CN101660004B - 贝类gⅱ型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒 - Google Patents
贝类gⅱ型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了贝类GII型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒。本发明上游引物的正向核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；与该引物配合使用的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，且该探针5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，上述引物和探针可制备成试剂盒用于贝类GII型扎幌样病毒检测。本发明还公开了一种检测贝类GII型扎幌样病毒的方法。本发明引物和探针特异性好，制备成试剂盒用于贝类GII型扎幌样病毒的检测灵敏度、准确性高；本发明检测方法可以快速直观判断样品是否含有GII型扎幌样病毒，并能准确测定样品中GII型扎幌样病毒的拷贝数含量。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术，具体涉及贝类GII型扎幌样病毒的检测。
背景技术
扎幌样病毒(Sapporo-like viruses，SLVs)属于人类杯状病毒科，是引起非菌性急性胃肠炎暴发流行的重要因素之一，在世界上很多国家均有其爆发流行的相关报道。SLVs为单股正链RNA病毒，包括3个开放阅读框(ORF)。扎幌样病毒一般被分为GI、GII、GIII、GIV、GV5个亚型，其中除GIII感染猪外，其它四个亚型均只感染人类。GII型扎幌样病毒的基因序列多变，样本中的病毒含量较低，不易被检测。GII型SLVs可通过粪口途径和人-人接触进行传播。生食贝类等水产品可引起GII型扎幌样病毒的大面积感染，因此如果能在贝类等水产品中检测GII型SLVs，并对感染的食品源头加以控制，有利于政府监控GII型SLVs突发公共卫生事件，具有重要的社会和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供贝类GII型扎幌样病毒检测用的引物、探针和试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种贝类GII型扎幌样病毒的检测方法。
本发明目的通过如下方案予以实现：通过分析已报道扎幌样病毒RNA多聚酶与衣壳蛋白的连接区域，分别设计引物和探针序列用于实时荧光定量PCR。上游引物的核苷酸序列(SLVs-FP)如SEQ IDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列(SLVs-RP)如SEQ ID NO：2所示(通用核苷酸符号：y＝c or t；s＝c or g；r＝a or g；h＝a，c or t；v＝a，c or g)；与该引物配合使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，且该探针5’端标记有报告基团(如FAM、VIC等)，3’端标记有荧光淬灭基团(如TAMRA等)。以样本总RNA为模板，在50μL反应体系中含有：5×荧光定量PCR缓冲液10μL，1μL dNTPs(20ummol/L)，1.5μL引物SLVs-RP(10ummol/L)，1.5μL引物SLVs-FP(10ummol/L)，1μL荧光探针(10ummol/L)，50ng总RNA(3μL)，1μL Taq酶(3U)，并用DEPC处理水补充到50μL，进行实时荧光定量PCR扩增，反应条件是：93℃，3min；93℃，30s；54℃，40s共做40个循环。当探针完整的时候，5’端报告基因所发射的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，仪器检测不到荧光信号；随着实时荧光定量PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基因远离淬灭基团，其能量不能被吸收故发出的荧光信号被仪器检测到，每个循环接收采集数据，故每经过一个PCR循环，荧光信号随着目的片段的延伸有一个同步指数增长的过程，反应结束后根据扩增曲线判定结果，从而实现对GII型扎幌样病毒的检测和定量。也可用含有本发明引物和探针的试剂盒通过实时荧光定量PCR检测贝类GII型扎幌样病毒。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明引物和探针特异性好，制备成试剂盒用于贝类GII型扎幌样病毒的检测灵敏度、准确性高；本发明检测方法可以快速直观判断样品是否含有GII型扎幌样病毒，并能准确测定样品中GII型扎幌样病毒的拷贝数含量。
附图说明
图1为实施例3中实时荧光定量PCR检测GII型扎幌样病毒的标准曲线；
图2为实施例4中实时荧光定量PCR检测GII型扎幌样病毒的结果；
其中，1为贝类中GII型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR扩增结果，2为干净贝类中GII型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR扩增结果，3为贝类中诺瓦克样病毒阳性质粒的实时荧光定量PCR扩增结果；
图3为实施例5中实时荧光定量PCR检测GII型扎幌样病毒的灵敏度实验；
其中，1表示贝类中GII型扎幌样病毒的量为106拷贝/μL，2表示贝类中GII型扎幌样病毒的量为105拷贝/μL，3表示贝类中GII型扎幌样病毒的量为104拷贝/μL，4表示贝类中GII型扎幌样病毒的量为103拷贝/μL，5表示贝类中GII型扎幌样病毒的量为102拷贝/μL，6表示贝类中GII型扎幌样病毒的量为10拷贝/μL，7为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1引物及探针的设计和合成
从GenBank下载GII型扎幌样病毒所有同源基因序列，引物和探针由Invitrogen公司合成。根据与GII型扎幌样病毒标准株(GeneBankNo.AJ249939)的所有同源基因序列，用Bioedit软件进行同源性比对，用primer Express3.0软件，设计出引物及TaqMan探针，扩增目的片段长度为116bp。
上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
与上述引物配合使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。该探针5’端标记有报告FAM荧光染料，另3’端标记有淬灭TAMRA荧光染料。
实施例2总RNA的提取
提取步骤如下：
1)取20g污染了病毒的贝类胃、肠组织，加入20mL甘氨酸缓冲液，匀浆器快速匀浆3min；
2)取10mL匀浆液装于离心管中，室温下充分振荡后，4℃6000r/min离心30min；
3)调上清液pH至7.5，加入等体积的8％PEG6000，4℃沉淀4h后，4℃6000r/min离心30min；
4)弃上清，加入10mL pH9.0的PBS振荡；加入等体积氯仿，充分混匀，4℃6000r/min离心30min，弃去沉淀，保留上清液；
5)调节上清液pH值至7.0，再用16％PEG60004℃沉淀2h后，4℃6000r/min离心30min；
6)弃上清，加入1ml的Trizol试剂提取RNA，反应管室温静置5min，加入0.2ml氯仿，置4℃，12000rpm离心15min；
7)取上层水相的1/3体积转入灭菌离心管，加入等体积异丙醇，置-20℃静置2h，然后4℃，12000rpm离心15min，弃去上清；
8)用1ml含75％DEPC的乙醇洗涤沉淀，吹打混匀。置4℃，12000rpm离心5min。吸去大部分乙醇，空气干燥10min，加适量灭菌DEPC双蒸水溶解沉淀，-70℃保存。
实施例3实时荧光定量PCR扩增方法的建立
1、实时荧光定量PCR反应体系
以总RNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应，即在50μL反应体系中含：5×定量PCR缓冲液10μL，1μL dNTPs(20ummol/L)，1.5μL引物SLVs-RP(10ummol/L)，1.5μL引物SLVs-FP(10ummol/L)，1μL荧光探针(10ummol/L)，50ng总RNA(3μL)，1μL Taq酶(3U)，并用DEPC处理水补充到50μL。
2、实时荧光定量PCR反应条件
将样品管放入ABI公司7000荧光PCR仪后，设置如下条件进行：93℃，3min；93℃，30s；54℃，40s共做40个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线和标准曲线判定结果。
3.实时荧光定量PCR标准曲线的建立
将GII型扎幌样病毒116bp基因片段克隆到PCR2.1-TOPO载体中构建成GII型SLVs的阳性质粒，调整质粒至1×1010拷贝/μL。然后以10倍系列稀释的阳性质粒为定量阳性标准模板，建立GII型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR反应。结果显示在102～106拷贝范围内GII型扎幌样病毒检测的标准曲线有很好的线性关系(图1)。
实施例4GII型扎幌样病毒实时荧光定量PCR方法的特异性确定
以污染病毒的贝类总RNA为模板，以干净贝类、诺瓦克样病毒阳性质粒为对照，通过实时荧光定量PCR检测荧光强度变化。结果显示，以污染GII型扎幌样病毒的贝类总RNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测可观察到明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果，而干净贝类、诺瓦克样病毒阳性质粒的荧光强度没有变化。提示本发明所建立的实时荧光定量PCR体系对GII型扎幌样病毒有很好的特异性(图2)。
实施例5灵敏度实验
用DEPC处理水分别稀释GII型扎幌样病毒阳性模板，以污染GII型扎幌样病毒的贝类总RNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测荧光强度变化。实验结果显示，实时荧光定量PCR检测可观察到明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果，贝类中GII型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR动力学曲线显示，浓度在102拷贝以上的反应体系有明显的荧光增长，而101拷贝和阴性对照均无荧光增长，因此该实时荧光定量PCR检测体系的最低检出限为102拷贝，即其灵敏度为102拷贝/μL(图3)。
贝类GII型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒
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Claims (7)
1.一种贝类GII型扎幌样病毒检测用的引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于该探针5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
4.一种贝类GII型扎幌样病毒检测用的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。
5.一种贝类GII型扎幌样病毒的检测方法，其特征在于该方法是以样品总RNA为模板，利用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针进行实时荧光定量PCR扩增。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于该方法是以样品RNA为模板，建立如下反应体系：
用DEPC处理水补充到50μL，将该体系进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线判定样品是否含有贝类GII型扎幌样病毒。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于该方法的反应条件是：93℃，3min；93℃，30s；54℃，40s，共做40个循环。
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