CN111893200A - 一种副溶血性弧菌的荧光定量rpa检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法，包括以下步骤，S1，副溶血性弧菌核酸的提取，S2，副溶血性弧菌荧光定量RPA引物的设计，S3，副溶血性弧菌普通RPA的建立，S4，副溶血性弧菌荧光定量RPA探针设计，S5，副溶血性弧菌荧光定量RPA灵敏度试验。本发明利用复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37‑42℃下反应20‑30分钟即可，与普通PCR方法及荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器，与传统的VP诊断方法：琼脂扩散实验(AGP)和间接ELISA方法相比，具有反应时间快的优点。

Description

一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法
技术领域
本发明涉及海产品中副溶血性弧菌快速检测技术领域，尤其涉及一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)隶属于γ-变形菌(Gammaproteobacteria)，弧菌目(Vibrionales)，弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)，为革兰氏阴性嗜盐菌。该菌是一种人的重要食源性致病菌，可引起腹泻、肠胃炎、伤口感染、败血症等疾病，甚至死亡。
副溶血性弧菌从1950年被分离鉴定出来到目前将近70年了，在该菌研究历程中有三个重要的时间节点使得人们对副溶血性弧菌发生新的认识。1950年分离到该病原菌，当时发生在日本大阪的一起沙丁鱼造成的食物中毒分离到了从前未知的新的一种细菌，事后才命名为副溶血性弧菌。该中毒事件当时造成了272人发病、20人死亡。随后，在1956年和1960年又暴发了2起由该菌引起的食物中毒。
据统计，在1965年～1974年间，日本有高达24％的食物中毒是由副溶血性弧菌引起的。在我国，1973年11月于北京召开的食品卫生细菌学检验方法座谈会上结合国际命名，建议将嗜盐菌改名为副溶血性弧菌，并且在1975年8月在盘锦地区发生了一起副溶血性弧菌集中暴发的食物中毒报道。
目前，副溶血性弧菌腹泻感染的状况呈现感染人数和病例数不断上升的趋势。根据美国CDC的数据报道，2012年副溶血性弧菌感染率相比2006年～2008年上升了43％，而沙门菌和O157大肠杆菌并没明显变化。在许多沿海国家和地区如：美国、日本、印度等国，副溶血性弧菌是食源性疾病感染的主要病原菌，占细菌性事件的一半以上。在我国，副溶血性弧菌无论是食物中毒发生次数或发病人数均超过沙门菌，成为主要的病原菌。
我国对海产品及水产品调味品中副溶血性弧菌的含量进行规定，依据国标GB29921—2013食品安全国家标准食品中致病菌限量，在熟制水产品即食生制水产品即食藻类制品中n＝5c＝1副溶血性弧菌限量100MPN/g，不超过1000MPN/g；即食(水产品)调味品酱油、酱及酱制品、水产调味品、复合调味料(沙拉酱等)n＝5、c＝1100副溶血性弧菌限量MPN/g(mL)，不超过1000MPN/g(mL)。
海产品中副溶血性弧菌的主要检查方法，依据GB4789.7—2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验方法，从样品中分离出副溶血性弧菌，经过制备、增菌后可采取显色培养基进行分离，该方法耗时较久。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification RPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可。与普通PCR方法及荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。与传统的VP诊断方法：琼脂扩散实验(AGP)和间接ELISA方法相比，具有反应时间快的优点。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内。
本研究将利用RPA技术建立一种快速检测海产品中副溶血性弧菌的方法
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法。
本发明提出的一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法，包括以下步骤：
S1：副溶血性弧菌核酸的提取，取副溶血性弧菌标准菌株冻干粉，使用0.2mL生理盐水溶解菌株冻干粉，涂于血琼脂平板，37℃培养18h，挑单菌培养，取菌液1mL，3000rpm离心10min，弃掉上清液液，加150μL的PBS悬起，金属浴99℃煮沸10min，冰浴3min，离心10min，取上清液，获得即为细菌基因组DNA，存放-80℃保存；
S2：副溶血性弧菌荧光定量RPA引物的设计，通过生物信息学手段，选取副溶血性弧菌种属特异性基因tlh基因GenBank(MH047288)作为保守区域设计引物；
S3：副溶血性弧菌普通RPA的建立，按照基础型RAA试剂盒的说明书，配制如下反应体系：依次在含有干粉酶的反应管中加入A buffer 41.5ul、上游引物F(10umol/L)2ul、下游引物R(10umol/L)2ul、DNA模板2ul，在反应管的盖子上加入B buffer 2.5ul，然后将反应管上下颠倒数次进行混匀，低速离心10秒，立即放置39℃金属浴锅中，孵育30min，反应结束后，使用PCR产物纯化试剂盒对基础型RAA产物进行纯化，取5ul纯化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪观察电泳结果，确定能扩增出产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体的引物对组合(F3+R3)后；
S4：副溶血性弧菌荧光定量RPA探针设计，针对F3+R3引物扩增产物序列，设计长度46-52bp的探针，将靠近的2个T碱基分别以荧光基团(i6FAMdT)和猝灭基团(iBHQ1dT)代替，i6FAMdT和iBHQ1dT必须是替换目的基因中相应碱基T，而不是插入，荧光基团和猝灭基团间隔2-4个碱基，选择一个用THF代替，THF之前不能少于30个碱基，THF之后15个碱基左右，3'末端标记一个修饰基团，例如C3-spacer，探针序列和引物识别位点不能重叠，避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；
S5:副溶血性弧菌荧光定量RPA灵敏度试验，取S1中所得核酸，用10倍比例稀释用做模板进行荧光RPA检测，模板浓度从3×102ng·uL-1～3×10-3ng·uL-1，共6个梯度，参照荧光型RAA试剂盒的说明书，实验ddH2O做空白对照，以确定建立的方法的灵敏度。
优选地，所述S2中副溶血性弧菌RPA引物序列表如下所示：
Figure BDA0002617768330000041
Figure BDA0002617768330000051
优选地，所述S4中设计出的探针序列如下所示：
Figure BDA0002617768330000052
本发明的有益效果为：
本发明中，RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可，与普通PCR方法及荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器，与传统的VP诊断方法：琼脂扩散实验(AGP)和间接ELISA方法相比，具有反应时间快的优点。
附图说明
图1为本发明提出的一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法的副溶血性弧菌RPA引物位置分布图；
图2为本发明提出的一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法的副溶血性弧菌RPA扩增产物电泳图；
图3为本发明提出的一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法的副溶血性弧菌荧光定量RPA扩增图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-3，一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法，包括以下步骤：
步骤1，副溶血性弧菌核酸的提取：
从广东省微生物菌种保藏中心购买获得副溶血性弧菌(ATCC17802)标准菌株。取0.2mL生理盐水溶解冻干粉，涂于血琼脂平板，37℃培养18h，挑单菌培养，取菌液1mL，3000rpm离心10min，弃掉上清液液，加150μL的PBS悬起，金属浴99℃煮沸10min，冰浴3min，离心10min，取上清液，存放-80℃保存。
步骤2，副溶血性弧菌荧光定量RPA引物的设计：
通过生物信息学手段，选取副溶血性弧菌种属特异性基因tlh基因GenBank(MH047288)作为保守区域设计引物，如图1示意位置分别设计4对RPA引物序列如下表：
副溶血性弧菌RPA引物序列表
Figure BDA0002617768330000071
步骤3，副溶血性弧菌普通RPA的建立：
按照杭州众测(基础型)RAA试剂盒(批号：82831002)的说明书，配制如下反应体系：依次在含有干粉酶的反应管中加入A buffer 41.5ul、上游引物F(10umol/L)2ul、下游引物R(10umol/L)2ul、DNA模板2ul，在反应管的盖子上加入B buffer 2.5ul，然后将反应管上下颠倒数次进行混匀，低速离心10秒，立即放置39度金属浴锅中，孵育30min。反应结束后，使用宝生物公司PCR产物纯化试剂盒对基础型RAA产物进行纯化，取5ul纯化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪观察电泳结果。如图2.2所示，确定能扩增出产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体的引物对组合(F3+R3)后，方可合成探针做下一步实验，参照图2，泳道M为DL500 DNA Marker、泳道1为F1+R1、泳道2为F2+R2、泳道3为F3+R3、泳道4为F4+R4、泳道6为阳性对照；
步骤4，副溶血性弧菌荧光定量RPA探针设计：
针对F3+R3引物扩增产物序列，设计长度46-52bp的探针，将靠近的2个T碱基分别以荧光基团(i6FAMdT)和猝灭基团(iBHQ1dT)代替，i6FAMdT和iBHQ1dT必须是替换目的基因中相应碱基T，而不是插入；荧光基团和猝灭基团间隔2-4个碱基，选择一个用THF代替，THF之前不能少于30个碱基；THF之后15个碱基左右；3'末端标记一个修饰基团，例如C3-spacer。探针序列和引物识别位点不能重叠，避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。由以上原则设计出的探针序列如下表：
副溶血性弧菌荧光定量RPA探针及引物序列表
Figure BDA0002617768330000081
Figure BDA0002617768330000091
步骤5，副溶血性弧菌荧光定量RPA灵敏度试验：
利用步骤1得到的核酸，用10倍比例稀释用做模板进行荧光RPA检测，模板浓度从3×102ng·uL-1～3×10-3ng·uL-1，共6个梯度，参照杭州众测(荧光型)RAA试剂盒的说明书，实验ddH2O做空白对照。以确定建立的方法的灵敏度，结果如图3所示，从图3结果可知副溶血性弧菌荧光定量RPA核酸检出限值为3×10-2ng·uL-1。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：副溶血性弧菌核酸的提取，取副溶血性弧菌标准菌株冻干粉，使用0.2mL生理盐水溶解菌株冻干粉，涂于血琼脂平板，37℃培养18h，挑单菌培养，取菌液1mL，3000rpm离心10min，弃掉上清液液，加150μL的PBS悬起，金属浴99℃煮沸10min，冰浴3min，离心10min，取上清液，获得即为细菌基因组DNA，存放-80℃保存；
S2：副溶血性弧菌荧光定量RPA引物的设计，通过生物信息学手段，选取副溶血性弧菌种属特异性基因tlh基因GenBank(MH047288)作为保守区域设计引物；
S3：副溶血性弧菌普通RPA的建立，按照基础型RAA试剂盒的说明书，配制如下反应体系：依次在含有干粉酶的反应管中加入A buffer 41.5ul、上游引物F(10umol/L)2ul、下游引物R(10umol/L)2ul、DNA模板2ul，在反应管的盖子上加入B buffer 2.5ul，然后将反应管上下颠倒数次进行混匀，低速离心10秒，立即放置39℃金属浴锅中，孵育30min，反应结束后，使用PCR产物纯化试剂盒对基础型RAA产物进行纯化，取5ul纯化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪观察电泳结果，确定能扩增出产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体的引物对组合(F3+R3)后；
S4：副溶血性弧菌荧光定量RPA探针设计，针对F3+R3引物扩增产物序列，设计长度46-52bp的探针，将靠近的2个T碱基分别以荧光基团(i6FAMdT)和猝灭基团(iBHQ1dT)代替，i6FAMdT和iBHQ1dT必须是替换目的基因中相应碱基T，而不是插入，荧光基团和猝灭基团间隔2-4个碱基，选择一个用THF代替，THF之前不能少于30个碱基，THF之后15个碱基左右，3'末端标记一个修饰基团，例如C3-spacer，探针序列和引物识别位点不能重叠，避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；
S5:副溶血性弧菌荧光定量RPA灵敏度试验，取S1中所得核酸，用10倍比例稀释用做模板进行荧光RPA检测，模板浓度从3×102ng·uL-1～3×10-3ng·uL-1，共6个梯度，参照荧光型RAA试剂盒的说明书，实验ddH2O做空白对照，以确定建立的方法的灵敏度。
2.根据权利要求1所述的一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法，其特征在于，所述S2中副溶血性弧菌RPA引物序列表如下所示：
Figure FDA0002617768320000021
3.根据权利要求1所述的一种副溶血性弧菌的荧光定量RPA检测方法，其特征在于，所述S4中设计出的探针序列如下所示：
Figure FDA0002617768320000031
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