CN116144808A - 一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明针对编码大肠埃希氏菌共有的β‑D‑葡糖醛酸糖苷酶的uidA基因上的保守序列，按等温扩增技术(LAMP)的独特特征，设计筛选出了5组特异性等温扩增的引物组合，通过该引物组合建立了以该引物组合为核心的LAMP法检测体系和检测方法，可快速识别水、食品、环境等公共卫生领域的大肠埃希氏菌，与现在食品卫生检验的常规培养方法比较，具有灵敏度高、可视化，检测快速等优点。

Description

一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合及检测方法。

背景技术

大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)是最常见的食源性病原微生物之一，也是临床上最常见的导致腹泻的病原体之一。大肠埃希氏菌原本是肠道中重要的正常菌群，在婴儿出生后数小时内就定植于婴儿的胃肠道，这些共生的大肠埃希氏菌菌株很少引起疾病。但在人体免疫力下降或细菌侵入肠道外组织器官后，即可成为机会致病菌。此外，某些血清型的大肠埃希氏菌获得了特定的毒力基因，具有广泛的致病性，能引起肠胃炎。大肠埃希氏菌在随人或动物的粪便排出体外后能在环境中生存较长时间，并通过污染食品等导致人和其他动物患病；即便不造成腹泻，致泻性大肠埃希氏菌的感染也可能使被感染的儿童发育迟缓。

大肠埃希氏菌是一类革兰染色阴性的短棒状兼性厌氧杆菌。多数菌株有周身鞭毛和菌毛，无芽孢。其生长速度快，培养要求低，常常被用作生物研究领域的工程菌，因此关于其各种特性的研究已十分详实。长期以来，针对大肠埃希氏菌的检测作为一种重要生物指标被广泛用于医药、食品、农业等各个领域。目前常用的方法主要有对活菌进行检测的培养法；以病原体特异性抗原为检测靶点的免疫学检查方法如酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫荧光技术(Immunofluorescence technique,IFT)等；以病原体的核酸为检测靶点的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)、基因芯片(Gene chip,GC)技术等。培养法检出活菌是检测各种病原菌的金标准，其检测灵敏度极高、特异性强，并能进行定量检测；但缺点是操作复杂、耗时良久。ELISA和IFT技术的特点比较相似，都有灵敏度高、特异性强、检测速度快的优点；但其缺点是操作复杂、检测成本较高。而在核酸检测技术中：PCR是最经典的核酸检测技术，优点是检测快速、准确；缺点是需要另外进行后续操作才能对结果进行判读，且仪器较昂贵。qPCR是对PCR的改进，在PCR快速检测的基础上，对结果实现了一定程度上的实时定量和可视化；但qPCR所需要的仪器比PCR所用仪器更为昂贵。GC的自动化程度高，可一次分析大量样品，检测快速、准确；但成本很高。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合及检测方法,由于大肠埃希菌菌株具有β-D-葡糖醛酸糖苷酶(β-D-glucuronidase,GUS)活性，在本发明中，针对编码大肠埃希氏菌β-D-葡糖醛酸糖苷酶的uidA基因上的保守序列设计了5组环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物组合，并建立了以该引物组合为核心的LAMP法检测体系和检测方法，该方法能快速进行核酸扩增，具有简单、快速、特异性强、检测成本低的特点。

本发明采用下述的技术方案：

一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合，所述引物组合为引物组合1，所述引物组合1包括正向内引物uidA1-FIP、反向内引物uidA1-BIP、正向环引物uidA1-LoopF、反向环引物uidA1-LoopB、正向外引物uidA1-F3、反向外引物uidA1-B3；所述引物组合1中各引物序列分别为：

正向内引物uidA1-FIP：

GCCCAGTCGAGCATCTCTTCAG-GGATTGGGGCCAACTCCT(序列表序列号1所示)；

反向内引物uidA1-BIP：

ATGAAACTGCTGCTGTCGGCT-CAGTTCTTTCGGCTTGTTGC(序列表序列号2所示)；

正向环引物uidA1-LoopF：

GGGTAATGCGAGGTACGGT(序列表序列号3所示)；

反向环引物uidA1-LoopB：

AACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCG(序列表序列号4所示)；

正向外引物uidA1-F3：

CGACCACGCATTAATGGACT(序列表序列号5所示)；

反向外引物uidA1-B3：

TGACTGCCTCTTCGCTGTA(序列表序列号6所示)。

进一步的，所述引物组合1对大肠埃希菌的检测限为1.0×10¹CFU/mL。

一种大肠埃希菌快速核酸检测方法包括以下步骤：

(1)热裂解法处理样本，获取样本DNA；没有用到专门的试剂盒提取DNA，使该检测方法能够适应粗糙实验环境的需求，降低成本；

(2)进行LAMP可视化检测，所述LAMP可视化检测步骤包括样本DNA、LAMP反应体系、采用的反应条件；

(3)可视化结果观察，反应体系颜色为红色，则为阴性结果；反应体系颜色为黄色，则为阳性结果。

进一步的，所述LAMP反应体系包括LAMP反应液、引物组合1Mix；所述LAMP反应液包括1.4mmol/L dNTP Mix、20mmol/L Tris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、6mmol/LMgSO₄、0.1％Triton X-100、320U/mLBst DNA聚合酶、10μmol/L苯酚红酸碱指示剂；所述引物组合1Mix包括0.2μmol/LuidA1-F3、0.2μmol/L uidA1-B3、1.6μmol/L uidA1-FIP、1.6μmol/L uidA1-BIP、0.8μmol/LuidA1-LoopF、0.8μmol/LuidA1-LoopB。

进一步的，所述反应条件包括反应温度60℃-65℃和反应时间30-60min。

一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合及检测方法在大肠埃希菌检测试剂盒中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明旨在建立一种针对所有种类大肠埃希氏菌的通用的灵敏、特异、快速的核酸检测方法。与传统的培养法相比，本发明提供的LAMP可视化检测法的操作更简便、成本更低廉，具有灵敏度高、可视化，检测快速等优点，尤其是将培养法2-3天的检测时间缩短到30-60分钟，大大提高了检测效率，非常适合大规模样品的快速检测，可快速识别水、食品、环境等公共卫生领域的大肠埃希氏菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。

图1引物组合1-5的筛选结果；

图2引物组LAMP检测的特异性和广谱性；

图3引物组合1的LAMP可视化检测结果；

图4琼脂糖凝胶电泳验证引物组合1的可视化检测结果；

图5引物组合1的反应温度筛选LAMP可视化结果；

图6引物组合1的反应温度筛选凝胶电泳验证结果；

图7引物组合1的反应时间筛选LAMP可视化结果；

图8引物组合1的反应温度筛选凝胶电泳验证结果；

图9引物组合1的荧光定量扩增结果；

图10引物组合1的LAMP可视化检测灵敏度测定；

图11引物组合1的LAMP反应灵敏度测定的琼脂糖凝胶电泳结果；

图12传统培养法检测待测样本中大肠埃希菌结果；

图13LAMP法检测待测样本中大肠埃希菌可视化结果；

图14LAMP法检测待测样本中大肠埃希菌凝胶电泳结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一热裂解法对阳性对照标准品/空白对照标准品的制备

先将培养好的大肠埃希菌标准菌株ATCC 44122菌液/空白对照培养液100℃水浴加热10min，然后1000rpm离心1min，取上清液分装于EP管内，置于-20℃冰箱保存，即得到阳性样本/阴性样本。

实施例二热裂解法对待测样本的制备

将收集到的液体样本(固体样本则先用无菌生理盐水进行溶解)稀释到一定倍数后，100℃水浴加热10min，然后1000rpm离心1min，取上清液用于检测。

实施例三LAMP反应体系建立及反应结果验证

实验优化出最佳引物浓度配比和反应液浓度，将各组分液按照表1和表2的配比加入到八连管内，充分混合后短离心至所有液体于管底，形成25μL的LAMP反应体系。盖上管盖并做好相应标记，将八连管置于PCR仪或qPCR仪内，60-65℃反应30-60min。体系中添加了苯酚红指示剂以建立可视化系统，则以肉眼观察终产物的颜色对反应结果进行判读，红色为阴性结果，黄色为阳性结果。

在体系中添加SYBR Green I作为指示剂以建立荧光信号检测系统，则以qPCR仪检测的荧光信号强度变化对LAMP反应结果进行验证，荧光信号明显增强、出现扩增曲线则为阳性结果，荧光信号无显著变化、无扩增曲线则为阴性结果。不添加指示剂时，则以2％琼脂糖凝胶电泳对LAMP反应体系中的核酸产物进行验证，琼脂糖凝胶电泳结果出现明亮连续瀑布样条带则为阳性结果，未出现条带则为阴性结果。

表1引物Mix配比

表2 LAMP反应液

实施例四引物组合的筛选

基于大肠埃希菌uidA基因设计5组LAMP法引物组合，各组引物序列情况如表3-7所示，引物由生工生物有限公司合成。引物组合1-5对阴性样本和阳性样本进行LAMP检测，结果如图1所示，引物组合1(序列表序列号1-6所示)、引物组合2(序列表序列号7-12所示)具有较好的检测能力；引物组合3(序列表序列号13-18所示)、引物组合5(序列表序列号25-30所示)在阴性样本的检测中出现了非特异性扩增；引物组合4(序列表序列号19-24所示)在阳性样本的检测中未能进行反应，。

表3引物组合1序列情况

表4引物组合2序列情况

表5引物组合3序列情况

表6引物组合4序列情况

表7引物组合5序列情况

实施例五基于大肠埃希菌uidA基因引物组的LAMP检测的特异性和广谱性

为了验证基于前述引物组合1和引物组合2的大肠埃希菌uidA基因LAMP检测的特异性和广谱性，应用大肠埃希菌标准菌株ATCC 44122和四川大学华西基础医学与法医学院感染与免疫教研室王保宁课题组保存的两株大肠埃希菌工程菌(分别记为WBN1、WBN2)以及乙型溶血性链球菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌等10种细菌的核酸样本作为待测样品在65℃下反应1h进行LAMP实验。如图2所示，2％琼脂糖凝胶电泳结果显示：引物组合1在加入大肠埃希菌标准菌株ATCC 44122样本及实验室保存的大肠埃希菌工程菌WBN1、WBN2样本的孔均出现扩增条带，其他菌株未见扩增条带；引物组合2则在对志贺菌进行检测时也出现了阳性条带，故引物组合2特异性不佳。因此，本方法建立的基于引物组合1的大肠埃希菌uidA基因LAMP检测具有较好的特异性和广谱性。

实施例六基于大肠埃希菌uidA基因引物组的LAMP检测反应条件的筛选

在LAMP反应过程中，当发生了扩增反应时，反应会不断消耗dNTPs生成新的DNA链并产生焦磷酸镁、氢离子等副产物，这使得溶液的pH值不断降低。因此，为对反应进行便捷地结果判读，可向体系中加入苯酚红酸碱指示剂(变色范围pH 6.8-8.4，红色变为黄色)，在65℃水浴锅中反应1h后肉眼观察颜色变化来判断反应是否发生。如图3所示，可见加入阳性样本的孔反应后变为黄色，加入阴性样本的孔反应后仍为红色。用2％琼脂糖凝胶电泳对可视化结果进行验证，结果如图4所示，可见加入阳性对照对应的跑道出现了扩增条带，而阴性对照对应的跑道中无扩增条带。

为了筛选最佳反应温度，将扩增温度分别设置为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃，恒温扩增1h后观察可视化结果。如图5所示，该体系仅在64℃和65℃条件下反应时阳性反应孔能产生肉眼可观察到的明显变化，且温度为65℃时阴性对照和阳性对照颜色差异最为明显。用2％琼脂糖凝胶电泳进行验证，如图6所示，用2％琼脂糖凝胶电泳可以看到在65℃时扩增条带最亮、最清晰。因此，大肠埃希菌uidA基因LAMP检测的最佳反应温度为65℃。

为了筛选最佳反应时间，应用苯酚红酸碱指示剂，验证反应体系在65℃下反应0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min的显色性能，结果如图7所示，在反应达到30min时及30min后可视化体系显色明显。对各孔反应后的液体进行琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图8所示。反应30min及以上的组出现极清晰的条带，与可视化体系的实验结果一致。将反应体系中的苯酚红换成SYBR Green I荧光染料，应用荧光定量PCR仪每2min测定一次反应体系的荧光信号强度，绘制出荧光信号强度-时间曲线，结果如图9所示，荧光信号在30min后已达到峰值。因此，在实际应用中，为快速进行检测，在65℃条件下反应30min便可很好地达到检测目的。

实施例七基于大肠埃希菌uidA基因引物组的LAMP检测的灵敏度

为确定本专利的引物组合及反应体系检测粗制样本中大肠埃希菌的灵敏度，培养并稀释获得菌液浓度为1.0×10⁹CFU/mL、1.0×10⁸CFU/mL、1.0×10⁷CFU/mL、1.0×10⁶CFU/mL、1.0×10⁵CFU/mL、1.0×10⁴CFU/mL、1.0×10³CFU/mL、1.0×10²CFU/mL、1.0×10¹CFU/mL、1.0×10⁰CFU/mL的大肠埃希菌ATCC 44122菌株菌液，通过热裂解法裂解菌液中的大肠埃希菌并离心取上清作为粗制样品进行灵敏度实验。如图10所示，可视化检测结果显示反应体系能对1.0×10⁹CFU/mL、1.0×10⁸CFU/mL、1.0×10⁷CFU/mL、1.0×10⁶CFU/mL、1.0×10⁵CFU/mL、1.0×10⁴CFU/mL、1.0×10³CFU/mL、1.0×10²CFU/mL、1.0×10¹CFU/mL的样本进行扩增。如图11所示，琼脂糖凝胶电泳结果与可视化检测结果一致。因此，本方法针对大肠埃希菌uidA基因建立的大肠埃希菌通用检测方法具有较高的灵敏度，检测限为1.0×10¹CFU/mL。

实施例八基于大肠埃希菌uidA基因引物组的LAMP检测与培养法效果对比

为评价本专利所建立的检测方法效果，将本方法与GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》使用的培养法效果进行对比。

将被粪便污染的牛奶作为待测样本，分别按照两种方法对样本中的大肠埃希菌进行检测。将待测样本用无菌生理盐水进行10倍倍比稀释后依次获得稀释倍数为1:10、1:100、1:1,000、1:10,000、1：100,000、1:1,000,000、1：10,000,000、1:100,000,000的稀释液，将各稀释倍数的稀释液用倾注法在结晶紫中性红胆盐琼脂中进行培养法检测大肠菌群；将剩余的稀释液热裂解并离心取上清作为LAMP法检测的核酸样本。

将结晶紫中性红胆盐琼脂平板置于37℃恒温培养箱内培养24h后，计数各平板上菌落数，发现接种1:10000倍稀释液的平板上的典型菌落和可疑菌落共为21个。挑取其中的典型菌落和可疑菌落共10个接种于放有倒置小试管并盛有煌绿乳糖胆盐肉汤培养基的大试管内进行发酵实验，将试管放置于恒温培养箱(37℃，200rpm)培养24h后结果如图12所示。10支试管中有9支均较浑浊且有大量气体储存在倒置小试管内，因此均报告为大肠菌群阳性。经计算可得原待检样本中大肠菌群数为21×9/10×10⁴/mL＝1.9×10⁵CFU/mL。

LAMP法检测结果如图13(可视化)、图14(琼脂糖凝胶电泳)所示，提示原待检样本中大肠埃希菌数在1×10⁴CFU/mL～1×10⁵CFU/mL区间内。

综合比较两种检测方法可知，本专利建立的LAMP法与传统的培养法相比，虽然不能精确定量大肠埃希菌，但能满足检测需求，而且LAMP法的操作更简便、成本更低廉，尤其是将培养法2-3天的检测时间缩短到30-60分钟，大大提高了检测效率，非常适合大量样品的快速检测。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合为引物组合1，所述引物组合1包括正向内引物uidA1-FIP、反向内引物uidA1-BIP、正向环引物uidA1-LoopF、反向环引物uidA1-LoopB、正向外引物uidA1-F3、反向外引物uidA1-B3；所述引物组合1中各引物序列分别为：

(1)正向内引物uidA1-FIP：

GCCCAGTCGAGCATCTCTTCAG-GGATTGGGGCCAACTCCT(序列表序列号1所示)；

(2)反向内引物uidA1-BIP：

ATGAAACTGCTGCTGTCGGCT-CAGTTCTTTCGGCTTGTTGC(序列表序列号2所示)；

(3)正向环引物uidA1-LoopF：

GGGTAATGCGAGGTACGGT(序列表序列号3所示)；

(4)反向环引物uidA1-LoopB：

AACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCG(序列表序列号4所示)；

(5)正向外引物uidA1-F3：

CGACCACGCATTAATGGACT(序列表序列号5所示)；

(6)反向外引物uidA1-B3：

TGACTGCCTCTTCGCTGTA(序列表序列号6所示)。

2.根据权利要求1所述的一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合1对大肠埃希菌的检测限为1.0×10¹CFU/mL。

3.一种大肠埃希菌快速核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)热裂解法处理样本，获取样本DNA；

(2)进行LAMP可视化检测，所述LAMP可视化检测步骤包括样本DNA、LAMP反应体系、采用的反应条件；

(3)可视化结果观察，反应体系颜色为红色，则为阴性结果；反应体系颜色为黄色，则为阳性结果。

4.根据权利要求2所述的一种大肠埃希菌快速核酸检测方法，其特征在于，所述LAMP反应体系包括LAMP反应液、权利要求1所述的引物组合1Mix；所述LAMP反应液包括1.4mmol/LdNTP Mix、20mmol/L Tris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH4)₂SO₄、6mmol/LMgSO₄、0.1％Triton X-100、320U/mLBst DNA聚合酶、10μmol/L苯酚红酸碱指示剂；所述引物组合1Mix包括0.2μmol/LuidA1-F3、0.2μmol/L uidA1-B3、1.6μmol/L uidA1-FIP、1.6μmol/L uidA1-BIP、0.8μmol/LuidA1-LoopF、0.8μmol/LuidA1-LoopB。

5.根据权利要求2所述的一种大肠埃希菌快速核酸检测方法，其特征在于，所述反应条件包括反应温度60℃-65℃和反应时间30-60min。

6.权利要求1-5所述的一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合及检测方法在大肠埃希菌检测试剂盒中的应用。

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