CN113943824A - 一种检测多粘菌素耐药基因的数字pcr引物探针组合物及其应用 - Google Patents

一种检测多粘菌素耐药基因的数字pcr引物探针组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其应用。所述数字PCR引物探针组合物包括分别检测MCR‑1基因、MCR‑2基因、MCR‑3基因、MCR‑4基因和MCR‑5基因的引物对和探针。所述数字PCR引物探针组合物具备高灵敏度和特异性，能够有效应用于数字PCR中，对MCR家族基因进行快速、灵敏、准确检测，利用所述数字PCR引物探针组合物制备的数字PCR试剂盒可以对样本是否含有MCR家族基因以及具体的基因种类进行快速准确的检测，并且可以对基因的拷贝数进行检测，实现了基因的绝对定量；无需建立标准曲线，实验的重复性、平行性及灵敏性均较好。

Description

一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其 应用
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，涉及一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其应用。
背景技术
兽用抗菌药物在防治动物疾病、提高养殖效益、保障畜禽水产品有效供给中发挥了重要作用，然而目前兽用抗菌药物市场秩序不规范、养殖环节使用不合理、科学安全用药意识不强等问题较为突出，动物源细菌耐药性风险评估和防控体系薄弱，致使多重耐药菌甚至超级耐药菌出现，细菌耐药形势严峻。细菌耐药率上升，致使兽用抗菌药物疗效降低，迫使养殖用药增加，从而造成兽用抗菌药物毒副作用加剧、兽药残留超标风险提高，威胁了畜禽水产品食品安全和公共卫生安全。开展细菌抗生素耐药性(AntimicrobialResistance，AMR)检测技术研究，综合治理兽用抗菌药物，遏制细菌耐药性，是推动养殖业供给侧结构性改革，保障畜禽水产品质量安全的关键环节。
多粘菌素(polymyxin/colistin)被认为是防治产β-内酰胺酶革兰阴性菌(如鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌以及肺炎克雷伯菌等)感染的“最后一道防线”，常被用作动物饲料的添加剂。但是目前已有多种细菌产生了对多粘菌素的耐药性，并且这种耐药性还在肉用动物和人类中同时存在，2015年中国科学家首次报道了从动物源大肠埃希菌中分离到质粒介导的多粘菌素抗性基因MCR-1，随后，陆续有多种多粘菌素抗性基因(MCR基因)被报道(包括MCR-2、MCR-3、MCR-4、MCR-5、MCR-6、MCR-7、MCR-8、MCR-9以及MCR-10等)。
针对细菌多粘菌素耐药性检测，目前仍主要依赖于表型检测(细菌敏感性实验)或常规PCR检测等方法。
CN108504723A公开了一种用于检测细菌MCR-1基因的引物组合物及应用，包括以下引物：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB，该引物组合物用于检测大肠杆菌的MCR-1耐药基因，可用于检测样本中是否含有细菌MCR-1耐药基因，有利于临床对细菌MCR-1耐药基因的检测监控，但其检测灵敏度及精密度较低，且检测需建立工作曲线，分析结果过程复杂，难度高。
CN108384851A公开了一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物，由五个引物对组成，通过在MCR-1、MCR-2、MCR-3、MCR-4、MCR-5的基因序列基础上进行引物设计，利用不同PCR产物的大小对相应的耐药基因加以区分，并对反应体系及条件加以优化，能够对多粘菌素耐药基因进行有效检测，但其通过观察凝胶电泳条带进行结果鉴定，耗时长，且准确度、特异性及灵敏度均难以满足目前进行快速、灵敏及准确检测的需求。
综上所述，建立一种针对MCR基因的快速灵敏且准确的检测方法，对于AMR检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其应用，所述引物探针组合物具备高特异性和灵敏度，利用所述引物探针组合物配合数字PCR检测方法，并控制引物探针的浓度以及退火温度，实现了MCR家族基因的快速、灵敏、准确检测，可应用于多粘菌素AMR的监测和防控。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物，所述数字PCR引物探针组合物包括分别检测MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因的引物对和探针。
其中，所述MCR-1基因的引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，所述MCR-1基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述MCR-2基因的引物对包括SEQ IDNo.4～5所示的核苷酸序列，所述MCR-2基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，所述MCR-3基因的引物对包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，所述MCR-3基因的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，所述MCR-4基因的引物对包括SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列，所述MCR-4基因的探针包括SEQ ID No.12所示的核苷酸序列，所述MCR-5基因的引物对包括SEQ ID No.13～14所示的核苷酸序列，所述MCR-5基因的探针包括SEQ IDNo.15所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：CGATGGCGTGACCAATTTTA。
SEQ ID No.2：CAGAATACGCCGTCGATGTG。
SEQ ID No.3：CAATGTCACATCGTGCG。
SEQ ID No.4：ATGCTACACCAAATGGGCAATC。
SEQ ID No.5：GCAAATTGCTCATCATAACGCTTA。
SEQ ID No.6：TGGGCCGGCGTACT。
SEQ ID No.7：TGGTTGGCTTCCACCTGATAG。
SEQ ID No.8：GCATCAGGGTAGCGCTTGTAG。
SEQ ID No.9：TAGCCATGGCCCAACC。
SEQ ID No.10：AGACGCCCATGGAATACCAA。
SEQ ID No.11：CGGGTTACGACTGGCATTCT。
SEQ ID No.12：AACTTGGCCTAGATGCG。
SEQ ID No.13：AATCACGGCCCAGCGTATT。
SEQ ID No.14：CGACCAGCGTCGGTAGCT。
SEQ ID No.15：CAGCGCTATCCCGC。
本发明中，对MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因的序列进行深入分析，分别针对特定区域设计引物对及探针，使得所述数字PCR引物探针组合物具备高灵敏度和特异性，能够有效应用于数字PCR中，对MCR家族基因进行快速、灵敏、准确检测。
优选地，所述探针含有荧光基团和淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM或HEX。
优选地，所述淬灭基团包括MGB或BHQ1。
第二方面，本发明提供一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒，所述数字PCR试剂盒包括第一方面所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物。
优选地，所述数字PCR试剂盒还包括预混液和质控品。
优选地，所述预混液包括缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
优选地，所述质控品包括阳性质控品，所述阳性质控品的终浓度为(1～5)×104拷贝数/μL，包括但不限于2×104拷贝数/μL、3×104拷贝数/μL或4×104拷贝数/μL。
优选地，所述数字PCR试剂盒还包括水。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒的制备方法，所述制备方法包括：
设计、合成引物对和探针，构建阳性质控品，再放入预混液，得到所述检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒。
优选地，所述阳性质控品的构建方法包括：
人工合成MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因，分别连接到克隆载体上，得到重组质粒，再对所得重组质粒进行序列验证、均匀性检验、稳定性监测及数字PCR定值，得到所述阳性质控品。
作为优选的技术方案，所述检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒的制备方法方法包括：
(1)合成引物对和探针；
(2)构建阳性质控品：
人工合成MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因，分别连接到克隆载体上，得到重组质粒，再对所得重组质粒进行序列验证、均匀性检验、稳定性监测及数字PCR定值，得到所述阳性质控品；
(3)放入预混液；
(4)对精密度和检出限进行检测，得到所述检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒。
第四方面，本发明提供一种检测多粘菌素耐药基因的方法，所述检测多粘菌素耐药基因的方法包括：
提取样本核酸，使用第一方面所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物和/或第二方面所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒，进行数字PCR检测，得到结果。
本发明的检测多粘菌素耐药基因的方法可用于检测环境样本中细菌的多粘菌素耐药基因表型。
优选地，所述数字PCR检测的反应体系中所述引物对的终浓度为(180～420)nM，包括但不限于180nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM或420nM，所述探针的终浓度为(80～220)nM，包括但不限于80nM、90nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、160nM、170nM、180nM、190nM、200nM、210nM或220nM。
优选地，所述MCR-1基因的引物对的终浓度为(180～220)nM，包括但不限于180nM、190nM、200nM、210nM或220nM，优选为200nM，所述MCR-1基因的探针的终浓度为(80～120)nM，包括但不限于80nM、90nM、100nM、110nM或120nM，优选为100nM。
优选地，所述MCR-2基因的引物对的终浓度为(180～220)nM，例如可以是180nM、190nM、200nM、210nM或220nM，优选为200nM，所述MCR-2基因的探针的终浓度为(180～220)nM，例如可以是180nM、190nM、200nM、210nM或220nM，优选为200nM。
优选地，所述MCR-3基因的引物对的终浓度为(380～420)nM，例如可以是380nM、390nM、400nM、410nM或420nM，优选为400nM，所述MCR-3基因的探针的终浓度为(80～120)nM，例如可以是80nM、90nM、100nM、110nM或120nM，优选为100nM。
优选地，所述MCR-4基因的引物对的终浓度为(380～420)nM，例如可以是380nM、390nM、400nM、410nM或420nM，优选为400nM，所述MCR-4基因的探针的终浓度为(80～120)nM，例如可以是80nM、90nM、100nM、110nM或120nM，优选为100nM。
优选地，所述MCR-5基因的引物对的终浓度为(380～420)nM，例如可以是380nM、390nM、400nM、410nM或420nM，优选为400nM，所述MCR-5基因的探针的终浓度为(180～220)nM，例如可以是180nM、190nM、200nM、210nM或220nM，优选为200nM。
本发明中，通过控制引物和探针的浓度，能够进一步改善数字PCR的扩增结果的阴阳性信号区分情况、定值结果以及结果重复性，使得数字PCR的阴阳性信号区分好、扩增结果高、重复性好。
优选地，所述MCR-1基因的数字PCR检测反应体系如表1所示。
表1
Figure BDA0003316604300000031
Figure BDA0003316604300000041
优选地，所述MCR-2基因的数字PCR检测反应体系如表2所示。
表2
组分 体积(μL) 终浓度
2×数字PCR酶预混液 10 1×
引物SEQ ID No.4(10μM) 0.4 200nM
引物SEQ ID No.5(10μM) 0.4 200nM
探针SEQ ID No.6(10μM) 0.4 200nM
提取DNA/质控品 5 /
超纯水 3.8 /
优选地，所述MCR-3基因或MCR-4的数字PCR检测反应体系如表3所示。
表3
组分 体积(μL) 终浓度
2×数字PCR酶预混液 10 1×
引物SEQ ID No.7/SEQ ID No.10(10μM) 0.8 400nM
引物SEQ ID No.8/SEQ ID No.11(10μM) 0.8 400nM
探针SEQ ID No.9/SEQ ID No.12(10μM) 0.2 100nM
提取DNA/质控品 5 /
超纯水 3.2 /
优选地，所述MCR-5基因的数字PCR检测反应体系如表4所示。
表4
组分 体积(μL) 终浓度
2×数字PCR酶预混液 10 1×
引物SEQ ID No.13(10μM) 0.8 400nM
引物SEQ ID No.14(10μM) 0.8 400nM
探针SEQ ID No.15(10μM) 0.4 200nM
提取DNA/质控品 5 /
超纯水 3.0 /
优选地，所述数字PCR检测的扩增程序包括：
预变性：
(93～98)℃，(4～6)min，温度例如可以是93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃等，时间例如可以是4min、4.5min、5min、5.5min或6min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
退火延伸：
(93～98)℃，(20～40)s，温度例如可以是93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃等，时间例如可以是20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
(52～60)℃，50～70s，温度例如可以是52℃、52.5℃、53℃、53.5℃、55.1℃、56.9℃、58.4℃、59.4℃或60℃等，优选为52.5℃，时间例如可以是50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、60s、61s、62s、63s、64s、65s、66s、67s、68s、69s或70s等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
循环(35～40)次，例如可以是35次、36次、37次、38次、39次或40次；
酶失活：
(95～100)℃，(8～12)min，温度例如可以是95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃等，时间例如可以是8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
所述扩增的过程中，升降温速率为(1～3)℃/s，例如可以是1℃/s、1.1℃/s、1.2℃/s、1.3℃/s、1.4℃/s、1.5℃/s、1.6℃/s、1.7℃/s、1.8℃/s、1.9℃/s、2℃/s、2.1℃/s、2.2℃/s、2.3℃/s、2.4℃/s、2.5℃/s、2.6℃/s、2.7℃/s、2.8℃/s、2.9℃/s或3℃/s等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述数字PCR检测的扩增程序如表5所示。
表5
Figure BDA0003316604300000051
本发明中，通过控制数字PCR的退火温度为(52～53)℃，与特定浓度引物探针组合物相配合，能够进一步改善数字PCR的阴阳性信号区分情况、定值结果以及结果重复性，使得数字PCR的阴阳性信号区分好、扩增结果高、重复性好。
第五方面，本发明提供第一方面所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物、第二方面所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒或第四方面所述的检测多粘菌素耐药基因的方法中的任意一种或至少两种的组合在细菌多粘菌素耐药基因检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中，对MCR基因的序列进行深入分析，分别针对特定区域设计引物对及探针，使得所述数字PCR引物探针组合物具备高灵敏度和特异性，能够有效应用于数字PCR中，对MCR家族基因进行快速、灵敏、准确检测；
(2)本发明中，通过控制引物和探针的浓度，能够进一步改善数字PCR的扩增结果的阴阳性信号区分情况、定值结果以及结果重复性，使得数字PCR的阴阳性信号区分好、扩增结果高、重复性好；
(3)本发明中，通过控制数字PCR的退火温度为(52～53)℃，与特定浓度引物探针组合物相配合，能够进一步改善数字PCR的阴阳性信号区分情况、定值结果以及结果重复性，使得数字PCR的阴阳性信号区分好、扩增结果高、重复性好；
(4)本发发明中，所述检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒可以对样本是否含有MCR家族基因以及具体的基因种类进行快速准确的检测，并且可以对基因的拷贝数进行检测，实现了基因的绝对定量；无需建立标准曲线，实验的重复性、平行性及灵敏性均较好，扩增反应的RSD值均不高于3.79％，检出限均不高于70.7copies/反应，且操作简便，耗时较短，成本较低；通过设置阳性质控品，可以对扩增反应的进程进行监控，降低假阳性结果的出现概率，结果更加准确。
附图说明
图1为MCR-1基因在不同退火温度下的数字PCR扩增图；
图2为MCR-2基因在不同退火温度下的数字PCR扩增图；
图3为MCR-3基因在不同退火温度下的数字PCR扩增图；
图4为MCR-4基因在不同退火温度下的数字PCR扩增图；
图5为MCR-5基因在不同退火温度下的数字PCR扩增图；
图6为MCR-1基因在退火温度52.5℃下的数字PCR信号直方图；
图7为MCR-2基因在退火温度52.5℃下的数字PCR信号直方图；
图8为MCR-3基因在退火温度52.5℃下的数字PCR信号直方图；
图9为MCR-4基因在退火温度52.5℃下的数字PCR信号直方图；
图10为MCR-5基因在退火温度52.5℃下的数字PCR信号直方图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物，所述数字PCR引物探针组合物包括分别扩增并检测MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因的引物对和探针。
所述探针含有荧光基团和淬灭基团，所述探针的荧光基团均为FAM，淬灭基团均为BHQ1。
对表6中相关MCR基因的序列进行深入分析，并创造性设计引物对和探针，所述引物对、探针的编号以及序列、扩增产物的大小如表7所示。
表6
Figure BDA0003316604300000061
表7
Figure BDA0003316604300000062
Figure BDA0003316604300000071
所述数字PCR引物探针组合物具有良好的灵敏度与特异性，可以对样本中是否含有MCR家族基因以及基因的拷贝数进行定量检测，结果准确。
实施例2
本实施检测实施例1中所述数字PCR引物探针组合物的灵敏度。
将实施例1中的所述数字PCR引物探针组合物与针对相同MCR基因所设计的其他引物探针组合物(序列见表8)以相同浓度的DNA为模板同时进行实时荧光PCR扩增，扩增反应体系及程序与各基因数字PCR反应体系与程序相同，扩增Ct值结果如表9所示。
表8
Figure BDA0003316604300000072
Figure BDA0003316604300000081
表9
Figure BDA0003316604300000082
Figure BDA0003316604300000091
由表9可知及扩增结果可知，比较扩增曲线的Ct值，实施例1中的所述数字PCR引物探针组合物的扩增曲线起峰更早、扩增Ct值更低，表明实施例1中的所述数字PCR引物探针组合物具有更高的灵敏度。
实施例3
本实施例提供一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒，所述试剂盒包括实施例1中的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合、2×数字PCR酶预混液(Bio-Rad公司)、阳性质控品和水。
所述试剂盒通过如下方法进行制备：
(1)合成实施例1所述引物对和探针；
(2)构建阳性质控品：
人工合成MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因，分别连接到pUC19载体(购买自宝生物工程公司)上，得到重组质粒，再对所得重组质粒进行序列验证、均匀性检验、稳定性监测，得到所述阳性质控品，所述质控品的具体信息如表10所示。
表10
Figure BDA0003316604300000092
对插入序列进行测序，确认序列的正确率为100％，将质控品稀释至浓度为104copies/μL，分装为50μL/管，置于-80℃保存；
(3)放入数字PCR酶预混液。
实施例4
本实施例以实施例3中制备的阳性质控品作为模板，利用实施例3制备的试剂盒分别对MCR-1～MCR-5基因进行数字PCR检测，数字PCR技术为将实时荧光定量PCR体系等量均分到相互隔离的大数量(大于10000个)微小的反应单元(芯片微孔或者微滴液珠)，经过PCR扩增反应，反应单元相应的表现为有荧光(阳性)或无荧光(阴性)，通过统计微反应单元的阳性率和泊松分布概率函数计算出核酸模板的拷贝数。
MCR-1基因数字PCR检测反应体系如表11所示。
表11
组分 体积(μL) 终浓度
2×数字PCR酶预混液 10 1×
上游引物(10μM) 0.2 100nM
下游引物(10μM) 0.2 100nM
探针(10μM) 0.2 100nM
阳性质控品 5 /
超纯水 补至20μL /
其余基因数字PCR检测反应体系按表11配比配制，同时针对每个基因分别额外配制不同引物终浓度(200nM、400nM)和探针终浓度(200nM、400nM)的反应体系，每组实验进行3次技术重复，具体如表13所示。
数字PCR扩增程序如表12所示。
表12
Figure BDA0003316604300000101
表13
Figure BDA0003316604300000102
由表13可知，引物和探针的浓度能够影响数字PCR检测的阴阳性信号区分情况、定值结果以及结果重复性，而本发明针对MCR基因及其特异的引物探针组合物，发现通过控制引物和探针的终浓度，能够进一步改善数字PCR的扩增结果的阴阳性信号区分情况、定值结果以及结果重复性，对于MCR-1，控制引物的终浓度为200nM，探针浓度为100nM；对于MCR-2，控制引物的终浓度为200nM，探针浓度为200nM；对于MCR-3，控制引物的终浓度为400nM，探针浓度为100nM；对于MCR-4，控制引物的终浓度为400nM，探针浓度为100nM；对于MCR-5，控制引物的终浓度为400nM，探针浓度为200nM，使得数字PCR的阴阳性信号区分好、扩增结果高、重复性好。
实施例5
本实施例以实施例3中制备的阳性质控品作为模板，利用实施例3制备的试剂盒分别对MCR-1～MCR-5基因进行数字PCR检测。
数字PCR检测反应体系如表11所示。
数字PCR扩增程序如表12所示，同时针对每个基因分别以不同的退火温度(52℃、52.5、53.5℃、55.1℃、56.9℃、58.4℃、59.4℃或60℃)进行数字PCR检测，每组实验进行3次技术重复，具体结果如表14所示，扩增图如图1～图5所示，图6～图10分别为MCR-1～MCR-5基因数字PCR信号直方图(退火温度为52.5℃)。
表14
Figure BDA0003316604300000111
Figure BDA0003316604300000121
由图1～图10及表14可知，退火温度能够影响数字PCR检测的阴阳性信号区分情况、定值结果以及结果重复性，如图1～图5所示，随着退火温度的变化，数字PCR检测的阴阳性信号区分情况发生改变，在退火温度为52.5℃时，阴阳性信号区分情况较好，满足数字PCR结果读数的要求；如图6～图10所示，PCR的扩增结果的阴、阳性信号间隔较宽，区分明显，即本发明发现通过控制退火温度为52.5℃，能够进一步改善数字PCR的扩增结果的阴阳性信号区分情况、定值结果以及结果重复性。
实施例6
本实施例使用实施例3制备的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒，对实施例3未经稀释的阳性质控品质粒的拷贝数进行检测。
按表11配制数字PCR反应体系，但针对不同阳性质控品质控品需控制不同的引物探针浓度，对于pMCR-1，控制引物的终浓度为200nM，探针浓度为100nM；对于pMCR-2，控制引物的终浓度为200nM，探针浓度为200nM；对于pMCR-3，控制引物的终浓度为400nM，探针浓度为100nM；对于pMCR-4，控制引物的终浓度为400nM，探针浓度为100nM；对于pMCR-5，控制引物的终浓度为400nM，探针浓度为200nM，数字PCR扩增程序如表12所示，每个阳性质控品检测8次，取8次检测的平均值作为质控品的标准值，检测结果如表15所示。
表15
Figure BDA0003316604300000122
由表15可知，本发明通过控制反应体系中引物探针的终浓度以及扩增反应中的退火温度，扩增反应的扩增效率及特异性更好，可以对质控品进行定量检测，结果准确，应用价值更高。
实施例7
本实施例对实施例3制备的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒的精密度及检测限进行评价。
精密度评价
以实施例3中的质控品作为模板，进行数字PCR扩增，每个质粒样品扩增8次，计算检测结果的RSD，作为精密度的评价标准。
扩增反应的体系及程序与实施例6中的相同，检测结果如表16所示。
表16
Figure BDA0003316604300000131
由表16可以看出，5组引物探针组合物的RSD值均不高于3.79％，证明扩增反应具有良好的特异性与平行性。试剂盒具有良好的精密度，实验的重复性更好，检测结果更加精准。
检出限评价
对实施例3中的质控品进行稀释，稀释至终浓度依次为20copies/μL、10copies/μL、2copies/μL和1copies/μL。以稀释后的质控品作为模板，进行数字PCR扩增，每个质粒样品扩增3次。观察数字PCR结果，将能稳定扩增的浓度作为每个方法的检测限(单位：copies/反应)。
扩增反应的体系及程序与实施例6中的相同，检测结果如表17所示。
表17
Figure BDA0003316604300000132
Figure BDA0003316604300000141
由表17可以看出，5组引物探针组合物的检出限均不高于70.7copies/反应，表明试剂盒具有良好的灵敏度，模板含量极少的样本也可以进行准确检测，具有实际应用的价值。
实施例8
本实施例基于对数字PCR反应体系及程序的深入研究，利用本发明的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒，制订多粘菌素耐药基因数字PCR法定量筛查方案，包括引物探针、PCR扩增程序以及配套的质粒DNA质控品，用于对微生物中及环境中潜在的5种MCR耐药基因进行定量筛查，并以检测10株表型为多粘菌素耐药的细菌株、一株质控大肠杆菌和三份环境样品(如表21所示，上述菌株及环境样品均由上海疾病预防控制中心提供)为例进行举例证明。
分别提取大肠杆菌B1、大肠杆菌B2、大肠杆菌B3、大肠杆菌B4、大肠杆菌B5、大肠杆菌B6、大肠杆菌B7、大肠杆菌B8、大肠杆菌B9大肠杆菌B10和质控大肠杆菌MCR-1的基因组DNA并置于-20℃保存，待检测；分别对环境样品7.7牛粪抽提D5、7.7牛粪抽提D6和7.7牛粪抽提G6进行样品预处理，提取总DNA，并置于-20℃保存，待检测。
检测MCR-1基因表型的样品的数字PCR检测反应体系如表18所示。
表18
组分 体积(μL) 终浓度
2×数字PCR酶预混液 10 1×
引物SEQ ID No.1(10μM) 0.4 200nM
引物SEQ ID No.2(10μM) 0.4 200nM
探针SEQ ID No.3(10μM) 0.2 100nM
待测基因组 5 /
超纯水 4 /
检测MCR-3或MCR-4基因表型的样品的数字PCR检测反应体系如表19所示。
表19
组分 体积(μL) 终浓度
2×数字PCR酶预混液 10 1×
引物SEQ ID No.7/SEQ ID No.10(10μM) 0.8 400nM
引物SEQ ID No.8/SEQ ID No.11(10μM) 0.8 400nM
探针SEQ ID No.9/SEQ ID No.12(10μM) 0.2 100nM
待测基因组 5 /
超纯水 3.2 /
数字PCR的扩增程序如表20所示。
表20
Figure BDA0003316604300000142
检测结果如表21所示。
表21
Figure BDA0003316604300000143
Figure BDA0003316604300000151
由表21可知，能有效定量检测出样品中相关MCR基因的拷贝数，表明本发明设计的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物以及建立的检测方案能够有效应用于微生物中及环境中潜在的MCR耐药基因的定量筛查。
综上所述，本发明所述检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物具有良好的特异性与灵敏度，通过控制引物、探针的浓度以及退火温度，进一步提高了扩增反应的扩增效率及特异性；所述检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒可以对样本是否含有MCR家族基因以及具体的基因种类进行快速准确的检测，并且对基因的拷贝数进行定量检测，精密度好，检测限低，用时短，操作简便，检测成本低，可应用于细菌多粘菌素耐药性的实际检测中。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市计量测试技术研究院
<120> 一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其应用
<130> 20211018
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgatggcgtg accaatttta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagaatacgc cgtcgatgtg 20
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caatgtcaca tcgtgcg 17
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgctacacc aaatgggcaa tc 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcaaattgct catcataacg ctta 24
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgggccggcg tact 14
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tggttggctt ccacctgata g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcatcagggt agcgcttgta g 21
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tagccatggc ccaacc 16
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agacgcccat ggaataccaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgggttacga ctggcattct 20
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aacttggcct agatgcg 17
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aatcacggcc cagcgtatt 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgaccagcgt cggtagct 18
<210> 15
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagcgctatc ccgc 14
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgccatctgc aacaccaa 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gccaacgagc ataccgacat 20
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccttataacg aatgccg 17
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcgccaaaag catcgattg 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
catagagcat ggcgacatcg t 21
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctaaaaacgc atgaagcg 18
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ttgtccttca agacctcgat agtg 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggtggaagcc aaccagctta 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aattgctcaa atgaaaggg 19
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgcgaaaagg aattgaaaaa ca 22
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gcggcataga tgcgatgaa 19
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccagaagttg atccc 15
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
agttgcggga cggatacg 18
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gccgaccatt gagggaaaa 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ctacatccct tccctgcat 19

Claims (10)

1.一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物，其特征在于，所述数字PCR引物探针组合物包括分别检测MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因的引物对和探针；
其中，所述MCR-1基因的引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，所述MCR-1基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
所述MCR-2基因的引物对包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，所述MCR-2基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
所述MCR-3基因的引物对包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，所述MCR-3基因的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
所述MCR-4基因的引物对包括SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列，所述MCR-4基因的探针包括SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；
所述MCR-5基因的引物对包括SEQ ID No.13～14所示的核苷酸序列，所述MCR-5基因的探针包括SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的数字PCR引物探针组合物，其特征在于，所述探针含有荧光基团和淬灭基团；
优选地，所述荧光基团包括FAM或HEX；
优选地，所述淬灭基团包括MGB或BHQ1。
3.一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒包括权利要求1或2所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物。
4.根据权利要求3所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒还包括预混液和质控品；
优选地，所述预混液包括缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs；
优选地，所述质控品包括阳性质控品，所述阳性质控品的终浓度为(1～5)×104拷贝数/μL；
优选地，所述数字PCR试剂盒还包括水。
5.一种权利要求3或4所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
合成引物对和探针，构建阳性质控品，再放入预混液，得到所述检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述阳性质控品的构建方法包括：
人工合成MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因，分别连接到克隆载体上，得到重组质粒，再对所得重组质粒进行检测，得到所述阳性质控品。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)合成引物对和探针；
(2)构建阳性质控品：
人工合成MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因，分别连接到克隆载体上，得到重组质粒，再对所得重组质粒进行检测，得到所述阳性质控品；
(3)放入预混液；
(4)对精密度和检出限进行检测，得到所述检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒。
8.一种检测多粘菌素耐药基因的方法，其特征在于，所述检测多粘菌素耐药基因的方法包括：
提取样本核酸，使用权利要求1或2所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物和/或权利要求3或4所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒，进行数字PCR检测，得到结果；
其中，所述引物对的终浓度为(180～420)nM，所述探针的终浓度为(80～220)nM；
优选地，所述MCR-1基因的引物对的终浓度为(180～220)nM，所述MCR-1基因的探针的终浓度为(80～120)nM；
优选地，所述MCR-2基因的引物对的终浓度为(180～220)nM，所述MCR-2基因的探针的终浓度为(180～220)nM；
优选地，所述MCR-3基因的引物对的终浓度为(380～420)nM，所述MCR-3基因的探针的终浓度为(80～120)nM；
优选地，所述MCR-4基因的引物对的终浓度为(380～420)nM，所述MCR-4基因的探针的终浓度为(80～120)nM；
优选地，所述MCR-5基因的引物对的终浓度为(380～420)nM，所述MCR-5基因的探针的终浓度为(180～220)nM。
9.根据权利要求8所述的检测多粘菌素耐药基因的方法，其特征在于，所述数字PCR检测的扩增程序包括：
预变性：(93～98)℃，(4～6)min；
退火延伸：(93～98)℃，(20～40)s；(52～60)℃，(50～70)s；循环(35～40)次；
酶失活：(95～100)℃，(8～12)min；
所述扩增的过程中，升降温速率为(1～3)℃/s。
10.权利要求1或2所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物、权利要求3或4所述的检测多粘菌素耐药基因的数字PCR试剂盒或权利要求8或9所述的检测多粘菌素耐药基因的方法中的任意一种或至少两种的组合在细菌多粘菌素耐药基因检测中的应用。
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