CN107190098A - 一套大熊猫微卫星位点的三重pcr体系检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法。本发明一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，大致包括1）提取基因组DNA；2）评估原始引物（单对引物）扩增产物的片段大小；3）设计并优化三重PCR引物组合；4）三重PCR扩增及条件优化；5）基因分型效果检测并确定最终组合方式。本发明大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法简单，与大熊猫常规的微卫星PCR体系相比，节约66.7%的DNA样本、66.7%的成本、效率提高了200%。本发明可在大熊猫的亲子鉴定、种群遗传多样性和遗传结构的评估方面进行推广。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法。
背景技术
微卫星DNA是真核生物基因组中短的串联重复序列(Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchoredpolymerase chain reaction amplification.Genomics,1994,20:176-183)。由于微卫星位点数量多，在基因组中均匀分布，共显性遗传且易于检测，微卫星DNA得到了广泛的应用(Wan QH,Wu H,Fujihara T,et al.Which genetic marker for which conservationgenetics issue.Electrophoresis,2004,25:2165-2176)。大熊猫的微卫星已用来解决亲子鉴定、遗传多样性、遗传结构等问题(Li DS,Cui HM,Wang CD,et al.A fast andeffective method to perform paternity testing for Wolong giant pandas.ChineseScience Bulletin,2011,56:2559-2564；Zhu Y,Wan QH,Yu B,et al.Patterns ofgenetic differentiation at MHC class I genes and microsatellites identifyconservation units in the giant panda.BMC Evolutionary Biology,2013,13:227.)。但是，上述遗传学实验均需要采用多个微卫星位点，研究者需要花费大量的时间和实验成本。更重要的是，要消耗较多的DNA样本。然而，对于大熊猫这种濒危动物来说，DNA样本十分珍贵。故发明一种对样本量要求少、成本低、高效的微卫星实验体系对于大熊猫的保护遗传学研究来说具有重要的意义。
目前，其他物种的微卫星遗传学研究中采用多重PCR以解决上述问题。微卫星多重PCR指在一个PCR体系中加入多对微卫星特异性引物，对同一个模板的不同区域进行同时扩增的PCR技术(Chamberlain JS,Gibbs RA,Ranier PN,et al.Deletion screening of theDuchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification.NucleicAcids Research,1988,16:11141-11156.)。微卫星多重PCR可以同时扩增多个目的片段，能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率的目的。微卫星多重PCR的核心内容在于如何设计和优化引物组合，使得引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠。尽管微卫星多重PCR技术已在其他物种中广泛得到应用(文萍,赵建,李伟等.基于微卫星多重PCR技术的黄喉拟水龟亲子鉴定[J].水生生物学报,2015,(06):1134-1141.；李佳凯,王志勇,韦信键等.大黄鱼微卫星多重PCR体系的建立及其应用[J].水产学报,2014,(04):470-475.)，但是迄今为止，大熊猫微卫星多重PCR体系仍未建立起来。
发明内容
本发明是克服目前大熊猫微卫星研究中的技术不足之处，提供一套高效的大熊猫微卫星位点的三重PCR体系的检测方法。
本发明一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，大致包括1)提取基因组DNA；2)评估原始引物(单对引物)扩增产物的片段大小；3)设计并优化三重PCR引物组合；4)三重PCR扩增及条件优化；5)基因分型效果检测并确定最终组合方式。具体包括以下步骤：
a、DNA样品提取：采用Axygen血液基因组提取试剂盒对大熊猫血液基因组DNA进行提取；
b、评估引物的扩增产物的大小：从文献(Huang J,Li YZ,Du LM,etal.2015.Genome-wide survey and analysis of microsatellites in giant panda(Ailuropodamelanoleuca),with a focus on the applications of a novelmicrosatellite marker system.BMC Genomics,16:Article 61.)中选择15对扩增效果好、分型效果佳、多态性高的大熊猫微卫星引物，分别为Gpz6，Gpz47，Gpz20，Gpl47，Gpl29，Gpl60，Gpz54，Gpl8，Gpl31，Gpl44，Gpz51，Gpl28，Gpl53，Gpy20，Gpy5，在上述15对引物上游的5’端加入接头序列5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，引物合成后，分别对大熊猫DNA进行单重PCR扩增，对扩增后的PCR产物按照150～200bp，200～250bp，250bp以上三个不同区间进行初步分组；
c、引物优化：采用Primer Premier 6.0重新设计引物使得扩增产物长度符合要求，且引物组合需使得三个片段区域各包含5对引物；
d、引物组合评估：利用Primer Premier 6.0进行引物间的评估，选择两两引物之间ΔdG<4.0的引物组合备用；
e、三重PCR体系：对d步骤选择的三重PCR组合均采用10μL PCR体系；
f、三重PCR扩增条件优化：采用降落PCR程序实施三重PCR；
g、基因分型：取1uLPCR产物在7％的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，激光扫描检测目的产物。
上述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其中b步骤中扩增体系为：1μL含Mg2+的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，引物的上下游10mmol/L各加0.3μL,0.3μL1pmol/μL的5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’(Μ13荧光引物)，0.1μL 5U/μL的rTaq酶，10～20ng基因组DNA，补加灭菌超纯水至体系为10μL。
上述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其中b步骤中扩增的条件为：95℃总变性5分钟，95℃变性30秒，退火温度下退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃总延伸5分钟。
上述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其中e步骤中所述三重PCR体系为：1μL含Mg2+的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，三对引物的上下游10mmol/L各加0.1μL，0.3μL 1pmol/μL的5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’(Μ13荧光引物)，0.1μL 5U/μL的rTaq酶，10～20ng基因组DNA，补加灭菌超纯水至体系为10μL。
上述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其中f步骤中所述降落PCR分为四个阶段，第一个阶段95℃变性5分钟；第二个阶段，95℃变性30秒，62.5℃退火30秒，72℃延伸30秒，共15个循环；第三个阶段，95℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，共20个循环；第四个阶段，72℃延伸5分钟。
进一步的，上述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其中所述第二个阶段退火温度每循环一次，减少0.7℃。
本发明的有益效果是：本发明大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法简单，与大熊猫常规的微卫星PCR体系相比，节约66.7％的DNA样本、66.7％的成本、效率提高了200％。本发明可在大熊猫的亲子鉴定、种群遗传多样性和遗传结构的评估方面进行推广。
附图说明
图1大熊猫微卫星位点的三重PCR分型图(第一组)，不同泳道代表不同的个体；
图2大熊猫微卫星位点的三重PCR分型图(第二组)，不同泳道代表不同的个体；
图3大熊猫微卫星位点的三重PCR分型图(第三组)，不同泳道代表不同的个体；
图4大熊猫微卫星位点的三重PCR分型图(第四组)，不同泳道代表不同的个体；
图5大熊猫微卫星位点的三重PCR分型图(第五组)，不同泳道代表不同的个体；
图6都江堰大熊猫基地种群微卫星三重PCR基因部分分型结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
本实例是利用在中国大熊猫保护研究中心都江堰大熊猫基地采集的大熊猫样品进行三重PCR体系检测方法的建立。具体方法如下：
(1)DNA样品提取：14个血液样本由中国大熊猫保护研究中心提供，按照Axygen血液基因组提取试剂盒的说明进行大熊猫血液基因组DNA提取。
(2)评估引物的扩增产物的大小。
从文献(Huang J,Li YZ,Du LM,et al.2015.Genome-wide survey and analysisof microsatellites in giant panda(Ailuropodamelanoleuca),with a focus on theapplications of a novel microsatellite marker system.BMC Genomics,16:Article61.)中找出扩增效果好、分型效果佳、多态性高的15对大熊猫微卫星引物，Gpz6,Gpz47,Gpz20,Gpl47,Gpl29,Gpl60,Gpz54,Gpl8,Gpl31,Gpl44,Gpz51,Gpl28,Gpl53,Gpy20,Gpy5.在上述的15对引物上游的5’端加入接头序列(5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’)，引物合成后分别对(1)步骤中的DNA样本进行扩增；扩增体系如表1；
扩增条件：95℃总变性5分钟，95℃变性30秒，退火温度下退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环。最后72℃总延伸5分钟。取PCR产物1μL进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
上述PCR产物按照150-200bp,200-250bp,250bp以上三个不同区间进行初步分组。
表1单重PCR体系组成
| 体系 | 体积(μL) |
| 10xBuffer(Mg2+) | 1.0 |
| dNTP(2.5mM) | 0.8 |
| 标记上游引物(10mmol/L) | 0.1 |
| 未标记下游引物(10mmol/L) | 0.1 |
| M13荧光引物(1pmol/μL) | 0.3 |
| rTaq(5U/μL) | 0.1 |
| gDNA | 10～20ng |
| 无菌水 | 补加到10μL |
(3)引物优化：引物组合需使得三个片段区域各包含5对引物。Gpz47,Gpy20,Gpy5,Gpl53,Gpl28,Gpl44与部分引物重叠，用Primer Premier 6.0重新设计引物使得扩增产物长度符合要求。优化后的引物分组如表2。
表2 15对引物扩增片段相对位置
| 相对位置 | 引物 |
| 上 | Gpz20、Gpl44*、Gpy5*、Gpl53*、Gpy20* |
| 中 | Gpz47*、Gpz6、Gpl60、Gpl8、Gpl28* |
| 下 | Gpl47、Gpz54、Gpl31、Gpz51、Gpl29 |
注：*表示此引物进行片段大小的优化。
(4)引物组合评估：利用Primer Premier 6.0进行引物间的评估。三重PCR引物组合要求每两对引物之间的ΔdG<4.0。故选择两两引物之间ΔdG<4.0的引物组合备用(引物之间不易形成引物二聚体和发卡结构)。满足条件的三重PCR组合共有23组(见表3所示)。
表3两两引物间ΔdG<4.0的三重PCR引物组合
| 组号 | 引物名称a | 引物名称b | 引物名称c |
| 1 | Gpl29 | Gpz47* | Gpy20* |
| 2 | Gpl29 | Gpl8 | Gpy20 |
| 3 | Gpz51 | Gpz6 | Gpz20 |
| 4 | Gpz51 | Gpz6 | Gpy5* |
| 5 | Gpz51 | Gpz6 | Gpl53 |
| 6 | Gpz51 | Gpl28 | Gpy5 |
| 7 | Gpz51 | Gpl28 | Gpz20 |
| 8 | Gpl31 | Gpl60 | Gpl53* |
| 9 | Gpl31 | Gpl60 | Gpl44 |
| 10 | Gpl31 | Gpl60 | Gpz20 |
| 11 | Gpz54 | Gpl8 | Gpy5 |
| 12 | Gpz54 | Gpl8 | Gpz20 |
| 13 | Gpz54 | Gpl28 | Gpy5 |
| 14 | Gpz54 | Gpl28 | Gpz20 |
| 15 | Gpz54 | Gpz47 | Gpz20 |
| 16 | Gpz54 | Gpz47 | Gpy5 |
| 17 | Gpl47 | Gpl28* | Gpl44* |
| 18 | Gpl47 | Gpl28 | Gpy5 |
| 19 | Gpl47 | Gpl28 | Gpz20 |
| 20 | Gpl47 | Gpl8 | Gpl44 |
| 21 | Gpl47 | Gpl8 | Gpy5 |
| 22 | Gpl47 | Gpl8 | Gpz20 |
| 23 | Gpl47 | Gpz6 | Gpl44 |
(5)三重PCR体系：上述23组三重PCR组合均采用10μL PCR体系(见表4)。Μ13荧光引物的序列为5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’。
表4三重PCR体系组成
| 体系 | 体积(μL) |
| 10xBuffer(Mg2+) | 1.0 |
| dNTP(2.5mM) | 0.8 |
| 引物1标记上游(10mmol/L) | 0.1 |
| 引物1未标记下游(10mmol/L) | 0.1 |
| 引物2标记上游(10mmol/L) | 0.1 |
| 引物2未标记下游(10mmol/L) | 0.1 |
| 引物3标记上游(10mmol/L) | 0.1 |
| 引物3未标记下游(10mmol/L) | 0.1 |
| M13荧光引物(1pmol/μL) | 0.3 |
| rTaq(5U/μL) | 0.1 |
| gDNA | 10～20ng |
| 无菌水 | 补加到10μL |
(6)三重PCR扩增条件优化：
由于不同的引物退火温度有一定的差异，普通的PCR扩增程序无法同时满足三对引物的扩增条件。本发明采用降落PCR程序实施三重PCR。降落PCR的退火温度在一定范围内变化，可以达到多对引物的退火温度。本发明的降落PCR分为四个阶段，第一个阶段95℃变性5分钟；第二个阶段，95℃变性30秒，62.5℃退火30秒(退火温度每个循环减少0.7℃)，72℃延伸30秒，共15个循环；第三个阶段，95℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，共20个循环；第四个阶段，72℃延伸5分钟。
(7)基因分型：取1uL三重PCR产物在7％的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。1000V电泳2.5小时，激光扫描检测目的产物。舍弃扩增效果不佳、有非特异性扩增、鬼影带严重、带型不易读取、扩增片段大小相近的组合。本发明所述的5组三重PCR引物组合及引物序列如表5所示，5组大熊猫微卫星位点的三重PCR分型电泳图依次见图1～图5所示。由电泳结果可以看出，本发明中的5组三重PCR引物组合扩增效果佳、无非特性扩增、带型容易读取。都江堰大熊猫部分个体的三重PCR分型电泳图如图6。
表5大熊猫微卫星三重PCR引物组合
如果采用单对引物逐一扩增的方法，需要消耗2100ng的DNA，105个单位的r-taq，进行15个PCR扩增。而采用本发明的方法，本实例只消耗了700ng的DNA，35个单位的r-taq，仅进行5个PCR扩增。相较于前者，节约66.7％的DNA样本、66.7％的成本、效率提高了200％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、DNA样品提取：采用Axygen血液基因组提取试剂盒对大熊猫血液基因组DNA进行提取；
b、评估引物的扩增产物的大小：从文献中选择15对大熊猫微卫星引物，分别为Gpz6，Gpz47，Gpz20，Gpl47，Gpl29，Gpl60，Gpz54，Gpl8，Gpl31，Gpl44，Gpz51，Gpl28，Gpl53，Gpy20，Gpy5，在上述15对引物上游的5’端加入接头序列5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，引物合成后，分别对大熊猫DNA进行单重PCR扩增，对扩增后的PCR产物按照150～200bp，200～250bp，250bp以上三个不同区间进行初步分组；
c、引物优化：采用Primer Premier 6.0重新设计引物使得扩增产物长度符合要求，且引物组合需使得三个片段区域各包含5对引物；
d、引物组合评估：利用Primer Premier 6.0进行引物间的评估，选择两两引物之间ΔdG<4.0的引物组合备用；
e、三重PCR体系：对d步骤选择的三重PCR组合均采用10μL PCR体系；
f、三重PCR扩增条件优化：采用降落PCR程序实施三重PCR；
g、基因分型：取1uLPCR产物在7%的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，激光扫描检测目的产物。
2.根据权利要求1所述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其特征在于，b步骤中扩增体系为：1μL含Mg2+的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，引物的上下游10mmol/L各加0.3μL，0.3μL 1pmol/μL的5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，0.1μL 5U/μL的rTaq酶，10～20ng基因组DNA，补加灭菌超纯水至体系为10μL。
3.根据权利要求1或2所述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其特征在于，b步骤中扩增的条件为：95℃总变性5分钟，95℃变性30秒，退火温度下退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃总延伸5分钟。
4.根据权利要求1～3任一项所述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其特征在于，e步骤中所述10μL PCR体系为：1μL含Mg2+的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，三对引物的上下游10mmol/L各加0.1μL，0.3μL 1pmol/μL的5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，0.1μL5U/μL的rTaq酶，10～20ng基因组DNA，补加灭菌超纯水至体系为10μL。
5.根据权利要求1～4任一项所述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其特征在于，f步骤中所述降落PCR分为四个阶段，第一个阶段95℃变性5分钟；第二个阶段，95℃变性30秒，62.5℃退火30秒，72℃延伸30秒，共15个循环；第三个阶段，95℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，共20个循环；第四个阶段，72℃延伸5分钟。
6.根据权利要求5所述一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其特征在于，所述第二个阶段退火温度每循环一次，减少0.7℃。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107190098A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108642189A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-10-12 | 浙江大学 | 大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列 |
| CN110643713A (zh) * | 2018-06-27 | 2020-01-03 | 深圳市华大司法技术协同创新研究院 | 用于大熊猫的str基因座集及用途 |
| CN111144775A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-05-12 | 四川省自然资源科学研究院 | 基于景观格局的乡级土地利用总体规划生态风险评价方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007174973A (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Visionbio Corp | Ｓｓｒプライマーを用いるマルチプレックスｐｃｒによる品種識別法。 |
| CN101948919A (zh) * | 2010-09-09 | 2011-01-19 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒 |
| CN103757113A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-04-30 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 草鱼亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 |
| CN104178566A (zh) * | 2014-07-18 | 2014-12-03 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种可用于微卫星检测的多重荧光pcr通用接头及检测方法和应用 |
| CN105177158A (zh) * | 2015-10-15 | 2015-12-23 | 天津商业大学 | 一种日本囊对虾微卫星三重pcr检测方法 |
| CN106947816A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-07-14 | 中山大学 | 一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 |
-
2017
- 2017-07-27 CN CN201710626400.7A patent/CN107190098A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007174973A (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Visionbio Corp | Ｓｓｒプライマーを用いるマルチプレックスｐｃｒによる品種識別法。 |
| CN101948919A (zh) * | 2010-09-09 | 2011-01-19 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒 |
| CN103757113A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-04-30 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 草鱼亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 |
| CN104178566A (zh) * | 2014-07-18 | 2014-12-03 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种可用于微卫星检测的多重荧光pcr通用接头及检测方法和应用 |
| CN105177158A (zh) * | 2015-10-15 | 2015-12-23 | 天津商业大学 | 一种日本囊对虾微卫星三重pcr检测方法 |
| CN106947816A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-07-14 | 中山大学 | 一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIE HUANG ET AL.: "Genome-wide survey and analysis of microsatellites in giant panda (Ailuropoda melanoleuca)，with a focus on the applications of a novel microsatellite marker system", 《BMC GENOMICS》 * |
| 周国华: "《SNP检测技术与个体化药物治疗》", 28 February 2015, 苏州大学出版社 * |
| 孟祥军等: "丝羽乌骨鸡微卫星标记多重PCR体系的建立与初步应用", 《遗传》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108642189A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-10-12 | 浙江大学 | 大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列 |
| CN110643713A (zh) * | 2018-06-27 | 2020-01-03 | 深圳市华大司法技术协同创新研究院 | 用于大熊猫的str基因座集及用途 |
| CN111144775A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-05-12 | 四川省自然资源科学研究院 | 基于景观格局的乡级土地利用总体规划生态风险评价方法 |
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