となる核酸配
列を含有する核酸を意味する。標的核酸配列は一本鎖であってもよいし二本鎖であっても
よく、二本鎖ＤＮＡであることがよくある。「標的核酸配列」、「標的配列」または「標
的領域」は、本明細書で用いられる場合、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて結合させ、また
はこれを用いて修飾しようとする特定の配列またはその相補体を意味する。標的配列は、
細胞のゲノム内で、インビトロまたはインビボの核酸内に存在するものであってよく、一
本鎖核酸または二本鎖核酸のいかなる形態であってもよい。

「標的核酸の鎖」とは、本明細書に記載のガイドＲＮＡを用いた塩基対形成に供される
標的核酸の鎖を意味する。すなわち、ｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡとハイブリダイズす
る標的核酸の鎖が「標的核酸の鎖」と称される。標的核酸の他方の鎖はガイド配列に対し
て相補的ではないが、これは「非相補的な鎖」と称される。二本鎖の標的核酸（例えば、
ＤＮＡ）の場合、それぞれの鎖はｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡを設計するための「標的
核酸の鎖」となることができ、適当なＰＡＭ部位が存在する限り本発明の方法を実施する
のに用いられうる。

本明細書で用いられる場合、「由来する」との語は、第１の成分（例えば、第１の分子
）または当該第１の成分からの情報が、別の第２の成分（例えば、当該第１の分子とは異
なる第２の分子）を単離し、抽出し、または作製するのに用いられるプロセスを意味する
。例えば、哺乳動物のコドンに最適化されたＣａｓ９ポリヌクレオチドは、野生型Ｃａｓ
９タンパク質のアミノ酸配列に由来する。また、Ｃａｓ９の単一変異ニッカーゼ（ｎＣａ
ｓ９Ｄ１０ＡなどのｎＣａｓ９）およびＣａｓ９の二重変異のヌル－ニッカーゼ（ｄＣａ
ｓ９ Ｄ１０Ａ Ｈ８４０ＡなどのｎＣａｓ９）などの哺乳動物のコドンに最適化された
Ｃａｓ９変異ポリヌクレオチドは、哺乳動物のコドンに最適化された野生型のＣａｓ９タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドに由来する。

本明細書において用いられる場合、「野生型」との語は、当業者によって理解される本
技術分野の用語であり、変異体またはバリアントの形態から区別されて天然に存在してい
る有機体、株、遺伝子または特性の典型的な形態を意味する。

本明細書において用いられる場合、「バリアント」とは、第２の成分（例えば、第２の
分子であり、これは「親の」分子と称される）と関連した第１の成分（例えば、第１の分
子）を意味する。バリアント分子は、親の分子に由来するもの、これから単離されるもの
、これに基づくもの、またはこれに相同のものでありうる。例えば、Ｃａｓ９の単一変異
ニッカーゼおよびＣａｓ９の二重変異のヌル－ニッカーゼなどの哺乳動物のコドンに最適
化されたＣａｓ９（ｈｓｐＣａｓ９）の変異体の形態は、哺乳動物のコドンに最適化され
た野生型のＣａｓ９（ｈｓｐＣａｓ９）のバリアントである。バリアントとの語は、ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれを説明するのにも用いられうる。

ポリヌクレオチドに適用される場合、バリアント分子はもとの親の分子との間で完全な
ヌクレオチド配列の同一性を有していてもよいし、あるいは当該親の分子との間で１００
％未満のヌクレオチド配列の同一性を有していてもよい。例えば、遺伝子のヌクレオチド
配列のバリアントは、もとのヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド配列において少
なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ
より高い同一性を有する第２のヌクレオチド配列でありうる。

ポリヌクレオチドのバリアントはまた、完全な親のポリヌクレオチドを含み、追加の融
合ヌクレオチド配列をさらに含むポリヌクレオチドをも包含する。ポリヌクレオチドのバ
リアントはまた、親のポリヌクレオチドの部分またはサブ配列であるポリヌクレオチドを
も包含する。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドの独特なサブ配列（例えば、標
準的な配列の比較・アラインメント技術により決定されるもの）もまた、本発明に包含さ
れる。

他の形態において、ポリヌクレオチドのバリアントは、親のヌクレオチド配列に対して
マイナーな、取るに足らない、または重要でない改変を含むヌクレオチド配列を包含する
。例えば、マイナーな、取るに足らない、または重要でない改変としては、（ｉ）対応す
るポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない、（ｉｉ）ポリヌクレオチドのタンパク質
をコードするオープンリーディングフレームの外側で生じる、（ｉｉｉ）対応するアミノ
酸配列に影響しうる欠失または挿入を生じるがポリペプチドの生物学的活性にはほとんど
またはまったく影響しない、（ｉｖ）ヌクレオチドの変化が、アミノ酸の化学的に類似の
アミノ酸による置換を生じる、ヌクレオチド配列に対する改変が挙げられる。ポリヌクレ
オチドがタンパク質をコードしない場合（例えば、ｔＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはｔｒ
ａｃｒＲＮＡ）、当該ポリヌクレオチドのバリアントは当該ポリヌクレオチドの機能の喪
失を生じないヌクレオチドの変化を含みうる。他の形態において、機能的に同一なヌクレ
オチド配列を生じる本明細書に開示のヌクレオチド配列の保存的なバリアントは本発明に
包含される。当業者であれば、本明細書に開示のヌクレオチド配列の多くのバリアントが
本発明に包含されることを理解している。

ポリペプチドに適用される場合、バリアントペプチドはもとの親のポリペプチドとの間
で完全なアミノ酸配列の同一性を有していてもよいし、あるいは当該親のタンパク質との
間で１００％未満のアミノ酸の同一性を有していてもよい。例えば、アミノ酸配列のバリ
アントは、もとのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列において少なくとも５０％、６
０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有
する第２のヌクレオチド配列でありうる。

ポリペプチドのバリアントはまた、完全な親のポリペプチドを含み、追加の融合アミノ
酸配列をさらに含むポリペプチドをも包含する。ポリペプチドのバリアントはまた、親の
ポリペプチドの部分またはサブ配列であるポリペプチドをも包含する。例えば、本明細書
に記載のポリペプチドの独特なサブ配列（例えば、標準的な配列の比較・アラインメント
技術により決定されるもの）もまた、本発明に包含される。

他の形態において、ポリペプチドのバリアントは、親のアミノ酸配列に対してマイナー
な、取るに足らない、または重要でない改変を含むポリペプチドを包含する。例えば、マ
イナーな、取るに足らない、または重要でない改変としては、非機能性ペプチド配列の付
加のような、ポリペプチドの生物学的活性に影響をほとんどまたはまったく与えず機能的
に同等のポリペプチドをもたらすアミノ酸の改変（置換、欠失および挿入など）が挙げら
れる。他の形態において、本発明に係るバリアントのポリペプチドは、親の分子（例えば
、ヌクレアーゼ活性が修飾され、または失われたＣａｓ９ポリペプチドの変異体）の生物
学的活性を変化させる。当業者であれば、本明細書に開示のポリペプチドの多くのバリア
ントが本発明に包含されることを理解している。

ある形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、わ
ずかな百分率（例えば、典型的には約１０％未満、約５％未満、４％未満、２％未満また
は１％未満）のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を変化させ、これを付加し、または欠
失させるバリアント分子を含みうる。

本明細書において用いられる場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における「保
存的置換」との語は、（ｉ）三量体コドンの暗号の縮重によりアミノ酸配列に対応する変
化を生じないか、または（ｉｉ）もとの親のアミノ酸が化学的に類似の構造を有するアミ
ノ酸で置換される、ヌクレオチド配列の変化を意味する。機能的に類似のアミノ酸を提供
する保存的置換の一覧表は本技術分野において周知であり、そこでは１つのアミノ酸残基
が類似の化学的特性（例えば、芳香族の側鎖または正に荷電した側鎖）を有する他のアミ
ノ酸残基で置換されており、よって得られるポリペプチド分子の機能的な特性には実質的
な変化は生じない。

以下に、類似の化学的特性を有する天然アミノ酸のグルーピングを示すが、ここではあ
る群の内部での置換は「保存的な」アミノ酸置換である。異なる機能的特性を考慮する場
合、これらの天然アミノ酸は異なるグルーピングで配置されうるため、以下に示すグルー
ピングは厳密なものではない。非極性および／または脂肪族の側鎖を有するアミノ酸とし
ては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびプロリンが挙げられ
る。極性の荷電していない側鎖を有するアミノ酸としては、セリン、スレオニン、システ
イン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。芳香族の側鎖を有する
アミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。正
に荷電した側鎖を有するアミノ酸としては、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げ
られる。負に荷電した側鎖を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン
酸が挙げられる。

「Ｃａｓ９の変異体」または「Ｃａｓ９のバリアント」とは、化膿連鎖球菌のＣａｓ９
タンパク質（すなわち、配列番号：１）のような野生型のＣａｓ９タンパク質のタンパク
質またはポリペプチド誘導体を意味し、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失、切断、
融合タンパク質またはこれらの組み合わせが挙げられる。これはＣａｓ９タンパク質のＲ
ＮＡ標的化活性を実質的に保持している。当該タンパク質またはポリペプチドは、配列番
号：１の断片を含んでもよいし、これからなっていてもよいし、実質的にこれからなって
いてもよい。一般に、この変異体／バリアントは、配列番号：１に対して少なくとも５０
％（例えば、５０％～１００％の任意の値）の同一性を有する。この変異体／バリアント
は、ＲＮＡ分子に結合し、当該ＲＮＡ分子を介して特定のＤＮＡ配列に標的化されること
ができ、ヌクレアーゼ活性をさらに有していてもよい。これらのドメインの例としては、
ＲｕｖＣ様モチーフ（配列番号：１の第７～２２アミノ酸、第７５９～７６６アミノ酸お
よび第９８２～９８９アミノ酸）およびＨＮＨモチーフ（第８３７～８６３アミノ酸）が
挙げられる。Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ．２０１２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５；１０９（３９）：Ｅ２５７９－Ｅ２５
８６およびＷＯ２０１３１７６７７２を参照のこと。

「相補性」とは、伝統的なワトソン－クリック塩基対形成または他の非伝統的な形式で
、核酸が他の核酸配列と水素結合を形成する能力を意味する。相補性の百分率は、核酸分
子中で第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）を形成しう
る残基の百分率を示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、および１０個は、５
０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全に相
補的」とは、核酸配列の連続したすべての残基が第２の核酸配列における同数の連続した
残基と水素結合するであろうことを意味する。本明細書において用いられる場合、「実質
的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ
よりも多いヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％
、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％である相補
性の程度を意味するか、または２つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
することを意味する。

本明細書において用いられる場合、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェン
トな条件」とは、その条件下で標的配列に対して相補性を有する核酸が当該標的配列と優
先的にハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を意味する
。ストリンジェントな条件は通常、配列依存的であり、種々の要因によって変動する。一
般に、配列が長くなるほど、当該配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度
は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎ
ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ
“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ
ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。

「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、特定のハイブリダイ
ゼーション条件下において、完全にまたは部分的に相補的な核酸の鎖が一体化して、これ
を構成する二本の鎖が水素結合により合わさった二本鎖の構造または領域を形成するプロ
セスを意味する。水素結合は通常、アデニンとチミンもしくはウラシルとの間（ＡとＴま
たはＵ）、またはシトシンとグアニンとの間（ＣとＧ）で形成されるが、他の塩基対がけ
いせいされてもよい（例えば、ｅ．ｇ．，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １１ｔｈ ｅｄ．，
１９９２）。

本明細書において用いられる場合、「発現」とは、それによってポリヌクレオチドがＤ
ＮＡの鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／
または、転写されたｍＲＮＡが引き続きペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻
訳されるプロセスを意味する。転写物およびコードされたポリペプチドは、総称して「遺
伝子産物」と称されうる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来のものである場合、発現
には真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングも含まれうる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」との語は、本明細書においては
区別せずに用いられ、任意の長さのアミノ酸の重合体を意味する。この重合体は線状であ
っても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、間に非アミノ酸を含んでい
てもよい。これらの語はまた、修飾されたアミノ酸の重合体、例えば、ジスルフィド結合
の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化、ＰＥＧ化、または、ラベル
化成分との共役などの他の任意の改変を施されたものをも包含する。本明細書において用
いられる場合、「アミノ酸」との語は、グリシンおよびＤ体またはＬ体の光学異性体、並
びにアミノ酸類似体およびペプチド類似体などの、天然および／または非天然もしくは合
成のアミノ酸を含む。

「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」との語は、２つ以上のポリペプチド配
列を一緒に合わせることによって作製されたタンパク質を意味する。本発明に包含される
融合ポリペプチドとしては、第１のポリペプチド（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）をコー
ドする核酸配列を、第２のポリペプチド（例えば、エフェクタードメイン）をコードする
核酸配列と合わせて単一のオープンリーディングフレームを形成したキメラ状の遺伝子構
築物の翻訳産物が挙げられる。言い換えれば、「融合ポリペプチド」または「融合タンパ
ク質」は、ペプチド結合によって、またはいくつかのペプチドを介して合わさった２つ以
上のタンパク質の組み換えタンパク質である。融合タンパク質はまた、２つのドメインの
間にペプチドリンカーを含んでもよい。

「リンカー」との語は、２つ以上のものを合わせるのに用いられる任意の手段、もの、
または部分を意味する。リンカーは共有結合性のリンカーであってもよいし、非共有結合
性のリンカーであってもよい。共有結合性のリンカーの例としては、共有結合または連結
すべきタンパク質もしくはドメインの１つ以上に共有結合で連結されたリンカー部分が挙
げられる。このリンカーはまた、非共有結合（例えば、白金原子などの金属中心を介した
有機金属結合）であってもよい。共有結合で連結するには、炭酸誘導体などのアミド基、
エーテル、有機エステルまたは無機エステルなどのエステル、アミノ、ウレタン、ウレア
などの種々の官能性が用いられうる。連結を提供すべく、各ドメインは、酸化、ヒドロキ
シ化、置換、削減などによって修飾されてカップリングのための部位を提供することがで
きる。共役の方法は当業者に周知であり、本発明での使用に包含される。リンカー部位と
しては、以下に限定されないが、化学的なリンカー部位または例えばペプチドリンカー部
位（リンカー配列）が挙げられる。ＲＮＡ結合ドメインおよびエフェクタードメインの機
能を有意に低下させない修飾が好ましいことは理解されるであろう。

本明細書において用いられる場合、「共役体」または「共役」または「連結された」と
の語は、２つ以上のものがあわさって１つのものを形成していることを意味する。共役体
には、ペプチド－小分子共役体と、ペプチド－タンパク質／ペプチド共役体の双方が包含
される。

「被験者」および「患者」の語は、本明細書では区別せずに用いられ、脊椎動物を意味
し、好ましくは哺乳動物を意味し、より好ましくはヒトを意味する。哺乳動物としては、
以下に限定されないが、マウス、サル、ヒト、家畜、運動競技用動物およびペットが挙げ
られる。インビボで得られた、またはインビトロで培養された、生命体の組織、細胞およ
びこれらの子孫もまた包含されうる。ある実施形態において、被験者は無脊椎動物（例え
ば、昆虫または線形動物）であってもよいが、他の実施形態では、被験者は植物または真
菌であってもよい。

本明細書で用いられる場合、「治療」または「治療する」または「緩和する」または「
軽減する」は区別せずに用いられる。これらの語は、以下に限定されないが、治療上の便
益および／または予防的な便益などの有利な、または所望の結果を得るためのアプローチ
を意味する。治療上の便益とは、治療に供された１つ以上の疾患、症状または兆候におけ
る、治療に関連した改善またはこれに対する効果を意味する。予防的な便益のためには、
特定の疾患、症状または兆候が進展するリスクのある被験者に対して、または疾患の病理
学的な兆候の１つ以上を申告している被験者に対して、組成物が投与されうるが、これら
の疾患、症状または兆候は依然として顕在化していなくてもよい。

本明細書において、「接触させる」との語が成分の任意のセットに関連して用いられる
場合には、接触させられる成分が同一の混合物中に混合される（例えば、同一の容器また
は溶液中に添加される）任意のプロセスを含むが、必ずしも当該成分が実際に物理的に接
触していなくてもよい。これらの成分は、任意の順序で、任意の組み合わせ（またはサブ
コンビネーション）で接触してよく、得られた混合物から当該成分の１つ以上が、続いて
（場合によっては他の成分の添加の前に）除去される場合も含みうる。例えば、「ＡをＢ
およびＣと接触させる」とは、以下の場合のいずれかまたはすべてが含まれる：（ｉ）Ａ
をＣと混合し、次いでこの混合物にＢを添加する；（ｉｉ）ＡおよびＢを混合して混合物
とし、この混合物からＢを除去し、次いでこの混合物にＣを添加する；（ｉｉｉ）ＢとＣ
との混合物にＡを添加する。標的の核酸または細胞を１つ以上の反応成分（Ｃａｓタンパ
ク質またはガイドＲＮＡなど）と接触させることとしては、以下の場合のいずれかまたは
すべてが含まれる：（ｉ）標的または細胞を反応混合物の第１の成分と接触させて混合物
とし、次いで当該反応混合物の他の成分を、任意の順序または組み合わせでこの混合物に
添加する；（ｉｉ）標的または細胞との混合の前に、上記反応混合物を完全に形成する。

本明細書において用いられる場合、「混合物」との語は、分散していて特定の秩序をも
たない、要素の組み合わせを意味する。混合物は異種のものであり、別々の構成要素へと
空間的に分離することはできない。要素の混合物の例としては、同一の水溶液中に溶解し
ている多数の異なる要素や、別々の成分が空間的に区別されないようにして、固体状の支
持体にランダムにまたは特定の秩序をもたずに付着している多数の異なる要素が挙げられ
る。言い換えれば、混合物はアドレス可能ではない。

本明細書に開示されている、値の範囲について多くのものが記載される。文脈から明ら
かにそうでないと言えない限り、ある範囲の上限値および下限値の中間のそれぞれの値も
また、下限値の単位の１０分の１の値として具体的に開示されているものとする。明記さ
れた任意の値または明記された範囲の中間の値と当該明記された範囲内に位置する他の任
意の明記された値または中間の値との間のより小さいそれぞれの範囲もまた、本発明の範
囲に包含される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、それぞれ独立して、
当該範囲に含まれても含まれなくてもよく、境界値のいずれかまたは双方がより小さい範
囲に含まれるか、あるいはいずれもより小さい範囲に含まれないそれぞれの範囲もまた、
明記された範囲において具体的に除外された任意の境界値に依存する形で、本発明に包含
される。明記された範囲が境界値の１つまたは双方を含む場合、これらの含まれた境界値
の一方または双方を除外した範囲もまた、本発明に包含される。「約」との語は一般的に
、示された数のプラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」とは、９
％～１１％の範囲を示し、「約２０」とは１８～２２を意味しうる「約」の別の意味は、
四捨五入などの文脈から明らかであり、よって例えば、「約１」は０．５～１．４をも意
味する。

実施例１ 細菌ゲノムの標的シチジンヌクレオチドにおいて部位特異的変異をもたらす
ＣＲＣシステム
本実施例では、大腸菌ＭＧ１６５５株をモデルとして用いた。細菌のＲＮＡポリメラー
ゼのサブユニットβ遺伝子（ｒｐｏＢ）における変異は、細胞を抗生物質であるリファン
ピシンに対して耐性にする（Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０２，４５－５８，（１９８８）およびＧｏｌｄｓｔｅｉ
ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ ６７，６２５－６３０，ｄｏｉ：１０．１０
３８／ｊａ．２０１４．１０７（２０１４））。変異については単離して個別に解析する
ことが可能であり、変異の頻度も算出されうる。ＡＩＤは、シチジンデアミナーゼのＡＰ
ＯＢＥＣファミリーに属するＢ細胞特異的なタンパク質であり、抗体の多様化および親和
性成熟の際の体細胞超変異およびクラススイッチ組み換えに関与している（Ｏｄｅｇａｒ
ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，５７３－５８３（２００６）
，およびＮｏｉａ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ７６，１－２２，ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．７６．０６１７０５．０９０７４０（２００７））。よって、これらの実験の
セットについては、非ヌクレアーゼエフェクタータンパク質としてＡＩＤを用いて大腸菌
ＭＧ１６５５株が標的化される。

コンストラクトおよびシステムの構成
誘導性プロモーター
タンパク質をコードするすべてのコンストラクトは、Ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御
下で設計した。誘導剤としては、３０ｎＭの濃度のアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ
；シグマ）を用いた。

Ｃａｓ９コンストラクト
本システムの主要な特徴は、ＤＳＢの生成を伴わずにヌクレオチドの修飾を正確に導入
することにある。この目的に向けて、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ欠損体（すなわち、触媒活
性を失ったＣａｓ９（Ｃａｓ９_{Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ}、ｄＣａｓ９）およびＣａｓ９ニッ
カーゼ（ｎＣａｓ９_Ｄ１０ＡまたはｎＣａｓ９_{Ｈ８４０Ａ}）（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎ
ｃｅ．１２２５８２９（２０１２）））をＤＮＡ標的化モジュールとして用いた。Ｃａｓ
９ニッカーゼは、オフセットダブルＤＮＡニッキングによりオフターゲットのＤＳＢを低
減する目的で用いられてきた（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４，１
３８０－１３８９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０８．０２１（
２０１３）およびＳｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈ １１，３９９－４０
２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８５７（２０１４））。また、ｄＣａｓ９
は、ヌクレアーゼ活性から独立した種々の活性をもたらすことを目的として作製されてき
た。Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４３９，１３２－１３
６，（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈ １
０，９７３－９７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６００（２０１３）、Ｍ
ａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８３３－８３８，ｄｏ
ｉ：１０．１０３８ ｅｔ ａｌ．／ｎｂｔ．２６７５（２０１３）、Ｚａｌａｔａｎ，
Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６０，３３９－３５０，ｄｏｉ：１０．１０１６／
ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．１１．０５２（２０１５）、Ｑｉ，Ｌ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ １５２，１１７３－１１８３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０
１３．０２．０２２（２０１３）、Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ． Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８，２１８０－２１９６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏ
ｔ．２０１３．１３２（２０１３）、Ｈｉｌｔｏｎ，Ｉ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈ ３３，５１０－５１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１９９（
２０１５）、Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈ １２，１１４
３－１１４９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３６３（２０１５）、Ｃｈｅｎ，
Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５５，１４７９－１４９１，ｄｏｉ：１０．１０１６／
ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．１２．００１（２０１３）およびＦｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍ
ｓ１１７０７（２０１６）を参照。したがって、これらのバリアントはほとんど安全であ
ると考えられ、本研究により提供されるシステムを開発するのにふさわしい候補である。

標的化された動員システム
本システムは、ＲＮＡスキャホールド媒介性の動員プラットフォームとして作製された
。本研究において用いられたコンストラクトの概要などの概略図を図１Ａに示す。Ｃａｓ
９のバリアントについては独立したコンストラクトとして設計したが、ｇＲＮＡについて
はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡスキャホールドの３’末端にファージＲＮＡスキャホールドを合
成的に融合したキメラＲＮＡ種として作製した。ファージＲＮＡスキャホールドは、非ヌ
クレアーゼエフェクタータンパク質に連結された特定のＲＮＡ結合タンパク質を動員する
（図１Ｂ）。このＲＮＡスキャホールド動員システムは、ファージＭＳ２およびそれが相
互作用する相手方であるＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）に由来するものである。

標的化ｇＲＮＡ
標的は、細菌のｒｐｏＢ遺伝子である。３つのクラスター（合わせてリファンピシン耐
性決定領域（ＲＲＤＲ）と称される）における変異により、細胞は抗生物質であるリファ
ンピシンに対する耐性を獲得する（Ｒｉｆ^Ｒ）（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ
Ａｎｔｉｂｉｏｔ ６７，６２５－６３０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｊａ．２０１４
．１０７（２０１４））。ＲＲＤＲクラスターＩ配列における重要なアミノ酸を標的化す
ることを目的として、４つのｇＲＮＡのセットを設計した（すなわち、Ｓ５１２、Ｄ５１
６、Ｈ５２６およびＳ５３１；図２Ａ）。Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０２，４５－５８，（１９８８）およびＪｉ
ｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｖ
ｏｌｕｍｅ ２７３ ３００－３１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。

実験的アプローチ
化学的にコンピテントとした大腸菌ＭＧ１６５５細胞を、セクション１に記載のコンス
トラクトをコードするプラスミドの組み合わせからなる全ＤＮＡ １０～２０ｎｇで形質
転換した。形質転換の後、細胞を選別し、適切な抗生物質を含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒ
ｔａｎｉ培地中で誘導した。選別／誘導の後、ＯＤを測定し、細胞を順次希釈し、リファ
ンピシン（１２０μＭ）を含有するＬＢ寒天プレート上に１０^８～１０^４個の細胞を播種
した。平板効率のためにリファンピシンを含まない選択寒天プレート上に２００個の細胞
を播種した。一晩インキュベーションした後、コロニーを計数し、変異の頻度を記録した
。また、コロニーから単離されたｒｐｏＢ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、配列を決定して
変異をマッピングした。

結果
ＡＩＤの標的化された動員はＣからＴへの部位特異的な変換をもたらす
ｒｐｏＢのＲＲＤＲ（クラスターＩ）領域を標的化する４つのｇＲＮＡのセットを用い
て、標的部位へとＡＩＤを動員した（図２Ａ）。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４を用いたＣＲＣ標的
化および、程度は低いがｒｐｏＢ＿ＴＳ－３を用いたＣＲＣ標的化により、リファンピシ
ン培地中でのＭＧ１６５５細胞の生存画分は増加した（図２Ｂ、図２Ｃ）。ｒｐｏＢ＿Ｔ
Ｓ－４による処理から得られたクローンの配列解析から、Ｃ１５９２のＴへの変異と、こ
れに付随する、Ｒｉｆ^Ｒ細胞をもたらす変異であることが知られているセリン５３１から
フェニルアラニンへのアミノ酸の変換についての高い特異性が確認された（Ｐｅｔｅｒｓ
ｅｎ－Ｍａｈｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８，９９－１０４（２００２），
Ｘｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８７
，２７８３－２７９２，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．１８７．８．２７８３－２７９
２．２００５（２００５）およびＺｅｎｋｉｎ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４９，１５８７－１５
９０，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．４９．４．１５８７－１５９０．２００５（２
００５））（図２Ｄ）。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－３、ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４およびスクランブルの
変異の分布を図２Ｅにまとめた。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４処理において観察された変異頻度の
かなりの増加と修飾ヌクレオチドの配置、並びにｒｐｏＢ＿ＴＳ－３処理における効率の
低下から、標的であるシトシンは、プロトスペーサーの５’末端により近い、ＣＲＩＳＰ
Ｒ Ｒ－ループにより残された対を形成していない鎖上に位置する必要があることが示唆
される（すなわち、変異頻度はＴＳ４＞ＴＳ３であり、これらはいずれも同一のヌクレオ
チドを標的化し、修飾する；図２Ａ、図２Ｃおよび図２Ｅ）。このことは、ＡＩＤが一本
鎖ＤＮＡ上のシトシン残基を積極的に脱アミノ化するという見解と整合している（Ｏｄｅ
ｇａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，５７３－５８３（２０
０６），Ｎｏｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ７６，１－２２，ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．７６．０６１７０５．０９０７４０（２００７），Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｃ．，
ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３，２５８－２６８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．
２０１１．１０．００４（２０１２）およびＲａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃ
ｏｍｍｓ５５１６（２０１４））。標的化モデルの概略図を図２Ｆに示す。

ＣＲＣのモジュラリティ
標的化モジュールをｄＣａｓ９からｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａへ変更するとＣからＴ／Ａへの
変換の効率が上昇する
標的化モジュールをｄＣａｓ９からｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａへ変更すると、リファンピシン
プレート上の生存画分の観点でのシステムの効率がコントロールに対して１８倍から４３
倍へと上昇した。変異の解析により、標的ヌクレオチドに対して^ＡＩＤＣＲＣ処理と同様
の特異性が確認された。この場合、Ｃ１５９２は１００％のクローンで修飾され、７５％
がＣからＴへと変異し、２５％がＣからＡへと変異していた（図３Ｂ）。

他の非ヌクレアーゼエフェクター（ＡＰＯＢＥＣ３ＧおよびＡＰＯＢＥＣ１）の標的化
された動員により、部位特異的なＣからＴ／Ａへの変換を導入することができる
エフェクタータンパク質としてのＡＩＤに加えて、ＡＰＯＢＥＣファミリーに由来する
他のシチジンデアミナーゼ（すなわち、ＡＰＯＢＥＣ３ＧおよびＡＰＯＢＥＣ１）につい
ても試験を行った（図４Ａ）。ＡＰＯＢＥＣ１は、プロトタイプシステム（^ＡＩＤＣＲＣ
_Ｄ１０Ａ）と比較して、標的化された変異の頻度を増加させた。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの活性
は、プロトタイプシステムよりも低かった。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４を標的化コンストラクト
として用い、^Ａｐｏ１ＣＲＣ_Ｄ１０Ａで処理された細胞の変異の解析では、１００％がＣ
１５９２→Ｔの変換を示した。また、カ移籍したクローンの２５％は二重変異体であり、
アミノ酸の変化を生じないＣ１５９０→Ｔの変換をも示した（図４Ｂ）。

ＲＮＡ動員スキャホールドの数を増加させるとＣからＴ／Ａへの変換の特異性を変えず
に変異の頻度が増加する
タンデムの多量体リクルーティングスキャホールドを付加することで、標的領域上に存
在するエフェクターを潜在的に増加させることができ、これによってシステムの効率を向
上させることができた。この目的に向けて、２つのＭＳ２ループ（２×ＭＳ２）を含むよ
うにｒｐｏＢ＿ＴＳ－４を改良した。１つのＭＳ２ループ（１×ＭＳ２）を有するｒｐｏ
Ｂ＿ＴＳ－４とｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ ２×ＭＳ２との間で、標的化の効率を比較した（図
５Ａ）。その結果から、リクルーティングループの数を増加させると、Ｒｉｆ^Ｒの観点で
の変異の効率は実際に向上することが示され、これによって存在するエフェクタータンパ
ク質が増加していることが示唆される。ｒｐｏＢ＿ＴＳ－４ ２×ＭＳ２を標的化コンス
トラクトとして用い、^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａで処理された細胞の変異の解析では、Ｃ１５
９２ヌクレオチドが１００％のクローンにおいて修飾され、そのうち６２．５％がＣから
Ｔへ変異し、３７．５％がＣからＡへ変異していたことが示された（図５Ｂ）。これらの
結果から、リクルーティングモジュールの改良はシステムの標的化の特異性に影響しない
ことが示唆される。

まとめると、以上の結果から、ＣＲＣシステムのモジュラー設計により作製プロセスが
簡便になり、システムのさらなる改善の可能性が高まることがわかる。

実施例２ ＣＲＣシステムは哺乳動物のシステムにおいて部位特異的なヌクレオチドの
変換をもたらした
実験のデザイン：哺乳動物での発現のためのシステムの改良
次いで、哺乳動物での発言のためにシステムの改良を試みた。この目的に向けて、自己
切断可能なＰ２Ａペプチドで隔てられたＡＩＤ＿ＭＣＰ融合物がその後に連結された、哺
乳動物のコドンに最適化されたｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａを用いて、原核細胞のＡＩＤＣＲＣＤ
１０Ａシステムを多シストロン性のコンストラクトとして反復した。このコンストラクト
をユビキチンＣプロモーターの制御下でクローニングした。それぞれ５’－Ｇまたは５’
－Ａを有する標的について、Ｕ６またはＨ１プロモーターの制御下で、ｇＲＮＡ＿２×Ｍ
Ｓ２カセットをクローニングした（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ
５５１６ （２０１４））。これらの一連の実験で用いられたコンストラクトの概略図を
図６Ａに示す。

染色体外ＤＮＡの標的化：ＥＧＦＰ逆変異アッセイ
ＥＧＦＰを改良して、そのフルオロフォアを破壊する機能喪失型点変異（１９７Ａ→Ｇ
、Ｙ６６Ｃ）を有するようにし、これによってタンパク質を非蛍光性とした（_ｎｆＥＧＦ
Ｐ^Ｙ６６Ｃ）。次いで、この変異体ＧＦＰの発現ベクターを哺乳動物の細胞にトランスフ
ェクションし、システムの基材とする。本実験の目的は、上述した機能喪失型点変異を「
修正」することであった。「修正された」遺伝子が転写されて翻訳されると、この修正に
よってタンパク質の機能は回復し、蛍光顕微鏡下で蛍光性の細胞として可視化することが
可能となる。

実験的アプローチ
_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ、^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０ＡおよびｇＲＮＡコンストラクトをコード
する標的プラスミドを含むＤＮＡの組み合わせ１０μｇを用いて、約７×１０^５個の２９
３Ｔ細胞をトランスフェクションした。比較のために、これら一連の実験では第３世代の
塩基エディターシステム（ＢＥ３、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１０３８／
ｎａｔｕｒｅ１７９４６）を用いた。ＢＥ３は異なる動員メカニズム（Ｃａｓ９とＡＰＯ
ＢＥＣ１との直接的な融合）を用いた少し似たシステムであり、ＤＮＡ修復に関与する酵
素であるウラシルＤＮＡグリコシラーゼを阻害するペプチドを含む。一晩のインキュベー
ションの後、蛍光顕微鏡下で細胞を解析して、ＧＦＰシグナルを観察した。

結果
上述したＣＲＣシステムは、タンパク質の機能を保ったまま、染色体外ＤＮＡにおける
標的ヌクレオチドを修飾することができることがわかった。標的のシトシンは鋳型鎖（Ｔ
Ｓ、－）に位置することから、２つのｇＲＮＡについては、標的ヌクレオチド周辺の非鋳
型鎖（ＮＴ、＋）に結合するように設計した（図６Ｂ）。標的のシトシンは、それぞれ_ｎ
ｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１プロトスペーサーおよび_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－２
プロトスペーサー内の５位および１２位に位置する。ｎＣａｓ９_Ｄ１０Ａ、ＡＩＤ＿ＭＣ
Ｐ、ｇＲＮＡ（_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１または_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－２
）、および標的コンストラクト（_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ）をコードするＤＮＡを用いて、
２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１および_ｎｆ
ＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－２で処理したがスクランブルでは処理していない細胞について
、ＥＧＦＰシグナルを検出した（図６Ｃ）。標的のシトシンの位置により、_ｎｆＥＧＦＰ
^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－２の場合と比較して、_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１で処理された細
胞ではＥＧＦＰシグナルがより強かった。_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１は、標的のＣ
をＡＩＤへよりアクセス可能にしているようである（図６Ｃ、中央および右のパネル）。
また、ＣＲＣプラットフォームを、動員のためのシチジンデアミナーゼタンパク質のＣａ
ｓ９タンパク質への直接融合を利用し、効率の改善のためにウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼ（ＵＧＩ）の阻害剤の共発現を必要とする別の遺伝子編集システム（ＢＥ３）と比較し
た。そうしたところ、予期せぬことに、エフェクターと配列標的化モジュールとがＲＮＡ
スキャホールドを介して連結しているＣＲＣシステムの方が、局所的なＵＮＧの阻害を必
要としなくとも、ＢＥ３システムよりもずっと効率的であることが判明した（図６Ｃ、図
６Ｄおよび図７Ｂ）。

これらの結果により、細菌の系からの知見が裏付けられ、本システムは、プログラム可
能な方法で、ヒトの細胞の染色体外ＤＮＡにおける特定のシトシン残基を効率的に脱アミ
ノ化することが示される。^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａによる処理および標的化ｇＲＮＡとして
_ｎｆＥＧＦＰ^Ｙ６６Ｃ＿ＮＴ－１を用いたＢＥ３による処理からのＧＦＰ陽性細胞の計量
により、ＣＲＣシステムがＢＥ３よりも優れた変換効率を示すことが示唆される（図６Ｄ
）。

実施例３ ＣＲＣシステムは哺乳動物の細胞において内因性の遺伝子の部位特異的なヌ
クレオチド変換をもたらす
内因性の遺伝子座の標的化：チャイニーズハムスターのＨＰＲＴ遺伝子
細菌の陰性選択システムから観察された良好な結果に後押しされて、哺乳動物の細胞に
おいても類似のアプローチを採用することとした。ヒポキサンチン－グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）は、プリン代謝に関与する酵素であり、そのコーデ
ィング配列における変異は代謝拮抗物質である６－チオグアニン（６－ＴＧ^Ｒ）に対する
耐性を生じることが知られている（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２６９，８１５－８１６（１９７７））。これらの実験は、ＣＲＣシステムを用いて
ＨＰＲＴ遺伝子を変異させてその機能を阻害し、さらなる解析のために、６－ＴＧを用い
て変異細胞を選択することを目的として行った。

実験的アプローチ
^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０ＡコンストラクトおよびｇＲＮＡであるＨＰＲＴ＿ＴＳ－１発現ベ
クターを含むＤＮＡの組み合わせ１０μｇを用いて、約７×１０^５個のチャイニーズハム
スターＶ７９－４細胞をトランスフェクションした。比較のために、細胞をＢＥ３および
ｇＲＮＡであるＨＰＲＴ＿ＴＳ－１で処理した。既報に記載の哺乳動物における突然変異
誘発性のプロトコールに従って、処理した細胞および未処理の細胞を増殖させた（Ｋｌｅ
ｉｎ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｔ
ｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００１））。簡単
に言えば、トランスフェクションの後、細胞を７日間維持し、次いで変異の固定および既
に存在していたＨＰＲＴ ｍＲＮＡおよびタンパク質のターンオーバーのための６－ＴＧ
による選択を行った。６０μＭの６－ＴＧを用いて１４日間細胞を選択し、６－ＴＧ^Ｒの
コロニーを形成させた。コロニーを計数して変異の頻度を見積もり、個々のコロニーを単
離して配列決定の解析のために別々に増殖させた。

結果
チャイニーズハムスターのＨＰＲＴ遺伝子に由来するエクソン３を標的化するように、
１つのｇＲＮＡを設計した（図７Ａ）。このｇＲＮＡは、フェニルアラニンをコードする
コドン７４を標的化し、この残基における変異はＨＰＲＴタンパク質の安定性を低下させ
ることが既に知られていた（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６
３，３３１－３３６，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／
０３７８－１１１９（８８）９０５３６－７（１９８８））。^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａまた
はＢＥ３コンストラクトをコードするＤＮＡを、標的化ｇＲＮＡ発現ベクターと一緒に用
いてＶ７９－４細胞をトランスフェクションした。^ＡＩＤＣＲＣ_Ｄ１０Ａシステムは、Ｂ
Ｅ３システムよりも高い効率で、細胞を６－ＴＧ処理に対して耐性にする変異をもたらし
た（すなわち、それぞれ未処理の細胞と比較して１４０倍ｖｓ．４０倍であった；図７Ｂ
）。この結果から、ＣＲＣシステムは哺乳動物の内因性の遺伝子座における特定のＤＮＡ
配列を標的化し、修飾することができることが示される。

上述した実施例および好ましい実施形態の記載は、特許請求の範囲によって確定される
本発明を限定するものとしてというよりも、例示的なものと捉えられるべきである。容易
に理解可能であろうが、上述した特徴についての多くの改変および組み合わせが、特許請
求の範囲に記載の本発明を逸脱することなく採用可能である。このような改変は本発明の
範囲からの逸脱とみなされてはならず、このような改変はすべて、後述する特許請求の範
囲に含まれるものとする。本明細書において引用されたすべての文献は、その全体が参照
により引用されている。

Claims (15)

1. （ｉ）配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
   （ｉｉ）（ａ）標的核酸の配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含む核酸標的化モチーフ、（ｂ）前記配列標的化タンパク質に結合可能なＣＲＩＳＰＲモチーフ、および（ｃ）リクルーティングＲＮＡモチーフを含むＲＮＡスキャホールドまたはこれをコードするポリヌクレオチドと、
   （ｉｉｉ）（ａ）前記リクルーティングＲＮＡモチーフに結合可能なＲＮＡ結合ドメイン、（ｂ）リンカー、および（ｃ）ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の酵素活性を有するエフェクタードメインを含む非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
   を含む、宿主細胞。
2. 前記配列標的化タンパク質がＣＲＩＳＰＲタンパク質である、請求項１に記載の宿主細胞。
3. 前記配列標的化タンパク質が、化膿連鎖球菌、Ｂ群溶血性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、サーモフィルス菌、サーモフィルス菌、髄膜炎菌およびトレポネーマ・デンティコラからなる群から選択される種のｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９の配列を含む、請求項１または２に記載の宿主細胞。
4. 前記リクルーティングＲＮＡモチーフおよび前記ＲＮＡ結合ドメインが、以下のものからなる群から選択される対である、請求項１～３のいずれか１項に記載の宿主細胞：
   テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質またはそのＲＮＡ結合部位；
   テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質またはそのＲＮＡ結合部位；
   ＭＳ２ファージオペレーターステムループおよびＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）またはそのＲＮＡ結合部位；
   ＰＰ７ファージオペレーターステムループおよびＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）またはそのＲＮＡ結合部位；
   ＳｆＭｕファージＣｏｍステムループおよびＣｏｍＲＮＡ結合タンパク質またはそのＲＮＡ結合部位；並びに、
   非天然のＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドまたはそのＲＮＡ結合部位。
5. 前記酵素活性が、脱アミノ化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性である、請求項１～４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
6. 前記細胞が、古細菌の細胞、細菌の細胞、真核細胞、真核の単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物の細胞、藻の細胞、動物の細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、魚の細胞、カエルの細胞、トリの細胞、哺乳動物の細胞、ブタの細胞、ウシの細胞、ヤギの細胞、ヒツジの細胞、齧歯動物の細胞、ラットの細胞、マウスの細胞、非ヒト霊長類の細胞およびヒトの細胞からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
7. 前記細胞が、ヒトまたは非ヒトの被験体中のものであるか、これ由来のものである、請求項６に記載の宿主細胞。
8. 前記ヒトまたは非ヒトの被験体が遺伝子の遺伝子変異を有しているか、または、病原体を有しているかもしくは前記病原体に曝露されるリスクを抱えている、請求項７に記載の宿主細胞。
9. 前記被験体が、前記遺伝子変異に起因する障害または前記障害を有するリスクを抱えている、請求項８に記載の宿主細胞。
10. 前記配列標的化タンパク質がヌクレアーゼ活性を有していない、請求項１～９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
11. （ａ）前記配列標的化タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
    （ｂ）前記ＲＮＡスキャホールドまたはこれをコードするポリヌクレオチドと、
    （ｃ）前記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドと、
    を宿主細胞に導入することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の宿主細胞の製造方法。
12. 前記配列標的化タンパク質が、前記配列標的化タンパク質をコードする核酸によって前記宿主細胞に導入される、請求項１１に記載の製造方法。
13. 前記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質が、前記非ヌクレアーゼエフェクター融合タンパク質をコードする核酸によって前記宿主細胞に導入される、請求項１１または１２に記載の製造方法。
14. 前記ＲＮＡスキャホールドが、前記ＲＮＡスキャホールドをコードする核酸によって前記宿主細胞に導入される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
15. 前記ＲＮＡスキャホールドまたは前記タンパク質の発現を可能とする適切な条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の製造方法。

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