KR101862008B1 - 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 멀티플렉스 pcr 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트에 관한 것으로, 구체적으로 토마토의 유전체에서 Ty2 및 Ty3 유전자 관련 특이적인 분자표지를 멀티플렉스 PCR을 통해 검출하여 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성을 검정하기 위한 7종의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 이 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트, 그리고 이 프라이머 세트를 이용하여 토마토황화잎말림바이러스 저항성을 검정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 다양한 토마토 품종 및 계통을 대상으로 한번의 멀티플렉스 PCR 반응을 통해 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성 관련 분자표지를 정확하게 검출할 수 있다. 특히 기존의 방법에서 토마토의 품종 및 계통에 따라 예상치 못한 PCR 증폭산물이 생성되어 저항성 검정에 오류를 초래하는 문제를 해소함으로써 보다 다양한 토마토 품종 및 계통을 대상으로 효율적이고 신뢰할 수 있는 저항성 검정이 가능하다. 따라서 본 발명은 새로운 우수 품종의 토마토를 개발하는데 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
본 발명에 따르면 다양한 토마토 품종 및 계통을 대상으로 한번의 멀티플렉스 PCR 반응을 통해 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성 관련 분자표지를 정확하게 검출할 수 있다. 특히 기존의 방법에서 토마토의 품종 및 계통에 따라 예상치 못한 PCR 증폭산물이 생성되어 저항성 검정에 오류를 초래하는 문제를 해소함으로써 보다 다양한 토마토 품종 및 계통을 대상으로 효율적이고 신뢰할 수 있는 저항성 검정이 가능하다. 따라서 본 발명은 새로운 우수 품종의 토마토를 개발하는데 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트에 관한 것으로, 구체적으로 토마토의 유전체에서 Ty2 및 Ty3 유전자 관련 특이적인 분자표지를 멀티플렉스 PCR을 통해 검출하여 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성을 검정하기 위한 7종의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 이 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트, 그리고 이 프라이머 세트를 이용하여 토마토황화잎말림바이러스 저항성을 검정하는 방법에 관한 것이다.
토마토황화잎말림바이러스는 담배가루이라는 해충에 의해 전파되며, 토마토에 감염될 경우 식물체가 오그라들고 생장이 저해되면서 잎의 가장자리가 말리는 현상을 나타낸다. 전염성이 강하고 감염에 따른 피해가 막대하기 때문에 토마토 농가에서는 이 바이러스에 의한 피해가 매우 큰 문제가 되고 있다. 따라서 토마토황화잎말림바이러스의 저항성 품종을 육성하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있으며, 이를 위해 저항성을 검정하기 위한 방법들도 연구개발되고 있다.
지금까지는 주로 담배가루이를 이용하거나 아그로인필트레이션(agroinfiltration) 방법을 이용하여 토마토 식물체에 바이러스 또는 이 바이러스의 유전체를 접종하여 저항성 식물체를 선발하는 방법을 사용해왔으나, 담배가루이를 이용하는 경우는 주변 확산 방지를 위한 시설 및 주의가 필요한 문제점이 있으며, 아그로인필트레이션법은 담배가루이와 같은 문제점은 다소 줄어들지만 기술상 복잡한 과정과 전문성을 필요로 하기 때문에 보편화에 어려움이 있다. 따라서 이러한 문제를 해소하기 위하여 PCR과 같이 분자표지를 이용하여 저항성을 검정하는 방법이 주로 개발되고 있다.
한편 기존에 개발된 분자표지를 이용함에 있어서 품종 및 계통에 따라 PCR 증폭산물의 크기가 다르게 나타나는 현상이 발생하고 있다(도 1 참조). 이러한 현상은 특성 검정에 오류를 초래하게 되고 결과적으로 다양한 품종 및 계통을 대상으로 저항성 개체를 선발하는데 큰 문제가 된다. 아울러 기존의 방법은 유전자별 분자표지를 각각 분석하는 방법이므로 시간, 노력 및 비용이 많이 요구되어 분석에 비효율적인 부분이 있어 왔다.
이에 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 다른 품종 및 계통의 토마토에서도 예상된 정확한 증폭산물을 생성할 수 있고, 한번의 반응으로 여러 분자표지를 동시에 분석할 수 있는 보다 효율적인 방법을 개발하고자 하였다.
Hanson, P.M., S.K. Green, and G. Kuo. 2006. Ty-2, a gene on chromosome 11 conditioning geminivirus resistance in tomato. Tomato Genet. Coop. Rep. 56:17-18.
Ji, Y. and J.W. Scott. 2006b. Ty-3, a begomovirus resistance locus linked to Ty-1 on chromosome 6. Rept. Tomato Genetics Cooperation 56:22-25.
따라서 본 발명의 주된 목적은 다양한 품종 및 계통을 대상으로 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성 관련 분자표지를 정확하고 용이하게 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 토마토황화잎말림바이러스 저항성을 정확하고 용이하게 검정할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 토마토 시료로부터 분리된 뉴클레오티드를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트로 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 다중중합효소연쇄반응으로 수득된 증폭산물을 분석하는 단계;를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정 방법을 제공한다.
본 발명의 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정 방법에 있어서, 상기 다중중합효소연쇄반응은 94 내지 98℃로 30초 내지 3분 개시 변성하는 단계; 94 내지 98℃로 5초 내지 1분간 변성, 58℃로 5 내지 10초간 복원 및 72℃로 15초 내지 1분간 연장하는 과정을 35회 반복하는 단계; 72℃로 1 내지 5분간 최종연장하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면 다양한 토마토 품종 및 계통을 대상으로 한번의 멀티플렉스 PCR 반응을 통해 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성 관련 분자표지를 정확하게 검출할 수 있다. 특히 기존의 방법에서 토마토의 품종 및 계통에 따라 예상치 못한 PCR 증폭산물이 생성되어 저항성 검정에 오류를 초래하는 문제를 해소함으로써 보다 다양한 토마토 품종 및 계통을 대상으로 효율적이고 신뢰할 수 있는 저항성 검정이 가능하다. 따라서 본 발명은 새로운 우수 품종의 토마토를 개발하는데 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
도 1은 기존에 개발되어 사용되고 있는 분자표지를 이용한 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정 PCR 결과이다. M : 100bp ladder size marker, R : 저항성, S : 감수성, H : 헤테로, lane1: 13-TG-84, lane2: 티티찰, lane3: 슈퍼도태랑, lane4: 13-TG-1, lane5: 13-TG-12, lane6: 13-TG-13, lane7: 13-TG-85, lane8: TGC09-25, lane9: TGC09-59, lane10: 13-TG-73, lane11: 난타, lane12: 솔루션, lane13: 썬레드, lane14: 캄파리, lane15: 미니흑수, lane16: 13-TG-91.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정 멀티플렉스 PCR 결과이다. M : 100bp ladder size marker, R : 저항성, S : 감수성, H : 헤테로, lane1: 13-TG-84, lane2: 티티찰, lane3: 슈퍼도태랑, lane4: 13-TG-1, lane5: 13-TG-12, lane6: 13-TG-13, lane7: 13-TG-85, lane8: TGC09-25, lane9: TGC09-59, lane10: 13-TG-73, lane11: 난타, lane12: 솔루션, lane13: 썬레드, lane14: 캄파리, lane15: 미니흑수, lane16: 13-TG-91.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정 멀티플렉스 PCR 결과이다. M : 100bp ladder size marker, R : 저항성, S : 감수성, H : 헤테로, lane1: 13-TG-84, lane2: 티티찰, lane3: 슈퍼도태랑, lane4: 13-TG-1, lane5: 13-TG-12, lane6: 13-TG-13, lane7: 13-TG-85, lane8: TGC09-25, lane9: TGC09-59, lane10: 13-TG-73, lane11: 난타, lane12: 솔루션, lane13: 썬레드, lane14: 캄파리, lane15: 미니흑수, lane16: 13-TG-91.
본 발명의 프라이머 세트에서 상기 각 프라이머는 PCR을 통해 증폭된 증폭산물의 검출을 용이하게 하기 위해 통상적인 표지물질로 표지될 수 있다. 표지물질은 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 크기, 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등을 의미하며, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED가 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명의 조성물에는 상기와 같은 프라이머 세트 이외에도 PCR 반응 또는 PCR 증폭산물 검출에 필요한 시약이 더 포함될 수 있다. 예를 들어 DNA 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자 등이 포함될 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머 세트와 같이 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성을 검정하기 위한 다른 프라이머를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트에는 상기와 같은 프라이머 세트 또는 조성물 이외에도 PCR 반응 또는 PCR 증폭산물 검출에 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다. 시약의 경우 예를 들어, DNA 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자 등이 별도로 포함될 수 있다.
본 발명의 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정 방법에서 다중중합효소연쇄반응은 97 내지 99℃로 20초 내지 1분간 개시-변성하는 단계를 거친 후 97 내지 99℃로 3 내지 10초간 변성(denaturation), 57 내지 59℃로 3 내지 10초간 결합(annealing) 및 71 내지 73℃로 10 내지 30초간 연장(extension)을 30 내지 40회 반복하는 단계를 거치고, 71 내지 73℃로 30초 내지 2분간 최종-연장하는 단계의 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따르면 표적부위의 정확한 증폭이 가능하며 전기영동 이후 EtBr 염색 등의 방법을 통해서도 육안으로 확인할 수 있는 정도의 농도로 증폭이 가능하다.
본 발명의 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 산물은 토마토황화잎말림바이러스 저항성에 따라 서로 다른 DNA 증폭 양상을 나타낸다. 따라서 증폭산물의 생성 여부 및 크기를 통해 저항성을 검정할 수 있으며, 이는 DNA 또는 RNA의 분자량을 측정하거나 서열을 규명하는데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 아가로스 젤에서의 전기영동 및 EtBr 염색 및 자외선 조사에 의한 시각화에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 Ty2 및 Ty3 유전자에서 저항성 및 감수성에 따라 나타나는 서열의 차이를 바탕으로 디자인되었으며, 또한 하나의 PCR 반응에서 동시에 정확한 증폭이 이루어질 수 있도록 디자인되었다.
7종의 프라이머 중 서열번호 1 ~ 3의 프라이머는 Ty2 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머로 2종의 정방향(forward) 프라이머와 1종의 역방향(reverse) 프라이머로 이루어지며, 서열번호 4 ~ 7의 프라이머는 Ty3 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머로 2종의 정방향 프라이머와 2종의 역방향 프라이머로 이루어진다.
Ty2 유전자에 대한 서열번호 1 ~ 3의 프라이머에 의하여 PCR을 통해 600bp 또는 550bp 크기의 증폭산물이 생성될 수 있는데, 600bp 크기의 증폭산물만 생성될 경우 Ty2 관련 저항성 분자표지의 동형접합체(homozygote)인 토마토, 550bp 크기의 증폭산물만 생성될 경우 Ty2 관련 감수성 분자표지의 동형접합체인 토마토로 판단할 수 있다. 또한 600bp 및 550bp 크기의 증폭산물이 모두 생성되는 경우에는 저항성과 감수성 분자표지의 이형접합체인 토마토로 판단할 수 있다.
Ty3 유전자에 대한 서열번호 4 ~ 7의 프라이머에 의해서는 106bp 또는 250bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성될 수 있는데, 106bp 크기의 증폭산물만 생성될 경우 Ty3 관련 저항성 분자표지의 동형접합체인 토마토, 250bp 크기의 증폭산물만 생성될 경우 Ty3 관련 감수성 분자표지의 동형접합체인 토마토로 판단할 수 있다. 또한 106bp 및 250bp 크기의 증폭산물이 모두 생성되는 경우에는 저항성과 감수성 분자표지의 이형접합체인 토마토로 판단할 수 있다.
상기와 같은 분자표지 판단을 통해 Ty2 및 Ty3 관련 저항성 분자표지를 보유할수록 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 우수한 토마토로 판단할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
비교예 1.
기존에 개발되어 사용되고 있는 Ty2 및 Ty3 각각에 대한 프라이머를 사용하고, 주형 DNA는 토마토 육성계통인 13-TG-84, 13-TG-1, 13-TG-12, 13-TG-13, 13-TG-85, TGC09-25, TGC09-59, 13-TG-73, 13-TG-91와 시판품종인 티티찰, 슈퍼도태랑, 난타, 솔루션, 썬레드, 캄파리, 미니흑수에서 추출하여 PCR을 수행하였다.
이때 사용된 Ty2에 대한 프라이머와 Ty3에 대한 프라이머는 표 1과 같다.
| 프라이머명 | 프라이머 염기서열(5-3) | 서열번호 | |
| Ty2 | TG0302-F | TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC | 8 |
| TG0302-R | AGTGTACATCCTTGCCATTGACT | 9 | |
| Ty3 | P6-25-F2 | GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC | 10 |
| P6-25-R2 | GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC | 11 |
이의 결과 도 1과 같이 특정 품종의 경우 저항성 또는 감수성으로 판별할 수 없는 예상하지 못한 크기의 PCR산물이 나타났다(도 1의 화살표 참조).
실시예 1.
표 2와 같은 7종의 프라이머를 제작하였다.
| 프라이머명 | 프라이머 염기서열(5'-3') | 서열번호 |
| MTY2R264F | GTAGATCCGACCCAAAGATT | 1 |
| TY2S349F | CGGGAGAATAAAGTTAAGAAG | 2 |
| TY2RS3914R | TGCTACAGAACACCAAGCAGAT | 3 |
| Ty3R250F | CGAGGACACGACTATAGC | 4 |
| Ty3R356R | AGTAAATTGAAGCAATGTGCA | 5 |
| Ty3S76F | AGATAAAGTGGAAGTTACTTTTCGA | 6 |
| TY3RS454R | TGCTCTGCCTATTGTCCCA | 7 |
상기 각 프라이머는 표 3과 같이 조합되어 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성 또는 감수성에 따라 다른 크기의 증폭산물이 나타나도록 디자인되었다. 즉 Ty2 유전자 연관 표지의 증폭산물 크기는 저항성인 경우 600bp, 감수성인 경우 550bp이며, Ty3 유전자 연관 표지의 증폭산물 크기는 저항성인 경우 106bp, 감수성인 경우 250bp가 되도록 디자인되었다.
| 정방향 프라이머 | 역방향 프라이머 | 증폭산물크기(bp) |
| MTY2R264F | TY2RS3914R | R: 600 S: 550 H: 600, 550 |
| TY2S349F | ||
| Ty3R250F | Ty3R356R | R: 106 S: 250 H: 250, 106 |
| Ty3S76F | TY3RS454R |
* R : 저항성, S : 감수성, H : 이형접합체
상기 표 2의 프라이머를 이용하여 다음 표 4에 따라 PCR 반응액을 만들고, 표 5의 조건에 따라 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.
이때 주형 DNA로는 토마토 육성계통인 13-TG-84, 13-TG-1, 13-TG-12, 13-TG-13, 13-TG-85, TGC09-25, TGC09-59, 13-TG-73, 13-TG-91와 시판품종인 티티찰, 슈퍼도태랑, 난타, 솔루션, 썬레드, 캄파리, 미니흑수에서 추출하여 사용하였다.
| 주형 DNA | 40ng |
| 10× PCR 반응 완충액 | 1× |
| MgCl2 | 1.5mM |
| dNTPs | 200uM |
| 프라이머 7종 | 각 0.4uM |
| Taq 중합효소 | 0.5U |
| 멸균 3차 증류수 | 전체 부피를 20㎕에 맞춤 |
| pre-denaturation | 98℃ 30초 | |
| 35 사이클 | denaturation | 98℃ 5초 |
| annealing | 58℃ 5초 | |
| extension | 72℃ 15초 | |
| final extension | 72℃ 1분 | |
이의 결과 도 2에서와 같이, Ty2 및 Ty3에서 저항성 또는 감수성 관련 분자표지를 명확하게 구분하여 검출할 수 있었으며, 저항성 또는 감수성인 경우에서 각 증폭산물이 품종들 간에 예상된 일정한 크기로 나타났다. 특히 기존의 방법에서는 예상되지 않은 크기의 증폭산물이 나타난 품종의 경우에도 본 발명의 프라이머 세트를 사용하면 예상된 정확한 크기의 증폭산물을 생성하는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명의 프라이머 세트를 사용하면 오류없이 저항성 검정을 용이하게 수행할 수 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Muliplex PCR primer set for detecting resistance against tomato
yellow leaf curl virus
<130> PA-D16135
<160> 11
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Ty2 resistibility, MTY2R264F
<400> 1
gtagatccga cccaaagatt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Ty2 sensitivity, TY2S349F
<400> 2
cgggagaata aagttaagaa g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Ty2, TY2RS3914R
<400> 3
tgctacagaa caccaagcag at 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Ty3 resistibility, Ty3R250F
<400> 4
cgaggacacg actatagc 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Ty3 resistibility, Ty3R356R
<400> 5
agtaaattga agcaatgtgc a 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Ty3 sensitivity, Ty3S76F
<400> 6
agataaagtg gaagttactt ttcga 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Ty3, TY3RS454R
<400> 7
tgctctgcct attgtccca 19
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Ty2, TG0302-F
<400> 8
tggctcatcc tgaagctgat agcgc 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Ty2, TG0302-R
<400> 9
agtgtacatc cttgccattg act 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Ty3, P6-25-F2
<400> 10
ggtagtggaa atgatgctgc tc 22
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Ty3, P6-25-R2
<400> 11
gctctgccta ttgtcccata tataacc 27
Claims (5)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 프라이머 세트.
- 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 조성물.
- 제 1항의 프라이머 세트 또는 제 2항의 조성물을 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 키트.
- 토마토 시료로부터 분리된 뉴클레오티드를 주형으로 하고, 제 1항의 프라이머 세트로 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 다중중합효소연쇄반응으로 수득된 증폭산물을 분석하는 단계;를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정 방법. - 제 4항에 있어서,
상기 다중중합효소연쇄반응은
94 내지 98℃로 30초 내지 3분 개시 변성하는 단계;
94 내지 98℃로 5초 내지 1분간 변성, 58℃로 5초 내지 10초간 복원 및 72℃로 15초 내지 1분간 연장하는 과정을 35회 반복하는 단계;
72℃로 1 내지 5분간 최종연장하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160128282A KR101862008B1 (ko) | 2016-10-05 | 2016-10-05 | 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 멀티플렉스 pcr 프라이머 세트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160128282A KR101862008B1 (ko) | 2016-10-05 | 2016-10-05 | 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 멀티플렉스 pcr 프라이머 세트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180037731A KR20180037731A (ko) | 2018-04-13 |
| KR101862008B1 true KR101862008B1 (ko) | 2018-05-31 |
Family
ID=61974143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160128282A KR101862008B1 (ko) | 2016-10-05 | 2016-10-05 | 토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 멀티플렉스 pcr 프라이머 세트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101862008B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102298723B1 (ko) * | 2018-11-16 | 2021-09-06 | 세종대학교산학협력단 | 토마토 황화잎말림 바이러스 저항성 판별용 마커 및 이를 이용한 판별 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012125025A1 (en) | 2011-03-11 | 2012-09-20 | Wageningen Universiteit | Tyclv resistance |
-
2016
- 2016-10-05 KR KR1020160128282A patent/KR101862008B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012125025A1 (en) | 2011-03-11 | 2012-09-20 | Wageningen Universiteit | Tyclv resistance |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Yuanfu Ji et al., Mol. Breeding, DOI 10.1007/s11032-9089-7, 2007. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180037731A (ko) | 2018-04-13 |
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