CN106947816A - 一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 - Google Patents

一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，包括以下步骤：(1)斜带石斑鱼个体DNA提取；(2)斜带石斑鱼多态性微卫星引物的筛选；(3)斜带石斑鱼8重PCR条件的优化和扩增；(4)亲子鉴定；本发明方法利用微卫星标记与多重荧光PCR技术结合，筛选了8个高度多态性微卫星位点，组建一个8重荧光PCR体系。利用斜带石斑鱼家系对8重荧光PCR体系进行验证，本发明所述鉴定方法操作简单、快捷、费用低廉，可以在斜带石斑鱼种质鉴定，家系管理和良种选育进行推广应用，并为增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。

Description

一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法
技术领域
本发明属于斜带石斑鱼亲子鉴定技术领域，具体涉及一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法。
背景技术
斜带石斑鱼(E.coioides)属于鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)、石斑鱼属(Epinephelus)，其分布范围极广，从南非德班，东至帕劳群岛和斐济，北至日本琉球群岛，南至阿拉弗拉海和澳大利亚(Heemstra&Randall 1993)。斜带石斑鱼是石斑鱼中少数几个被广泛人工养殖的品种之一，因其肉质鲜美，蛋白含量高等特点，已成为亚太地区一种重要的使用商品鱼类。不过，由于生态环境的破坏和过度捕捞等原因，斜带石斑鱼已经在2004年被世界濒危物种红皮书(IUCN Red List of Threatened Species)列为近危物种(IUCN 2004)。良种选育是我国斜带石斑鱼养殖产业健康、持续发展的重要手段。
分子标记是种质资源鉴定、家系选育和放流效果评估等研究和应用中一个重要技术手段。在家系选育中，了解整个家系遗传多样性、子代与亲代的对应关系以及子代与子代的关系，对指导亲本选留，从而避免近亲杂交、种质衰退有重要作用。同样，在增殖放流工作中，需要了解回捕个体与放流个体的对应关系，以评估放流的效果。微卫星又称简单重复序列，是指一类重复单位在2～6个碱基的重复序列。微卫星序列作为分子标记具有扩增率高，灵敏度高等优势，且结果可靠，方法简单，省时省力。在对于个体的识别可以采用物理标记的方法，但这种办法对幼鱼具有很大的局限性，或因为幼体太小无法标记，或因为标记对幼体生存产生较大影响。因此选用有效的微卫星标记，实现个体识别和亲子关系鉴定是斜带石斑鱼良种选育和放流效果评估工作中一种可靠、高效的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，该方法选用有效的微卫星引物，可靠、高效，能对斜带石斑鱼进行亲子鉴定，还能用于家系管理和增殖放流效果评估。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，包括以下步骤：
(1)斜带石斑鱼个体DNA提取
取斜带石斑鱼个体鳍条，采取酚-氯仿法提取基因组DNA；
(2)斜带石斑鱼多态性微卫星引物的筛选
用步骤(1)获得的基因组DNA为模板，筛选8对微卫星引物，所述8对微卫星引物分别为M3-134，M4-44，M2-16，M2-64，M4-138，M4-116，M3-118和M3-33，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.16所示；
(3)斜带石斑鱼8重PCR条件的优化和扩增
每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，设计8重PCR反应体系和反应程序，进行8重PCR扩增；
(4)亲子鉴定
将8重PCR产物在测序仪上进行分型，读取个体等位基因大小bp，即碱基对，排成数字基因型矩阵，读取亲本及子代基因型后，根据孟德尔定律判断亲子关系。
在上述斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法中：
步骤(1)中优选将基因组DNA稀释至100ng/μL。
步骤(2)中筛选8对微卫星引物的过程优选是：根据已发表的斜带石斑鱼微卫星标记，合成引物，并分别对30个野生斜带石斑鱼个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高并且具有相同退火温度的8对微卫星引物。
步骤(2)中相邻两对引物扩增出的片段大小范围不相同。
步骤(3)中M2-16、M4-138、M3-118标记荧光物质FAM，M3-134、M4-44、M2-64、M4-116、M3-33标记荧光物质HEX。
步骤(3)中所述8重PCR反应体系优选如下：
步骤(3)中8重PCR反应程序优选设定为：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度60℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
步骤(4)中优选采用ABI 3730XL进行基因型分型，优选利用Gene mapper v4.0读取个体等位基因大小bp。
进一步的，作为本发明的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法中的一种优选的具体实施方式，该方法包括以下步骤：
(1)、斜带石斑鱼个体DNA提取
剪取斜带石斑鱼家系父本、母本及子代个体鳍条并立即保存在95％(体积百分含量)乙醇中，用酚-氯仿方法提取基因组DNA，并把样品DNA浓度调整至100ng/μL；
(2)、斜带石斑鱼多态性微卫星引物的筛选
根据已发表的斜带石斑鱼微卫星标记，合成引物，并分别对30个野生斜带石斑鱼个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高并且具有相同退火温度的8对引物，设计成一个8重PCR体系；
所述8对微卫星引物为：M3-134，M4-44，M2-16，M2-64，M4-138，M4-116，M3-118，M3-33，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示，相邻两对引物扩增出的片段大小范围不相同，每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，其中：M2-16、M4-138、M3-118标记荧光物质FAM；M3-134、M4-44、M2-64、M4-116、M3-33标记荧光物质HEX；
(3)、斜带石斑鱼8重PCR条件的优化、扩增
每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，其中：M2-16、M4-138、M3-118标记荧光物质FAM，M3-134、M4-44、M2-64、M4-116、M3-33标记荧光物质HEX，其中M3-134，M4-44，M2-16，M2-64引物浓度稀释至10μmol/L，M4-138，M4-116，M3-118，M3-33引物浓度稀释至5μmol/L，8重PCR体系总体系具体如下：
PCR反应程序设定：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度60℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min；
PCR结束后，取5μL在琼脂糖胶上电泳检测，送至商业公司采用ABI 3730XL进行基因型分型；
(4)、亲子鉴定
将多重PCR产物在测序仪上进行分型，读取个体等位基因大小bp，即碱基对。由于子代所有的基因均来自亲本，且孟德尔定律显示，生物体在进行减数分裂形成配子的时候，等位基因发生分离，分别进入到两个配子当中，独立地随配子遗传给后代。故可以在读取亲本及子代基因型后，根据孟德尔定律判断是否具有亲子关系。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明利用微卫星标记与多重荧光PCR技术的结合，筛选了8个高度多态性微卫星位点，组建一个8重荧光PCR体系，通过测序仪分型，对斜带石斑鱼家系进行个体识别和亲子关系鉴定；
(2)本发明一次可以检测8个位点，相对于简单的单位点检测，效率提高，费用下降为原来八分之一左右；
(3)本发明通过测序仪分型，等位基因大小判读更加准确，提高了基因型数据的准确性；
(4)本发明可以在斜带石斑鱼种质鉴定，家系管理和良种选育进行推广应用，并为增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。
附图说明
图1为斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光标记8重PCR基因分型图，其中图A是荧光物质HEX标记的引物在个体中扩增出的基因位点分型图，从左到右每个峰分别代表引物M3-33、M4-116、M2-64、M4-44、M3-134扩增出的基因位点；图B是荧光物质FAM标记的引物在个体中扩增出的基因位点分型图，从左到右每个峰分别代表M3-118、M4-138、M2-16。
具体实施方式
下面结合实例具体进一步说明本发明的具体实施方式。
本实施例提供的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，包括以下步骤：
(1)斜带石斑鱼DNA提取
剪取斜带石斑鱼家系父本、母本及30个子代个体鳍条并立即保存在95％乙醇中，父本标记为C，母本标记为X，30个子代分别标记为1-30，用酚-氯仿方法提取基因组DNA：
用镊子取出保存在酒精中的尾鳍，剪取约20mg，用滤纸轻轻按压吸去多余的酒精，转移到预先加入580μL组织裂解液的1.5mL离心管中并将组织剪碎。然后加入20μL 20mg/mL的蛋白酶K，轻轻摇晃混匀，置于56℃水浴锅中直至组织完全溶解，消化过程中每隔20min取出离心管轻轻震荡10sec混匀；加入600μL酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液，上下颠倒混匀5min使水相和有机相分层，12000rpm离心5min。用剪去尖端的枪头小心吸取上清转移到新的离心管中；重复上述步骤；加入等体积-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀10min，此时离心管中可以看到白色沉淀。12000rpm离心5min，弃上清液，用1mL 70％乙醇洗涤沉淀两次，如果沉淀较松散，再离心5min，室温下空气干燥沉淀约15-20min；加入100μL TE缓冲液溶解DNA，使用紫外分光光度计检测DNA浓度，并把样品DNA浓度调整至100ng/μL。
(2)斜带石斑鱼多态性微卫星引物的筛选
根据已发表的斜带石斑鱼微卫星标记，合成引物，并分别对30个野生斜带石斑鱼个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高并且具有相同退火温度的8对引物，设计成一个8重PCR体系。本发明8对微卫星引物：M3-134，M4-44，M2-16，M2-64，M4-138，M4-116，M3-118，M3-33，相邻两对引物扩增出的片段大小范围不相同。
上述筛选出来的8对引物，组成一个8重PCR。每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，其中：M2-16、M4-138、M3-118标记荧光物质FAM；M3-134、M4-44、M2-64、M4-116、M3-33标记荧光物质HEX，见表1。
表1斜带石斑鱼8重PCR组合的引物序列及荧光物质
注：F表示正向引物，R表示反向引物，所有荧光物质均标记在正向引物的5’端。
(3)斜带石斑鱼8重PCR条件的优化和扩增
将上述筛选出来的8对引物，组成一个8重PCR，每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，其中：M2-16、M4-138、M3-118标记荧光物质FAM；M3-134、M4-44、M2-64、M4-116、M3-33标记荧光物质HEX。8重PCR体系总体系具体见表2：
表2斜带石斑鱼亲子鉴定PCR反应体系
PCR反应程序设定：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度60℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR结束后，取5μL在琼脂糖凝胶上电泳检测，送至商业公司采用ABI3730XL进行基因型分型。
(4)亲子鉴定
根据测序仪分型结果，利用Gene mapper v4.0读取个体基因型(bp，即碱基对)，具体如图1所示，从左到右分别读出所有个体8个位点的基因型，其中图A是荧光物质HEX标记的引物在个体中扩增出的基因位点分型图，从左到右每个峰分别代表引物M3-33、M4-116、M2-64、M4-44、M3-134扩增出的基因位点；图B是荧光物质FAM标记的引物在个体中扩增出的基因位点分型图，从左到右每个峰分别代表M3-118、M4-138、M2-16。
结合人工加以校正，排成数字基因型矩阵，表3a和表3b一个斜带石斑鱼家系部分个体的基因型数据。
表3a斜带石斑鱼家系亲本及30个子代的部分基因型
表3b斜带石斑鱼家系亲本及30个子代的部分基因型
表4斜带石斑鱼8个微卫星位点遗传学参数
位点 Na HExp HObs HWE PIC
M3-134 16 0.876 0.633 0.0000* 0.850
M4-44 13 0.903 0.933 0.0688 0.878
M2-16 6 0.715 0.567 0.0592 0.653
M2-64 13 0.910 0.833 0.1672 0.886
M4-138 8 0.816 0.633 0.0694 0.774
M4-116 6 0.676 0.633 0.3230 0.619
M3-118 12 0.892 0.967 0.3985 0.865
M3-33 6 0.788 0.667 0.1720 0.737
注：Na，等位基因数；HExp，期望杂合度；Hobs，观测杂合度；HWE，哈代温伯格平衡检测的P值；PIC，多态信息含量；退火温度均为57℃；*Bonferroni修正之后明显偏离HWE的位点(α＝0.05，P<0.0006)。
由表3a和表3b可知，子代个体中8个引物位点扩增出的基因型均来自父母本，且父母本8个引物位点扩增出的基因型随机分配到子代个体中，符合孟德尔定律，表明父本C和母本X与这30个子代亲子关系成立。
表4表明用于亲子鉴定的8个微卫星位点多态性高，能充分有效地运用于斜带石斑鱼亲子鉴定系统。
以上结果表明，本发明的微卫星8重荧光PCR方法在斜带石斑鱼家系的亲子鉴定中稳定，准确，满足斜带石斑鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估的要求。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不做出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
<110 > 中山大学
<120 >一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法
<210 > 1
<211> 22
<212> DNA
<221> 微卫星引物M3-134的上游引物
<400 >1
ACTCCCTCCT CAGACTCCAC AA 22
<210 > 2
<211> 22
<212> DNA
<221>微卫星引物M3-134的下游引物
<400 >2
GTTAAACCAA TCAGGCTCCA CC 22
<210 > 3
<211> 20
<212> DNA
<221>微卫星引物M4-44的上游引物
<400 >3
CCCACCCCAA ACAGGACCAT 20
<210 > 4
<211> 25
<212> DNA
<221>微卫星引物M4-44的下游引物
<400 >4
GAGTTACCTC AACCCAAATC CATTA 25
<210 > 5
<211> 20
<212> DNA
<221>微卫星引物M2-16的上游引物
<400 >5
GGATGGGAGG GGCACAGATA 20
<210 > 6
<211> 24
<212> DNA
<221>微卫星引物M2-16的下游引物
<400 >6
GCAGAAAGGG ACATAATGAG GAGA 24
<210 > 7
<211> 25
<212> DNA
<221>微卫星引物M2-64的上游引物
<400 >7
CACATACATC ATTTCGTTCA CCATC 25
<210 > 8
<211> 22
<212> DNA
<221>微卫星引物M2-64的下游引物
<400 >8
GTCAGTTCAA GTCTGCCCGT TT 22
<210 > 9
<211> 21
<212> DNA
<221>微卫星引物M4-138的上游引物
<400 >9
GCAGTGGCAG ATGGACAGAA A 21
<210 > 10
<211> 24
<212> DNA
<221>微卫星引物M4-138的下游引物
<400 >10
ATTAAGGGCA GGAAGTGATA AACC 24
<210 > 11
<211> 20
<212> DNA
<221>微卫星引物M4-116的上游引物
<400 >11
CATTGCTGGG TAGAGGGACG 20
<210 > 12
<211> 24
<212> DNA
<221>微卫星引物M4-116的下游引物
<400 >12
ACTGTACTAT GCGGGATTTG ACTG 24
<210 > 13
<211> 22
<212> DNA
<221>微卫星引物M3-118的上游引物
<400 >13
GTGAGGTGAC CTTGGGTGTT TC 22
<210 > 14
<211> 22
<212> DNA
<221>微卫星引物M3-118的下游引物
<400 >14
GTGAGGTGAC CTTGGGTGTT TC 22
<210 > 15
<211> 20
<212> DNA
<221>微卫星引物M3-33的上游引物
<400 >15
CTTCTCGCTG CCTTCGTCCA 20
<210 > 16
<211> 20
<212> DNA
<221>微卫星引物M3-33的下游引物
<400 >16
CGGCTTCTCC CTGAAATCCC 20

Claims (8)

1.一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)斜带石斑鱼个体DNA提取
取斜带石斑鱼个体鳍条，采取酚-氯仿法提取基因组DNA；
(2)斜带石斑鱼多态性微卫星引物的筛选
用步骤(1)获得的基因组DNA为模板，筛选8对微卫星引物，所述8对微卫星引物分别为M3-134，M4-44，M2-16，M2-64，M4-138，M4-116，M3-118和M3-33，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.16所示；
(3)斜带石斑鱼8重PCR条件的优化和扩增
每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，设计8重PCR反应体系和反应程序，进行8重PCR扩增；
(4)亲子鉴定
将8重PCR产物在测序仪上进行分型，读取个体等位基因大小bp，即碱基对，排成数字基因型矩阵，读取亲本及子代基因型后，根据孟德尔定律判断亲子关系。
2.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(1)中将基因组DNA稀释至100ng/μL。
3.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(2)中筛选8对微卫星引物的过程是：根据已发表的斜带石斑鱼微卫星标记，合成引物，并分别对30个野生斜带石斑鱼个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高并且具有相同退火温度的8对微卫星引物。
4.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(2)中相邻两对引物扩增出的片段大小范围不相同。
5.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(3)中M2-16、M4-138、M3-118标记荧光物质FAM，M3-134、M4-44、M2-64、M4-116、M3-33标记荧光物质HEX。
6.根据权利要求1或2所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(3)中所述8重PCR反应体系如下：
7.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(3)中8重PCR反应程序设定为：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度60℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
8.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(4)中采用ABI 3730XL进行基因型分型，利用Gene mapper v4.0读取个体等位基因大小bp。
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