JP2023514327A - ゲノム改変のための高忠実度ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ - Google Patents

ゲノム改変のための高忠実度ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ Download PDF

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Abstract

操作されたＣａｓ９タンパク質変異体および系、前記タンパク質変異体および系をコードする核酸、およびゲノム改変のために前記タンパク質変異体および系を作成および使用する方法。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年３月１１日に出願された米国仮出願第６２／９８８，２７９号の優先権の利益を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。２０２１年３月１１日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ２０－０３５＿ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４９，１２０バイトサイズである。
本開示の技術分野
本開示は、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体および系、当該タンパク質変異体および系をコードする核酸、ならびにゲノム改変のための当該タンパク質変異体および系の生産および使用方法に関する。
本開示の背景
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、多くの細胞種および生物種においてゲノム編集エンドヌクレアーゼとして広く採用されている。しかし、野生型ヌクレアーゼは、標的部位に似た配列を持つ意図しないゲノム部位に変異を引き起こす性質を有する。この欠点を改善するために、特異性を向上させたいくつかのＳｐＣａｓ９変異体が開発されてきた。これらには、ｅＳｐＣａｓ９ １．０（Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９ １．１（Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１（Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ）、ＨｙｐａＣａｓ９（Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａ）、ＥｖｏＣａｓ９（Ｍ４９５Ｖ、Ｙ５１５Ｎ、Ｋ５２６Ｅ、Ｒ６６１Ｌ）、Ｓｎｉｐｅｒ Ｃａｓ９（Ｆ５３９Ｓ、Ｍ７６３Ｉ、Ｋ８９０Ｎ）、ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３（Ｒ６９１Ａ）、Ｏｐｔｉ－ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１Ａ およびＫ１００３Ｈ）、およびＯｐｔｉＨＦ－ＳｐＣａｓ９（Ｑ６９５Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｅ２９３Ｍ、Ｔ９２４Ｖ およびＱ９２６Ａ）（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，８４－８８；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４９０－４９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５５０，４０７－４１０；Ｃａｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６，２６５－２７１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９，３０４８；Ｖａｋｕｌｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４，１２１６－１２２４；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６，７２２－７３０）を含む。しかし、これらの変異体のほとんどはプラスミド形態におけるスクリーニングによって同定されたものであり、およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）送達によるゲノム編集のための組み換えタンパク質への変換ではしばしば低い活性となった。
ゲノム改変におけるＳｐＣａｓ９組み換えタンパク質の需要が大きく増加しているため、異なるゲノム部位にわたって向上した特異性および持続的な活性で機能し得る組み換えタンパク質形態のヌクレアーゼが必要とされている。
本開示の概要
本発明の種々の態様の中には、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体およびこれを含む系の提供がある。
したがって略述すると、本開示は、アミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０の１つ、２つまたはそれ以上において改変を含む、操作されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質変異体に関し、ここで前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるリジン（Ｋ）がロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更され、および／または前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるアルギニン（Ｒ）がロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更される。例えば、１つの例示的な実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＫ８５５Ｌ／Ｑ変異、ならびにアミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の例示的な実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ／Ｑ変異、ならびにアミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。特定の実施形態では、変異は以下の群から選択される：Ｋ５６２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｋ５６２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｋ６５２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；およびＫ６５２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）。
本開示の別の態様は、本明細書で開示する操作されたＣＡｓ９タンパク質変異体および少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡを含む操作されたＣａｓ９系に関し、ここで各々の操作されたＲＮＡは操作されたＣａｓ９タンパク質変異体と複合体を形成するように設計される。
本開示の別の態様は、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体およびこれを含む系をコードする核酸に関する。当該核酸を含むベクターもまた提供される。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の操作されたＣａｓ９タンパク質変異体および系の生産および使用方法に関する。
その他の目的および特徴は、以下においてある部分明らかにされ、ある部分指摘されることとなる。
図１Ａは、Ｋ８５５残基の５種類の異なる置換の、ヒトＵ－２ ＯＳ細胞におけるＨＥＫＳｉｔｅ４標的部位でのオンターゲット活性を示す。Ｋ８５５ＥおよびＫ８５５Ａはオンターゲット活性が低下した（実施例１）。図は配列番号７３を開示する。
図１Ｂは、Ｋ８５５残基の５種類の異なる置換の、ヒトＵ－２ ＯＳ細胞におけるＨＥＫＳｉｔｅ４オフターゲット部位でのオフターゲット活性を示す（実施例１）図は配列番号７４を開示する。
図２は、Ｒ６６１、Ｎ６９２、またはＱ６９５残基の異なる置換の、ヒトＵ－２ ＯＳ細胞におけるＨＥＫＳｉｔｅ４標的部位でのオンターゲット活性を示す（実施例２）。図は配列番号７３を開示する。
図３Ａは、３重および４重変異体タンパク質の、ヒトＫ５６２細胞におけるＦＡＮＣＦ０２標的部位でのオンターゲット活性を示す（実施例３）。図は配列番号７５を開示する。
図３Ｂは、３重および４重変異体タンパク質の、ヒトＫ５６２細胞におけるＦＡＮＣＦ０２単一ミスマッチオフターゲット部位でのオフターゲット活性を示す（実施例３）。図は配列番号７６を開示する。
図３Ｃは、３重および４重変異体タンパク質の、ヒトＫ５６２細胞におけるＨＢＢ０３標的部位でのオンターゲット活性を示す（実施例３）。図は配列番号７７を開示する。
図３Ｄは、３重および４重変異体タンパク質の、ヒトＫ５６２細胞におけるヒトＫ５６２細胞におけるＨＢＢ０３単一ミスマッチオフターゲット部位でのオフターゲット活性を示す（実施例３）。図には配列番号７８は開示する。
図４は、Ｋ５６２細胞の異なる５つのゲノム部位における、変異体タンパク質の選択群のオンターゲット活性を示す（実施例４）。図には出現順にそれぞれ配列番号７９～８３を開示されている。
詳細な説明
ゲノム改変におけるＳｐＣａｓ９組み換えタンパク質の需要が大きく増加しているため、異なるゲノム部位にわたって向上した特異性および持続的な活性で機能し得る組み換えタンパク質形態のヌクレアーゼが必要とされている。組み換えタンパク質ベースのスクリーニングアプローチを用いて、異なるレベルの特異性および活性を持つ少なくとも２つの異なるＳｐＣａｓ９変異体の群が同定された。１つの群は、その他のＳｐＣａｓ９変異体に比べて非常に高いレベルの特異性を有するが、異なるゲノム部位間で大きく異なった活性を有する。もう一方の群は、バランスのとれた特異性と活性を有し、活性においては十分確立されたｅＳｐＣａｓ９ １．１を上回り、特異性においては近年開発されたＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３を上回る。この群のヌクレアーゼは真核細胞のゲノム改変に広く応用し得る大きな可能性を秘めている。
高忠実度のＳｐＣａｓ９変異体を開発する従来の試みは、特定のプラスミド発現をベースとした選択スキームに大きく依存するものであった。これらの変異体は組み換えタンパク質として用いた際にしばしば低い活性を示した。特定の理論に拘束されるものではないが、哺乳類細胞におけるプラスミドの過剰発現によって、特異性を向上する変異に起因するこれらの変異体の活性の減衰が偽装され得る事が推測される。プラスミドの過剰発現によるこの混乱を回避するために、ヌクレアーゼを改良するための組み換えタンパク質ベースのスクリーニングアプローチを採用した。加えて、鍵となる残基の変異には必ずアラニン置換を用いていた従来の試みとは対照的に、特異性を向上させながらオンターゲット活性を維持するために最適アミノ酸置換を使用した。これらの方法論の違いによって、本開示のタンパク質は、従来のＳｐＣａｓ９タンパク質を操作する試みによるものよりも際立って優れたものとなる。
変異とその組み合わせには、Ｃａｓ９のＤＮＡ基質結合の安定性の根底にあるさまざまなメカニズムにおそらく関与する重要な残基が含まれるが、以前の試みでは、変異の組み合わせは、おそらく１つのメカニズムに関与する重要な残基に限定されていた。例えば、ｅＳｐＣａｓ９は、非標的鎖の負に荷電したリン酸主鎖と相互作用する正に荷電した保存的アミノ酸残基を変異させる事で開発されたが、これはこれらの正に荷電した残基が鎖の解離の際に非標的鎖を安定化させ、続いてガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡヘテロ二本鎖の形成を安定化させるという仮説に基づくものである（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，８４－８８）。対照的に、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１は標的鎖のリン酸主鎖との水素結合または電荷相互作用を減らす事で開発された（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４９０－４９５）。一方で、ＨｙｐａＣａｓ９は、ＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用を感知し、このシグナルを伝達することでＨＮＨヌクレアーゼドメインの構造的切り替えを誘起すると推測されるＲＥＣ３ドメインの保存的残基群（Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５およびＨ６９８）をアラニンに変異させる事で得られた（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０，４０７－４１０）。
組み換えタンパク質ベースの独自のスクリーニングアプローチを採用し、本明細書に開示するように異なるメカニズムの組み合わせに合理的な設計を広げることによって、本開示では異なるレベルの特異性および活性を持つ少なくとも３つの異なるＳｐＣａｓ９変異体の群を同定した。
（Ｉ）操作されたＣａｓ９タンパク質
本開示の１つの態様は操作されたＣａｓタンパク質に関する。操作されたＣａｓタンパク質は、その野生型タンパク質と比較して少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのアミノ酸置換、挿入または欠失を含む；すなわち、操作されたＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、アミノ酸配列に改変または変異を含む。種々のＣａｓタンパク質の内、Ｃａｓ９タンパク質は例えば、様々な細菌中に存在するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の単一のエフェクタータンパク質である。
１つの実施形態では、本明細書で開示する操作されたＣａｓ９タンパク質はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．に由来する。別の実施形態では、例えば、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）に由来する。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＣａｓ９タンパク質はＳｐＣａｓ９のホモログである。
野生型Ｃａｓ９タンパク質は、２つのヌクレアーゼドメイン、すなわち、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、これらそれぞれは二本鎖配列の内の１つの鎖を切断する。Ｃａｓ９タンパク質はまた、ガイドＲＮＡと相互作用するＲＥＣドメイン（例えば、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２）またはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖と相互作用するＲＥＣドメイン（例えば、ＲＥＣ３）、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相互作用するドメイン（すなわち、ＰＡＭ相互作用ドメイン）を含む。
本明細書に記載するように、本開示のＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質が変更された活性、特異性、および／または安定性を有するように１つ以上の改変（すなわち、少なくとも１つのアミノ酸の置換、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、少なくとも１つのアミノ酸の挿入）を含むように操作される。これらの操作されたＣａｓ９タンパク質は天然には生じない。
一般に、周知および／または市販のＣａｓ９変異体は、タンパク質の特定の領域における点変異に焦点が当てられており、他の領域およびタンパク質の異なる領域における変異の組み合わせは考慮されていない。Ｃａｓ９タンパク質の異なる領域における変異の組み合わせが、周知のＣａｓ９変異体と比較して、向上した特異性、活性（例えば、オンターゲット活性またはオフターゲット活性）および／またはその他有益な性質をもたらし得ることが有利には見出された。
例えば、本明細書に開示するＣａｓ９タンパク質は、非標的ＤＮＡ鎖接触残基を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有し、および／または標的ＤＮＡ／ガイドＲＮＡヘテロ二本鎖接触残基を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有し、および／またはアルファへリックスローブ（ａｌｐｈａ－ｈｅｌｉｃａｌ ｌｏｂｅ）を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有する。本開示の目的のために、非標的ＤＮＡ鎖接触残基には、例えば、アミノ酸Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３、およびＲ１０６０を含み；標的ＤＮＡ／ガイドＲＮＡヘテロ二本鎖接触残基には例えば、アミノ酸Ｒ６６１およびＲ６９１を含み；およびアルファヘリックスローブ残基には、例えば、アミノ酸Ｋ５２６、Ｋ５６２、およびＫ６５２を含む（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）。よって、種々の実施形態において、本明細書で開示するＣａｓ９タンパク質は非標的ＤＮＡ鎖接触残基を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有し、および標的ＤＮＡ／ガイドＲＮＡヘテロ二本鎖接触残基を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有する。その他の実施形態では、本明細書に開示するＣａｓ９タンパク質は、非標的ＤＮＡ鎖接触残基を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有し、アルファヘリックスローブを含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有する。さらにその他の実施形態では、本明細書に開示するＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ／ガイドＲＮＡヘテロ二本鎖接触残基を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有し、およびアルファヘリックスローブを含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有する。さらにその他の実施形態では、本明細書に開示するＣａｓ９タンパク質は、非標的ＤＮＡ鎖接触残基を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有し、標的ＤＮＡ／ガイドＲＮＡヘテロ二本鎖接触残基を含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有し、およびアルファヘリックスローブを含むタンパク質の構造領域に少なくとも１つの変異を有する。
本明細書に開示するＣａｓ９タンパク質変異体は、改変されていない成熟（野生型）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（配列番号１）の対応する位置におけるアミノ酸番号を参照する事で同定される改変アミノ酸配列を有する。本明細書に開示するＣａｓ９タンパク質変異体は、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列番号１に対する同一性を有する。
Figure 2023514327000002
参照しやすいように、２０の必須アミノ酸の表記とその一文字コードを表Ａに示す。
Figure 2023514327000003
本明細書に記載するアミノ酸の改変は、改変が及ぼされるアミノ酸を参照する文字（一文字コード）で始まり、変更を指定する文字（一文字コード）で終わり、アミノ酸残基の位置は２つの文字の間である、命名法を利用する事が理解されるはずである。例えば、仮想的なタンパク質がアラニン残基を仮想のアミノ酸位置１００に有しているとすると、Ａ１００と指定される。さらなる例として、仮想的なアミノ酸位置１００におけるアラニンからバリンへの改変は、Ａ１００Ｖと指定される。２つ以上の選択肢から選択される改変は、「／」を付して指定され、例えば、仮想的なアミノ酸位置１００におけるアラニンからバリンまたはセリンへの改変は、Ａ１００Ｖ／Ｓと指定される。
１つの実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体は、アミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の１つ以上において変異を含む。別の実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体は、アミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の２つ以上において変異を含む。よって、例えば操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０、の内の１つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の２つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の３つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の４つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の５つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の６つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の７つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の８つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の９つ以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の内の１０以上において変異を含み得る。別の例では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３およびＲ１０６０の各々において変異を含み得る。これらの種々の実施形態のある場合では、例えば、前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるリジン（Ｋ）は、ロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されており、および／または前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるアルギニン（Ｒ）はロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されている。
１つの実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｋ５２６Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｋ５６２Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｋ６５２Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｒ６６１Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｒ６９１Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６６１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｒ７８０Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６６１、６９１、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｋ８１０Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６６１、６９１、７８０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｋ８４８Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６６１、６９１、７８０、８１０、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｋ８５５Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｋ１００３Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。別の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９変異体は、Ｒ１０６０Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、および１００３（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む。
よって、ある実施形態では、例えば、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体は、Ｋ５２６Ｌ／Ｑ、Ｋ５６２Ｌ／Ｑ、Ｋ６５２Ｌ／Ｑ、Ｋ８１０Ｌ／Ｑ、Ｋ８４８Ｌ／Ｑ、Ｋ８５５Ｌ／Ｑ、Ｒ６６１Ｌ／Ｑ、Ｒ６９１Ｌ／Ｑ、Ｒ７８０Ｌ／Ｑ、Ｋ１００３Ｌ／Ｑ、およびＲ１０６０Ｌ／Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）から選択される、２つの異なるアミノ酸位置における２つの変異を含む。その他の実施形態では、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体は、Ｋ５２６Ｌ／Ｑ、Ｋ５６２Ｌ／Ｑ、Ｋ６５２Ｌ／Ｑ、Ｋ８１０Ｌ／Ｑ、Ｋ８４８Ｌ／Ｑ、Ｋ８５５Ｌ／Ｑ、Ｒ６６１Ｌ／Ｑ、Ｒ６９１Ｌ／Ｑ、Ｒ７８０Ｌ／Ｑ、Ｋ１００３Ｌ／Ｑ、およびＲ１０６０Ｌ／Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）から選択される、３つの異なるアミノ酸位置における３つの変異を含む。Ｋ５２６Ｌ／Ｑ、Ｋ５６２Ｌ／Ｑ、Ｋ６５２Ｌ／Ｑ、Ｋ８１０Ｌ／Ｑ、Ｋ８４８Ｌ／Ｑ、Ｋ８５５Ｌ／Ｑ、Ｒ６６１Ｌ／Ｑ、Ｒ６９１Ｌ／Ｑ、Ｒ７８０Ｌ／Ｑ、Ｋ１００３Ｌ／Ｑ、およびＲ１０６０Ｌ／Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）から選択されるアミノ酸位置における４、５、６、７、８、９、１０および１１個の変異が存在するその他の実施形態が提供される事が理解されるはずである。
前述の段落において、特定の実施形態または実施例の範囲内の当技術分野で知られている変異体は、もしあれば、但し書きにより除外されるべきであることが理解されよう。
別の特定の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体は、以下の変異：Ｋ５２６Ｌ、Ｋ５２６Ｑ、Ｋ５６２Ｌ、Ｋ５６２Ｑ、Ｋ６５２Ｌ、Ｋ６５２Ｑ、Ｋ８１０Ｌ、Ｋ８１０Ｑ、Ｋ８４８Ｌ、Ｋ８４８Ｑ、Ｋ８５５Ｌ、Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６６１Ｑ、Ｒ６９１Ｌ、Ｒ６９１Ｑ、Ｒ７８０Ｌ、Ｒ７８０Ｑ、Ｋ１００３Ｌ、Ｋ１００３Ｑ、Ｒ１０６０Ｌ、およびＲ１０６０Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の内の少なくとも１つを含む。
別の特定の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体は、以下の変異：Ｋ５２６Ｌ、Ｋ５２６Ｑ、Ｋ５６２Ｌ、Ｋ５６２Ｑ、Ｋ６５２Ｌ、Ｋ６５２Ｑ、Ｋ８１０Ｌ、Ｋ８１０Ｑ、Ｋ８４８Ｌ、Ｋ８４８Ｑ、Ｋ８５５Ｌ、Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６６１Ｑ、Ｒ６９１Ｌ、Ｒ６９１Ｑ、Ｒ７８０Ｌ、Ｒ７８０Ｑ、Ｋ１００３Ｌ、Ｋ１００３Ｑ、Ｒ１０６０Ｌ、およびＲ１０６０Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の内の少なくとも２つを含む。
さらに別の特定の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体は、以下の変異：Ｋ５２６Ｌ、Ｋ５２６Ｑ、Ｋ５６２Ｌ、Ｋ５６２Ｑ、Ｋ６５２Ｌ、Ｋ６５２Ｑ、Ｋ８１０Ｌ、Ｋ８１０Ｑ、Ｋ８４８Ｌ、Ｋ８４８Ｑ、Ｋ８５５Ｌ、Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６６１Ｑ、Ｒ６９１Ｌ、Ｒ６９１Ｑ、Ｒ７８０Ｌ、Ｒ７８０Ｑ、Ｋ１００３Ｌ、Ｋ１００３Ｑ、Ｒ１０６０Ｌ、およびＲ１０６０Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の内の少なくとも３つを含む。
さらに別の特定の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体は、以下の変異：Ｋ５２６Ｌ、Ｋ５２６Ｑ、Ｋ５６２Ｌ、Ｋ５６２Ｑ、Ｋ６５２Ｌ、Ｋ６５２Ｑ、Ｋ８１０Ｌ、Ｋ８１０Ｑ、Ｋ８４８Ｌ、Ｋ８４８Ｑ、Ｋ８５５Ｌ、Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６６１Ｑ、Ｒ６９１Ｌ、Ｒ６９１Ｑ、Ｒ７８０Ｌ、Ｒ７８０Ｑ、Ｋ１００３Ｌ、Ｋ１００３Ｑ、Ｒ１０６０Ｌ、およびＲ１０６０Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の内の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１１個を含む。
１つの特定の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の変異体の群：Ｋ５６２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｋ５６２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｋ６５２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｋ６５２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｒ６６１Ｌ Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｑ；およびＲ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｒ１０６０Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の内の１つから選択される。別の特定の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の変異体の群：Ｋ５６２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｋ５６２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｋ６５２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；およびＫ６５２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑの内の１つから選択される。よって、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体は、Ｋ５６２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＫ５６２Ｑ Ｒ６６１Ｌ Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＫ６５２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＫ６５２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｒ１０６０Ｑであり得る。この変異体の群の一員は、比較的バランスの取れた特異性および活性を有し、活性においては十分確立されたｅＳｐＣａｓ９ １．１を上回り、特異性においては近年開発されたＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３を上回る。
別の特定の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の変異体の群：Ｋ５２６Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｒ６６１Ｌ－Ｒ６９１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｒ６６１Ｌ－Ｒ７８０Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｒ６６１Ｌ－Ｒ７８０Ｑ－Ｋ８５５Ｑ；Ｒ６６１Ｌ Ｋ８１０Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、およびＲ６６１Ｌ－Ｋ８４８Ｌ－Ｋ８５５Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の内の１つから選択される。よって、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＫ５２６Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ Ｒ６９１Ｌ Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ－Ｒ７８０Ｌ－Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体は、Ｒ６６１Ｌ－Ｒ７８０Ｑ－Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ Ｋ８１０Ｌ Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ－Ｋ８４８Ｌ－Ｋ８５５Ｑであり得る。この変異体の群の一員は、非常に高いレベルの特異性を有するが、標的部位間で活性が大きく異なる。
別の特定の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の変異体の群：Ｋ５２６Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８１０Ｑ－Ｋ８５５Ｑ；Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｌ；およびＲ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｒ１０６０Ｌ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の内の１つから選択される。よって、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＫ５２６Ｑ Ｒ６６１Ｌ Ｋ８５５Ｑであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ－Ｋ８１０Ｑ－Ｋ８５５Ｑであり得る。 あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｌであり得る。あるいは、例えば操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体はＲ６６１Ｌ Ｋ８５５Ｑ Ｒ１０６０Ｌであり得る。この変異体の群の一員は、特異性および活性のレベルの両者においてｅＳｐＣａｓ９ １．１と類似する；しかし、これらはその変異プロファイルにおいてｅＳｐＣａｓ９ １．１と異なる。
上記の種々の変異体に加えて、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つまたは両方を不活性化するように１つ以上の変異および／または欠失により操作されてもよい。１つのヌクレアーゼドメインの不活性化は、二本鎖配列の一本鎖を切断するＣａｓ９タンパク質（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼ）を産生する。ＲｕｖＣドメインは、変異、例えばＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａにより不活性化されてもよく、ＨＮＨドメインは、変異、例えばＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、および／またはＮ８６３Ａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）により不活性化されてもよい。両方のヌクレアーゼドメインの不活性化は、切断活性を有しないＣａｓ９タンパク質（すなわち、触媒的に不活性な、または不活性型（ｄｅａｄ）Ｃａｓ９）を産生する。
上記の種々の変異体に加えてさらに、Ｃａｓ９タンパク質はまた、向上した標的化特異性、向上した忠実性、変更されたＰＡＭ特異性、減少したオフターゲット効果、および／または増加した安定性を有するように１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入により操作されてよい。標的化特異性を向上させる、忠実性を向上させる、および／またはオフターゲット効果を減少させる１つ以上の変異の非限定的な例には、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ、および／またはＤ１１３５Ｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）を含む。
上記の種々の変異体に加えて、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも１つの異種ドメインを含むように操作されてよい、すなわち、Ｃａｓ９はまた、１つ以上の異種ドメインに融合される。２つ以上の異種ドメインがＣａｓ９と融合される状況において、２つ以上の異種ドメインは同じであってよく、またはそれらは異なっていてよい。１つ以上の異種ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、内部位置またはそれらの組合せに対して融合されてよい。融合は化学結合を介して直接的であってよく、または結合は１つ以上のリンカーを介して間接的であってよい。種々の実施形態では、異種ドメインは、核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、検出を容易にするマーカーもしくはレポータードメイン（蛍光または酵素レポータータンパク質）、クロマチン改変ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなど）、転写調節ドメイン、ＤＮＡもしくはＲＮＡデアミナーゼドメイン、ウラシル－ＤＮＡ－グリコシラーゼドメイン、逆転写酵素ドメイン、リコンビナーゼドメイン、ＲＮＡアプタマー結合ドメイン、または非Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインから選択される。
（ａ）核局在化シグナル
いくつかの実施形態では１つ以上の異種ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であってよい。核局在化シグナルの非限定的な例は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号３）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号４）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号７）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号８）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号９）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１０）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１１）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１２）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１３）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１４）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１５）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１６）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１８）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１９）を含む。
（ｂ）細胞膜透過ドメイン
その他の実施形態では、１つ以上の異種ドメインは、細胞膜透過ドメインであってよい。好適な細胞膜透過ドメインの例は、非限定的に、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２２）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２４）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２５）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号２６）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２７）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２８）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２９）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号３０）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３１）を含む。
（ｃ）マーカードメイン
代替の実施形態では、１つ以上の異種ドメインは、マーカードメインであってよい。マーカードメインは、蛍光タンパク質および精製またはエピトープタグを含む。好適な蛍光タンパク質は、非限定的に、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、またはそれらの組合せを含む。マーカードメインは、１つ以上の蛍光タンパク質のタンデムリピート（例えば、Ｓｕｎｔａｇ）を含んでよい。好適な精製またはエピトープタグの非限定的な例は、６ｘＨｉｓ（配列番号３２）、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｍｙｃ、ＳＡＭなどを含む。ＣＲＩＳＰＲ複合体の検出または濃縮を容易にする異種融合の非限定的な例は、ストレプトアビジン（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１９９５，６（３）：９３－１０１）、アビジン（Ａｉｒｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９９，１６（１－４）：８７－９２）、アビジンの単量体形態（ｉｎ（Ｌａｉｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，２７８（６）：４０１０－４０１４）、組み換え体の生産中におけるビオチン化を容易にするペプチドタグ（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０００，３２６：４３０－４４０）を含む。
（ｄ）クロマチン調節モチーフ
さらに他の実施形態では、１つ以上の異種ドメインは、クロマチン調節モチーフ（ＣＭＭ）であってよい。ＣＭＭの非限定的な例は、高移動度グループ（ＨＭＧ）タンパク質（例えば、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＨＭＧＢ３、ＨＭＧＮ１、ＨＭＧＮ２、ＨＭＧＮ３ａ、ＨＭＧＮ３ｂ、ＨＭＧＮ４、およびＨＭＧＮ５タンパク質）、ヒストンＨ１変異体の中央球状ドメイン（例えば、ヒストンＨ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４、Ｈ１．５、Ｈ１．６、Ｈ１．７、Ｈ１．８、Ｈ１．９、およびＨ．１．１０）、またはクロマチンリモデリング複合体のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦ（スイッチ／スクロース非発酵性（ＳＷＩｔｃｈ／Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｎｏｎ－Ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ））、ＩＳＷＩ（模倣スイッチ（Ｉｍｉｔａｔｉｏｎ ＳＷＩｔｃｈ））、ＣＨＤ（クロモドメイン－ヘリカーゼ－ＤＮＡ結合（Ｃｈｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ－Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ））、Ｍｉ－２／ＮｕＲＤ（ヌクレオソームリモデリングおよびデアセチラーゼ）、ＩＮＯ８０、ＳＷＲ１、およびＲＳＣ複合体に由来するヌクレオソーム相互作用ペプチドを含む。その他の実施形態では、ＣＭＭはまた、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、またはウイルスタンパク質に由来してよい。ＣＭＭの供給源は変化してよく、且つ変化するはずである。ＣＭＭは、ヒト、動物（すなわち、脊椎動物および無脊椎動物）、植物、藻類、または酵母由来であってよい。特定のＣＭＭの非限定的な例は、以下の表Ｂに列挙されている。当業者は、他の種におけるホモログおよび／またはそれとの関連融合モチーフを容易に同定することができる。
Figure 2023514327000004
（ｅ）エピジェネティック修飾ドメイン
さらにその他の実施形態では、１つ以上の異種ドメインは、エピジェネティック修飾ドメインであってよい。好適なエピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例は、ＤＮＡ脱アミノ化（例えば、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、シトシンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ＤＮＡアミノ化、ＤＮＡ酸化活性、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性（例えば、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００に由来するＨＡＴドメイン）、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性、ヒストンキナーゼ活性、ヒストンホスファターゼ活性、ヒストンユビキチンリガーゼ活性、ヒストン脱ユビキチン化活性、ヒストンアデニル化活性、ヒストン脱アデニル化活性、ヒストンＳＵＭＯ化活性、ヒストン脱ＳＵＭＯ化活性、ヒストンリボシル化活性、ヒストン脱リボシル化活性、ヒストンミリストイル化活性、ヒストン脱ミリストイル化活性、ヒストンシトルリン化活性、ヒストンアルキル化活性、ヒストン脱アルキル化活性、またはヒストン酸化活性を有するものを含む。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾ドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、アデノシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含んでよい。
（ｆ）転写調節ドメイン
その他の実施形態では、１つ以上の異種ドメインは、転写調節ドメイン（すなわち、転写活性化ドメインまたは転写リプレッサードメイン）であってよい。好適な転写活性化ドメインは、非限定的に、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（すなわち、ＶＰ１６の４つのタンデムコピー）、ＶＰ１６０（すなわち、ＶＰ１６の１０個のタンデムコピー）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン（ｐ６５）、エプスタイン－バールウイルスＲ転写活性化因子（Ｒｔａ）ドメイン、ＶＰＲ（すなわち、ＶＰ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）、ｐ３００－依存性転写活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ヒートショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、Ｓｍａｄ４活性化ドメイン（ＳＡＤ）、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメイン、またはそれらの組合せを含む。好適な転写リプレッサードメインの非限定的な例は、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、Ｍｘｉリプレッサードメイン、誘導ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ＩκＢリプレッサー、Ｓｉｎ３リプレッサー、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサー、またはそれらの組合せを含む。転写活性化または転写リプレッサードメインは、Ｃａｓ９タンパク質に遺伝的に融合されてよく、または非共有タンパク質－タンパク質、タンパク質－ＲＮＡ、またはタンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して結合されてよい。
（ｇ）ＲＮＡアプタマー結合ドメイン
さらなる実施形態では、１つ以上の異種ドメインは、ＲＮＡアプタマー結合ドメイン（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５１７（７５３６）：５８３－５８８；Ｚａｌａｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６０（１－２）：３３９－５０）であってよい。好適なＲＮＡアプタマータンパク質ドメインの例は、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、ＭｕバクテリオファージＣｏｍタンパク質、ラムダバクテリオファージＮ２２タンパク質、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）、脆弱性Ｘ精神遅滞症候群－関連タンパク質１（ＦＸＲ１）、バクテリオファージに由来するタンパク質、例えばＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ－β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、およびＶＫ、それらのフラグメント、またはそれらの誘導体を含む。
（ｈ）非Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメイン
さらにその他の実施形態では、１つ以上の異種ドメインは、非Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインであってよい。好適なヌクレアーゼドメインは、あらゆるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。ヌクレアーゼドメインが由来することができるエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、非限定的に、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、タイプＩＩ－Ｓ制限エンドヌクレアーゼに由来してよい。タイプＩＩ－Ｓエンドヌクレアーゼは、典型的に認識／結合部位から数塩基対離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。これらの酵素は、一般的に、一時的に会合して二量体を形成し、互いにずれた位置でＤＮＡの各鎖を切断する、単量体である。好適なタイプＩＩ－Ｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、およびＳａｐＩを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であってよい。タイプＩＩ－Ｓヌクレアーゼドメインは、２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量化を容易にするように改変されてよい。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは、特定のアミノ酸残基を変異することによって改変されてよい。非限定的な例として、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８でのアミノ酸残基が、改変のための標的である。特定の実施形態では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、および／またはＮ４９６Ｄ変異を含む第１のＦｏｋＩハーフドメイン、およびＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、および／またはＨ５３７Ｒ変異を含む第２のＦｏｋＩハーフドメインを含んでよい。
（ｉ）核酸塩基改変酵素
本明細書に記載する操作されたＣａｓ９変異体はまた、核酸塩基改変酵素またはその触媒ドメインを含み得る。
種々の核酸塩基改変酵素は、本明細書に開示する系において使用するのに好適である。核酸塩基改変酵素はＤＮＡ塩基エディターであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ塩基エディターは、ポリメラーゼ酵素にチミンとして読まれるウリジンへとシチジンを変換するシチジンデアミナーゼであり得る。シチジンデアミナーゼの非限定的な例は、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）、シチジンデアミナーゼ２（ＣＤＡ２）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ－編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーシチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４）、ＡＰＯＢＥＣ１相補因子（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）／ＡＰＯＢＥＣ１刺激因子（ＡＣＦ１／ＡＳＦ）シチジンデアミナーゼ、ＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＲ）、細菌性長アイソフォームシチジンデアミナーゼ（ＣＤＤＬ）およびｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）を含む。その他の実施形態では、ＤＮＡ塩基エディターは、アデノシンをポリメラーゼ酵素にグアノシンと読まれるイノシンへと変換する、アデノシンデアミナーゼであり得る。アデノシンデアミナーゼの非限定的な例は、ｔＲＮＡ アデニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、およびｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）を含む。
核酸塩基改変酵素（塩基エディター）は、野生型またはそのフラグメント、その改変バージョン（例えば、必須でないドメインを削除することができる）、またはその操作したバージョンであり得る。核酸塩基改変酵素（塩基エディター）は、真核生物由来、細菌由来または古細菌由来であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸塩基改変酵素（塩基エディター）はシチジンデアミナーゼまたはその触媒ドメインであり得る。シチジンデアミナーゼは、ヒト、マウス、ヤツメウナギ、アワビ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来であり得る。核酸塩基改変酵素がシチジンデアミナーゼである実施形態では、ＲＮＡにガイドされる核酸塩基改変系にはさらに少なくとも１つのウラシルグリコシラーゼ阻害（ＵＧＩ）ドメインを含み得る。シトシンの脱アミノ化の結果であるＤＮＡからのウラシルの除去は、ＵＧＩによって阻害される。好適なＵＧＩドメインは当分野で知られている。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼおよびＵＧＩを採用する系は、それらの成分が過剰発現された際には、負の効果を有し得る。過剰発現を防止するために、分解タグが付加されてもよい。分解タグは、タンパク質リサイクル系によって分解されるべきタンパク質の目印となる。これらの分解タグは、異なるタンパク質半減期をもたらす。非限定的な分解タグの例は、ＬＶＡ、ＡＡＶ、ＡＳＶおよびＬＡＡである。
（ｊ）逆転写酵素
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＳｐＣａｓ９変異体に融合するドメインは逆転写酵素である。逆転写酵素の例には、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）逆転写酵素とモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を含む。
（ｋ）リコンビナーゼ／インテグラーゼ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＳｐＣａｓ９変異体に融合するドメインはリコンビナーゼまたはインテグラーゼである。好適なリコンビナーゼの非限定的な例には、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼ（ＮＢＵ２遺伝子にコードされる）、ストレプトマイセスファージ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｇｅ）ｐｈｉＣ３１（φＣ３１）リコンビナーゼ、大腸菌ファージ（ｃｏｌｉｐｈａｇｅ）Ｐ４リコンビナーゼ、大腸菌ファージラムダインテグラーゼ、リステリアＡ１１８ファージ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ａ１１８ｐｈａｇｅ）リコンビナーゼ、レンチウイルスまたはＨＩＶインテグラーゼ、およびアクチノファージ（ａｃｔｉｎｏｐｈａｇｅ）Ｒ４ Ｓｒｅリコンビナーゼを含む。リコンビナーゼ／インテグラーゼは、２つの配列特異的認識（または付着）部位（例えば、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位または２つのＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位）間の組換えを仲介するか、ＨＩＶインテグラーゼのように無作為にＤＮＡを挿入し得る、
（ｌ）リンカー
１つ以上の異種ドメインはＣａｓ９タンパク質に１つ以上の化学結合（例えば、共有結合）を介して直接的に連結されてよく、または１つ以上の異種ドメインはＣａｓ９タンパク質に１つ以上のリンカーを介して間接的に連結されてよい。
リンカーは、少なくとも１つの共有結合を介して１つ以上の他の化学基に連結する化学基である。好適なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子（例えば、マレイミド誘導体、Ｎ－エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル－３、４’、５－トリカルボン酸、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル、など）、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）を含む。リンカーは、非限定的に、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニルなどを含む、１つ以上のスペーサー（ｓｐａｃｉｎｇ）基を含んでよい。リンカーは、中性であってよく、または正または負の電荷を有してもよい。さらに、リンカーは、リンカーを別の化学基に連結するリンカーの共有結合が、ｐＨ、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素を含む特定の条件下で破壊または切断することができるように切断可能であってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーであってよい。ペプチドリンカーは、フレキシブルな（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）アミノ酸リンカー（例えば、小さい非極性または極性アミノ酸を含む）であってよい。フレキシブルなリンカーの非限定的な例は、ＬＥＧＧＧＳ（配列番号３３）、ＴＧＳＧ（配列番号３４）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３５）、（ＧＧＧＧＳ）１－４（配列番号３６）、および（Ｇｌｙ）６－８（配列番号３７）を含む。あるいは、ペプチドリンカーは硬い（ｒｉｇｉｄ）アミノ酸リンカーであってよい。かかるリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）１－４（配列番号３８）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）２－５Ａ（配列番号３９）、ＰＡＰＡＰ（配列番号４０）、および（ＡＰ）６－８（配列番号４１を含む。好適なリンカーのさらなる例は当分野でよく知られており、リンカーを設計するプログラムは容易に利用できる（例えば、 Ｃｒａｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，２０００，１３（５）：３０９－３１２）。
（ｍ）操作されたＣａｓ９タンパク質の生産
いくつかの実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、無細胞系、細菌細胞、または真核細胞において組換え的に生産されてよく、従来的な精製方法を使用して精製されてよい。その他の実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸から関心のある真核細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで生産される（以下のセクション（ＩＩＩ）を参照し、およびこのセクション（Ｉ）に参照により援用する）。
操作されたＣａｓ９タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を含む実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメイン、ならびに少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインをさらに含んでよい。操作されたＣａｓ９タンパク質がエピジェネティック修飾ドメインに連結される実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメイン、ならびに少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインをさらに含んでよい。さらに、操作されたＣａｓ９タンパク質が転写調節ドメインに連結される実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメイン、ならびに少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインおよび／または少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合ドメインをさらに含んでよい。
（ＩＩ）操作されたＣａｓ９系
本開示の別の態様は、参照によりこのセクション（ＩＩ）において援用される上記のセクション（Ｉ）で記載されるような操作されたＣａｓ９タンパク質変異体（例えば、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体はアミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の１つ以上（例えば２つまたは３つ）における改変を含む）、ここで、前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるリジン（Ｋ）は、ロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されており、および／または前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるアルギニン（Ｒ）はロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されている、ならびに操作されたガイドＲＮＡ、ここで、各操作されたガイドＲＮＡは特異的な操作されたＣａｓ９タンパク質と複合体を形成するように設計されている、を含む操作されたＣａｓ９系を提供する。各操作されたガイドＲＮＡは、二本鎖配列の標的配列とハイブリダイズするように設計された５’ガイド配列を含み、ここで、標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’にある。
（ａ）操作されたガイドＲＮＡ
操作されたガイドＲＮＡは、特定の操作されたＣａｓ９タンパク質と複合体を形成するように設計される。ガイドＲＮＡは、（ｉ）標的配列とハイブリダイズするガイド配列を５’末端に含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質を動員するトランス作用ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。各ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡガイド配列は、異なっている（すなわち、配列特異的である）。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一般的に、特定の細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質と複合体を形成するように設計されたガイドＲＮＡにおいて同じである。
ｃｒＲＮＡガイド配列は、二本鎖配列において標的配列（すなわち、プロトスペーサー）とハイブリダイズするように設計される。一般的に、ｃｒＲＮＡおよび標的配列間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。特定の実施形態では、相補性は完全である（すなわち、１００％）。種々の実施形態では、ｃｒＲＮＡガイド配列の長さは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの範囲であってよい。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長であってよい。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、約１９、２０、または２１ヌクレオチド長である。１つの実施形態では、ｃｒＲＮＡガイド配列は、２０ヌクレオチドの長さを有する。
ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する少なくとも１つのステムループ構造を形成するリピート配列、および一本鎖のままである３’配列を含む。各ループおよびステムの長さは変化してよい。例えば、ループは約３から約１０ヌクレオチド長の範囲であってよく、ステムは約６から約２０塩基対の長さの範囲であってよい。ステムは、１から約１０ヌクレオチドの１つ以上の突出部を含んでよい。一本鎖３’領域の長さは変化してよい。操作されたガイドＲＮＡにおけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一般的に、関心のある細菌種における野生型ｔｒａｃｒＲＮＡをコード配列に基づく。野生型配列は、二次構造の形成を容易にする、二次構造の安定性を増加させる、真核細胞における発現を容易にするなどのために改変されてよい。例えば、１つ以上のヌクレオチド変化は、ガイドＲＮＡコード配列に導入されてよい（以下の実施例３参照）。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約５０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの長さの範囲であってよい。種々の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約５０から約９０ヌクレオチド、約９０から約１１０ヌクレオチド、約１１０から約１３０ヌクレオチド、約１３０から約１５０ヌクレオチド、約１５０から約１７０ヌクレオチド、約１７０から約２００ヌクレオチド、約２００から約２５０ヌクレオチド、または約２５０から約３００ヌクレオチドの長さの範囲であってよい。
一般的に、操作されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結されている単一の分子（すなわち、単一のキメラガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、しかしながら、操作されたガイドＲＮＡは、２つの別々の分子（例えば、２分子ガイドＲＮＡ）であってよい。例えば、ガイドＲＮＡは、第２の分子の５’末端と塩基対合することができる３’配列（約６から約２０ヌクレオチドを含む）を含むｃｒＲＮＡを含む第１の分子（または領域）、および第１の分子の３’末端（または領域）と塩基対合することができる５’配列（約６から約２０ヌクレオチドを含む）を含むｔｒａｃｒＲＮＡを含む第２の分子（または領域）を含み得る。
いくつかの実施形態では、操作されたガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つ以上のアプタマー配列を含むように改変されてよい（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５１７（７５３６）：５８３－５８８；Ｚａｌａｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６０（１－２）：３３９－５０）。好適なアプタマー配列は、ＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ、ＳＬＢＰ、ＦＸＲ１、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ－β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、ＶＫ、それらのフラグメント、またはそれらの誘導体から選択され、アダプタータンパク質に結合するアプタマー配列を含む。当業者は、アプタマー配列の長さが変化してよいことを理解する。
その他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含んでよい。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ、Ｈａｌｏ ｔａｇｓ、または好適な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子であってよい。
ガイドＲＮＡは、標準リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、標準または修飾デオキシリボヌクレオチドを含んでよい。ガイドＲＮＡが酵素的に合成される（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）実施形態では、ガイドＲＮＡは、一般的に、標準リボヌクレオチドを含む。ガイドＲＮＡが化学的に合成される実施形態では、ガイドＲＮＡは、標準または修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、塩基修飾（例えば、シュードウリジン、２－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシンなど）および／または糖修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－アミノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）など）を含む。ガイドＲＮＡの骨格はまた、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、またはペプチド核酸を含むように改変されてよい。
（ｂ）ＰＡＭ配列
上記に詳述する操作されたＣａｓ９系はＰＡＭ配列の上流に位置する二本鎖ＤＮＡの特異的配列を標的とする。ＰＡＭ配列は典型的な５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭまたは非典型的なＰＡＭ、例えば５’－ＮＡＧ－３’ＰＡＭを含み得る。いくつかの実施形態では、上記に詳述する操作されたＣａｓ９系は、５’-ＮＧＡＮ-３’、５’-ＮＧＮＧ-３’、および５’-ＮＧＣＧ-３’ＰＡＭなどの代替ＰＡＭを認識するように改変されてもよい。
（ＩＩＩ）核酸
本開示のさらなる態様は、参照によりこのセクション（ＩＩＩ）において援用される上記のせクション（Ｉ）および（ＩＩ）に記載する操作されたＣａｓ９タンパク質変異体および系をコードする核酸を提供する（例えば、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体はアミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の１つ以上（例えば２つまたは３つ）における改変を含み、ここで、前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるリジン（Ｋ）は、ロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されており、および／または前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるアルギニン（Ｒ）はロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されている）。当該タンパク質および系は、単一の核酸または複数の核酸によってコードされてよい。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、線状または環状、一本鎖または二本鎖であってよい。ＲＮＡまたはＤＮＡは、関心のある真核細胞においてタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化されてよい。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとしてまたは市販のソースから利用できる。
いくつかの実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸はＲＮＡであってよい。ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素的に合成されてよい。このために、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ合成のためのファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に連結されてよい。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列の変異型であってよい。操作されたタンパク質をコードするＤＮＡは、以下に詳述されるようにベクターの一部であってよい。このような実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡは、精製、キャップ付加、および／またはポリアデニル化されてよい。他の実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードするＲＮＡは、自己複製ＲＮＡの一部であってよい（Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１３，１３：２４６－２５４）。自己複製ＲＮＡは、限られた数の細胞分裂のために自己複製を可能にする一本鎖プラス鎖ＲＮＡであり、関心のあるタンパク質をコードするように修飾することができる、非感染性の自己複製のベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスＲＮＡレプリコンに由来してもよい（Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１３，１３：２４６－２５４）。
その他の実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸はＤＮＡであってよい。ＤＮＡコード配列は、関心のある細胞における発現のための少なくとも１つのプロモーター制御配列に作動可能に連結されてよい。ある実施形態では、ＤＮＡコード配列は、細菌（例えば、大腸菌）細胞または真核（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物）細胞における、操作されたＣａｓ９タンパク質の発現のためのプロモーター配列に作動可能に連結されてよい。好適な細菌プロモーターは、非限定的に、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターのハイブリッドである）、前記いずれかの変異型、および前記いずれかの組合せを含む。好適な真核プロモーターの非限定的な例は、構成的、調節、または細胞もしくは組織特異的なプロモーターを含む。好適な真核構成的プロモーター制御配列は、非限定的に、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、延長因子（ＥＤ１）－アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらのフラグメント、または前述のいずれかの組合せを含む。好適な真核調節プロモーター制御配列の例は、非限定的に、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって調節されるものを含む。組織特異的なプロモーターの非限定的な例は、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は野生型であってよく、またはそれはより効率的または有効な発現のために改変されてよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコード配列はまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ｐｏｌｙＡシグナルなど）および／または少なくとも１つの転写終結配列に連結されてよい。いくつかの状況において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、細菌または真核細胞から精製されてよい。
さらにその他の実施形態では、操作されたガイドＲＮＡはＤＮＡによってコードされてよい。場合によっては、操作されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ合成のためのファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に連結されてよい。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列の変異型であってよい。他の例では、操作されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、関心のある真核細胞における発現のためのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に作動可能に連結されてよい。好適なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例は、非限定的に、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ ＲＮＡプロモーターを含む。
種々の実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸は、ベクター中に存在してよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、操作されたガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含んでよい。好適なベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および自己複製ＲＮＡを含む（Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１３，１３：２４６－２５４）。いくつかの実施形態では、複合または融合タンパク質をコードする核酸は、プラスミドベクターにおいて存在してよい。好適なプラスミドベクターの非限定的な例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらの変異型を含む。他の実施形態では、複合または融合タンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）の一部であってよい。プラスミドまたはウイルスベクターは、さらなる発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含んでよい。ベクターおよびその使用についてのさらなる情報は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３ または “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１に見出だされ得る。
（ＩＶ）真核細胞
本開示の別の態様は、参照によりこのセクション（ＩＶ）において援用される上記のセクション（Ｉ）で詳述される少なくとも１つの操作されたＣａｓ９タンパク質変異体（例えば、アミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の１つ以上（例えば２つまたは３つ）における改変を含み、ここで、前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるリジン（Ｋ）は、ロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されており、および／または前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるアルギニン（Ｒ）はロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されている、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体）、および／または、上記のセクション（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）（これら各々は参照によりこのセクション（Ｖ）において援用される）に詳述される、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、および／または系、および／または操作されたガイドＲＮＡを含む真核細胞を含む。
真核細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物であってよい。好適な真核細胞の例は、以下のセクション（Ｖ）（ｃ）において詳述される。真核細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏであってよい。
（Ｖ）配列の改変方法。
本開示のさらなる態様は、真核細胞の染色体配列を改変するための方法を包含する。一般に、当該方法は、上記セクション（Ｉ）に詳述される操作されたＣａｓ９タンパク質変異体をさらに含む、上記セクション（ＩＩ）に詳述される少なくとも１つの操作されたＣａｓ９系を、関心のある真核細胞に導入する事を含み、ここでセクション（Ｉ）および（ＩＩ）の各々は参照によりこのセクション（Ｖ）において援用される（例えば、アミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）の１つ以上（例えば２つまたは３つ）における改変を含み、ここで、前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるリジン（Ｋ）は、ロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されており、および／または前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるアルギニン（Ｒ）はロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されている、操作されたＣａｓ９タンパク質変異体、および／または、上記のセクション（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）（これら各々は参照によりこのセクション（ＩＶ）において援用される）に詳述される、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、および／または系、および／または操作されたガイドＲＮＡ）。
操作されたＣａｓ９タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を含む実施形態では、染色体配列改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入を含んでよい。いくつかの反復において、方法は、操作されたＣａｓ９の１つの系または複数の系が染色体配列における標的部位に二本鎖切断を導入し、細胞性ＤＮＡ修復プロセスによる二本鎖切断の修復が少なくとも１つのヌクレオチド変化（すなわち、インデル）を導入し、それにより染色体配列を不活性化する（すなわち、遺伝子ノックアウト）ように、真核細胞にドナーポリヌクレオチドを含まず、ヌクレアーゼ活性を含む１つの操作されたＣａｓ９系またはニッカーゼ活性を含む２つの操作されたＣａｓ９系を導入することを含む。その他の反復において、方法は、操作されたＣａｓ９の１つの系または複数の系が染色体配列における標的部位に二本鎖切断を導入し、細胞性ＤＮＡ修復プロセスによる二本鎖切断の修復によってドナーポリヌクレオチド中の配列が染色体配列の標的部位へと挿入または交換（すなわち、遺伝子修正または遺伝子ノックイン）されるように、ヌクレアーゼ活性を含む１つの操作されたＣａｓ９系またはニッカーゼ活性を含む２つの操作されたＣａｓ９系をドナーポリヌクレオチドと共に真核細胞に導入することを含む。
操作されたＣａｓ９タンパク質がエピジェネティック的修飾活性または転写調節活性を含む実施形態では、染色体配列改変は、染色体配列における、標的部位内または付近での少なくとも１つのヌクレオチドの変換、標的部位内または付近での少なくとも１つのヌクレオチドの修飾、標的部位内または付近での少なくとも１つのヒストンタンパク質の修飾、および／または標的部位内または付近での転写の変化を含み得る。
さらに、本明細書に記載の操作されたＣａｓ９変異体が真核細胞以外、例えば微生物ゲノムを改変するためにも使用され得ることは理解されるはずである。
（ａ）細胞への導入
上記のとおり、方法は少なくとも１つの操作されたＣａｓ９系および／またはこの系をコードする核酸（および所望のドナーポリヌクレオチド）を真核細胞に導入することを含む。少なくとも１つの系および／または核酸／ドナーポリヌクレオチドは、種々の手段により関心のある細胞に導入されてよい。
いくつかの実施形態では、細胞は、好適な分子（すなわち、タンパク質、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ）でトランスフェクトされてよい。好適なトランスフェクション方法は、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（またはエレクトロポレーション）、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性ポリマートランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、ビロゾームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン性リポソームトランスフェクション、免疫リポソームトランスフェクション、非リポソーム脂質トランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送達、インペールフェクション、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、および核酸のプロプライエタリー（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）剤で増強された摂取を含む。トランスフェクション方法は、当分野でよく知られている（例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３または“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１参照）。他の実施形態では、分子は、マイクロインジェクションにより細胞に導入されてよい。例えば、分子は、関心のある細胞の細胞質または核に注入されてよい。細胞に導入される各分子の量は変動してよいが、当業者は好適な量を決定するための手段をよく知っている。
種々の分子は、同時にまたは連続して細胞に導入されてよい。例えば、操作されたＣａｓ９系（またはそのコードする核酸）およびドナーポリヌクレオチドは同時に導入されてよい。あるいは、一方が最初に細胞に導入されてよく、そしてもう一方がその後に導入されてよい。
一般的に、細胞は細胞増殖および／または維持のために適当な条件下で維持される。好適な細胞培養条件は、当分野でよく知られており、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００８，１０５：５８０９－５８１４；Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００７，１０４：３０５５－３０６０；Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５：６４６－６５１；およびＬｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，２５：１２９８－１３０６に記載されている。当業者は、細胞を培養するための方法が当分野で知られており、細胞種に依存して変化してよく、且つ変化するはずであることを理解する。すべての場合において、日常的な最適化が使用されて、特定の細胞種のための最適な技術を決定することができる。
（ｂ）任意のドナーポリヌクレオチド
操作されたＣａｓ９タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を含む実施形態では、方法は、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含んでよい。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、線状または環状、および／またはＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ベクター、例えばプラスミドベクターであってよい。
ドナーポリヌクレオチドは少なくとも１つのドナー配列を含む。いくつかの態様では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は内因性または天然の染色体配列の改変バージョンであってよい。例えば、ドナー配列は操作されたＣａｓ９系によって標的化される配列の、またはその付近の染色体配列の一部と実質的に同一であってよいが、少なくとも１つのヌクレオチドの変更を含む。したがって天然配列との組み込みまたは交換時に、標的化される染色体位置における配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの変更を含む。例えば、当該変更は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組合せであってよい。改変される配列の「遺伝子修正」組み込みの結果として、細胞は、標的化された染色体配列から改変された遺伝子産物を生産することができる。
他の態様では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は外因性配列であってよい。本明細書において使用される「外因性」配列は、細胞について天然でない配列、またはその天然の位置が細胞のゲノムにおける異なる位置である配列を指す。例えば、外因性配列は、外因性プロモーター制御配列に作動可能に連結され得るタンパク質コード配列を含んでよく、これによりゲノムに組み込まれた際に、組み込まれる配列によってコードされるタンパク質を細胞が発現することができる。あるいは、外因性配列は、その発現が内因性プロモーター制御配列によって調節されるように染色体配列に組み込まれてよい。他の反復において、外因性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡコード配列などであってよい。上記のとおり、外因性配列の染色体配列への組み込みは、「ノックイン」と称される。
当業者によって理解され得るように、ドナー配列の長さは、変化してよく、且つ変化するはずである。例えば、ドナー配列の長さは、数ヌクレオチドから数百ヌクレオチド、数十万ヌクレオチドまで様々である。
典型的に、ドナーポリヌクレオチドにおけるドナー配列は、操作されたＣａｓ９系によって標的化される配列の上流および下流それぞれに位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に挟まれている。これらの配列類似性のため、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流配列は、ドナー配列が染色体配列に組み込まれ得る（または交換される）ように、ドナーポリヌクレオチドおよび標的化される染色体配列間の相同組換えを可能にする。
本明細書において使用する場合、上流配列とは、操作されたＣａｓ９系によって標的化される配列の上流にある染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に下流配列とは、操作されたＣａｓ９系によって標的化される配列の下流にある染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。本明細書において使用する場合、「実質的な配列同一性」なるフレーズは、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。したがって、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的配列に対する上流または下流配列と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有してよい。例示的な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流の配列は、操作されたＣａｓ９系によって標的化される配列の上流または下流にある染色体配列と約９５％または１００％配列同一性を有してよい。
いくつかの実施形態では、上流配列は、操作されたＣａｓ９系によって標的化される配列のすぐ上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、上流配列は、標的配列から上流約百（１００）ヌクレオチド内に位置される染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、上流配列は、標的配列から上流約１から約２０、約２１から約４０、約４１から約６０、約６１から約８０、または約８１から約１００ヌクレオチドに位置される染色体配列と実質的な配列同一性を共有してよい。いくつかの実施形態では、下流配列は、操作されたＣａｓ９系によって標的化される配列のすぐ下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、下流配列は、標的配列から下流約百（１００）ヌクレオチド内に位置される染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、下流配列は、標的配列から下流約１から約２０、約２１から約４０、約４１から約６０、約６１から約８０、または約８１から約１００ヌクレオチドに位置される染色体配列と実質的な配列同一性を共有してよい。
各上流または下流配列は、長さにおいて約２０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの範囲であってよい。いくつかの実施形態では、上流および下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含んでよい。特定の実施形態では、上流および下流配列は、長さにおいて約５０から約１５００ヌクレオチドの範囲であってよい。
（ｃ）細胞種
種々の細胞は、本明細書に記載されている方法における使用のために好適であり、原核細胞（例えば、細菌）および真核細胞（例えば、動物、昆虫および植物細胞）を含む。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞真核生物であってよい。いくつかの実施形態では、細胞は、１つの細胞胚であってよい。例えば、非ヒト哺乳動物胚は、ラット、ハムスター、齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類胚を含む。さらに他の実施形態では、細胞は、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞などであってよい。１つの実施形態では、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、その全体がここに援用されるＷＯ２００３／０４６１４１またはＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００８，２：１１３－１１７）に記載されている技術によって作られるものを含んでよい。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（すなわち、培養物において）、ｅｘ ｖｉｖｏで（すなわち、生物体から単離された組織内で）、またはｉｎ ｖｉｖｏで（すなわち、生物体内で）あってよい。例示的な実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞系である。特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞株である。
例として、いくつかの実施形態では、真核細胞もしくは真核細胞集団は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、中央メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、造血幹細胞、長期造血系幹細胞、短期造血幹細胞、多分化能前駆細胞、系列拘束された前駆細胞、リンパ系前駆細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、骨髄系前駆細胞、一般的な骨髄系前駆細胞、赤血球系前駆細胞、巨核球系赤血球系前駆細胞、単球系前駆細胞、内分泌前駆細胞、外分泌細胞、線維芽細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、マクロファージ、膵島ベータ細胞、心筋細胞、血球、管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、網膜細胞、視細胞、杆体細胞、錐体細胞、網膜色素上皮細胞、トラベキュラーメッシュワーク細胞、蝸牛の有毛細胞、外有毛細胞、内有毛細胞、肺上皮細胞、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、肺上皮前駆細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、筋衛星細胞、筋細胞、神経細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、単細胞、巨核球、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、網目状細胞、Ｂ細胞、例えば、前駆Ｂ細胞、プレＢ細胞、プロＢ細胞、メモリーＢ細胞、プラズマＢ細胞、胃腸上皮細胞、胆道上皮細胞、膵管上皮細胞、腸管幹細胞、肝細胞癌、肝星細胞、クッパー細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞（例えば、褐色脂肪細胞、または白色脂肪細胞）、脂肪前駆細胞、膵臓前駆細胞、膵島細胞、膵臓ベータ細胞、膵臓アルファ細胞、膵臓デルタ細胞、膵臓外分泌細胞、シュワン細胞、もしくはオリゴデンドロサイト、またはかかる細胞集団である。好適な哺乳類細胞または細胞株の非限定的な例には、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒトＴ細胞（自己または同種）、ヒトＢ細胞、ヒトマクロファージ、ヒト造血幹細胞、（ｈＨＳＣ）、ヒト肝細胞、ヒト網膜細胞、膵臓膵島、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；ヒトＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ－４３１細胞、およびヒトＫ５６２細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胚性線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウスメラノーマＢ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚性間葉系Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞；マウス癌腫ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳房ＥＭＴ６細胞；マウス肝細胞癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮細胞ＭＴＤ－１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ－５Ｆ細胞；マウスメラノーマＸ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ－１細胞；ラットグリオブラストーマ９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞；ラット肝細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ－４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ－７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ－７６）細胞を含む。哺乳動物細胞株の広範なリストは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションカタログ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）において見つけることができる。
本開示のその他の態様は、上述のように核酸またはベクターをコードするよう操作された動物、または本開示の操作されたＳｐｃａｓ９変異体によって永続的に改変された動物を含む。例えば、動物はモデル動物（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、マウス、蚊、ラット）、または動物は家畜または養殖魚、またはペットであり得る。別の例として、動物は少なくとも１つの疾患のためのベクターとすることができる。別の例として、生物はヒト疾患に対するベクター（すなわち、蚊、ダニ、鳥）とすることができる。
本開示のさらにその他の態様は、上述のように核酸もしくはベクターを使用して操作された植物、または本開示の操作されたＳｐＣａｓ９によって一時的にもしくは永続的に改変された植物を含む。例えば、植物は作物（すなわち、米、大豆、小麦、タバコ、綿、アルファルファ、カノーラ、トウモロコシ、テンサイなど）であり得る。
（ＶＩ）応用
本明細書に開示される組成物および方法は、種々の治療、診断、産業、および研究用途において使用することができる。いくつかの実施形態において、本開示は、遺伝子の機能をモデル化および／または研究する事、関心のある遺伝的またはエピジェネティックな状態を研究する事、または種々の疾患または障害に関与する生化学的経路を研究する事を目的として、細胞、動物、または植物における関心のある染色体配列を改変するために使用することができる。例えば、疾患または障害と関連する１つ以上の核酸配列の発現が変更されている疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物を作成することができる。疾患モデルは、生物体における変異の効果を研究する、疾患の発症および／または進行を研究する、薬学的に活性のある化合物の疾患における効果を研究する、および／または可能性のある遺伝子治療戦略の有効性を評価するために使用することができる。
他の実施形態では、組成物および方法は、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子の機能、および遺伝子発現における何れの変更が生物学的プロセスにどのように影響し得るか、を研究するために使用し得る効率的且つ費用対効果の高い機能性ゲノムスクリーニングを実施するために、または細胞表現型と合わせてゲノム遺伝子座の突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）またはディープスキャニング（ｄｅｅｐ ｓｃａｎｎｉｎｇ）を実施するために使用することができる。突然変異誘発の飽和またはディープスキャニングは、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性、および疾患の反転のために必要な機能要素の重要な最小限の特徴および個々の脆弱性を決定するために使用することができる。
さらなる実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、疾患または障害の存在を確立するための診断試験のために、および／または処置選択肢の決定における使用のために用いることができる。好適な診断試験の例は、癌細胞における特定の変異の検出（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２などにおける特定の変異）、特定の疾患と関連する特定の変異の検出（例えば、トリヌクレオチドリピート、鎌状赤血球症と関連するβ－グロビンにおける変異、特定のＳＮＰなど）、肝炎の検出、ウイルスの検出（例えば、Ｚｉｋａ）などを含む。
さらなる実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、特定の疾患または障害と関連する遺伝子変異を修正するために使用することができ、例えば、鎌状赤血球症またはサラセミアと関連するグロビン遺伝子変異を修正する、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）と関連するアデノシンデアミナーゼ遺伝子における変異を修正する、ハンチントン病の原因遺伝子であるＨＴＴの発現を低下させる、または網膜色素変性の処置のためにロドプシン遺伝子における変異を修正するために使用することができる。かかる改変は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞において行われてよい。
さらに他の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、改善された特性または環境ストレスに対する耐性の増加を有する作物植物を生成するために使用することができる。本開示はまた、改善された特性を有する家畜または生産動物を生成するために使用することができる。例えば、ブタは、とりわけ再生医療または異種移植において、生物医学モデルとして魅力的な多くの特徴を有する。
例として、本開示は上述のように、遺伝子療法のための医薬として使用するための、ヌクレオチドまたは核酸またはベクターの配列を提供する。本開示はまた、上述のようなヌクレオチドまたは核酸またはベクターの配列および少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本開示はまた、上述の変異を含む組み換えＣａｓ９ポリペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる賦形剤には、典型的に、ビヒクル、希釈剤、または剤形を構成する成分、もしくは治療剤などの薬剤を含む医薬組成物を構成する成分として用いられる不活性成分を含む。薬学的に許容できる賦形剤には、典型的には、結着機能（すなわち、結着剤）、崩壊機能（すなわち、崩壊剤）、潤滑機能（潤滑剤）、および／またはその他の機能（すなわち、溶媒、界面活性剤など）を組成物に付与する不活性成分を含む。さらに、本開示は、ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現またはその他のバイオテクノロジー用途のための、上述のようなヌクレオチドまたは核酸またはベクターの配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ での使用を提供する。さらに本開示は、ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現またはその他のバイオテクノロジー用途のための、ガイドＲＮＡ（例えば、単一分子（すなわち、キメラ）ガイドＲＮＡまたは２分子（すなわち、２部分）ガイドＲＮＡと共に、上述の変異を含む組み換えＣａｓ９ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用を提供する。
本開示のその他の態様は、本明細書に記載の種々の成分、例えば本明細書に記載のＣａｓ９タンパク質変異体、ガイドＲＮＡ、ベクター、プライマー等を含み、ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現またはその他のバイオテクノロジー用途におけるそれらの使用のための指示を含むキットに関する。
定義
以下の定義および方法は、本発明をよりよく定義し、本発明の実施へと当業者を導くために提供される。別段の記載が無い限り、用語は、関連する分野における当業者による従来的な使用法に従って理解されるものである。
他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の文献は、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ Ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書において使用される以下の用語は、別段の指定がない限り、それらに帰する意味を有する。
本開示またはその好ましい実施形態の要素を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、１つ以上の要素が存在することを意味することを意図する。「含む」、「含有する」および「有する」なる用語は、包括的であることを意図し、リストされた要素以外の追加の要素があってもよいことを意味することを意図する。
「約」なる用語は、数値ｘに関して使用された場合には例えばｘ±５％を意味する。
本明細書において使用される「相補的」または「相補性」なる用語は、特定の水素結合を介する塩基対合による二本鎖核酸の会合を指す。塩基対合は、標準のワトソンクリック塩基対合であり得る（例えば、５’－ＡＧＴＣ－３’は、相補的配列３’－ＴＣＡＧ－５’と対合する）。塩基対合はまた、フーグスティーン型（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）または逆フーグスティーン型水素結合であってよい。相補性は、典型的に二本鎖領域に対して測定され、したがって例えばオーバーハングを除く。二本鎖領域の２つの鎖間の相補性は、部分的であってよく、一部の塩基（例えば、７０％）のみが相補的であるとき、パーセンテージ（例えば、７０％）として表現されてよい。相補的でない塩基は「不一致」である。相補性はまた、二本鎖領域における全ての塩基が相補的であるとき、完全（すなわち、１００％）であってよい。
本明細書において使用される「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」または「Ｃａｓ９系」なる用語は、Ｃａｓ９タンパク質（すなわち、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、または触媒的に不活性型のタンパク質）およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。
本明細書において使用される「内因性配列」なる用語は、細胞において天然の染色体配列を指す。
本明細書において使用される「外因性」なる用語は、細胞において天然でない配列、または細胞のゲノムにおける天然の位置が異なる染色体位置にある染色体配列を指す。
本明細書において使用される「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、および遺伝子産物の生産を調節する全てのＤＮＡ領域を指し、係る調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かにかかわらない。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、境界要素（ｂｏｕｎｄａｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）、複製起点、マトリックス付着部位（ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｓｉｔｅ）、および遺伝子座制御領域を含む。
「異種」なる用語は、関心のある細胞に対して内因性または天然でない実体（ｅｎｔｉｔｙ）を指す。例えば、異種タンパク質は、外因性に導入された核酸配列のような外因性供給源に由来するかまたは当初由来されたタンパク質を指す。場合によっては、異種タンパク質は、通常、関心のある細胞によって産生されない
「ニッカーゼ」なる用語は、二本鎖核酸配列の一本鎖を切断する（すなわち、二本鎖配列にニックを入れる）酵素を指す。例えば、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼを、変異および／または欠失によって、ニッカーゼとして機能し、二本鎖配列の一本鎖のみを切断するように改変し得る。
本明細書において使用される「ヌクレアーゼ」なる用語は、二本鎖核酸配列の両方の鎖を切断する酵素を指す。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる用語は、線状または環状構造における、および一本鎖または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さを限定するものとして解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知のアナログ、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含してよい。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対を形成する。
「ヌクレオチド」なる用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準ヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチドアナログであってよい。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然ヌクレオチド（例えば、イノシン、シュードウリジンなど）または非天然ヌクレオチドであってよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分における修飾の非限定的な例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素原子および窒素原子の他の原子での置換（例えば、７－デアザプリン）を含む。ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノを含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。
「標的配列」、「標的染色体配列」および「標的部位」なる用語は、操作されたＣａｓ９系が標的とする染色体ＤＮＡにおける特定の配列、および操作されたＣａｓ９系がＤＮＡを改変する部位、または当該ＤＮＡと関連するタンパク質を改変する部位を指すように互換的に使用される。
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は当分野で知られている。典型的には、かかる技術は、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列と第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列とを比較することを含む。ゲノム配列もまた、この様式において決定および比較されてもよい。一般的に、同一性は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれの正確なヌクレオチド－対－ヌクレオチドまたはアミノ酸－対－アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、これらの同一性パーセントを決定することによって比較されてもよい。核酸またはアミノ酸配列のいずれであれ、２つの配列の同一性パーセントは、２つの整列された配列間の正確な一致の数を、より短い方の配列の長さで割り、１００を掛けたものである。核酸配列のおおよそのアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３（１９８６）によって正規化されるスコアリングマトリックスを使用することによってアミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）により提供される。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを計算するための他の好適なプログラムは、一般的に当分野で知られており、例えば、別のアライメントプログラムはデフォルトパラメーターで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメーターを使用して使用することができる：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧＥＮＢＡＮＫ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧＥＮＢＡＮＫ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧＥＮＢＡＮＫ ＮＩＨ 遺伝子配列データベースウェブサイトにて見る事ができる。
本発明について詳述してきたが、添付する特許請求の範囲において定義される発明の範囲を逸脱することなしに改変および変更が可能である事は明らかであろう。さらに、本開示における全ての実施例は、非限定的な例として提供されることを理解されたい。
以下の非限定的な例は本発明をさらに説明するために提供される。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能する事を本発明者らが見出したアプローチを表しており、およびよって本発明の実施のための様式の例を構成するものと考えられ得ることは、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
実施例１：Ｋ８５５の異なるアミノ酸置換は異なるオンターゲット活性を持つ
野生型ＳｐＣａｓ９のＫ８５５残基をアラニン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、またはグルタミンに変異させ、および組み換えタンパク質をＥ．ｃｏｌｉから９５％以上の均質性をもって精製した。Ｋ８５５Ｑ変異体タンパク質のアミノ酸配列を表１に示した。全てのＫ８５５変異体タンパク質は、Ｋ８５５単一変異を除いて同一のポリペプチドは配列を共有する。コントロールとして用いるために野生型のＳｐＣａｓ９タンパク質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社から購入した。ガイド配列５’－ＧＧＣＡＣＵＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＧＵＧＧ－３’（配列番号４２）を持つ、化学的に合成されたＨＥＫＳｉｔｅ４一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまたＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社から購入した。各タンパク質を３連の生物学的複製について試験した。
１．５ｍＬの微量遠心管に、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５）、１５０ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、および８μｇのＣａｓ９タンパク質を１０μＬの総反応液量で加える事でリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を調製した。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質のモル比はおおよそ３：１であった。複合体を室温で１５分間インキュベートし、トランスフェクションまで氷上に置いた。８０％コンフルエントのヒトＵ－２ ＯＳ細胞をトリプシン溶液で剥離させ、ハンクス平衡塩類溶液で２回洗浄した。１００μＬあたり約０．２５×１０６細胞で細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。ヌクレオフェクションは、１００μＬの細胞をＲＮＰ複合体に移し入れ、気泡が入らないようにすぐに穏やかに上下にピペッティングする事で混合してから、その後Ａｍａｘａ ｐｒｏｇｒａｍ Ｘ－００１を用いたエレクトロポレーションのためのキュベットに移して実施した。すぐに細胞を１ウェル当たり２ｍＬの温めておいた培地を加えた６ウェルプレートに移し、および３７℃、５％ＣＯ２で３日間増殖してから、ゲノム改変アッセイのために回収した。
トランスフェクションした細胞のゲノムＤＮＡ抽出物をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて調製した。標的ゲノム領域を、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プライマーで以下のサイクル条件でＰＣＲ増幅した：９５°Ｃ／３ｍ；９８°Ｃ／２０ｓ、６８°Ｃ／３０ｓ、および７２°Ｃ／４５ｓを３４サイクル；７２°Ｃ／５ｍ。ＨＥＫＳｉｔｅ４標的部位のＮＧＳプライマーは以下である：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡ－３’（フォワード）（配列番号４３）および５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＡＣＧＴ－３’（リバース）（配列番号４４）。ＨＥＫＳｉｔｅ４オフターゲット部位のＮＧＳプライマーは以下である：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＣＴＡＧＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＣＣ－３’（フォワード）（配列番号４５）および５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＴＣＣＣＴＧＡＴＧ－３’（リバース）（配列番号４６）。そして一次ＰＣＲ産物を、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒｓを用いて以下のサイクル条件で再増幅した：９５°Ｃ／３ｍ；９５°Ｃ／３０ｓ、５５°Ｃ／３０ｓ、および７２°Ｃ／３０ｓで８サイクル；７２°Ｃ／５ｍ。インデックス付加されたＰＣＲ産物をＳｅｌｅｃｔ－ａ－Ｓｉｚｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で定量した。そしてＰＣＲ産物を正規化およびプールし、ＮＧＳライブラリーを作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 装置および２ｘ３００ｂｐ ｋｉｔを使用してＮＧＳを行った。ＮＧＳ解析パイプラインを使用して、各サンプルのＦＡＳＴＱファイルをゲノム編集頻度について解析した。
結果を図１Ａおよび１Ｂに示す。この結果は、異なるＫ８５５変異体タンパク質は、異なるレベルのオンターゲット活性を有し、および５つのＫ８５５変異体タンパク質の全てが同等のレベルまでオフターゲット効果を実質的に低減する事を示す。この結果はまた、グルタミン酸およびアラニンはオンターゲット活性を維持するためのＫ８５５の最適な置換基ではない事を示す。
Figure 2023514327000005
実施例２：最適なアミノ酸置換の二重変異体はオンターゲット活性を維持する
Ｋ８５５ＭおよびＫ８５５Ｑ変異体バックグラウンドに対してＲ６１１、Ｎ６９２またはＱ６９５における異なるアミノ酸置換を導入し、二重変異体を作成した。組み換えタンパク質をＥ．ｃｏｌｉから、９５％以上の均質性で精製した。全ての二重変異体は、表１に示したＫ８５５Ｑ変異体のポリペプチド配列と、指定された変異を除いて、同一のポリペプチド配列を共有する。各タンパク質を、Ｕ２－ＯＳ細胞の同一のＨＥＫＳｉｔｅ４標的部位について３連の生物学的複製において試験した。ＲＮＰ複合体の調製、細胞トランスフェクション、およびＮＧＳ解析については実施例１に記載するとおりである。
結果を図２に示す。結果は、Ｒ６６１、Ｎ６９２、またはＱ６９５における異なるアミノ酸置換によって異なるレベルのオンターゲット活性がもたらされる事を示す。Ｒ６６１残基について、イソロイシンへの置換は活性の実質的な減少をもたらしたが、ロイシン、アスパラギンまたはグルタミンへの置換はＷＴ Ｃａｓ９の活性と同レベルの活性を維持した。２つの非電荷残基における置換効果は予想しにくいものであった。
実施例３：特異性と活性のバランスが取れた特徴を持つ三重変異体
Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑバックグランドに、Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ１００３、またはＲ１０６０においてロイシンまたはグルタミンへの置換を導入し、１８個の三重変異体および１つの四重変異体（Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｑ－Ｒ１０６０Ｑ）を生成した。全ての三重変異体および四重変異体は、表１に示したＫ８５５Ｑのポリペプチド配列と、指定された変異を除いて同一のポリペプチド配列を共有する。組み換えタンパク質をＥ．ｃｏｌｉから、９５％以上の均質性で精製した。ヒトＦＡＮＣＦ０２およびＨＢＢ０３を標的とする合成ｓｇＲＮＡをＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社から購入した。これらのｓｇＲＮＡのガイド配列を表２に示す。 ｅＳｐＣａｓ９ １．１タンパク質はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社から購入しおよびＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３タンパク質はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。各タンパク質を３連の生物学的複製において試験した。
実施例１に記載するようにＲＮＰ複合体を調製した。トランスフェクションの前日にヒトＫ５６２細胞を１ｍＬあたり０．２５×１０６細胞で播種し、トランスフェクション時にはおおよそ１ｍＬあたり０．５×１０６細胞であった。細胞を、ハンクス平衡塩類溶液で２回洗浄し、そして１００μＬあたり約０．３５×１０６細胞で細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。ヌクレオフェクションは、１００μＬの細胞をＲＮＰ複合体に移し入れ、気泡が入らないようにすぐに穏やかに上下にピペッティングする事で混合してから、その後Ａｍａｘａ ｐｒｏｇｒａｍ Ｔ－０１６を用いたエレクトロポレーションのためのキュベットに移して実施した。すぐに細胞を１ウェル当たり２ｍＬの温めておいた培地を加えた６ウェルプレートに移し、および３７℃、５％ＣＯ２で３日間増殖してから、ゲノム改変アッセイのために回収した。トランスフェクションした細胞のゲノムＤＮＡ抽出物をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて調製した。標的ゲノム領域を、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用し、ＮＧＳプライマーで以下のサイクル条件でＰＣＲ増幅した：９８°Ｃ／２ｍ；９８°Ｃ／１５ｓ、６２°Ｃ／３０ｓ、および７２°Ｃ／４５ｓで３４サイクル；７２°Ｃ／５ｍ。ＮＧＳプライマー配列を表２に示す。ＮＧＳライブラリー調製、シーケンシングおよびデータ解析は実施例１に記載するとおりである。
結果を図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄに示す。図３Ａおよび図３Ｂの結果は、全てのタンパク質がＦＡＮＣＦ０２標的部位において高い活性を有し、およびそれらの間でのばらつきは僅かであったことを示す。しかし、ＦＡＮＣＦ０２シングルミスマッチオフターゲット部位でのオフターゲットな変異頻度ではタンパク質間で幅広いばらつきが存在した。６つの三重変異体タンパク質が、ｅＳｐＣａｓ９ １．１よりもオフターゲット活性の低減において優れていた。これらには、Ｋ５２６Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ－Ｒ６９１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ－Ｒ７８０Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ－Ｒ７８０Ｑ－Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８１０Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、およびＲ６６１Ｌ－Ｋ８４８Ｌ－Ｋ８５５Ｑを含む。残りの変異体タンパク質は、外れ値の変異体タンパク質Ｒ６６１Ｌ－Ｒ６９１Ｑ－Ｋ８５５Ｑを除いて、ＷＴ Ｃａｓ９と比較して、オフターゲット変異頻度の低減においてｅＳｐＣａｓ９ １．１と同程度であるか、またはｅＳｐＣａｓ９ １．１とＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３の間のいずれかであった。図３Ｃおよび３Ｄの結果は、これらのタンパク質間のオンターゲット活性および特異性レベルをさらに区別する。ＦＡＮＣＦ０２部位で同定された非常に特異性の高い変異体タンパク質は、ＨＢＢ０３部位ではほとんど全てのオンターゲット活性を失っていた。しかし、６つの三重変異体タンパク質はｅＳｐＣａｓ９ １．１と同レベルのオフターゲット変異頻度を有するが、ＨＢＢ０３部位においてｅＳｐＣａｓ９ １．１よりも実質的に高いレベルのオンターゲット活性を有する。これらの結果をまとめると、この変異体タンパク質の群はバランスの取れた特異性および活性を有する。この変異体タンパク質の選択的な群には、Ｋ５６２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、Ｋ５６２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、Ｋ６５２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、Ｋ６５２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｑ、およびＲ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｒ１０６０Ｑを含む。まとめた結果に基づいて、ｅＳｐＣａｓ９ １．１様の４つの３重変異体タンパク質もまた同定され、これらにはＫ５２６Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８１０Ｑ－Ｋ８５５Ｑ、Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｌ、およびＲ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｒ１０６０Ｌを含む。
Figure 2023514327000006
実施例４：特異性が向上したＳＰＣＡＳ９ヌクレアーゼは、異なるゲノム部位にわたって効率的な編集を仲介する。
５つのヒトゲノム部位を標的とするｓｇＲＮＡをＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社から購入した。これらのｓｇＲＮＡのガイド配列を表３に示す。ＲＮＰ複合体を実施例１に記載するように調製した。ヒトＫ５６２細胞を１ｍＬあたり０．２５×１０６細胞でトランスフェクションの前日に播種し、トランスフェクション時にはおおよそ１ｍＬあたり０．５×１０６細胞であった。細胞を、ハンクス平衡塩類溶液で２回洗浄し、そして１００μＬあたり約０．３５×１０６細胞で細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。ヌクレオフェクションは、１００μＬの細胞をＲＮＰに移し入れ、気泡が入らないようにすぐに穏やかに上下にピペッティングする事で混合してから、その後Ａｍａｘａ ｐｒｏｇｒａｍ Ｔ－０１６を用いたエレクトロポレーションのためのキュベットに移して実施した。すぐに細胞を１ウェル当たり２ｍＬの温めておいた培地を加えた６ウェルプレートに移し、および３７℃、５％ＣＯ２で３日間増殖してから、ゲノム改変アッセイのために回収した。
トランスフェクションした細胞のゲノムＤＮＡ抽出物をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて調製した。標的ゲノム領域を、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用し、ＮＧＳプライマーで以下のサイクル条件でＰＣＲ増幅した：９８°Ｃ／２ｍ；９８°Ｃ／１５ｓ、６２°Ｃ／３０ｓ、および７２°Ｃ／４５ｓで３４サイクル；７２°Ｃ／５ｍ。ＮＧＳプライマー配列を表３に示す。ＮＧＳライブラリー調製、シーケンシングおよびデータ解析は実施例１に記載するとおりである。結果を図４に示す。この結果は、バランスの取れた特異性および活性を有すると同定された４つの三重変異体タンパク質が、実質的にｅＳｐＣａｓ９ １．１よりも高い編集効率を有し、５つのゲノム標的領域すべてにおいてＷＴ Ｃａｓ９と同等であった事を示す。
Figure 2023514327000007

Claims (35)

  1. アミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）のうちの２つ以上に変異を含む、操作されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質変異体であって、ここで、前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるリジン（Ｋ）がロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更され、および／または前述のアミノ酸位置の１つ以上におけるアルギニン（Ｒ）がロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に変更されている、ＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  2. ＳｐＣａｓ９タンパク質変異体がＫ８５５Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６６１、６９１、７８０、８１０、８４８、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  3. ＳｐＣａｓ９タンパク質変異体がＲ６６１Ｌ／Ｑ変異およびアミノ酸位置５２６、５６２、６５２、６９１、７８０、８１０、８４８、８５５、１００３、および１０６０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）における少なくとも１つのその他の変異を含む、請求項１に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  4. Ｋ５２６Ｌ／Ｑ、Ｋ５６２Ｌ／Ｑ、Ｋ６５２Ｌ／Ｑ、Ｋ８１０Ｌ／Ｑ、Ｋ８４８Ｌ／Ｑ、Ｋ８５５Ｌ／Ｑ、Ｒ６６１Ｌ／Ｑ、Ｒ６９１Ｌ／Ｑ、Ｒ７８０Ｌ／Ｑ、Ｋ１００３Ｌ／Ｑ、およびＲ１０６０Ｌ／Ｑ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９の付番方式を参照）から選択される、２つの異なるアミノ酸位置における２つの変異を含む、請求項１に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  5. Ｋ５２６Ｌ／Ｑ、Ｋ５６２Ｌ／Ｑ、Ｋ６５２Ｌ／Ｑ、Ｋ８１０Ｌ／Ｑ、Ｋ８４８Ｌ／Ｑ、Ｋ８５５Ｌ／Ｑ、Ｒ６６１Ｌ／Ｑ、Ｒ６９１Ｌ／Ｑ、Ｒ７８０Ｌ／Ｑ、Ｋ１００３Ｌ／Ｑ、およびＲ１０６０Ｌ／Ｑから選択される、３つの異なるアミノ酸位置における３つの変異を含む、請求項１に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  6. 変異が以下の群：Ｋ５６２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｋ５６２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｋ６５２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｋ６５２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｒ６６１Ｌ Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｑ；および
    Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｒ１０６０Ｑ、より選択される、請求項５に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  7. 変異が以下の群：Ｋ５６２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｋ５６２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｋ６５２Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；および
    Ｋ６５２Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑから選択される、請求項５に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  8. 変異が以下の群：Ｋ５２６Ｌ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｒ６６１Ｌ－Ｒ６９１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｒ６６１Ｌ－Ｒ７８０Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｒ６６１Ｌ－Ｒ７８０Ｑ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｒ６６１Ｌ Ｋ８１０Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、および
    Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８４８Ｌ－Ｋ８５５Ｑ、から選択される、請求項
    ５に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  9. 変異が、以下の群：Ｋ５２６Ｑ－Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８１０Ｑ－Ｋ８５５Ｑ；
    Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｋ１００３Ｌ；および
    Ｒ６６１Ｌ－Ｋ８５５Ｑ－Ｒ１０６０Ｌから選択される、請求項５に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  10. Ｎ末端、Ｃ末端、内部位置、またはそれらの組合せに融合される１つ以上の異種ドメインをさらに含む、前述の請求項の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  11. 異種ドメインが、核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、検出を容易にするマーカーもしくはレポータードメイン、クロマチン改変ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写調節ドメイン、ＤＮＡもしくはＲＮＡデアミナーゼドメイン、ウラシル－ＤＮＡ－グリコシラーゼドメイン、逆転写酵素ドメイン、リコンビナーゼドメイン、ＲＮＡアプタマー結合ドメイン、および非Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインから選択される、請求項１０に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  12. Ｎ末端、Ｃ末端、内部位置またはそれらの組合せに融合される少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む、前述の請求項の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  13. ＲｕｖＣドメインにおける少なくとも１つの変異、および／またはＨＮＨドメインにおける少なくとも１つの変異をさらに含む、前述の請求項の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  14. ＲｕｖＣドメインにおける少なくとも１つの変異が、存在する場合には、Ｄ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、およびＤ９８６Ａから選択される少なくとも１つの変異を含み；およびＨＮＨドメインにおける少なくとも１つの変異が、存在する場合には、Ｈ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、およびＮ８６３Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１３に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  15. 前述の請求項の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体および少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡを含む操作されたＣａｓ９系であって、ここで前記少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡは前記操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体と複合体を形成するように設計される、操作されたＣａｓ９系。
  16. 前述の請求項の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体をコードする複数の核酸。
  17. 請求項１５に記載の操作されたＳｐＣａｓ９系をコードする複数の核酸。
  18. 操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体をコードする少なくとも１つの核酸および操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を含む、請求項１７に記載の複数の核酸。
  19. 少なくとも１つの核酸がＲＮＡである、請求項１６～１８の何れか１項に記載の複数の核酸。
  20. 少なくとも１つの核酸がＤＮＡである、請求項１６～１８の何れか１項に記載の複数の核酸。
  21. 操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体をコードする少なくとも１つの核酸が、真核細胞での発現のためにコドン最適化されている、請求項１６～２０の何れか１項に記載の複数の核酸。
  22. 真核細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、請求項２１に記載の複数の核酸。
  23. 操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸がＤＮＡである、請求項１５に記載の複数の核酸。
  24. 操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体をコードする少なくとも１つの核酸が、ｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ合成または細菌細胞におけるタンパク質発現のためにファージプロモーター配列に作動可能に連結されており、および操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸が、ｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ合成のためにファージプロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項１５に記載の複数の核酸。
  25. 操作されたＣａｓ９タンパク質変異体をコードする少なくとも１つの核酸が、真核細胞における発現のために真核プロモーター配列に作動可能に連結されており、および操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸が、真核細胞における発現のために真核プロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項１２に記載の複数の核酸。
  26. 請求項１６～２５の何れか１項に記載の複数の核酸を含む少なくとも１つのベクター。
  27. プラスミドベクター、ウイルスベクターまたは自己複製性ウイルスＲＮＡレプリコンである、請求項２６に記載の少なくとも１つのベクター。
  28. 請求項１５に記載の少なくとも１つの操作されたＣａｓ９系、または請求項１７もしくは１８に記載の核酸を含む真核細胞。
  29. ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、植物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、または単細胞真核生物である、請求項２８に記載の真核細胞。
  30. ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項２９に記載の真核細胞。
  31. Ｃａｓ９ホモログである、請求項１～１３の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体。
  32. 請求項１～１３の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
  33. 請求項１～１３の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体を含む融合タンパク質。
  34. 請求項１～１３の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  35. 請求項１～１３の何れか１項に記載の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質変異体を真核細胞においてガイドＲＮＡと共に発現させる事を含む、真核細胞の染色体配列を改変する方法。
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