CN106290834A - 一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明提供一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗军团菌抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出人尿液样本中的军团菌抗原。

Description

一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途。

背景技术

军团菌为需氧的多性革兰阴性菌，广泛存在于自然环境中，其传染源是水源和空调系统，通过空气传播。军团杆菌的菌体微小,悬浮在空气中,人在正常呼吸时,会将空气中含有军团杆菌的气溶胶吸入呼吸道内,致使军团杆菌有机会侵染肺泡组织和巨噬细胞,引发炎症,导致军团菌病，易爆发流行。

军团杆菌可以侵犯身体内许多器官,因此其临床表现常是多种多样。军团菌病根据临床特征,一般分为两种类型,一类为非肺炎型,病情较轻,潜伏期1～2d,似普通感冒或流感样起病,有发热、肌痛、咽喉疼痛、咳嗽等症状,约1～2周可自愈。另一类是肺炎型,潜伏期2～10d,其初发症状为全身不适、疲乏、肌肉酸痛、头痛、发热、咳嗽、胸痛、咳血、呼吸困难等,还能侵犯消化系统、中枢神经系统,重症病人可出现肝功能变化及肾功能衰竭,并可出现精神紊乱等脏器损害。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的军团菌抗原近红外荧光检测技术，解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗军团菌抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。

优选的，所述免疫荧光探针为抗军团菌抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。

更优选的，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。

近红外光(NIR)，是介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，ASTM定义NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大为减少。

本发明第二方面提供所述军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用磷酸盐缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗军团菌抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；

2)利用微量蛋白点膜系统将含有抗军团菌抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；

3)用制备好的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用；

4)将包被抗军团菌抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒。

优选的，所述步骤1中，磷酸盐缓冲液为0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的磷酸盐缓冲液。

优选的，所述步骤1中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。

优选的，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗军团菌抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1。

在本发明一实施例中，乳胶颗粒、抗军团菌抗体、EDCA的投料量分别为1mg、100ug、100ug。

优选的，所述封闭液为乙醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调整乙醇胺的用量。更优选的，所述封闭液还包括胶原蛋白，即封闭液为乙醇胺与胶原蛋白的混合液，乙醇胺与胶原蛋白的重量比为5-10:1。

优选的，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。

本领域技术人员可选取适当浓度和pH的PBS缓冲液。

优选的，所述步骤2中，含有抗军团菌抗体的缓冲溶液中抗军团菌抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml。

优选的，所述步骤2中，抗军团菌抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm。

优选的，所述步骤2中，烘干的具体条件为36-38℃烘箱烘干。

优选的，所述抗军团菌抗体(单克隆抗体)的制备方法如下：

动物免疫：对小鼠进行免疫；

优选的，所述对小鼠进行免疫具体包括如下步骤：第一次免疫时抗原加等量的福氏完全佐剂充分乳化，第二次及第三次抗原加等量福氏不完全佐剂充分乳化，细胞融合前腹腔直接注射抗原加强免疫，一免抗原加福氏完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0.1mg/鼠，15天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐剂，抗原量为0.2mg/鼠，25天后三免抗原加福氏不完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0.2mg/鼠，10天后剪尾巴取血测ELISA效价，选取效价大于10万倍的小鼠进行加强免疫，水剂腹腔注射抗原1mg/鼠，三天后取脾脏细胞融合；

细胞融合：处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备B淋巴细胞悬浮液，将B淋巴细胞与准备好的处于对数生长期的同系SP2/0骨髓瘤细胞混合，制备杂交瘤细胞，并进行杂交瘤细胞筛选；

优选的，所述单克隆抗体的制备过程中杂交瘤细胞筛选的具体方法为：用HAT培养基培养细胞，2周后即可筛选出骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞的克隆化：克隆细胞生长的各个孔检测100％抗体阳性为止；

优选的，所述克隆化的方法是有限稀释法。

抗体的制备：将小鼠首先腹腔注射石蜡，1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞，1-2周后，用注射器抽取腹水，纯化后即可获得大量的单克隆抗体。优选的，所述腹腔内接种杂交瘤细胞时，将杂交瘤细胞浓度调节到1×10⁵个/ml按每只小鼠腹腔注射1ml接种。

优选的，所述单克隆抗体的制备过程中，小鼠为6-8周龄BALB/C小鼠。

优选的，单克隆抗体的纯化：选择HiTraprProtein A FF 5ml预装色谱柱纯化抗体，收集纯化的抗体备用。

本发明第三方面提供所述军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒在军团菌抗原检测领域的用途。

所述用途具体为使用所述军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒对军团菌抗原进行检测。

近红外光(NIR)是介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，ASTM定义NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大为减少。随着激光荧光、传感器、免疫检测装置的建立，近红外荧光分析仪在免疫测定领域中显示出极大的优越性。

本发明所提供的检测试剂盒以患者的尿液作为检测样本，结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中特异性、可溶性军团菌抗原。军团菌抗原近红外荧光检测法灵敏度高，特异性好，检测过程中样品收集及处理简单，可快速准确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用，并可应用到临床检测中，为临床治疗提供定性依据。

具体实施方式

本发明所提供的军团菌抗原近红外荧光检测法，实验室考核结果显示，不与其他样本中的抗原及多种细菌发生交叉反应，与细菌培养结果较一致，具有较高的敏感性和特异性。整体而言，近红外荧光法检测军团菌的可信度及各项性能均已达到临床定性检测的要求，有望用于由军团菌引发的军团病的快速早期诊断。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS INENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

本发明各实施例中试验菌种由军事医学科学院提供；交叉实验所用细菌由本实验室培养保存。近红外荧光检测仪，由上海凯创生物技术有限公司开发提供。

实施例1

1.抗原的制备：

从ATCC购买嗜肺军团菌菌株，接种在缓冲活性碳酵母琼脂培养基(BCYE)上，37℃、5％CO2的条件下培养，3-5天后用生理盐水从平板上洗脱细菌，5000rpm离心获取菌泥(同时去除平板被洗脱的液体成分)，菌泥加适量PBS缓冲液超声破裂，过阴离子柱纯化，用50mM NaCl洗涤，再用150mM NaCl洗脱，洗脱液装透析袋，用PEG包埋吸水浓缩，获取抗原。

2.单克隆抗体的制备：

动物免疫：选择6-8周龄BALB/C小鼠进行免疫，第一次免疫时抗原加等量的福氏完全佐剂充分乳化，第二次及第三次抗原加等量福氏不完全佐剂充分乳化，细胞融合前3天腹腔直接注射抗原加强免疫，一免抗原加福氏完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0.1mg/鼠，15天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐剂，抗原量为0.2mg/鼠，25天后三免抗原加福氏不完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0.2mg/鼠，10天后剪尾巴取血测ELISA效价，选取效价大于10万倍的小鼠进行加强免疫，水剂腹腔注射抗原1mg/鼠，三天后取脾脏细胞融合；

细胞融合：采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备B淋巴细胞悬浮液，将B淋巴细胞与准备好的处于对数生长期的同系SP2/0骨髓瘤细胞混合，制备杂交瘤细胞；

杂交瘤细胞筛选：用HAT培养基培养细胞，2周后即可筛选出骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂交瘤细胞；

杂交瘤细胞的克隆化：克隆化的方法是有限稀释法，按照实验室的常规方法进行，克隆化3-4次，直至克隆细胞生长的各个孔检测100％抗体阳性为止；

抗体的制备：取BALB/C小鼠，首先腹腔注射石蜡，1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞浓度调节到1×10⁵个/ml按每只小鼠腹腔注射1ml接种。1-2周后，用注射器抽取腹水，即可获得大量的单克隆抗体。

单克隆抗体的纯化：选择HiTraprProtein A FF 5ml预装色谱柱纯化抗体，收集纯化的抗体备用。

2.免疫荧光抗军团菌抗体颗粒制备：

用0.01mol/L，PH7.3±0.05的磷酸盐缓冲液将直径为150nm的荧光乳胶微粒离心清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入抗军团菌抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；加入封闭液(乙醇胺：胶原蛋白＝8:1)封闭乳胶颗粒上多余的基团按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体，100微克的EDCA用量标记。每毫克的微球乳胶最后加相当于20微克的乙醇胺当量的封闭液进行封闭。

3.试剂盒的制备：

用0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释抗军团菌抗体至浓度2.0mg/ml，利用微量蛋白点膜系统将溶液喷加到适当孔径的硝酸纤维素膜上，按1ul/cm的量进行喷膜，37℃烘箱烘干备用。

用制备好的探针(步骤2制得的标记有抗军团菌抗体的近红外荧光乳胶微球)溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用。

将包被抗军团菌抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒。

实施例2

军团菌抗原近红外荧光检测法与细菌培养对比实验：

试剂盒检测：

待测样品为尿液，使用0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释，稀释比例为1：1。

待测样品及试剂盒均平衡至室温开始检测，用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加3滴样本(约120-150ul)。15分钟时，用近红外荧光检测仪检测荧光信号，并用荧光仪器进行判断，分析仪的对荧光信号的检测范围是AD值0-10000，根据仪器的性能，CUTOFF值为50，检测AD值大于等于50为阳性结果。

实验结果与细菌培养结果对比验证。军团菌抗原近红外荧光检测法与尿液细菌培养结果如表1所示：

表1

Sensitivity＝75％

Specificity＝94.11％

实施例3

交叉实验：

在军团菌抗原近红外检测试剂盒分别滴加制备好的粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、克雷伯菌、乳酸杆菌、淋病奈瑟菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌、人型支原体、解脲脲原体、金黄色葡萄球菌、链球菌及幽门螺旋菌菌液(1×10⁶CFU/ml)，进行交叉实验检测，检测以上细菌是否对本试剂盒检测结果产生影响，军团菌抗原近红外荧光检测试剂与细菌交叉实验结果如表2所示，各细菌交叉实验中均无交叉反应发生：

表2

交叉物	结果	交叉物	结果
				粪肠球菌	-	淋病奈瑟菌	-
屎肠球菌	-	绿脓假单胞菌	-
				大肠埃希菌	-	大肠杆菌	-
鲍曼不动杆菌	-	人型支原体	-
				克雷伯菌	-	解脲脲原体	-
乳酸杆菌	-	金黄色葡萄球菌	-
				幽门螺旋菌	-	链球菌	-

由实施例2中的表1和实施例3中的表2可以看出，本试剂盒具有高灵敏度、高特异性的优点，且不与其他细菌发生交叉反应，稳定性及重复性良好。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗军团菌抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。

2.如权利要求1所述的一种军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，其特征在于，所述免疫荧光探针为抗军团菌抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。

3.如权利要求1-2任一权利要求所述的军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用磷酸盐缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入抗军团菌抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；

2)利用微量蛋白点膜系统将含有抗军团菌抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；

3)用制备好的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用；

4)将包被抗军团菌抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒。

4.如权利要求3所述的军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。

5.如权利要求3所述的军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗军团菌抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1。

6.如权利要求3所述的军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，抗军团菌抗体的喷加量为：1.8-2.2mg/ml的抗体溶液按0.9-1.1ul/cm的喷量制备免疫硝酸纤维素膜。

7.如权利要求1-2任一权利要求所述的军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒在军团菌抗原检测领域的用途。