CN107893121A - 含acsl4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒 - Google Patents

含acsl4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒，本发明根据利用利用绵羊ACSL4基因的mRNA序列自行人工设计特异性引物，正向引物：5'‑ATCGTTCTGTCACGCACTTC‑3'；反向引物：5'‑GTTCCCAGGCTCTCCTTCTT‑3'，以样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行荧光定量PCR检测，对基因表达量与肌内脂肪含量及脂肪酸含量进行关联分析；本发明从而找出与吐鲁番黑羊肉质显著相关的RNA分子标记，用以提高吐鲁番黑羊的肉质性能，为促进吐鲁番黑羊品种资源的合理开发奠定基础。

Description

含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本发明涉及一种吐鲁番黑羊产肉性能选育的试剂盒的技术领域。
背景技术
吐鲁番黑羊俗称“托克逊黑羊”，是小型地方品种绵羊，成年公羊体重46kg，具有生长速度快、肉质独特等特点，是新疆地方优良肉羊品种。然而新疆地区夏季冬季均长达近半年，最高温度高达42℃度，且最冷可达零下35℃至零下40℃，自然条件恶劣，许多优良品种在这里无法生存。而吐鲁番黑羊就是在这样一个特殊的条件下，通过长期的自然和人工选择而形成的，既适应夏季酷热、冬季严寒的吐鲁番盆地气候；能耐受粗纤维多、木质化强、的牧草植物，且能快速增膘和迅速生长的优良地方绵羊品种。吐鲁番黑羊肉质鲜美，且由于其放牧草场天然无污染，可通过生产有机羊肉，打入高端市场，以此来增加当地农牧民的经济收入，进而提高和改善生活水平。由于新疆地区少数民族的传统习惯和宗教信仰，对于羊肉的需求量极大，近年来羊肉供不应求，价格居高不下。因此，对于解决新疆羊肉供不应求、少数民族生活小康意义重大。
吐鲁番黑羊作为新疆代表性优良品种，具有其独特性，应做好本地品种资源的有效保护，此外，其优良产肉特性没有得到合理的开发利用，极大地不利于当地经济和新疆肉羊产业的发展。因此，运用先进生物技术，结合现代育种技术和传统育种方法，发展新疆优势畜牧业，提高绵羊选育程度，培育肉羊专门化品种，提高羊肉畜产品质量，以加速新疆绵羊产业的发展进程。
目前，在国内外ACSL4基因作为影响家畜肉质性状的候选基因，相关研究的报道多见于人类和小鼠中，在绵羊中鲜有报道，以及基于托克逊大尾黑羊典型性品种的特殊性。现有技术未在国内外见到利用利用ACSL4基因试剂盒对吐鲁番黑羊产肉性状进行选育的研究和报道。
发明内容
针对现有技术中未见报道专门针对ACSL4基因在吐鲁番黑羊产肉性能选育中应用及吐鲁番黑羊自身品种的特殊专有性的技术现状，本发明旨在于提供一种含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒，用于提高吐鲁番黑羊产肉性能。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒，试剂盒包括：
(1)目的基因ACSL4扩增引物：
上游引物F：5'-ATCGTTCTGTCACGCACTTC-3'；
下游引物R：5'-GTTCCCAGGCTCTCCTTCTT-3'。
(2)cDNA模板。
(3)荧光定量PCR反应液和无RNA酶水；
优选的，所述的试剂盒包括2.5×Real Master Mix10μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.5μl。
进一步，本发明提供含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒的应用，包括以下步骤：
(1)吐鲁番黑羊背最长肌、臂三头肌和股四头肌RNA提取：采取吐鲁番黑羊背最长肌、臂三头肌和股四头肌组织样3-5mg，提取RNA，在-80℃保存；反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增。
(2)ACSL4基因PCR扩增：根据设计的引物，特异性扩增ACSL4基因；PCR反应体系为：Mix 10.0μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.5μl，加水至总体积20μl；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s、退火温度30s、72℃延伸1min，循环31次，72℃延伸5min，4℃保存；特异性扩增的PCR产物均由1％琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量。
(3)荧光定量PCR检测：在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5×RealMasterMix 10μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.5μl，加水至总体积20μl；循环条件为95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火30s共40个循环；最后在95℃10s、65℃5s、94℃5s，作熔解曲线。
(4)基因表达量与肌内脂肪含量及脂肪酸含量的关联分析：对ACSL4基因在吐鲁番黑羊背最长肌中的表达量与饱和脂肪酸含量进行显著性检验。
本发明中，吐鲁番黑羊ACSL4基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站NCBI(National Center for Biotechnology)，检索得到绵羊ACSL4基因的cDNA序列(GenBank登录号：ACSL4:NC_019484)，借助公知软件Primer 5.0，自行人工设计特异性引物，引物序列进行合成。
通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：
(1)本发明通过提供含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒及其应用，在新疆吐鲁番黑羊群体中，ACSL4基因的表达量与吐鲁番黑羊饱和脂肪酸含量呈显著正相关，P<0.05，ACSL4基因可作为新疆吐鲁番黑羊影响肉质的一个分子标记，可用于选育并提高吐鲁番黑羊的肉质性能；这不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于保护吐鲁番黑羊的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业发展具有实际应用价值。
(2)本发明通过提供含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒及其应用，吐鲁番黑羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为0.8-1.0，极强相关；其它品种羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为0.0-0.2，无明显相关性，说明本发明提供的含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒具有较好的特异性。
附图说明
图1为总RNA产物电泳图。
图2为PCR扩增产物电泳图，图中，M为DL2000DNA Marker，泳道1-10为PCR扩增产物。
图3为ACTB和ACSL4基因的熔解曲线图。
图4为ACSL4基因的表达量比较图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中的设备和材料有：
采用的主要原材料及相关试剂等：Trizol Total RNA Reagent总RNA提取试剂由北京天根公司提供；Z Serum Clot Activator真空采血血清管由奥地利Greiner Bio-One公司提供；2×Taq PCR MasterMix由博迈德生物(PC0912)提供；DL2000DNA Marker由庄盟生物(ZM404-1)提供；EB由新疆宝信提供。
主要仪器设备：TG16-W微量高速离心机产自长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYCZ-24F型电泳槽和DYY-6C型电泳仪产自北京市六一仪器厂；AL204-IC电子天平产自梅特勒-托勒多仪器厂(上海)有限公司；JY04S凝胶成像仪产自北京君意东方电泳设备有限公司；恒温箱恒温水浴振荡器产自北京桑翌实验仪器研究所。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：
本发明提供含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒，试剂盒包括：
(1)目的基因ACSL4扩增引物：
上游引物F：5'-ATCGTTCTGTCACGCACTTC-3'；
下游引物R：5'-GTTCCCAGGCTCTCCTTCTT-3'
(2)cDNA模板。
(3)荧光定量PCR反应液和无RNA酶水。
优选的，所述的试剂盒包括2.5×Real Master Mix10μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.5μl。
实施例二：
1、组织样RNA提取：
采集待测吐鲁番黑羊背最长肌、臂三头肌和股四头肌组织样3-5mg，液氮保存；提取RNA，在-80℃保存；反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增。
配制1％琼脂糖凝胶：琼脂糖1g，溶于100ml 0.5×TBE，微波炉加热至充分熔解，待降至室温后倒入插有梳子的胶槽内，冷却凝固后待用。
利用配制的1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压100V，电流50mA，电泳30分钟。经溴化已锭染色15分钟后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，电泳图如附图1所示，观察条带的大小和亮度，判断cDNA的提取质量。
2、PCR扩增：
(1)引物设计及合成。根据绵羊ACSL4基因的mRNA序列(GenBank登录号：ACSL4:NC_019484)，利用软件Primer 5.0独立设计引物，引物自身进行合成。设计的引物序列为：
引物的上游引物序列F：5'-ATCGTTCTGTCACGCACTTC-3'，引物的下游引物序列R：5'-GTTCCCAGGCTCTCCTTCTT-3'；扩增片段大小为157bp，碱基参见附后的基因序列表。
(2)PCR扩增反应体系及程序优化。根据所设计引物，特异性扩增ACSL4基因的片段。PCR反应体系为：Mix 10.0μl，上下游引物各0.4μl，DNA模板1.5μl，加水至总体积20μl；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s、退火温度30s、72℃延伸1min，循环31次，72℃延伸5min，4℃保存。
对引物PCR扩增反应程序的退火温度进行优化。在其他反应条件不变的情况下，在PCR仪上对退火温度设置梯度，梯度范围为55℃-65℃，即平均每个板孔变化温度为1℃。经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增条带的亮度和纯度，最终确定引物的最适退火温度为59℃。
特异性扩增的PCR产物均由1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电压100V，电泳30min，经溴化已锭EB染色15min后，于Bio-RAD凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增条带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量，结果参见附图2。
3、荧光定量PCR检测：
(在96孔板中分别加入以下荧光定量PCR反应体系：2.5×RealMasterMix(SYBRGreen)10μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.5μl，加水至总体积20μl；整个反应在BIO-RAD荧光定量PCR序列扩增仪中进行，循环条件为95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火30s共40个循环；最后在95℃10s、65℃5s、94℃5s，作熔解曲线，如附图3所示。为保证特异性的扩增，要求得到的熔解曲线只有一个峰。
4、关联分析：
利用软件SPSS 20.0，将基因的表达量与肌内脂肪酸和脂肪酸含量进行关联分析，结果如下表1和附图4：
表1:吐鲁番黑羊ACSL4基因的表达量与肌内脂肪酸和脂肪酸含量的关联分析
肌内脂肪含量 饱和脂肪酸含量 不饱和脂肪酸含量
背最长肌 -0.76 1* 0.53
臂三头肌 -0.77 -0.62 -0.75
股四头肌 -0.89 0.57 0.46
注：*表示显著相关(P<0.05)。
从表1可以看出，在新疆吐鲁番黑羊群体中，ACSL4基因的表达量与吐鲁番黑羊饱和脂肪酸含量呈显著正相关，P<0.05，ACSL4基因可作为新疆吐鲁番黑羊影响肉质的一个分子标记，由此可见本发明提供的含ACSL4基因的检测试剂盒用于选育并提高吐鲁番黑羊的肉质性能具有典型性。
实施例三：
基于实施例二，在上述实施例提供的含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒应用于小鼠、小尾寒羊、卡拉库尔羊、和田羊、哈萨克羊、巴音布鲁克羊中，观测ACSL4基因在其背最长肌中的表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联度。具体见表2：
表2:ACSL4基因表达量与部分肉品质指标的相关系数
脂肪酸含量 水分含量 背最长肌剪切力
吐鲁番黑羊 0.94 0.92 0.90
小鼠 0.48 0.56 0.38
小尾寒羊 0.12 0.07 0.09
卡拉库尔羊 0.06 0.14 0.04
和田羊 0.15 0.08 0.05
哈萨克羊 0.15 0.16 0.08
巴音布鲁克羊 0.09 0.21 0.18
注：0.0-0.2无相关，0.4-0.6中等程度相关，0.8-1.0极强相关。
由表2分析可知，吐鲁番黑羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为0.8-1.0，表示极强相关；ACSL4基因在小鼠背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量相关系数为0.4-0.6，表示中等程度相关，其它品种羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为0.0-0.2，无明显相关性，说明本发明提供的含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒具有较好的特异性。
实施例四：
采集待测吐鲁番黑羊个体的背最长肌、臂三头肌和股四头肌肌肉组织样3-5mg，提取RNA，并反转录为cDNA；自行设计引物，进行PCR扩增，其中退火温度为59℃；应用荧光定量PCR技术对其表达量进行检测，在将其表达量与肌内脂肪含量及脂肪酸含量进行关联分析。对于该基因表达量低的，可淘汰；表达量高的，可留用，以此来选育提高新疆吐鲁番黑羊的肉品质。
表3:不同吐鲁番黑羊个体ACSL4基因表达量
由表3可知，2号吐鲁番黑羊的ACSL4基因表达量明显高于其他，可留用；其他吐鲁番黑羊ACSL4基因表达量较低，可淘汰，以此来选育提高新疆吐鲁番黑羊的肉品质。
本发明通过提供吐鲁番黑羊产肉性能选育的ACSL4基因试剂盒及其应用，利用荧光定量PCR技术对新疆吐鲁番黑羊ACSL4基因的表达量进行检测，并与肌内脂肪含量及脂肪酸含量进行关联分析，从而找出与吐鲁番黑羊肉质显著相关的RNA分子标记，用以提高吐鲁番黑羊的肉质性能；这不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于保护吐鲁番黑羊的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业发展具有实际应用价值。
如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
序列表
<110> 新疆农业大学
<120> 含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (１)..(２０)
<223> 目的基因ACSL4上游引物
<400> 1
atcgttctgt cacgcacttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (１)..(２０)
<223> 目的基因ACSL4下游引物
<400> 2
gttcccaggc tctccttctt 20

Claims (4)

1.含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
（1）目的基因ACSL4扩增引物：
上游引物F：5'-ATCGTTCTGTCACGCACTTC-3'；
下游引物R：5'-GTTCCCAGGCTCTCCTTCTT-3'；
（2）cDNA模板；
（3）荧光定量PCR反应液和无RNA酶水。
2.如权利要求1所述含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应液为2.5×Real Master Mix。
3.如权利要求1所述含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括2.5×Real Master Mix10μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.5μl。
4.一种如权利要求1所述含ACSL4基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）吐鲁番黑羊背最长肌、臂三头肌和股四头肌RNA提取：采取吐鲁番黑羊背最长肌、臂三头肌和股四头肌组织样3-5mg，提取RNA，在-80℃保存；反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增；
（2）ACSL4基因PCR扩增：根据设计的引物，特异性扩增ACSL4基因；PCR反应体系为：Mix10.0μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.5μl，加水至总体积20μl；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s、退火温度30s、72℃延伸1min，循环31次，72℃延伸5min，4℃保存；特异性扩增的PCR产物均由1%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量；
（3）荧光定量PCR检测：在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5×RealMasterMix 10μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.5μl，加水至总体积20μl；循环条件为95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火30s共40个循环；最后在95℃10s、65℃5s、94℃5s，作熔解曲线；
（4）基因表达量与肌内脂肪含量及脂肪酸含量的关联分析：对ACSL4基因在吐鲁番黑羊背最长肌中的表达量与饱和脂肪酸含量进行显著性检验。
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