CN110172522A - 一种多黏菌素耐药基因的检测方法 - Google Patents

一种多黏菌素耐药基因的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多黏菌素耐药基因的检测方法，首先准备材料，包括菌株与质粒、试剂、仪器，引物设计，DNA模板制备，采用多重PCR反应体系及程序进行PCR产物测序。本发明的有益效果是节省检测时间，减少工作、节省费用，且操作简便，适合临场和研究检测用。

Description

一种多黏菌素耐药基因的检测方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种多黏菌素耐药基因mcr-6、mcr-7、mcr-8多重PCR聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)引物及检测方法。
背景技术
抗生素的发现和应用给人类及动物健康带来保障，目前仍旧是治疗细菌感染最有效手段。但随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性日趋严重；世界卫生组织称细菌耐药性列为21世纪人类健康最大威胁之一。近年来多重耐药菌、泛耐药菌，尤其是“超级细菌”的出现导致抗生素疗效急剧降低，加剧了感染疾病的死亡率，迫使人类进入“后抗生素时代”，即无药可用的窘境。多黏菌素类抗生素因其具有良好的治疗碳青霉烯类耐药菌感染的作用，一度被视为感染治疗的“最后一道防线”。但近年来，随着多黏菌素作为临床及饲料添加剂被广泛使用，其耐药性日益显现；尤其是2016年在我国发现的多黏菌素耐药基因mcr-1，进一步加剧了多黏菌素耐药菌的传播和流行。mcr-1基因大多定位于接合转移型质粒上，具有可转移性，能够介导多黏菌素的快速传播，尤其是跨菌属传播。mcr-1一经报道，便引起了世界广泛关注，各国也投入了大量精力进行研究。为了保障多黏菌素在人类临床仍旧可用，缓解多黏菌素耐药性，各国相继出台了多黏菌素的使用政策，我国也禁止了多黏菌素作为饲料添加剂应用于养殖业。但mcr仍旧在不断的传播和流行，在动物、人医、环境等环节均有发现，而mcr基因可以通过多种途径进入通过多种途径(包括医院和废水处理厂的排污，人和动物的粪尿排泄以及用于土壤灌溉的养殖场粪肥)进入到环境中，造成生态环境的破坏。mcr基因可通过接合转移、自然转化或者借助各种水平转移元件等多种方式进行水平转移，在某些情况下即使在无抗压力下也能持续存在，并难以消除，已经成为“新型污染物”，成为大家关注的焦点和研究的热点，同时多重耐药致病菌在食品动物、动物性食品及相关环境中的流行，不仅危害食品安全，还对人类健康的造成巨大威胁。因此，如何快速高效地检测与控制这类新型污染物，已成为了当前迫切的需要，对保障食品安全和维护人类健康具有很重要的意义。
然而，自mcr-1报道后，新的mcr变异体不断被发现，尤其是近来出现的多种变异体mcr-6、mcr-7、mcr-8(我国)。PCR是检测mcr基因最为灵敏、高效、廉价的方法，传统PCR仅能检测一种mcr变体型；如果进行同一样品多基因型检测，需要进行多次试验，不仅费时费力、耗物耗资、程序繁琐，同时还对样品具有较高的质量要求，抗噪能力差，灵敏度低，分辨率不高，特异性差。多重PCR一种较好的选择，能够满足以上需求，但目前未有mcr-6、mcr-7、mcr-8多重PCR的研究及专利，因此本项目旨在建立一种灵敏度高、特异性好、分辨率高的mcr-6、mcr-7、mcr-8检测多重PCR。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多黏菌素耐药基因的检测方法，本发明的有益效果是能完成单一样品中mcr多基因的检测，特点是能通过不同条带大小区分确定基因亚型，克服了单一样品中无法多基因检测及无法区分的问题，且该方法因设计时采用了300bp左右的间隔，比同类方法具有更好的分辨率；且该方法适用于商业化DNA聚合酶，克服了已有mcr多重PCR方法必须采用临场配制的PCR缓冲条件。该方法节省检测时间，减少工作、节省费用，且操作简便，适合临场和研究检测用。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
(一)材料：
(1)菌株与质粒
基因重组构建pBAD质粒上的mcr-6、mcr-7、mcr-8大肠杆菌，选取临床菌株以及检测所用菌株；
(2)试剂
DNA分子标准量Marker购自博迈德生物技术有限公司；2×Taq Master Mix购自诺唯赞生物技术有限公司；TAE缓冲液本实验室提供配置；琼脂糖、GelRed染料购自上海拜力生物科技有限公司；
(3)仪器：摇床、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪；
(二)引物设计
采用primer premier 5.0人工设计，采用每条引物与非目的基因同源性最低，与目的基因同源性最高，做到最高的特异性，引物由博迈德生物科技有限公司合成；
(三)DNA模板制备
将携带mcr-6、mcr-7、mcr-8菌株复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2mL含100μg/mL的MHB液体培养基中，在37℃的条件下200rpm摇培，过夜培养，离心收菌，水煮法提取DNA；
(四)多重PCR反应体系及程序
1、PCR反应体系：2μL水煮或试剂盒提取的DNA为模板，引物1μL，2×Taq MasterMix DNA聚合酶12.5μL，用蒸馏水补足25μL；
2、PCR反应条件：预变性94℃，时间3min；变性94℃，时间30s；退火56℃，时间30s；延伸72℃，时间1min；最后延伸3min；
(五)PCR产物测序
PCR产物凝胶电泳检测：配制1.2％凝胶块，120V电压，电泳时间20分钟，凝胶成像。
进一步，引物如下：
BMCR6-MF：CGTAGCTATGACAATCCCGTG，BMCR6-MR：
AATCAAAATACTGCGAAGCA，用来检测mcr-6；
BMCR7-MF：CAAAGTCGTCGCCATAGGGG，BMCR7-MR：
CCTTCTCTATGGCAAAGCCC，用来检测mcr-7；
BMCR8-MF：
TGTACGTCCAATATATTCGAAT，BMCR8-MR：
CAACTGCGGAAGACAGTGGT，用来检测mcr-8。
附图说明
图1是检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明方法能同时检测mcr-6、mcr-7、mcr-8多基因的引物组，如表1所示包括以下5组引物：
表1
mcr-6、mcr-7、mcr-8多黏菌素耐药基因检测方法如下：
(一)材料：
(1)菌株与质粒
基因重组构建pBAD质粒上的mcr-6、mcr-7、mcr-8的大肠杆菌，选取mcr-6、-8临床菌株以及检测所用菌株均为申请单位提供。
(2)主要试剂
DNA分子标准量Marker购博迈德生物技术有限公司；2×Taq Master Mix诺唯赞生物技术有限公司；TAE缓冲液本实验室提供配置；琼脂糖、GelRed染料购自上海拜力生物科技有限公司。
(3)主要仪器：摇床、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪和PCR仪。
(二)引物设计
采用primer premier 5.0人工设计，采用每条引物与非目的基因同源性最低，与目的基因同源性最高，做到最高的特异性，序列见表1；引物由博迈德生物科技有限公司合成。
(三)DNA模板制备
将携带mcr-6、mcr-7、mcr-8菌株复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2mL含100μg/mL的MHB液体培养基中，在37℃的条件下200rpm摇培，过夜培养，离心收菌，水煮法提取DNA。
(四)多重PCR反应体系及程序
1、PCR反应体系：2μL水煮或试剂盒提取的DNA为模板，引物1μL，2×Taq MasterMix DNA聚合酶12.5μL，用蒸馏水补足25μL。
2、PCR反应条件：预变性94℃，时间3min(菌液时间为8min)；变性94℃，时间30s；退火56℃，时间30s；延伸72℃，时间1min；最后延伸3min。
(五)PCR产物测序
PCR产物凝胶电泳检测：配制1.2％凝胶块，120V电压，电泳时间20分钟，凝胶成像。
(六)检测结果
如图1所示，泳道M为marker，泳道mcr-6～8为用mcr-6～8三对引物对mcr-6～8三个基因的多重检测，泳道mcr-6、mcr-7、mcr-8依次为用mcr-6～8三对引物对耐药基因mcr-6、mcr-7、mcr-8单一的耐药基因检测。图中mcr-6～8泳道条带清晰，直观分辨，各条带没有相互干扰，展示了该检测方法较好的特异性和灵敏度
本发明引物组可以在单一样品中一次性检测5个耐药基因；PCR产物大小间隔大，便于区分，结果直观，分辨率高；可适用于检测菌落、菌液、DNA基因组样品的检测。缓冲液采用商品化的Taq酶，便于操作，实用性高。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种多粘菌素耐药基因的检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtagctatg acaatcccgt g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatcaaaata ctgcgaagca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaagtcgtc gccatagggg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccttctctat ggcaaagccc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtacgtcca atatattcga at 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caactgcgga agacagtggt 20

Claims (2)

1.一种多黏菌素耐药基因的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(一)材料：
(1)菌株与质粒
基因重组构建pBAD质粒上的mcr-6、mcr-7、mcr-8大肠杆菌，选取临床菌株以及检测所用菌株；
(2)试剂
MHA培养基；DNA分子标准量Marker购博迈德生物技术有限公司；2×Taq Master Mix诺唯赞生物技术有限公司；TAE缓冲液本实验室提供配置；琼脂糖、GelRed染料购自上海拜力生物科技有限公司；
(3)仪器：摇床、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪；
(二)引物设计
采用primer premier 5.0人工设计，采用每条引物与非目的基因同源性最低，与目的基因同源性最高，做到最高的特异性，引物由博迈德生物科技有限公司合成；
(三)DNA模板制备
将携带mcr-6、mcr-7、mcr-8菌株复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2mL含100μg/mL的MHB液体培养基中，在37℃的条件下，200rpm，过夜培养，离心收菌，水煮法提取DNA；
(四)多重PCR反应体系及程序
1、PCR反应体系：2μL水煮或试剂盒提取的DNA为模板，引物1μL，2×TaqDNA聚合酶12.5μL，用蒸馏水补足25μL；
2、PCR反应条件：预变性94℃，时间3min；变性94℃，时间30s；退火56℃，时间30s；延伸72℃，时间1min；最后延伸3min；
(五)PCR产物测序
PCR产物凝胶电泳检测：配制1.2％凝胶块，120V电压，电泳时间20分钟，凝胶成像。
2.按照权利要求1所述一种多黏菌素耐药基因的检测方法，其特征在于：所述引物如下：
BMCR6-MF：CTTGTGCTATTTGGGGCG，BMCR6-MR：GTGCCGCTCGCTGTTCTT，用来检测mcr-6；
BMCR7-MF：TTTATTCTGTTCGCAGTGGTC，BMCR7-MR：AGATGTAGACCCCGCTTCTTT，用来检测mcr-7；
BMCR8-MF：TGGTCACCTTAAAGGAAAATACC，BMCR8-MR：CAACTGCGGAAGACAGTGGT，用来检测mcr-8。
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