CN106755334A - 一种绵羊肉质相关的基因的检测引物和方法及其应用 - Google Patents

一种绵羊肉质相关的基因的检测引物和方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绵羊肉质的基因检测引物和方法及其应用，所述的引物包括上游引物：5’‑TGGAGTCCATGCAGCAAAC‑3’和下游引物：5’‑AGCCTGTACGGAGCTAACG‑3’，通过将样品基因组DNA扩增测序达到检测目的，本发明还提供了所述的绵羊肉质的基因检测引物在制备检测绵羊肉质的制剂或试剂盒中应用。本发明引物用于检测绵羊肉质与传统的分型方法相比，HRM技术方法简单，耗时短，成功率高，更直观，可以大批量进行分型。

Description

一种绵羊肉质相关的基因的检测引物和方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种绵羊肉质相关的基因检测引物和方法及其应用。
背景技术
绵羊是我国普遍饲养的家畜之一，饲养历史已有7000余年。羊肉中含有丰富的人体必需的蛋白质、维生素B1、B2、脂肪以及钙、磷、铁、钾、碘等矿物质元素。羊肉鲜嫩，属于温性食物，多食也不会上火，能够健脾，补血，因为吃羊肉可以促进血液循环，所以在我国一些较冷的地方很喜欢在冬天吃羊肉火锅。如今，羊肉再也不是草原的专属美食，也越来越受到人们的喜爱，羊肉的需求量增加的同时，人们对肉质的要求也随之升高。近年来，育种工作者们逐渐将研究方向转移至绵羊肉质方面性状的改善，利用分子育种方法，通过探知影响绵羊肉质性状的候选基因的作用机理，为绵羊提高肉质质量的育种提供理论依据。
肌内脂肪的沉积直接会影响羊肉的品质，口感也会有所不同。羊肉中不饱和脂肪酸不仅会影响羊肉的口感而且还是人体所必需的营养物质。长链脂酰辅酶A合成酶家族(long-chain fatty acyl-CoA synthetases，ACSLs)是哺乳动物利用外源和内源脂肪酸活化催化生成酯酰辅酶A过程中所必需的酶。实验证实长链脂酰CoA合成酶在甘油三酯、磷脂和胆固醇脂的合成以及脂肪酸的代谢中起着关键作用。本实验选用东北细毛羊为实验对象。通过HRM技术分析基因遗传多态性并与肉质性状数据相结合进行相关分析。旨在从分子水平探究ACSL1基因对绵羊体内肌内脂肪沉积的调控作用，为优质绵羊的育种工作提供理论基础和科学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种绵羊肉质相关的基因检测引物和方法及其应用，为绵羊肉质营养成分相关基因的检测提供一种快速有效的方法，为以提高绵羊肉质质量为目的的育种提供依据。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种绵羊肉质相关的基因检测引物，所述的引物包括上游引物和下游引物：
所述的上游引物为：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’
所述的下游引物为：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’
本发明所述的绵羊肉质相关的基因检测引物的PCR反应体系为：取2×Master Mix10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl22μL(2.5mM)，DNA 1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH2O补齐至20μL。
本发明所述的绵羊肉质相关的基因检测引物的PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环。95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。
本发明还提供了一种绵羊肉质营养成分相关基因的检测方法，具体包括以下步骤：
1)提取绵羊样品的基因组DNA，并将基因组保存于-15℃～-20℃；
2)以步骤(1)所述的基因组DNA作为模板，通过PCR反应扩增绵羊基因，所述的PCR包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’；
3)反应结束后根据标准化曲线区分出三种不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增；
4)将PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min；
5)确定目的条带后将剩余样品进行胶回收，连接载体克隆得到菌液送到测序公司测序。
进一步的，步骤(2)中反应体系为：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl22μL(2.5mM)，DNA 1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH2O补齐至20μL。反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环。95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。
进一步的，步骤(3)中反应体系为：10×PCR Buffer with MgCl26.25μL，dNTPMixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，Taq DNApolymerase(2U/μL)1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH2O补齐至50μL。反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性40s；退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
本发明还提供所述的绵羊肉质相关的基因检测引物在制备检测绵羊肉质相关基因的制剂或试剂盒中应用，所述的制剂或试剂盒包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’。
本发明的有益效果为：针对ACSL1基因第2外显子DNA片段突变进行快速分型。与传统的分型方法相比，HRM技术方法简单，耗时短，成功率高，更直观，可以大批量进行分型。
附图说明
图1是引物对绵羊基因组DNA扩增产物的电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
本发明利用已克隆得到的ACSL1基因序列，设计特异性引物，克隆包括全部第2外显子的部分DNA序列，以东北细毛羊肝组织DNA为试验样品，利用HRM技术对ACSL1基因多态性检测，根据测序得到的不同基因型与肉质性状数据结合进行分析，为优质绵羊育种工作提供理论依据。
引物设计：以绵羊ACSL1基因DNA序列为参照，根据HRM试验引物要求设计引物1对，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，目的片段长度为500bp。引物序列：
ACSL1基因exon2HRM分型上游引物序列：5’-TTTTCCCAGGGCAGTGA-3’
ACSL1基因exon2HRM分型下游引物序列：5’-TTCAGGCCGATGCTTACT-3’
ACSL1基因exon2PCR扩增上游引物序列：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’
ACSL1基因exon2PCR扩增下游引物序列：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’
通过梯度PCR试验确定最佳试验温度，在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：2×PCR mix 10μL，上下游引物各0.2μL，DNA 0.5μL，用ddH2O补齐至20μL。
将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；设置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取5μLPCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min。根据条带亮度及清晰度确定最终退火温度。
在96孔PCR管中加入HRM反应扩增体系：取2×Master Mix10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl22μL(2.5mM)，DNA 1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH2O补齐至20μL.
冰上操作，充分混匀后封膜离心30s，放入荧光定量PCR仪。
PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环。95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。
反应结束后根据标准化曲线区分出三种不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增。
在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：10×PCRBuffer with MgCl26.25μL，dNTP Mixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，Taq DNA polymerase(2U/μL)1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH2O补齐至50μL。
将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取5μL PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min。
取每个样品的PCR产物50μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳。电压为100V，电泳约30min后进行回收。
具体为首先称量离心管重量，记录后在紫外光照射下按照目的片段边缘将凝胶切下，尽量去除多余部分。将凝胶块放入离心管中，再次称量，两次差值为凝胶重。按照比例换算。设凝胶体积为A
向凝胶中加入3Aml的buffer DE-A，使凝胶完全没入液体中后，放到65℃水浴锅中融化至凝胶完全消失。然后再加热两分钟左右。
从水浴锅中取出后再向离心管中加入1.5Aml buffer DE-B，混合均匀。
转移3中的黄色液体到试剂盒中所提供的滤管放入2ml的离心管中，12,000×g离心1min。倒掉液体。
向滤管中加入500μL buffer W1，10,000×g离心1min。倒掉液体。
向滤管中加700μL buffer W2，10,000×g离心1min。倒掉液体。按照相同的方法再一次清洗。
倒出液体后再放回离心机12,000×g离心1min。
将滤管转移至新的1.5mL离心管中，在滤管中加25μL Eluent，室温静止2min。12,000×g离心1min洗脱DNA。(将Eluent加热至65℃提高洗脱效率。)
取胶回收产物4.5μL，连接PMD18-T Vector 0.5μL，solution 5μL，16℃30min。
LB平板37℃预热。
从冰箱中取出，并在冰上融化感受态细胞，取30μL感受态细胞加入5μL连接反应物，用移液器混匀，冰浴30min。
将混合液转移到加热到42℃的水浴中，加热1min30s，注意小心不能摇晃。
时间到后迅速将离心管取出放回冰上，2min。
在无菌操作台中取800μL LB培养基加入细胞混合液中，然后37℃摇床摇匀45min。
离心4000rmp，4min，去上清液，留约200μL。充分混匀，然后用灭菌后的玻璃棒均匀涂抹于预热的LB固体培养基平板。
在无菌台中放置，观察菌液的吸收情况。
完全吸收后，倒置平皿于37℃培养箱中培养过夜。
次日，在无菌台中，取800μLAmp+抗性的LB液体培养基到1.5ml的离心管中，用牙签挑取转化板上的大小适中单克隆的菌体，挑过菌体的牙签放到LB培养基中。
将带有菌液的LB培养基，放到摇床中，37℃，230r/min条件下摇菌。
摇至培养基浑浊，大约5h后，取0.5μL菌液进行PCR检测。
利用通用引物M13以菌体DNA为模板，进行菌落PCR，所得条带长度为载体中插入的目的片段长度。在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：2×PCR mix 10μL，上下游引物各0.2μL，菌液0.5μL，用ddH2O补齐至20μL。
将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；设置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取5μLPCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min。挑取PCR检测结果为阳性的单克隆菌液送哈尔滨博仕公司进行测序。
用本发明设计的引物对绵羊基因组DNA扩增得到500bp的特异性扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，见图1，其中M泳道为标准分子量Marker，其余为被检测的PCR产物。
测序后(SEQ ID No.3)经比对发现在chr.2613930064位置，发生G-A的突变。分为三个基因型AA型，AB型及BB型。AA基因型18只，AB基因型28只，BB基因型2只。ACSL1基因第2外显子不同基因型之间进行脂肪酸含量的差异显著性比较，结果显示，不同基因型中脂肪酸含量存在显著差异。其中，BB基因型的硬脂酸含量显著高于AA型和AB型，说明BB基因型对硬脂酸有一定的正面影响。基因型BB的丙氨酸含量也显著高于AA基因型。
实施例2绵羊ACSL1基因多态性测序分析
经过HRM检测，ACSL1基因第2外显子，第14外显子在东北细毛羊中存在多态现象。PCR扩增后克隆目的片段后测序。
测序结果可以分为3个基因型，分别定义为AA，AB和BB三种基因型。经比对发现第2外显子在chr.2613930064位置，发生G-A的突变。第14外显子在chr.2613929965位置，发生C-T的突变。第18外显子在chr.2613922514位置，发生G-A的突变。在内含子中也发现了5处突变，分别在第5内含子chr.2613942306C-T的突变，第11内含子chr.2613933803C-T的突变，第13内含子有两处突变，分别是chr.2613930149G-A和chr.2613930218A-G的突变，还有第14内含子chr.2613929965A-G的突变。
实施例3ACSL1基因第2外显子遗传变异及肉质分析
测序分型后计算基因型频率以及等位基因频率后发现基因型AB为优秀基因型，等位基因A为优势等位基因。
表1绵羊ACSL1基因exon2的基因型频率和基因频率
ACSL1基因第2外显子不同基因型之间进行氨基酸含量的差异显著性比较，结果显示，不同基因型中大部分氨基酸含量差异不显著，个别氨基酸含量有显著差异。其中，基因型AB的组氨酸含量显著高于基因型AA(P<0.05)，基因型BB的丙氨酸含量也显著高于AA基因型(P<0.05)，说明AA型对氨基酸含量有一定的负作用。
表2绵羊ACSL1基因第2外显子各基因型氨基酸均值差异显著性检验
ACSL1基因第2外显子不同基因型之间进行脂肪酸含量的差异显著性比较，结果显示，不同基因型中脂肪酸含量存在显著差异。其中，BB基因型的硬脂酸含量显著高于AA型和AB型，说明BB基因型对硬脂酸有一定的正面影响。而油酸含量AA基因型和AB基因型都显著高于BB基因型，说明BB基因型对油酸的含量有一定负面作用。基因型AA的亚油酸含量显著低于AB基因型。
表3绵羊ACSL1基因第2外显子各基因型脂肪酸均值差异显著性检验
ACSL1基因第2外显子不同基因型之间进行营养成分含量的差异显著性比较，结果显示，不同基因型之间营养成分含量差异不显著。
表4绵羊ACSL1基因第2外显子各基因型营养成分均值差异显著性检验
实施例4ACSL1基因第14外显子遗传变异及肉质分析
测序分型后计算基因型频率以及等位基因频率后发现基因型AB为优秀基因型，等位基因A为优势等位基因。
表5绵羊ACSL1基因exon14的基因型频率和基因频率
ACSL1基因第14外显子不同基因型之间进行氨基酸含量的差异显著性比较，结果显示，不同基因型中部分氨基酸含量存在显著差异。其中基因型AB的天冬氨酸，甘氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸的含量显著高于AA基因型，说明AB基因型在天冬氨酸，甘氨酸，组氨酸，赖氨酸，精氨酸的含量上有一定的正影响。BB基因型中的丙氨酸含量显著高于AA，AB基因型，说明BB基因型对丙氨酸含量有一定的积极影响。基因型AA，BB中的蛋氨酸含量都显著高于AB型，说明AB基因型对蛋氨酸含量有一定的负作用。
表6绵羊ACSL1基因第14外显子各基因型氨基酸均值差异显著性检验
ACSL1基因第14外显子不同基因型之间进行脂肪酸含量的差异显著性比较，结果显示，不同基因型之间脂肪酸含量差异不显著。
表7绵羊ACSL1基因第14外显子各基因型脂肪酸均值差异显著性检验
ACSL1基因第14外显子不同基因型之间进行营养成分含量的差异显著性比较，结果显示，不同基因型之间营养成分含量差异显著。AA基因型中粗蛋白的含量明显高于AB基因型。
表8绵羊ACSL1基因第14外显子各基因型营养成分均值差异显著性检验
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一种绵羊肉质相关的基因的检测引物和方法及其应用
<130> 2016
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggagtccat gcagcaaac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcctgtacg gagctaacg 19
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> 绵羊基因
<400> 3
tggagtccat gcagcaaacg ctcacccctc ccaggccctg gaggggattg agggtgcaca 60
cggtagacat tttcttttta atgctttctt ctgaccttct gtctgtctgt cttttttccc 120
agggcagtga tggtgcccgg agatccacac tcctggacag tgacgagccc ctggtgtatt 180
tctacgatga tgtcagaacg ttataccaag gtttccagag gggcatacag gtgtccagta 240
agcatcggcc tgaatctgtg caattagcgc ttcaggtttt tcctttcgac agaggggtct 300
ttcttcaaga agccatattt gctcacaact ctctccaata cagcctggct cccagctccc 360
tgtctcctcc tgttaacttc tgcagagcga gtccccccgc acacaggtcc catcgggtgt 420
ggcccatggt caaggcattt ctgcagtcac atgcggcgtg tttcatggag agtcacacat 480
ccgttagctc cgtacaggct 500

Claims (7)

1.一种绵羊肉质的基因检测引物，其特征在于，所述的引物包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种绵羊肉质的基因检测引物，其特征在于，所述的绵羊肉质的基因检测引物的PCR反应体系为：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl22μL 2.5mM，DNA 1μL，用ddH2O补齐至20μL。
3.根据权利要求1所述的一种绵羊肉质的基因检测引物，其特征在于，所述的绵羊肉质的基因检测引物的PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环；95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。
4.一种绵羊肉质营养成分基因的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)提取绵羊样品的基因组DNA，并将基因组保存于-15℃～-20℃。
2)以步骤(1)所述的基因组DNA作为模板，通过PCR反应扩增绵羊基因，所述的PCR包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’；
3)反应结束后根据标准化曲线区分出三种不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增；
4)将PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min；
5)确定目的条带后将剩余样品进行胶回收，连接载体克隆得到菌液送到测序公司测序。
5.根据权利要求4所述的一种绵羊肉质营养成分基因的检测方法，其特征在于，步骤(2)中反应体系为：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl2 2μL 2.5mM，DNA1μL，用ddH2O补齐至20μL；反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环；95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。
6.根据权利要求4所述的一种绵羊肉质营养成分基因的检测方法，其特征在于，步骤(3)中反应体系为：10×PCR Buffer with MgCl26.25μL，dNTP Mixture 10mm 2.25μL，下游引物各1μL，TaqDNA polymerase 2U/μL 1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH2O补齐至50μL；反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性40s；退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
7.权利要求1所述的绵羊肉质的基因检测引物在制备检测绵羊肉质的制剂或试剂盒中应用，其特征在于，所述的制剂或试剂盒包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’。
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