CN108265118A - 与湖羊肉质性状相关的分子标记及其特异性引物对和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与湖羊肉质性状相关的分子标记及其特异性引物对，所述特异性引物对作为制备体外检测与湖羊肉质性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用，以及所述分子标记在湖羊育种中的应用。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明能够实现湖羊肉质性状优良品种种羊的选种，选育成本低，选育效率高，可促进湖羊生长发育和肉质性状的遗传改良。

Description

与湖羊肉质性状相关的分子标记及其特异性引物对和应用

技术领域

本发明属于动物分子标记技术领域，特别是涉及一种与湖羊肉质性状相关的分子标记及其特异性引物对，所述特异性引物对作为制备体外检测与湖羊肉质性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用，所述分子标记在湖羊育种中的应用。

背景技术

湖羊主要产于太湖流域，为稀有的白色羔皮用绵羊品种。同时，也是我国重要的一级保护地方畜禽品种、限制出口的禽畜良种之一。湖羊体型狭长、体格中等，公、母湖羊均无角，头狭长，鼻梁隆起，多数耳大下垂，颈细长，体躯狭长，背腰平直，腹微下垂，尾扁圆，尾尖上翘，四肢偏细而高。湖羊具有性成熟早、四季发情、繁殖力高、多胎性强的优点，其平均产羔率达230％以上，高繁殖率选育群可达300％以上。

但与其他肉用专门化品种相比，湖羊的肉用性能较差，屠宰率低，后期生长速度比较缓慢。随着国内外消费市场的逐渐变化以及现在消费者对羊肉的需求程度，湖羊的肉用性能的进一步选育和提高慢慢成为该品种的主要目标。既要保证维持湖羊的既有特色、又要提高湖羊的肉用性能。

传统的动物遗传育种均是基于表型的选择，然而肉用性状无法从活体中获取。随着分子生物学、分子遗传学以及生物信息学的发展，以及最新生物技术在遗传育种的各个领域的应用，通过对与肉用性状相关的分子标记的选择，能够达到早期选种的目的。因此，要提高湖羊的肉用性能就必须采用分子育种方法从肉用性状各重要指标方面进行选育。

肉用性能通常与肌肉组织有着密切的联系，所以研究肌肉组织的特性将会为湖羊的科学饲养和品种改良提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与湖羊肉质性状相关的分子标记及其特异性引物对，所述特异性引物对作为制备体外检测与湖羊肉质性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用，所述分子标记在湖羊育种中的应用。本发明能够有效解决选育肉质品质好的优质湖羊时，存在选育效率较低、选育成本较高的问题。

本发明的目的之一是通过以下方案来实现的：

一种与湖羊肉质性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1序列：5’-TACGCCTCTGGACGCACAACTGGAATGGCTGATCTGGAGTGGTGTCCCCACAACGTGCCCATCTATGAGGGCTACGCCCTGCCCCACGCCATCATGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGAGATCTCACCGACTACCTCATGAAGATCCTGACCGAGCGAGGATGAAGATCCTGACCGAGCGAGG-3’。

该分子标记为湖羊的平滑肌肌动蛋白α2(actin,alpha 2,smooth muscle,aorta——ACTA2)基因的特征序列，位于22号染色体，ACTA2基因全长18.03kb包括9个外显子，mRNA长为2062bp，CDS序列长为1133bp，编码377个氨基酸。

平滑肌α肌动蛋白(ACTA2)表达主要限于平滑肌细胞、周细胞和肌成纤维细胞。有研究表明ACTA2敲低与Erk1/2磷酸化的显着降低相关，且ACTA2在肌成纤维细胞细胞运动和收缩中具有重要作用。目前关于ACTA2基因与湖羊背最长肌肉质性状相关性的研究尚未有报道。

本发明的目的之二是通过以下方案来实现的：

一种用于扩增与湖羊肉质性状相关的分子标记的特异性引物对，包括：

P1上游引物F:5'-TACGCCTCTGGACGCACAACT-3'；

P1下游引物R：5'-CCTCGCTCGGTCAGGATCTTCA-3'。

本发明的目的之三是通过以下方案来实现的：

一种上述特异性引物对作为制备体外检测与湖羊肉质性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用。

本发明的目的之四通过以下方案来实现的：

一种上述的与湖羊肉质性状相关的分子标记在湖羊育种中的应用。

进一步的，上述的与湖羊肉质性状相关的分子标记在湖羊育种中的应用，包括如下步骤：

第一步，提取待测湖羊背最长肌的总RNA；

第二步，利用特异性引物对湖羊背最长肌基因组进行PCR扩增；

PCR扩增反应体系每10μL组成如下：

上、下游引物(10μmol/L)0.5μL；

dNTPs(2mmol/L)2.5μL；

2×Taq plus master(5U/μL)0.5μL；

DNA模板(50ng/μL)0.5μL；

Mg²⁺(25mmol/L)1.5μL；

超纯水3.5μL；

PCR扩增反应条件：95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min；

第三步，结果判定：PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，若出现181bp的目的片段，则待测湖羊属于肉质较好的优势品种。

本发明的原理和有益效果：

肌肉的重量主要是由肌纤维数目和肌纤维横截面积决定，而动物出生后，肌纤维数目保持不变，因此肌肉的增长主要体现在肌纤维横截面积的增加，随着肌纤维的增粗，肌肉内脂肪含量增加，肌纤维密度下降，因此认为肌纤维密度与肌肉嫩度关系相当密切。肌纤维密度大，单位面积内肌纤维数目多，能够从侧面发映出肉质的细嫩程度。不论屠宰体重或日龄大小，都是肌纤维越细肉质越鲜嫩。

本发明将湖羊肉质性状与湖羊背最长肌肌纤维性状相关联，提供检测湖羊背最长肌肌纤维直径和密度的一个重要基因，从而提供了与湖羊肉质性状相关的分子标记，能够实现湖羊肉质性状优良品种种羊的选种，选育成本低，选育效率高，可促进湖羊生长发育和肉质性状的遗传改良。

附图说明

图1总RNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2 ACTA2和18s rRNA基因的扩增曲线和溶解曲线，(a)ACTA2基因的扩增曲线，(b)ACTA2基因的溶解曲线，(c)18s rRNA基因的扩增曲线，(d)18s rRNA基因的溶解曲线；

图3 ACTA2基因在湖羊和杂交羊中的表达差异分析。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

(一)样本选取

以6月龄的湖羊为研究对象，6月龄的杜湖杂交羊F1代为参照群体开展实验。

(二)两种羊的背最长肌上与肉质性状相关的指标的测定

采取了两种羊的背最长肌，并测定肌肉的长度、重量、剪切力、系水力等指标，测定结果见表1。

表1：肉质性状指标

同一指标数据肩标无小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

由表1可以看出，湖羊上背最长肌的剪切力、系水力与肌肉长度均显著高于杂交羊。

测定了两种羊的背最长肌肌纤维组织学指标，如下表2：

表2：肌纤维组织学特性

同一指标数据肩标无小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

由表2可以看出，湖羊上背最长肌的肌纤维密度显著高于杂交羊、肌纤维直径显著低于杂交羊。

(三)总RNA提取与质量检测

分别提取了两种羊背最长肌的总RNA，并通过1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，检测结果参见附图1。从附图1可以看出，电泳结果显示清晰的28s rRNA和18s rRNA条带。核酸蛋白分析仪检测，1.8＜A_260/A_280≤2.2(A为吸光值)，显示RNA完整且质量较好。

(四)引物设计及PCR扩增

根据羊ACTA2基因序列设计以下1对引物：

P1上游引物F:5'-TACGCCTCTGGACGCACAACT-3'；

P1下游引物R：5'-CCTCGCTCGGTCAGGATCTTCA-3'。

用上述引物对在湖羊背最长肌基因组中进行PCR扩增。

PCR扩增反应为10μL体系，包括：上、下游引物(10μmol/L)0.5μL；dNTPs(2mmol/L)2.5μL；2×Taq plus master(5U/μL)0.5μL；DNA模板(50ng/μL)0.5μL；Mg2+(25mmol/L)1.5μL；超纯水3.5μL。

PCR扩增反应程序：95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。

PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后获得目的基因片段P1(SEQ ID No.1)。凝胶回收纯化目的基因片段，pMD18-T载体连接、转化DH5α，菌液PCR检测后，阳性克隆进行测序和系列比对分析。分析结果显示引物具有较好的特异性。溶解曲线分析发现，ACTA2基因及18s rRNA基因的PCR产物均呈较为锐利的单一峰，PCR得到了较好的优化。ACTA2和18srRNA基因的扩增曲线和溶解曲线参见图2。

(五)实时荧光定量结果分析

初步的实时定量PCR结果显示，6月龄纯种雄性湖羊背最长肌ACTA2基因表达量极显著高于杜泊×湖羊杂交F1代羊，参见图3。

(六)ACTA2基因表达量与肌纤维指标相关分析

ACTA2基因的相对表达量与肌纤维密度存在极显著正相关、与肌纤维直径存在极显著负相关，参见表3。

表3：ACTA2基因表达量与肌纤维指标相关分析

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 与湖羊肉质性状相关的分子标记及其特异性引物对和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 181

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

tacgcctctg gacgcacaac tggaatggct gatctggagt ggtgtcccca caacgtgccc 60

atctatgagg gctacgccct gccccacgcc atcatgcgtc tggacctggc tggccgagat 120

ctcaccgact acctcatgaa gatcctgacc gagcgaggat gaagatcctg accgagcgag 180

g 181

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

tacgcctctg gacgcacaac t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

cctcgctcgg tcaggatctt ca 22

Claims (5)

1.一种与湖羊肉质性状相关的分子标记，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种用于扩增根据权利要求1所述的与湖羊肉质性状相关的分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述序列如下：

P1上游引物F:5'-TACGCCTCTGGACGCACAACT-3'；

P1下游引物R：5'-CCTCGCTCGGTCAGGATCTTCA-3'。

3.一种根据权利要求2所述的特异性引物对作为制备体外检测与湖羊肉质性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用。

4.一种根据权利要求1所述的与湖羊肉质性状相关的分子标记在湖羊育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，提取待测湖羊背最长肌的总RNA；

第二步，利用特异性引物对湖羊背最长肌基因组进行PCR扩增；

PCR扩增反应体系每10μL组成如下：

上、下游引物(10μmol/L)0.5μL；

dNTPs(2mmol/L)2.5μL；

2×Taq plus master(5U/μL)0.5μL；

DNA模板(50ng/μL)0.5μL；

Mg²⁺(25mmol/L)1.5μL；

超纯水3.5μL；

PCR扩增反应条件：95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min；

第三步，结果判定：PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，若出现181bp的目的片段，则待测湖羊属于肉质较好的优势品种。