CN112458191A - 一种用于鉴别mcr基因分型的试剂盒、鉴别方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别MCR基因分型的试剂盒、鉴别方法及其应用。所述试剂盒包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对及SEQ ID No:3所示探针、SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的引物对及SEQ ID No:6所示探针、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对及SEQ ID No:9所示探针，以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:10所示的引物对及SEQ ID No:11所示探针。本发明将mcr‑8与mcr‑10的特异性引物对采用了统一的前引物序列SEQ ID No:7后，同时选择了特异的无相互干扰的片段设计了特异性的荧光探针，实现了简化多重PCR引物体系达到良好的扩增效果，而且高度特异性的完成了mcr‑8与mcr‑10的分型。弥补了目前市面上还没有出现实现临床样本中所有MCR基因的有效分型与检测的多重PCR试剂盒的空白，特别是能有效鉴别分型mcr‑8和mcr‑10功能的多重PCR试剂盒的空白。
Description
技术领域
本发明属于医疗卫生以及微生物检测领域，特别涉及了一种用于鉴别MCR基因分型的试剂盒、鉴别方法及其应用。
背景技术
多黏菌素（polymyxin）是发现于多黏类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）培养液中的抗菌性多肽，有A、B、C、D、E等五种，其中多黏菌素E（colistin）和多黏菌素B（PMB）是临床中最常用的两种多黏菌素。由于其存在一定的神经毒性，在临床上的使用受到严格限制，但在亚洲、欧洲和北美，多黏菌素广泛应用于禽畜养殖业中。根据中国CHINET细菌耐药性监测，由于耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（Carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE）的高感染率，多粘菌素作为最后一道防线得到重视，在对CRE菌株感染的危重患者的治疗中，多粘菌素是挽救疗法策略中最为倚重的抗菌药。
近几年，多粘菌素耐药的肠杆菌科细菌在医学临床不断出现并流行传播，成为全球卫生工作者的关注热点。到目前为止对多粘菌素耐药的CRE涵盖产KPC、NDM、VIM和IMI酶的肠杆菌科细菌。然而近几年在临床、养殖厂、动物性食物、甚至健康人群样本中，均发现对多黏菌素耐药的可转移性耐药性MCR（mobile colistin resistance）基因。其中在2015年的调查中显示，广东省健康人群的肠道菌群中MCR的携带率高达15%，这可能是由于多黏菌素在养殖业中的广泛使用，使得多粘菌素耐药基因通过动物性食品到人群的食物链进入到健康人群体中。最令人担忧的是，mcr-1可与产KPC、NDM和VIM等碳青霉烯酶的CRE同时存在，形成名副其实的“超级细菌”。这就意味着其极大的阻碍了作为抗革兰阴性菌最后一道防线的多粘菌素的使用。
mcr-1基因的可转移性、高携带率和大范围分布引起社会极大的关注和不安。自mcr-1首次报道以来，已在临床和环境样本中多次发现，全世界范围内共有10类MCR被报道发现，然而目前在临床样本中发现的能通过环境转移并定植于人体内耐药菌的MCR只有mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10，因此这四类MCR基因型可称为影响人类健康的高危型MCR耐药基因。携带mcr-1基因的细菌并不局限于我国，在东南亚、欧洲、美洲和非洲的30多个国家均有发现。MCR每个基因型可能含有多个基因变异类型，其中mcr-1已发现多达30种基因变异类型。再者，由于MCR的广泛存在，特别是在健康人群和动物性食品中的存在，使得针对MCR检测现用的选择性筛菌、质谱鉴定菌种、药敏检测和普通PCR验证的检测程序方法变得十分繁复且低效。还有传统的微生物培养法和药敏试验法因耗时长、繁琐的操作过程、对仪器设备要求高等原因未能在临床上大规模推广使用。因此，寻找一种能有效鉴别携带各种MCR基因，特别是对人类健康存在高度危险的四类高危型MCR基因的“超级细菌”的方法迫在眉睫，同时临床上对能快速鉴别与监测目前在临床中流行的四类高危型MCR类型（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）的检测方法尤为重要。
发明内容
本发明的首要目的在于，提供一种用于鉴别MCR基因分型的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法。
本发明的又一目的在于提供一种如上述的用于鉴别MCR基因分型的试剂盒在临床或环境监测中非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
第一方面，一种用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒，其包括SEQ ID No:1和SEQ IDNo:2所示的引物对及SEQ ID No:3所示探针、SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的引物对及SEQ ID No:6所示探针、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对及SEQ ID No:9所示探针，以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:10所示的引物对及SEQ ID No:11所示探针。
作为本发明提供的所述的用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒的一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：2×PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光探针以及FTA试纸片、10%SDS溶液、TE缓冲液。
作为本发明提供的所述的用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒的一种优选实施方式，所述试剂盒所述试剂盒为20~50μL荧光PCR反应体系的试剂盒，各组分及其含量如下：
| PCR反应体系 | |
| 组分 | 终浓度 |
| PCR缓冲液 | 1× |
| Mg<sup>2＋</sup>浓度 | 2.00mmol/L |
| dNTPs（含dUTP） | 0.15mmol/L |
| Taq酶 | 2U |
| SEQ ID No:1所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:2所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:3所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:4所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:5所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:6所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:7所示引物 | 0.30μmol/L |
| SEQ ID No:8所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:9所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:10所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:11所示探针 | 0.10μmol/L |
| 模板 | 2μL |
| 补水至 | 20~50μL |
第二方面，一种非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法，其包括下述步骤：
（1）提取待测样品中的DNA；
（2）分别配置具有如上述的4组引物对和4个探针的PCR反应体系；
（3）将步骤（1）提取的DNA作为模板加入到PCR反应体系，进行PCR扩增反应并进行荧光PCR检测；当PCR反应体系中出现单一或多重荧光探针信号时，根据预设的荧光信号对应MCR基因类型鉴别出MCR基因分型；其中不同的预设荧光信号对应不同种类MCR基因类型。
作为本发明提供的所述的非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法的一种优选实施方式，步骤（1）具体包括如下步骤：取20μL待测样品，置于有直径2.0mmFTA滤膜片的离心管中，然后56℃干燥，干燥后的FTA滤膜片加入10%SDS溶液200μL，煮沸10min，用FTA专用缓冲液洗涤2次，然后再用TE缓冲液洗涤两次，56℃干燥后，可作为PCR反应模板。
作为本发明提供的所述的非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法的一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：2×PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光探针以及FTA试纸片、10%SDS溶液、TE缓冲液。
作为本发明提供的所述的非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法的一种优选实施方式，所述PCR反应体系为20~50μL荧光PCR反应体系，各组分及其含量如下：
| PCR反应体系 | |
| 组分 | 终浓度 |
| PCR缓冲液 | 1× |
| Mg<sup>2＋</sup>浓度 | 2.00mmol/L |
| dNTPs（含dUTP） | 0.15mmol/L |
| Taq酶 | 2U |
| SEQ ID No:1所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:2所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:3所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:4所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:5所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:6所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:7所示引物 | 0.30μmol/L |
| SEQ ID No:8所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:9所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:10所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:11所示探针 | 0.10μmol/L |
| 模板 | 2μL |
| 补水至 | 20~50μL |
第三方面，一种上述用于鉴别MCR基因分型的试剂盒在临床或环境监测中非疾病诊断和治疗用途的检测鉴别MCR基因分型的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）针对目前在临床样品中流行的MCR类型（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）的检测及鉴别分型的多重PCR检测技术，现有技术均没有相关的报道，而且当采用常规多重PCR检测方案（即分别设计mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10的特异性引物对，引物均不同）检测临床样品时发现引物对之间存在相互干扰，使得扩增效率降低，导致多重PCR体系失效无法检测MCR基因，即无法有效检测到样本中的产物的新的技术问题。虽然荧光探针作为PCR检测的技术具有高度特异性，但用于多重PCR检测时容易出现荧光探针相互干扰导致扩增效率降低的问题，导致检测失败，即无法有效检测到样本中的产物的问题。在多重PCR检测中，常规设计上是尽量避开相似的片段序列，避免相互干扰从而提高特异性效果。但本发明人反而采用相反的设计思路，利用这一原本引物设计上的难点，将mcr-8与mcr-10的特异性引物对采用了统一的前引物序列SEQ ID No:7，意外发现：将mcr-8与mcr-10的特异性引物对采用了统一的前引物序列SEQ ID No:7后，同时选择了特异的无相互干扰的片段设计了特异性的荧光探针，实现了简化多重PCR引物体系达到良好的扩增效果，而且高度特异性的完成了mcr-8与mcr-10的分型。弥补了目前市面上还没有出现实现临床样本中所有MCR基因的有效分型与检测的多重PCR试剂盒的空白，特别是能有效鉴别分型mcr-8和mcr-10功能的多重PCR试剂盒的空白。
（2）本试剂盒特别适合于医疗临床监测场景中，能够快速简便有效的对粪便样本中的MCR基因进行检测预警，对PCR产物进行实时监测，将大大降低监测可移动性多粘菌素耐药基因的人力和物力消耗，简化日常生产生活中大批量的临床样品的抽检与监测，因此本试剂盒及其检测方法在医疗临床监测场景中具有较大的应用价值，也可应用到环境监测场景中监测预警危险度高的MCR类型（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）。
（3）本发明提供的引物对于不含有mcr的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。
附图说明
图1为对NCBI数据库中46条MCR基因的SeqMan序列分析图；
图2为采用本发明试剂盒检测mcr-1的荧光扩增信号（信号颜色为绿色FAM）；
图3为采用本发明试剂盒检测mcr-3的荧光扩增信号（信号颜色为红色Cy3）；
图4为采用本发明试剂盒检测mcr-8的荧光扩增信号（信号颜色为橙色VIC）；
图5为采用本发明试剂盒检测mcr-10的荧光扩增信号（信号颜色为蓝色TET）；
图6为具有mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10的混合模板样本采用本发明试剂盒检测的荧光扩增信号（信号颜色为从左至右依次为蓝色TET、绿色FAM、橙色VIC及红色Cy3）；
图7为采用单重PCR检测mcr-3（探针为表5的探针1）的荧光扩增信号；
图8为采用单重PCR检测mcr-3（探针为表5的探针2）的荧光扩增信号；
图9为采用多重PCR检测mcr-3与mcr-8（探针为表5的探针1）的荧光扩增信号；
图10为采用多重PCR检测mcr-3与mcr-8（探针为表5的探针2）的荧光扩增信号；
其中荧光扩增信号图的纵坐标为Derivative导数，具体为荧光强度的变化对扩增循环数的变化求导，即d(Fluorescence)/d(cycle number)或d(荧光值)/d(循环数)；横坐标为循环数（cycle number）。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、本发明试剂盒中的引物序列设计：通过分别对所有已知的临床样本中的MCR基因序列进行分析，对共59条基因采用SeqMan进行序列分析（图1），通过分析，找出高度保守的区段，通过premier 3.0选择无二级结构且高度保守的区段，设计多组引物，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。引物列表1如下所示：
表1 引物与扩增片段序列列表（均为5'-3'）
| 目标基因 | 引物与探针序列5’-3’ | SEQ ID | 扩增片段长度（bp） | |
| <i>mcr-1</i> | 前引物 | F:5’-CTCGTTGGCTTAGATGACT-3’ | 1 | <i>mcr-1</i>:167bp |
| 后引物 | R: 5’-AAGTGCGAACATCAGTCC-3’ | 2 | ||
| 探针 | 5’FAM-TCGCTGCCAATAACGGCAAAGATATG-BHQ1 3’ | 3 | ||
| <i>mcr-3</i> | 前引物 | F:5’-ATATGGGGAGAAAGGAGTTTGAT-3’ | 4 | <i>mcr-3</i>:207bp |
| 后引物 | R:5’-CACATGCTATGACGAGGTTGT-3’ | 5 | ||
| 探针 | 5’Cy3-TTGGAAGGAGAACGATGGCGGC-BHQ1 3’ | 6 | ||
| <i>mcr-8</i> | 前引物 | F:5-CTGGTCAATACATACGACAATAC-3’ | 7 | <i>mcr-8</i>:204bp |
| 后引物 | R:5’-CAAACACACATCCCGATG-3’ | 8 | ||
| 探针 | 5’VIC-CCGGGATGCGTGACGTTGCTATGA-BHQ1 3’ | 9 | ||
| <i>mcr-10</i> | 前引物 | F:5’-CTGGTCAATACATACGACAATAC-3’ | 7 | <i>mcr-10</i>:204bp |
| <i></i> | 后引物 | R:5’-CAGACGCACATCCCGATG-3’ | 10 | |
| <i></i> | 探针 | 5’TET-CAATACAGCGAACAGTACAACACCGT-BHQ1 3’ | 11 |
2、反应体系的建立和优化：反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：分别取mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10携带株的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌菌株复苏后培养48小时，取培养液1mL经过无菌水洗涤后复溶到1mL，采用酚-氯仿法或试剂盒分别提取基因组核酸，再用上述引物进行PCR扩增，并取其中Ct值24-27之间者作为以后反应体系优化时的模板。其中最初反应体系如表2所示：
表2最初设计的PCR反应体系
| PCR反应体系 | |
| 组分 | 终浓度 |
| PCR缓冲液 | 1× |
| Mg<sup>2＋</sup>浓度 | 2.00mmol/L |
| dNTPs（含dUTP） | 0.15mmol/L |
| Taq酶 | 2U |
| SEQ ID No:1所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:2所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:3所示探针 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:4所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:5所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:6所示探针 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:7所示引物 | 0.30μmol/L |
| SEQ ID No:8所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:9所示探针 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:10所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:11所示探针 | 0.15μmol/L |
| 模板 | 2μL |
| 补水至 | 40μL |
2.1引物浓度的优化：在反应体系中，将引物浓度分别从0.1μmol/L～0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为反应：特异性引物浓度为0.05~0.20 μmol/L，荧光探针浓度为0.08~0.15 μmol/L。
2.2镁离子浓度的优化：在引物的终浓度为0.2μmol/L以及反应体系中其它条件同表2的前提下，将MgCl2的浓度从1 mmol/L～2.5 mmol/L以0.5 mmol/L递增，经过多次重复实验选定2.5 mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。
2.3Taq DNA聚合酶（Taq酶）用量的优化：在引物的终浓度为0.2μmol/L、镁离子的终浓度为2.5 mmol/L以及反应体系中其它条件同表2的前提下，通过比较Taq酶用量（以单位Unit计）的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。
2.4dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）浓度的优化：在引物的终浓度为0.2μmol/L、镁离子的终浓度为2.5 mmol/L以及反应体系中其它条件同表2的前提下，通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2 mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。
由于本法所涉及的引物、探针及目标片段众多，利用上述引物及荧光染料进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为40μL体系，所需各组分及相应浓度见表3。
表3优化后的PCR反应体系
| PCR反应体系 | |
| 组分 | 终浓度 |
| PCR缓冲液 | 1× |
| Mg<sup>2＋</sup>浓度 | 2.00mmol/L |
| dNTPs（含dUTP） | 0.15mmol/L |
| Taq酶 | 2U |
| SEQ ID No:1所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:2所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:3所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:4所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:5所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:6所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:7所示引物 | 0.30μmol/L |
| SEQ ID No:8所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:9所示探针 | 0.10μmol/L |
| SEQ ID No:10所示引物 | 0.15μmol/L |
| SEQ ID No:11所示探针 | 0.10μmol/L |
| 模板 | 2μL |
| 补水至 | 40μL |
注：在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。
3、本发明试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：
（1）提取待测样品中的DNA；
由于已知的可移动MCR均在质粒上，因此可用煮沸法等较为激烈的方法提取样本中的DNA，具体步骤为：取20μL新鲜的待测样品如粪便样本，置于有直径2.0mmFTA滤膜片的离心管中，然后56℃干燥，干燥后的FTA滤膜片加入10%SDS溶液200微升，煮沸10min，用FTA专用缓冲液洗涤2次，然后再用TE缓冲液洗涤两次，56℃干燥后，可作为PCR反应模板。
（2）按表3配置PCR反应体系；
（3）将步骤（1）提取的DNA作为模板按表3加入到PCR反应体系中，进行PCR扩增反应并进行荧光PCR检测，其中，PCR扩增反应程序条件如下：95℃ 2 min，1个循环；95℃ 5 sec、60℃ 40 sec， 40个循环。
本实施例中荧光PCR检测使用赛默飞世尔科技有限公司产的Applied BiosystemsABI 7500型的实时荧光定量PCR仪，但不局限于此。选择仪器的检测通道：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道，具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
实施例2
选取实施例1中表1的所述引物对，将待检的细菌培养液和其他非目标菌株共33株菌的培养液用采用酚-氯仿法或试剂盒提取各种来源样品中细菌的基因组DNA。其中标准菌株为华南理工大学食品安全与检测实验室购买或保藏菌株；分离株来源于深圳市各养殖场、农贸市场与健康人群粪便中，并采用Shen, et al.（2018）的方法鉴定菌株中有无MCR的存在，且所述菌株均经过16S测序或质谱鉴定。
在40μL荧光PCR反应体系（按表3配制）中，加入以上提取的不同菌株的基因组DNA2 μL，根据实施例1中的PCR反应条件进行荧光PCR检测。
实验结果如下表4所示。
表4不同菌株的荧光定量qPCR结果
| 菌株 | 来源<sup>b</sup> | qPCR | Shen, et al.(2018)<sup>c</sup> |
| 目标菌株(n=14) | |||
| 克雷伯氏菌属<i>Klebsiella</i>(n=3) | |||
| 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i>ssp. <i>rhinoscleromatis</i> | 粪便分离株1 | ＋<sup>a</sup> | ＋ |
| 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i>ssp. <i>rhinoscleromatis</i> | 粪便分离株2 | ＋ | ＋ |
| 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i>ssp. <i>rhinoscleromatis</i> | 粪便分离株3 | ＋ | ＋ |
| 大肠埃希氏菌属<i>Escherichiacoli</i>(n=11) | ＋ | ＋ | |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株1 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株2 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株3 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株4 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株5 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株6 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株7 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株8 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株9 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株10 | ＋ | ＋ |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | 粪便分离株11 | ＋ | ＋ |
| 非目标菌株(n=19) | |||
| 肠杆菌属<i>Enterbacter</i>(n=4) | |||
| 阴沟肠杆菌<i>Enterbacter cloacae</i> | CICC No.21539 | - | - |
| 阪崎肠杆菌<i>Enterbactersakazakii</i> | ATCC No.29544 | - | - |
| 产气肠杆菌<i>Enterbacteraerogenes</i> | CICC No.10293 | - | - |
| 产气肠杆菌<i>Enterobacteraerogenes</i> | ATCCNo.13408 | - | - |
| 大肠埃希氏菌属<i>Escherichiacoli</i>(n=12) | |||
| 大肠杆菌<i>E. coli</i> O157:H7 | CICC No.21530 | - | - |
| 大肠杆菌<i>E. coli</i> O157:H7 | SZCIQ No.13813 | - | - |
| 大肠杆菌<i>E. coli</i> O157:H7 | ADCPC No.931 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | ATCC No.9637 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | SZCIQNo.eco3 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | SZCIQNo.eco5 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | SZCIQNo.jm109 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | CMCC No.44104 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | CMCC No.44105 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | CMCC No.44106 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | CMCC No.44111 | - | - |
| 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> | CGMCC No.1.129 | - | - |
| 克雷伯氏菌属<i>Klebsiella</i>(n=2) | |||
| 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i> | CMCC No.46102 | - | - |
| 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i> | CICC No.10781 | - | - |
| 沙门氏菌属<i>Salmonella</i>（n=1） | - | - | |
| 都柏林沙门氏菌<i>Salmonella dublin</i> | GZCDCNo.dbl1a | - | - |
a. +，阳性； -，阴性
b. ATCC，美国菌种保藏中心，美弗吉尼亚洲马纳萨斯镇丹佛大学美国菌种保藏中心，邮编10801；CMCC，中国医学微生物菌种保藏中心，北京市大兴区生物医药产业基地华佗路31号院，邮编102629；CGMCC，中国普通微生物菌种保藏中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101；CICC，工业微生物菌种保藏管理中心，北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，邮编：100015；SZCIQ，深圳出入境检验检疫局，广东省深圳市福田区福强路1011号，邮编518000；ADCPC，重庆动物疾病控制和预防中心，重庆市渝中区长江二路8号，邮编：400042。其中来自于ATCC、CMCC、CGMCC、CICC的菌种均可以购买得到。来自于SZCIQ与ADCPC的菌株由这些机构分别惠赠；这些菌株已在文献“Xing-long Xiao,Li Zhang,Hui Wuet. al.,Simultaneous Detection ofSalmonella,Listeriamonocytogenes,andStaphylococcusaureusby Multiplex Real-Time PCR Assays Using High-Resolution Melting [J]. Food Analytical Methods, 2014,7(10):1960-1972”中公开。
c. MCR检测方法参考文献“Yingbo, S. , Hongwei, Z. , Jiao, X. ,Yongqiang, W. , Qijing, Z. , & Walsh, T. R. , et al. (2018). Anthropogenicand environmental factors associated with high incidence of mcr-1 carriage inhumans across china.Nature Microbiology.”。
经检测，若待检培养液中含有MCR variants（MCR的基因变异型，即mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）中任意一种或以上则显示阳性扩增曲线，其中mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr- 10的荧光扩增信号图如图2-5所示；若待检培养液中不含有MCR variants则无扩增信号，提示上述引物对及探针具有良好的灵敏度和特异性。对表4中的菌株进行检测，结果表明含目标基因的菌株均有检出，而非目标菌株均为无扩增曲线为阴性，说明本法具有良好的特异性。
进一步地，为了确定待测样品中的MCR种类，则需要通过荧光信号对应的荧光探针进行鉴定。使用不同的荧光信号作为判读标准，如图2-5所示不同种类MCR基因对应的不同荧光信号，当测得的荧光信号为绿色FAM、红色Cy3、橙色VIC及蓝色TET时，则对应耐药基因分别为mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10，说明本法具有良好的分辨率。
具体实际检测过程中，由于不同种类MCR基因可能同时出现，因此进一步对混合DNA模板进行了检测，其中试验所述混合样本均为等比例混合的DNA模板，结果如图6所示。
如图6所示，当mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10同时存在时，PCR反应体系可得到不同的荧光扩增信号，可对mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10同时进行检测。
综上，本发明试剂盒检测方法不仅可有效的检出待测样本中的所有临床样本中发现的MCR（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）的任一种，当MCR同时存在时，具有同时检出并鉴别出多个MCR基因分型的功能。
实施例3
本实施例所述粪便为采用华大智造粪便采集套装采集的健康人群新鲜粪便样本共112份，悬浮于保存液中，并置于4℃保存不超过一周的粪便样本。
选取实施例1中表1的引物对，将使用实施例1所述煮沸法所提取到的粪便细菌总DNA和采用实施例2中所述Shen, et al.（2018）的方法提取到的DNA模板作为不同的DNA模板进行PCR检测对比。结果表明，Shen, et al.（2018）的方法检出阳性率为12.5%（14/112），而本法检出阳性率为13.4%（15/112）。说明本发明采用煮沸法提取待测样品中的DNA作为模板具有良好的检出率。
对比例1
该对比例与实施例1不同之处在于：采用了其他荧光染料作为探针，如下表5所示，
| 目标基因 | 引物与探针序列5’-3’ | SEQ ID | 扩增片段长度（bp） | |
| <i>mcr-1</i> | 前引物 | F:5’-CTCGTTGGCTTAGATGACT-3’ | 1 | <i>mcr-1</i>:167bp |
| 后引物 | R: 5’-AAGTGCGAACATCAGTCC-3’ | 2 | ||
| 探针 | 5’FAM-TCGCTGCCAATAACGGCAAAGATATG-BHQ1 3’ | 3 | ||
| <i>mcr-3</i> | 前引物 | F:5’-ATATGGGGAGAAAGGAGTTTGAT-3’ | 4 | <i>mcr-3</i>:207bp |
| 后引物 | R:5’-CACATGCTATGACGAGGTTGT-3’ | 5 | ||
| 探针1 | 5’HEX-TCGCTGCCAATAACGGCAAAGATATG-BHQ1 3’ | 12 | ||
| 探针2 | 5’JOE-TTGGAAGGAGAACGATGGCGGC-BHQ1 3’ | 13 | ||
| <i>mcr-8</i> | 前引物 | F:5-CTGGTCAATACATACGACAATAC-3’ | 7 | <i>mcr-8</i>:204bp |
| 后引物 | R:5’-CAAACACACATCCCGATG-3’ | 8 | ||
| 探针 | 5’VIC-CCGGGATGCGTGACGTTGCTATGA-BHQ1 3’ | 9 | ||
| <i>mcr-10</i> | 前引物 | F:5’-CTGGTCAATACATACGACAATAC-3’ | 7 | <i>mcr-10</i>:204bp |
| <i></i> | 后引物 | R:5’-CAGACGCACATCCCGATG-3’ | 10 | |
| <i></i> | 探针 | 5’TET-CAATACAGCGAACAGTACAACACCGT-BHQ1 3’ | 11 |
实验结果表明，当进行单独PCR实验时，探针能有效的扩增目标片段（如下图7、8所示）。但当加入到多重PCR体系中时，由于探针间的相互作用，无论是以HEX还是JOE作为荧光染料，其扩增效率都出现显著下降，无法得到有效扩增，影响了多重PCR体系中mcr-3的检出效果（如下图9、10所示）。
对比例2
该对比例与实施例1不同之处在于：将表1修改为如下表6，具体地，
表6引物与扩增片段序列列表（均为5'-3'）
| 目标基因 | 引物与探针序列5’-3’ | SEQ ID | 扩增片段长度（bp） | |
| <i>mcr-1</i> | 前引物 | F:5’-CTCGTTGGCTTAGATGACT-3’ | 1 | <i>mcr-1</i>:167bp |
| 后引物 | R: 5’-AAGTGCGAACATCAGTCC-3’ | 2 | ||
| 探针 | 5’FAM-TCGCTGCCAATAACGGCAAAGATATG-BHQ1 3’ | 3 | ||
| <i>mcr-3</i> | 前引物 | F:5’-ATATGGGGAGAAAGGAGTTTGAT-3’ | 4 | <i>mcr-3</i>:207bp |
| 后引物 | R:5’-CACATGCTATGACGAGGTTGT-3’ | 5 | ||
| 探针 | 5’Cy3-TTGGAAGGAGAACGATGGCGGC-BHQ1 3’ | 6 | ||
| <i>mcr-8</i> | 前引物 | F:5’ CAGTCTGCCAATATTTCTTTTCTGCT-3’ | 14 | <i>mcr-8</i>:169bp |
| 后引物 | R:5’GTTTTGCACCATGCTGCGGTC-3’ | 15 | ||
| 探针 | 5’VIC-ATGCAGGCCTCTACTTGTAGTTCTTATTC-BHQ1 3’ | 9 | ||
| <i>mcr-10</i> | 前引物 | F:5’ CGCTACCTGCTCAAACCCTTCTTTGCCCTGT-3’ | 16 | <i>mcr-10</i>:187bp |
| <i></i> | 后引物 | R:5’GAATGCCCATGAAGACCAGCCACAGCA-3’ | 17 | |
| <i></i> | 探针 | 5’TET-ACTGAAATATAAAGTGATGTTTGATCAGTCC-BHQ1 3’ | 11 |
将表6中mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10各自特异性引物及特异性探针进行单重PCR检测时，均能在单一PCR体系中特异性识别目标片段，但当将表6的引物对组合应用到多重PCR体系中时，发现引物对之间存在相互干扰，使得扩增效率降低，无法得到有效的扩增，影响了多重PCR体系的检出效果。
在多重PCR检测中，常规设计上是尽量避开相似的片段序列，避免相互干扰从而提高特异性效果。但本发明人反而采用相反的设计思路，利用这一原本引物设计上的难点，将mcr-8与mcr-10的特异性引物对采用了统一的前引物序列SEQ ID No:7，意外发现：将mcr-8与mcr-10的特异性引物对采用了统一的前引物序列SEQ ID No:7后，同时选择了特异的无相互干扰的片段设计了特异性的荧光探针，实现了简化多重PCR引物体系达到良好的扩增效果，而且高度特异性的完成了mcr-8与mcr-10的分型。弥补了目前市面上还没有出现实现临床样本中所有MCR基因的有效分型与检测的多重PCR试剂盒的空白，特别是能有效鉴别分型mcr-8与mcr-10功能的多重PCR试剂盒的空白。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒，其特征在于，其包括SEQ ID No:1和SEQ IDNo:2所示的引物对及SEQ ID No:3所示探针、SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的引物对及SEQ ID No:6所示探针、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对及SEQ ID No:9所示探针，以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:10所示的引物对及SEQ ID No:11所示探针。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒，其特征在于，还包括：2×PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光探针以及FTA试纸片、10%SDS溶液、TE缓冲液。
3.根据权利要求2所述的用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为20~50μL荧光PCR反应体系的试剂盒，各组分及其含量如下：
。
4.一种非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）提取待测样品中的DNA；
（2）分别配置具有如权利要求1所述4组引物对和4个探针的PCR反应体系；
（3）将步骤（1）提取的DNA作为模板加入到PCR反应体系，进行PCR扩增反应并进行荧光PCR检测；当PCR反应体系中出现单一或多重荧光探针信号时，根据预设的荧光信号对应MCR基因类型鉴别出MCR基因分型；其中不同的预设荧光信号对应不同种类MCR基因类型。
5.根据权利要求4所述的非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法，其特征在于，步骤（1）具体包括如下步骤：取20μL待测样品，置于有直径2.0mmFTA滤膜片的离心管中，然后56℃干燥，干燥后的FTA滤膜片加入10%SDS溶液200μL，煮沸10min，用FTA专用缓冲液洗涤2次，然后再用TE缓冲液洗涤两次，56℃干燥后，可作为PCR反应模板。
6.根据权利要求4所述的非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的的方法，其特征在于，所述试剂盒还包括：2×PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光探针以及FTA试纸片、10%SDS溶液、TE缓冲液。
7.根据权利要求4或5所述的非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为20~50μL荧光PCR反应体系，各组分及其含量如下：
。
8.一种如权利要求1至3任一所述的用于鉴别MCR基因分型的试剂盒在临床或环境监测中非疾病诊断和治疗用途的检测鉴别MCR基因分型的应用。
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Citations (2)
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| CN108754000A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-06 | 中国农业大学 | 耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法 |
| CN109680056A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-26 | 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） | 一种检测mcr基因的试剂盒、检测方法及其应用 |
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