KR102659468B1 - 암 면역요법을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

암 면역요법을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물-내성 면역요법, 면역 체크포인트 억제제, 및 화학요법을 암의 치료를 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 조합 요법을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

암 면역요법을 위한 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2016년 8월 18일 출원된 미국 가특허출원 62/376,680호의 이익을 주장한다. 상기 출원(들)의 전체 교시내용은 본원에 참조로서 포함된다.
발명의 배경
암 검출 및 치료 분야에서 현저한 진전이 이루어졌지만, 말기 및 전이성 암의 치료는 여전히 주요 도전 과제이다. 세포독성 화학치료제가 가장 많이 사용되고 성공적으로 사용되는 항암 치료제로 남아 있다. 그러나, 이들은 균일하게 효과적이지 않고, 면역요법과 같은 새로운 요법과 함께 이러한 제제의 도입은 문제가 된다. 예를 들어, 화학치료제는 그 제제의 비특이적 독성 프로파일로 인해 강력한 항-종양 면역적격 세포(immunocompetent cell)의 확립에 해로울 수 있다. 세포 증식 경로를 표적화한 소분자-기반 요법 또한 항-종양 면역의 형성을 방해할 수 있다. 면역치료적 접근법에서 발견되는 추가 합병증은 MHC-클래스 I 항원 발현의 하향 조절, 종양 또는 이펙터 세포 표면 상에 면역 체크포인트 분자의 제시 또는 이펙터 세포 수용체 하향조절을 발생시키는 혈장으로의 용해성 종양 리간드의 발산을 통한 신체의 면역 반응을 능가하는 종양 세포의 능력이다. 그러한 과정은 정상적으로 보이는 종양을 발생시켜 면역 시스템의 공격을 회피한다. 그러나, 일시적으로 효과적인 화학치료 요법이 새로운 면역적격 세포 요법 및 면역 체크포인트 억제제 둘 모두와 함께 조합될 수 있다면, 항-신생물 요법에서의 상당한 개선이 달성될 수 있다.
표적화된 면역 세포에 약물 내성을 부여하는데 잠재적으로 사용될 수 있는 몇몇 약물 내성 유전자가 확인되었고, 유전자 치료 기술의 발전으로 인해 약물 내성 유전자 치료 연구에서 이러한 유전자를 사용할 가능성을 시험할 수 있게 되었다. 예를 들어, shRNA 전략을 사용하여 6-티오쿠아닌에 대한 내성을 부여하는 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT)의 수준을 감소시켰다. 또한, 인간 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(hAGT)를 코딩하는 약물 내성 유전자 MGMT는 니트로소우레아 및 테모졸로미드(TMZ)와 같은 알킬화제의 세포독성 효과에 대한 내성을 부여하는 DNA 복구 단백질이다. 6-벤질구아닌(6-BG)은 니트로소우레아 독성을 강화시키는 AGT의 억제제이고, 이는 TMZ와 공동-투여되어 이 제제의 세포독성 효과를 강화시킨다. AGT의 변이체를 코딩하는 MGMT의 몇몇 돌연변이체 형태는 6-BG에 의한 불활성화에 고도로 내성이지만, DNA를 복구할 수 있는 이들의 능력을 유지한다. P140KMGMT-기반 약물 내성 유전자 치료는 마우스, 개, 붉은 털 원숭이, 및 인간 세포, 특히 조혈 세포에 화학보호를 제공하는 것으로 나타났다.
종양 세포는 종종 이들의 암성 본질을 드러내는 세포-표면 분자를 발현시킨다. 그러나, 이들 동일한 세포는 또한 정상 세포를 모방하는 면역 체크포인트 분자를 이들의 표면에 제시하여, 면역 공격을 회피할 수 있다. 면역 체크포인트는 종종 CTLA-4 및 PD-1을 포함하는 특정 수용체/리간드 쌍 사이의 상호작용에 의해 조절된다. CTLA-4, PD-1 및 이의 리간드는 T-세포 기능 및 다른 세포 기능의 모든 단계를 통틀어 중요한 역할을 하는 공동-신호전달 분자의 CD28-B7 패밀리의 구성원이다. PD-1 수용체는 활성화된 T 세포(및 B 세포)의 표면 상에 발현되고, 정상적인 환경 하에, 수지상 세포 또는 대식세포와 같이, 항원-제시 세포의 표면 상에 발현되는 이의 리간드(PD-L1 및 PD-L2)에 결합한다. 이 상호작용은 신호를 T 세포로 보내어, 본질적으로 이것을 차단하거나 또는 이것을 억제한다. 암 세포는 이들의 표면에서 높은 수준의 PD-L1의 발현을 유도함으로써 이러한 시스템을 이용한다. 이를 통해 이들은 PD-1 경로의 제어를 획득하고, 종양 미세환경에 들어갈 수 있는 PD-1을 발현하는 T 세포를 차단함으로써, 항암 면역 반응을 억제할 수 있다.
체크포인트 억제제는 CTLA-4 또는 PD-1과 같은 수용체/리간드 쌍을 차단하여, T 세포가 면역 반응을 시작하도록 함에 의해 종양 세포를 가려 내기 위한 수단을 제공한다. 미국 식품의약청으로부터 암에 대한 가속 승인을 받은 6개의 면역 체크포인트 억제제는 이필리무맙(ipilimumab)(YERVOY®), 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(KEYTRUDA®), 아테졸리주맙(atezolizumab)(TECENTRIQ®), 더발루맙(durvalumab)(IMFINZI™), 아벨루맙(avelumab)(BAVENCIO), 및 니볼루맙(nivolumab)(OPDIVO®)이다. YERVOY®는 T 세포의 표면에서 CTLA-4를 표적화하는 모노클로날 항체이고, 흑색종의 치료를 위해 승인되었다. KEYTRUDA®는 PD-L1을 표적화하고, 흑색종 및 비소세포폐암을 치료하는데 사용된다. OPDIVO®도 PD-1을 표적화하고, 흑색종, 신세포 암종, 및 비소세포폐암의 치료를 위해 승인되었다. 효과적인 것으로 입증될 수 있는 추가 체크포인트 표적은 TIM-3, LAG-3, 다양한 B-7 리간드, CHK 1 및 CHK2 키나제, BTLA, A2aR 등이다.
전형적으로, 체크포인트 억제제 치료와 관련된 활성 및 높은 객관적 반응률(ORR)은 높은 돌연변이 부하를 가진 종양과 연관된다. 돌연변이 빈도는 일반적으로 증가된 종양 면역원성을 발생시키는 높은 신생항원 신호전달과 관련이 있다.
2017년 5월에, 미국 식품의약청(FDA)은 이전 치료 후 진행된, 절제 불가능 또는 전이성, 현미부수체 불안정성(MSI-H: unresectable or metastatic, microsatellite instability-high) 또는 불일치 복구 결핍(dMMR: mismatch repair deficient) 고형 종양을 가지며 만족스러운 대체 치료 옵션이 없거나, 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴, 및 이리노테칸으로 치료 후 진행된 MSI-H 또는 dMMR 결장직장암을 갖는 성인 및 소아 환자에 대해, 펨브롤리주맙에 대한 가속 승인을 인정하였다. 이것은 조직/부위 불문의 적응증에 대한 FDA의 최초 승인이다. dMMR을 갖는 환자는 과돌연변이된 상태로 이어지는 유전적 돌연변이를 바로 잡을 능력이 없는 결함을 갖는다.
임상 데이터는 체크포인트 억제제 치료로 ORR이 전형적으로 0%인 결장직장암과 같은 암에서, ORR이 이들의 높은 돌연변이 부담으로 인해 dMMR을 갖는 환자에서 62%로 증가한다는 것을 입증하였다(Le DT, et al. ASCO 2015. Abstract LBA100). 유사하게, Hodges 등(Neuro-Oncology, 19(8), 1047-1057, 2017)에 의한 분석은 아교모세포종(GBM)이 전형적으로 낮은 돌연변이 부담을 가지는 것을 입증하며, 분석된 GBM의 단지 3.5%만이 높은 종양 돌연변이 부하를 나타낸다. 그러나, dMMR을 갖는 GBM 환자에서, 이들은 다른 고-악성도 종양에 비해 가장 높은 돌연변이 부하를 갖는 것이 Boufett 등에 의해 발견되었다(JCO, 2016 34:19, 2206-2211). Boufett 등은 단일-제제 니볼루맙으로 치료시 현재의 표준 요법에 불응성이었던 재발성 다초점 GBM을 갖는 2명의 소아 환자의 현저하고 지속적인 반응을 기술하고 있다. dMMR 돌연변이는 이들 두 환자가 체크포인트 억제에 반응하도록 하였지만, 표준 요법에 대한 이들의 실패한 반응 역시 dMMR 때문일 수 있었다. 이는 일반적으로 GBM이 현저하게 면역원성이 아니고 체크포인트 억제제로 치료시 유의한 ORR을 나타내지 않을 것임을 시사하는 데이터를 지지한다.
2005년 이래로, 1군 GBM에 대한 표준-관리 치료는 화학요법 테모졸로미드(TMZ)로의 치료를 포함하는 Stupp 프로토콜이다(Stupp et al., N Engl J Med 2005; 352:987-996March 10, 2005). TMZ는 이중 가닥 DNA 손상을 초래하는 알킬화제이다. TMZ는 DNA에서 미스페어링(mispairing) 및 GC에서 AT로의 점 돌연변이의 형성을 초래할 O6-메틸구아닌(O6MeG) 부가물을 생성함에 의해 기능한다(Roos et al., Cancer Letters 332 (2013) 237). TMZ로의 효과적인 치료에 대한 내성 메커니즘은 O6 위치로부터 메틸 부가물을 제거하는 O6-메틸구아닌-메틸트랜스퍼라제(MGMT)이다. 기능성 MMR 시스템을 갖는 세포에서, GC에서 AT로의 점 돌연변이는 DNA 복제의 2회 사이클 후에 이중 가닥 손상을 일으킬 것이다. Roos가 주목한 대로, "O6MeG는 직접 아폽토시스를 유발하지 않는다; 이는 MMR 및 DNA 복제를 필요로 한다". 따라서, 높은 돌연변이 부하 및 신생항원 부담으로 인해 면역요법 및/또는 체크포인트 억제에 가장 잘 반응할 새롭게 진단된 GBM 환자는 또한 통상적인 알킬화 화합요법에 가장 덜 반응할 환자이다. 이러한 인식은 GBM 환자에서 MMR 및 MLH1 돌연변이가 실제로 생존에 부정적인 예후인자라는 관찰을 설명할 것이다(Draaisma et al., Acta Neuropathol Commun. 2015; 3: 88). 이러한 환자들은 TMZ에 의한 통상적인 치료에 반응하지 않는다.
본 발명은 이러한 도전 과제에 대한 해결책을 제공한다. dMMR로 인한 과돌연변이는 보다 강력한 면역원성 신호전달을 유도할 수 있지만, 이들은 또한 표준 화학치료제에 대한 낮은 반응 및 낮은 생존율을 초래할 수 있다. 이중 가닥-DNA 손상을 일으킴으로써, TMZ는 종양에서 과돌연변이 및 더 강력한 면역원성 신호전달을 유발시키는 능력을 입증하였다. 화학요법으로 과돌연변이를 인위적으로 생성함에 의해, 화학요법 치료 동안 림프구를 또한 살아 있게 유지할 수 있다면 종양 면역원성 및 체크포인트 억제에 대한 반응성을 증가시키면서 표준 치료에 대한 종양 민감성을 유지할 수 있다.
불행히도, 시간이 지남에 따라 TMZ 유도된 과돌연변이는 MMR 시스템에서 돌연변이를 일으킬 가능성이 있어, TMZ 및 다른 알킬화제에 대한 감소된 민감성을 발생시킨다. 이론에 얽매이지 않으며, TMZ 또는 다른 알킬화제에 의해 초래된 과돌연변이는 장기적인 면역원성을 이끌어 내지 못할 수 있는 서브클로날 서명(subclonal signature) 11 돌연변이일 가능성이 가장 높다(Alexandrov et al., Nature, Vol 500, 22 Aug. 2013). 그러나, 본 발명자들의 데이터는, 단기간에, 이중 가닥 손상의 개시가 종양 세포 표면 상의 NKG2D 수용체 리간드의 일시적인 상향조절을 발생시키는 DNA 손상 반응을 유발하고 선천 면역 반응의 활성화 및 약물 내성 γδ T-세포에 의한 종양 사멸을 유발할 수 있음을 입증한다(Lamb et al., PLOS ONE, Vol 8, Issue 1, Jan. 2013).
따라서, 본 발명은 암의 진행 초기에 둘 모두의 메커니즘을 함께 표적화한다. 이론에 구속되지 않으며, TMZ에 의해 초래된 DNA 손상은 DNA 손상 반응과 관련된 모세혈관 확장성 운동실조 변이(ATM) 및 모세혈관 확장성 운동실조 Rad-3 관련(ATR) 단백질 키나제의 상향조절을 발생시킨다. DNA 손상 반응 및 ATM 및 ATR의 상향조절은 종양 세포 표면 상의 MICA/B 및 ULBP16과 같은 NKG2D 리간드의 상향조절 및 항-종양 면역 반응의 개시를 발생시킨다. DNA 손상을 통해 면역 반응을 상향조절하고 체크포인트 억제로 면역 세포를 제동하면서 화학요법에 민감한 종양의 대부분을 사멸시킴에 의해, 본 발명자들은 암 환자에 대한 보다 강력하고, 더욱 지속적인 반응을 생성하고자 한다.
따라서, 암 및 특히 화학요법에 대한 일시적인 반응을 나타내는 암을 치료하는 현재의 방법을 향상, 대체 또는 보완하는 조합 요법이 시급히 필요하다. 약물-내성 면역적격 세포, 면역 체크포인트 억제제, 및 화학요법을 포함하는 조합 요법은 그러한 보완적인 접근법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 화학요법 동안 약물-유도된 독성으로부터의 보호를 포함하여, 암에 대한 면역적격 세포의 면역 반응을 향상시키는 조성물 및 방법을 포함하는 암을 치료하기 위한 조합 요법을 제공함으로써, 면역 체크포인트 억제제의 1회 이상의 사이클 및/또는 용량과 함께 "약물 내성 면역요법"으로 명명된 항암 치료인 면역요법 및 화학요법의 조합된 투여를 허용한다. 체크포인트 억제제 및 약물 내성 면역요법의 조합은 임의의 순서로 순차적으로, 또는 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 약물 내성-면역요법은 분리된 세포독성 면역 세포의 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게는, 분리된 세포독성 면역 세포는 당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 유전적으로 변형된다. 바람직하게는 유전자 변형 방법은 HIV-기반 렌티바이러스 시스템 또는 유전자 편집 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 유전자 편집 시스템은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 약물 내성-부여 유전적 요소를 면역적격 세포주에 전달하기 위해 규칙적인 간격을 갖는 군집성 회문구조 반복부(CRISPR)와 연관된 Cas9와 같은 단백질을 비제한적으로 포함하는 지시된 엔도뉴클레아제의 사용을 포함한다. 유전적으로 조작된 면역적격 세포는 변형되지 않은 세포와 비교하여 특정 화학치료 세포독성 제제에 대한 상당한 내성을 일으키지만; 상기 약물 내성은 화학치료제의 존재 또는 부재 하에 표적 암 세포를 사멸시키는 유전적으로 조작된 세포의 능력에 영향을 미치지 않는다. 그러한 약물 내성 면역요법은, 예를 들어, 문헌[Spencer H.T. et al. in US 2015/0017137]에 기재되어 있다.
본 발명은 세포독성 면역 세포의 선택적으로 농축되고/거나 선택적으로 증식된 집단을 수득하는 단계로서, 상기 세포독성 면역 세포가 치료제에 내성이 되도록 유전적으로 변형된 세포를 포함하는, 단계; 상기 유전적으로 조작된 세포가 내성인 치료제의 유효량을 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포의 집단과 함께 이를 필요로 하는 환자에게 투여하고, 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제의 유효량를 환자에게 추가로 투여하여, 환자의 암을 치료하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 γδ T-세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 γδ T-세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 50% 내지 약 95%의 γδ T-세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 γδ T-세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상의 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 5% 내지 약 25%의 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 γδ T-세포, NK 세포 및 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포를 비제한적으로 포함하는 다른 면역적격 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래된 γδ T-세포를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 NK 세포 및 γδ T-세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상의 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 5% 내지 약 25%의 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 NK 세포, γδ T-세포, 및 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포를 비제한적으로 포함하는 다른 면역적격 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래된 NK 세포를 포함한다.
바람직하게는, 치료제에 내성이 되도록 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포의 집단을 수득하는 단계는, 예를 들어, 대상체로부터 혈액 또는 종양 생검을 포함하는 조직 샘플을 비제한적으로 포함하는 생물학적 샘플을 수득함에 의해, 인간 대상체 또는 동물 대상체와 같은 대상체로부터 세포독성 면역 세포의 집단을 수득하는 것을 포함한다. 샘플은 세포독성 면역 세포 및 다른 면역적격 세포에 대해 선택적으로 농축될 수 있고/거나 샘플에 존재하는 세포는 샘플에 존재하는 세포의 집단을 증가시키기 위해 선택적으로 증식될 수 있다. 세포독성 면역 세포는 바람직하게는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종성 핵산 서열을 포함하는 벡터로 안정하게 형질전환되거나 유전자 편집되고, 이 때 상기 이종성 핵산 서열은 하나 이상의 화학치료제에 대한 세포 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩한다.
바람직하게는, 본 발명은 암 세포의 생존을 억제하는 특성을 갖는 세포독성 치료제, γδ T-세포, NK 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함하고 선택적으로 다른 면역적격 세포를 추가로 포함하며 세포독성 치료제에 내성이 되도록 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포의 집단, 및 암 세포 상의 세포-표면 단백질을 차단하는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는, 환자에서 암을 치료하기 위한 시스템을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 암 세포의 생존을 억제하고 암 세포에서 스트레스 단백질을 유도하는 특성을 갖는 치료제, 세포독성 면역 세포의 집단, 및 암 세포 상의 세포-표면 단백질을 차단하는 면역 체크포인트 억제제를 함께 포함하는, 환자의 아교모세포종을 치료하기 위한 시스템을 제공하고, 이 때 상기 세포독성 면역 세포는 γδ T-세포, NK 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함하고 선택적으로 다른 면역적격 세포를 추가로 포함하며 상기 세포독성 면역 세포는 치료제에 내성이도록 유전적으로 변형된 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 γδ T-세포(이 때 γδ T-세포의 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%, 또는 95% 초과는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현한다), 또는 γδ T-세포를 포함하는 분리된 조성물(이 때 γδ T-세포의 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%, 또는 95% 초과는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다), 또는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 γδ T-세포로 필수적으로 이루어지는 분리된 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드는 O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), 디하이드로폴레이트 환원효소의 약물 내성 변이체(L22Y-DHFR), 티미딜레이트 신타제, 및/또는 다중 약물 내성-1 단백질(MDR1)이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 NK 세포를 포함하고, 이 때 NK 세포의 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%, 또는 95% 초과는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포는 NK 세포를 포함하고, 이 때 NK 세포의 약 50% 초과는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 NK 세포의 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%, 또는 95% 초과가 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포는 NK 세포의 약 50% 초과가 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 NK 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드는 O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), 디하이드로폴레이트 환원효소의 약물 내성 변이체(L22Y-DHFR), 티미딜레이트 신타제, 및/또는 다중 약물 내성-1 단백질(MDR1)이다.
바람직하게는, 본 발명은 적어도 하나의 체크포인트 억제제, 및 γδ T-세포, NK 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 세포독성 면역 세포의 분리된 집단을 포함하는 조성물을 제공하고, 이 때 세포독성 면역 세포의 집단의 약 5% 초과, 및 바람직하게는 약 50% 초과는 암 세포의 생존을 억제할 수 있는 치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면에 예시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구체예에 대한 다음의 보다 특정한 설명으로부터 명백해질 것이고, 역시 동일한 도면 부호는 상이한 도면을 통틀어 동일한 부분을 나타낸다. 도면은 반드시 일정한 비율은 아니며, 대신 본 발명의 원리를 예시할 때 강조된다.
도 1은 공여자 1로부터의 PBMC의 시험관내 배양 전에, γδ T 세포에 대한 체크포인트 분자 발현을 나타낸다.
도 2는 공여자 1로부터의 시험관내 농축된 γδ T 세포에 대한 체크포인트 분자의 상향조절을 나타낸다.
도 3은 공여자 2로부터의 PBMC의 시험관내 배양 전에, γδ T 세포에 대한 체크포인트 분자 발현을 나타낸다.
도 4는 공여자 2로부터의 시험관내 농축된 γδ T 세포에 대한 체크포인트 분자의 상향조절을 나타낸다.
도 5는 IL2 및 Zol로 자극시 인간 γδ T 세포에 대한 PD-1 및 CTLA-4의 상향조절을 나타낸다.
도 6은 아교모세포종 종양 세포에 대한 PD-L1 발현을 나타낸다.
도 7은 GMP 제조된 γδ T 세포의 세포독성을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 기술된 특정 구체예에 제한되지 않으며, 물론 이들은 달라질 수 있다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이므로 이를 제한하고자 하는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, (문맥에서 달리 명확하게 언급하지 않는 한) 그 범위의 상한과 하한 사이에 있는 하한 단위의 10분의 1까지의 각각의 개재된 값, 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값은 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 언급된 범위에서 특별히 배제된 임의의 한계를 조건으로 하여, 본 발명 내에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 기술된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참조로서 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼 본원에 참조로서 포함되며 간행물이 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위해 본원에 참조로서 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 그 발명에 대한 것이고 본 발명이 종래 발명으로 인해 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공되는 간행물의 날짜는 실제 공개 날짜와 다를 수 있었고, 이는 독립적으로 확인해야 할 수도 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서는 당 분야의 기술 내에 있는 화학, 합성 유기 화학, 생화학, 생물학, 분자 생물학, 분자 영상화 등의 기술을 설명한다. 그러한 기술은 문헌에 의해 충분히 설명된다.
하기 실시예는 당업자에게 방법을 수행하는 방법 및 본원에 개시되고 청구된 조성물 및 화합물을 사용하는 방법에 대한 완전한 발명 및 설명을 제공하기 위해 제시된다.
달리 지시되지 않는 한, 본 발명은 특정 물질, 시약, 반응 물질, 제조 공정 등에 제한되지 않으며, 이들은 다양할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 기능을 설명하기 위한 것이고, 제한하고자 하는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다. 본 발명에서는 단계들이 논리적으로 가능한 다른 순서로 실행될 수 있는 것이 또한 가능하다.
명세서 및 첨부된 청구 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명백히 지시하지 않는 한 복수의 대상물을 포함하는 것임이 주목되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "지지체"에 대한 언급은 복수의 지지체를 포함한다. 본 명세서 및 이어지는 청구 범위에서, 반대의 의도가 명백하지 않는 한, 다음의 의미를 갖는 것으로 정의되는 다수의 용어가 언급될 것이다.
정의
개시된 주제를 기술하고 청구함에 있어서, 다음의 용어가 하기에 제시된 정의에 따라 사용될 것이다.
"투여"는 본 발명의 화합물, 세포 집단을 포함하는 생물학적 물질, 또는 이의 조합물을 인간 또는 동물 대상체에 도입하는 것을 의미한다. 화합물의 한 바람직한 투여 경로는 정맥내이다. 화합물의 다른 바람직한 투여 경로는 복강내 또는 흉강내, 또는 카테터를 통해 뇌로 투여될 수 있다. 그러나, 경구, 국소, 피하, 복막, 동맥내, 흡입, 질, 직장, 코, 뇌척수액으로의 도입, 또는 신체 구획으로의 점적주입과 같은 임의의 투여 경로가 사용될 수 있다. 고형 종양과 같은 표적 조직 부위로의 직접 주입도 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료제"는 암 세포와 상호작용하여, 세포의 증식 상태를 감소시키고/거나 세포를 사멸시킬 수 있는 화합물 또는 이의 유도체를 지칭한다. 치료제의 예는 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드); 대사 길항제(예를 들어, 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이의 유도체); 치환된 뉴클레오티드; 치환된 뉴클레오시드; DNA 탈메틸화제(항대사물질로도 공지됨; 예를 들어, 아자시티딘(azacitidine)); 항종양 항생제(예를 들어, 미토마이신, 아드리아마이신); 식물-유래된 항종양제(예를 들어, 빈크리스틴(vincristine), 빈덴신(vindesine), TAXOL®, 파클리탁셀(paclitaxel), 아브락산(abraxane)); 시스플라틴(cisplatin); 카르보플라틴(carboplatin); 에토포시드(etoposide) 등을 비제한적으로 포함하는 화학치료제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 제제는 항암제 트리메토트렉세이트(TMTX); 테모졸로미드; 랄티트렉시드(raltitrexed); S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR); 6-벤질구아니딘(6-BG); 니트로소우레아[예를 들어, 비스-클로로니트로소우레아(BCNU; 카르무스틴(carmustine)), 로무스틴(lomustine) (CCNU) +/- 프로카르바진(Procarbazine) 및 빈크리스틴(Vincristine)(PCV 요법), 포테무스틴(fotemustine)]; 시타라빈(cytarabine); 및 캄프토테신(camptothecin); 또는 이의 임의의 치료학적 유도체를 추가로 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 치료되는 질병, 질환, 또는 장애의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 투여되는 화합물 또는 치료적 활성 조성물의 양을 지칭한다. 조절되지 않은 세포 분열과 관련된 암 또는 병리학과 관련하여, 치료적 유효량은 (1) 종양의 크기를 감소시키고/거나, (2) 비정상적인 세포 분열, 예를 들어, 암 세포 분열을 억제하고/거나(즉, 어느 정도 늦추고, 바람직하게는 중단시킴), (3) 암 세포의 전이를 예방 또는 감소시키고/거나, (4) 조절되지 않거나 비정상적인 세포 분열과 관련되거나 부분적으로 이에 의해 초래된, 예를 들어, 암을 포함하는 병리학, 또는 혈관신생과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화(또는 바람직하게는 제거)시키는 효과를 갖는 양을 지칭한다.
본원에 사용되는 질병(또는 질환 또는 장애)를 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질병에 걸리기 쉽지만 아직 질병의 증상을 경험하거나 나타내지 않은 인간 대상체 또는 동물 대상체에서 질병이 발생하는 것을 예방하고(예방적 치료), 질병을 억제하고(발생을 늦추거나 억제함), 질병의 증상 또는 부작용으로부터 경감을 제공하고(완화적 치료 포함), 질병의 퇴행을 야기하는 것을 지칭한다. 암과 관련하여, 이러한 용어는 또한 암에 걸린 개인의 평균 수명이 증가할 수 있거나 질병의 증상 중 하나 이상이 감소될 것임을 의미한다. 암과 관련하여, "치료하는"은 또한 대상체에서 항-종양 반응을 향상시키거나 연장시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 "조합물", "조합 요법" 및/또는 "조합된 치료 요법"의 임의의 투여 형태는 별도로 또는 조합된 제형으로 동시에, 또는 수 분, 수 기간 또는 수 일만큼 떨어진 상이한 시간에 순차적으로 투여될 수 있지만, 어떤 방식으로든 함께 작용하여 요망되는 치료 반응을 제공하는 적어도 2개의 치료적 활성 약물 또는 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "향상"은 대상체 또는 종양 세포가 본원에 개시된 치료에 반응하는 능력을 개선시키도록 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 향상된 반응은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 반응성에서의 증가를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "향상"은 또한 화학요법, 약물-내성 면역적격 세포, 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 조합 요법과 같은 치료에 반응하는 대상체의 수를 증가시키는 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 향상된 반응은 치료에 반응하는 대상체의 총 백분율을 지칭할 수 있고, 상기 백분율은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상이다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간, 포유동물(예를 들어, 고양이, 개, 말 등), 살아 있는 세포, 및 다른 살아 있는 유기체를 포함한다. 살아 있는 유기체는, 예를 들어, 단일 진핵생물 세포처럼 단순할 수 있거나 포유동물처럼 복잡할 수 있다. 전형적인 환자는 포유동물, 특히 영장류, 특히 인간이다. 수의학적 적용에서, 가축, 예를 들어, 축우, 양, 염소, 소, 돼지 등; 가금, 예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조 등; 및 길들여진 동물, 특히 애완동물, 예를 들어, 개 및 고양이와 같은 매우 다양한 대상체가 적합할 것이다. 진단용 또는 연구 응용을 위해, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류, 및 근친돈과 같은 돼지 등을 포함하는 매우 다양한 포유동물이 적합한 대상체일 것이다. 바람직하게는, 시스템은 샘플 및 대상체를 포함한다. 용어 "살아 있는 숙주"란 살아 있고 죽지 않은 상기 언급된 숙주 또는 유기체를 지칭한다. 용어 "살아 있는 숙주"는 전체 숙주 또는 유기체 뿐만 아니라 살아 있는 숙주로부터 절제된 부위(예를 들어, 간 또는 다른 기관)도 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "γδ T-세포(감마 델타 T-세포)"는 이들의 표면 상에 별개의 T-세포 수용체(TCR)를 발현시키는 T-세포의 작은 서브세트를 지칭한다. 대부분의 T-세포는 α- 및 β-TCR 사슬이라고 불리는 2개의 당단백질 사슬로 구성된 TCR을 갖는다. 대조적으로, γδ T-세포에서, TCR은 하나의 γ-사슬 및 하나의 δ-사슬로 구성된다. 이러한 T-세포의 그룹은 대개 αβ T-세포보다 훨씬 덜 일반적이지만, 상피내 림프구(IEL)로서 알려진 림프구의 집단 내에서, 창자 점막에서 가장 높은 풍부도(abundance)로 발견된다. γδ T-세포를 활성화시키는 항원성 분자는 아직 많이 알려져 있지 않다. 그러나, γδ T-세포는 일부가 MHC 클래스 IB 분자를 인지할지라도 펩티드 에피토프의 항원 처리 및 MHC 제시를 필요로 하지 않는 것으로 보인다는 점에서 특이하다. 더욱이, γδ T-세포는 지질 항원의 인지에서 중요한 역할을 하고, MIC-A 및 MIC-B와 같은 스트레스-관련 항원에 반응하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 유도된 다능성 줄기 세포"(hiPSC)는 임의의 다른 유형의 인간 세포, 예를 들어, 치료학적 면역적격 세포의 생성을 가능하게 하는 배아-유사 다능성 상태로 다시 재프로그램된 피부 또는 혈액 세포와 같은 인간 성체 세포로부터 직접 생성될 수 있는 다능성 줄기 세포의 유형을 지칭한다. hiPSC가 치료될 환자 또는 성체 세포로부터 수득될 수 있는 인간 성체 세포는 상이한 개체로부터 수득될 수 있다. 인간 성체 세포는 성체 세포를 다능성 줄기 세포로 전환시킬 수 있는 전사 인자를 코딩하는 유전자를 도입하기 위한, 예를 들어, 레트로바이러스 시스템 또는 렌티바이러스 시스템에 의해 다능성 줄기 세포로 형질전환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 또는 이의 일부를 지칭하고, 공급원, 기원 종, 생산 방법, 및 특성에 관계 없이 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 단편으로 구성될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단일-쇄 Fvs(scFv), 단일-쇄 항체, 디설파이드-결합된 Fvs(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. ScFv 분자는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 5,892,019호에 기술되어 있다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 치료제" 또는 "생물약제"는 생물학적 공급원에서 제조되거나 이로부터 추출된 임의의 의약품을 지칭한다. 생물약제는 화학적으로 합성된 약학적 제품과 구별된다. 생물약제의 예는 백신, 혈액 또는 혈액 성분, 알레르겐, 체세포, 유전자 치료제, 조직, 항체 치료제 및 융합 단백질을 포함하는 재조합 치료 단백질, 및 살아 있는 세포를 포함한다. 생물학제는 당류, 단백질 또는 핵산 또는 이러한 물질의 복합 조합물로 구성될 수 있거나, 세포 및 조직과 같은 살아 있는 실체일 수 있다. 생물학제는 다양한 자연 공급원-인간, 동물 또는 미생물로부터 분리되고 생물공학 방법 및 다른 기술에 의해 생산될 수 있다. 생물학적 치료제의 특정 예는 면역자극제, T 세포 성장 인자, 인터류킨, 항체, 융합 단백질, 및 암 백신과 같은 백신을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 비정상적인 세포가 제어되지 않으며 분열하는 질병에 대한 일반적인 용어로서, 이의 통상적인 의미로 제공될 것이다. 특히, 및 본 발명의 구체예의 문맥에서, 암은 혈관신생-관련 암을 지칭한다. 암 세포는 가까운 조직에 침입할 수 있고 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 몇 가지 주요 유형의 암이 있고, 예를 들어, 암종은 피부 또는 내부 기관의 안을 대거나 덮는 조직에서 시작되는 암이다. 육종은 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관, 또는 다른 결합 또는 지지 조직에서 시작되는 암이다. 백혈병은 골수와 같은 혈액-형성 조직에서 시작하여, 수많은 비정상적인 혈액 세포가 생산되어 혈류로 들어가도록 하는 암이다. 림프종은 면역 시스템의 세포에서 시작되는 암이다.
정상 세포가 특정되고 제어되고 협조된 단위로서 거동하는 이들의 능력을 상실할 때, 종양이 형성된다. 일반적으로, 고형 종양은 대개 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다(일부 뇌종양은 낭종 및 액체로 채워진 중심 괴사 영역을 갖는다). 단일 종양은 심지어 그 안에 상이한 세포 집단을 가질 수 있고, 예측을 벗어난 상이한 과정을 나타낸다. 고형 종양은 양성(암성이 아님)이거나 악성(암성)일 수 있다. 고형 종양의 상이한 유형은 이들을 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예는 육종, 암종, 및 림프종이다. 백혈병(혈액의 암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다.
대표적인 암은 특히 급성 림프모구 백혈병, 성인; 급성 림프모구 백혈병, 소아; 급성 골수 백혈병, 성인; 부신겉질 암종; 부신겉질 암종, 소아; AIDS-관련 림프종; AIDS-관련 악성종양; 항문암; 별아교세포종, 소아 소뇌; 별아교세포종, 소아 대뇌; 담관암, 간바깥; 방광암; 방광암, 소아; 골암, 골육종/악성 섬유 조직구종; 아교모세포종, 소아; 아교모세포종, 성인; 뇌 줄기 신경아교종, 소아; 뇌 종양, 성인; 뇌 종양, 뇌 줄기 신경아교종, 소아; 뇌 종양, 소뇌 별아교세포종, 소아; 뇌 종양, 뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, 소아; 뇌 종양, 뇌실막종, 소아; 뇌 종양, 속질모세포종, 소아; 뇌 종양, 전막위 원시 신경외배엽 종양, 소아; 뇌 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경아교종, 소아; 뇌 종양, 소아(기타); 유방암; 유방암 및 임신; 유방암, 소아; 유방암, 남성; 기관지 샘종/카르시노이드, 소아: 카르시노이드 종양, 소아; 카르시노이드 종양, 위창자; 암종, 부신겉질; 암종, 섬 세포; 원발부위 미상암; 중추신경계 림프종, 원발성; 소뇌 별아교세포종, 소아; 뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, 소아; 자궁경부암; 소아암; 만성 림프 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수증식 장애; 건초의 투명 세포 육종; 결장암; 결장직장암, 소아; 피부 T-세포 림프종; 자궁내막암; 뇌실막종, 소아; 상피암, 난소; 식도암; 식도암, 소아; 종양의 유잉 패밀리; 두개외 생식 세포 종양, 소아; 고환외 생식 세포 종양; 간외 담관암; 눈암, 안내 흑색종; 눈암, 망막모세포종; 담낭암; 위(위)암; 위(위)암, 소아; 위창자 카르시노이드 종양; 생식 세포 종양, 두개외, 소아; 생식 세포 종양, 고환외; 생식 세포 종양, 난소; 임신 융모 종양; 신경아교종, 소아 뇌 줄기; 신경아교종, 소아 시각 경로 및 시상하부; 털세포 백혈병; 두경부암; 간세포(간) 암, 성인(원발); 간세포(간) 암, 소아(원발); 호지킨 림프종, 성인; 호지킨 림프종, 소아; 임신 중 호지킨 림프종; 하인두암; 시상하부 및 시각 경로 신경아교종, 소아; 안내 흑색종; 섬 세포 암종(내분비 췌장); 카포시 육종; 신장암; 후두암; 후두암, 소아; 백혈병, 급성 림프모구, 성인; 백혈병, 급성 림프모구, 소아; 백혈병, 급성 골수, 성인; 백혈병, 급성 골수, 소아; 백혈병, 만성 림프구; 백혈병, 만성 골수성; 백혈병, 털세포; 입술 및 구강암; 간암, 성인(원발); 간암, 소아(원발); 폐암, 비소세포; 폐암, 소세포; 림프모구 백혈병, 성인 급성; 림프모구 백혈병, 소아 급성; 림프구 백혈병, 만성; 림프종, AIDS-관련; 림프종, 중추신경계(원발); 림프종, 피부 T-세포; 림프종, 호지킨, 성인; 림프종, 호지킨; 소아; 림프종, 임신 중 호지킨; 림프종, 비호지킨, 성인; 림프종, 비호지킨, 소아; 림프종, 임신 중 비호지킨; 림프종, 원발성 중추신경계; 고분자글로불린혈증, 발덴스트롬; 남성 유방암; 악성 중피종, 성인; 악성 중피종, 소아; 악성 가슴샘종; 속질모세포종, 소아; 흑색종; 흑색종, 안내; 메르켈 세포 암종; 중피종, 악성; 잠복 원발성을 갖는 전이성 편평 경부암; 다발성 내분비 신생물 증후군, 소아; 다발성 골수종/형질 세포 신생물; 균상식육종; 골수형성이상 증후군; 골수성 백혈병, 만성; 골수 백혈병, 소아 급성; 골수종, 다발성; 골수증식 장애, 만성; 비강 및 및 부비동 암; 비인두암; 비인두암, 소아; 신경모세포종; 신경섬유종; 비호지킨 림프종, 성인; 비호지킨 림프종, 소아; 임신 중 비호지킨 림프종; 비소세포폐암; 구강암, 소아; 구강암 및 입술암; 입인두암; 골육종/뼈의 악성 섬유 조직구종; 난소암, 소아; 난소 상피암; 난소 생식 세포 종양; 난소 저 악성도 잠재 종양; 췌장암; 췌장암, 소아의 췌장암, 섬 세포; 부비동 및 비강암; 부갑상샘암; 음경암; 크롬친화세포종; 송과체 및 전막위 원시 신경외배엽 종양, 소아; 뇌하수체 종양; 형질 세포 신생물/다발성 골수종; 흉막폐장 모세포종; 임신 및 유방암; 임신 및 호지킨 림프종; 임신 및 비호지킨 림프종; 원발성 중추신경계 림프종; 원발성 간암, 성인; 원발성 간암, 소아; 전립선암; 직장암; 신세포(신장) 암; 신세포 암, 소아; 신우 및 요관, 이행 세포암; 망막모세포종; 횡문근육종, 소아; 침샘암; 침샘의 암, 소아; 육종, 종양의 유잉 패밀리; 육종, 카포시; 육종(골육종)/뼈의 악성 섬유 조직구종; 육종, 횡문근육종, 소아; 육종, 연조직, 성인; 육종, 연조직, 소아; 세자리 증후군; 피부암; 피부암, 소아; 피부암(흑색종); 피부 암종, 메르켈 세포; 소세포폐암; 소장암; 연조직 육종, 성인; 연조직 육종, 소아; 잠복 원발성을 갖는 편평 경부암, 전이성; 위(위) 암; 위(위) 암, 소아; 전막위 원시 신경외배엽 종양, 소아; T-세포 림프종, 피부; 고환암; 가슴샘종, 소아; 가슴샘종, 악성; 갑상샘암; 갑상샘암, 소아; 신우 및 요관의 이행 세포암; 영양막 종양, 임신; 원발부위 미상암, 소아; 소아의 비정상적인 암; 요관 및 신우, 이행 세포암; 요도암; 자궁 육종; 질암; 시각 경로 및 시상하부 신경아교종, 소아; 외음부암; 발덴스트롬 고분자글로불린혈증; 및 월름스 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
종양은 악성 또는 양성으로 분류될 수 있다. 둘 모두의 경우에, 세포의 비정상적인 응집 및 증식이 존재한다. 악성 종양의 경우, 이들 세포는 보다 공격적으로 거동하여, 증가된 침습성의 성질을 획득한다. 궁극적으로, 종양 세포는 심지어 이들이 유래된 미세한 환경에서 벗어나, 신체의 다른 영역(일반적으로 이들의 성장에 도움이 되지 않는, 매우 다른 환경에서)으로 퍼져 나가고, 이 새로운 위치에서 급속한 성장 및 분열을 계속하는 능력을 얻을 수 있다. 이것을 전이라고 한다. 일단 악성 세포가 전이되면 치유를 달성하는 것이 더욱 어렵다. 양성 종양은 침습하는 경향이 덜하고 전이될 가능성이 적다.
뇌 종양은 뇌 내부에서 광범위하게 퍼지지만 보통 뇌 외부로 전이되지 않는다. 신경아교종은 뇌의 내부, 심지어 반구를 가로질러 매우 침습적이다. 그래도 이들은 제어되지 않은 방식으로 분열한다. 이들의 위치에 따라, 마치 악성 병변처럼 생명을 위협할 수 있다. 이의 한 예가 뇌의 양성 종양일 것이며, 이것은 성장하여 두개골 내의 공간을 점유함으로써, 뇌에 증가된 압력을 발생시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "농축된(enriched)"은, 본원에 기재된 대로, 농축 전에 동일한 하나 이상의 세포 유형의 총 백분율에 비해, 샘플 중 존재하는 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형(예를 들어, γδ T-세포 및/또는 NK 세포) 1의 총 백분율을 증가시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 유형의 세포독성 면역 세포에 대해 "농축된" 샘플은 약 10% 내지 100%의 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형을 샘플 내에 포함할 수 있는 반면, 농축 전에 샘플 중 세포독성 면역 세포 유형 중 하나 이상의 총 백분율은, 예를 들어, 0% 내지 10%이다. 바람직하게는, 농축된 샘플은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% ,70%, 80%, 90% 또는 100%의 세포독성 면역 세포의 하나 이상의 유형을 포함한다. 샘플은 표준 기술, 예를 들어, 유세포분석 기술을 사용하여 하나 이상의 세포 유형에 대해 농축될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "고도로 농축된"은 샘플 중 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형의 총 백분율을 증가시켜 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형이 샘플 중 세포독성 면역 세포 유형의 적어도 약 70% 내지 약 100%를 구성할 수 있도록 하는 것을 지칭하는 반면, 농축 전에 동일한 유형의 세포독성 면역 세포의 총 백분율은, 예를 들어, 0% 내지 10%이다. 바람직하게는, 고도로 농축된 샘플은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 세포독성 면역 세포의 하나 이상의 유형을 포함한다. 샘플은 표준 기술, 예를 들어, 유세포분석 기술을 사용하여 하나 이상의 세포 유형에 대해 고도로 농축될 수 있다.
샘플에서 하나 이상의 세포독성 면역 세포의 증식과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "증식된" 및 "증식"은 샘플 중 하나 이상의 세포독성 면역 세포의 수를, 예를 들어, 적어도 약 2배, 바람직하게는 약 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 약 50배 이상 증가시키는 것을 의미한다. 세포독성 면역 세포 집단의 증식은 당 분야에 공지된 임의의 수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, T-세포는 공급자 림프구 및 인터류킨-2(IL-2) 또는 인터류킨-15(IL-15)의 존재 하에 비특이적인 T-세포 수용체 자극을 사용하여 급속히 증식될 수 있고, IL-2가 선호된다. 비특이적인 T-세포 수용체 자극은 마우스 모노클로날 항-CD3 항체(ORTHO-MCNEIL®, Raritan, N.J.로부터 이용 가능함)인 약 30 ng/ml의 OKT3를 포함할 수 있다. 대안적으로, T-세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 시험관내에서 암의 하나 이상의 항원(에피토프(들)와 같은 이의 항원성 부분, 또는 세포를 포함함)으로 자극함에 의해 급속하게 증식될 수 있고, 이는 선택적으로 T-세포 성장 인자, 예를 들어, 300 IU/ml의 IL-2 또는 IL-15, 바람직하게는 IL-2의 존재 하에, 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 0.3 μM MART-1:26-35(27 L) 또는 gp100:209-217(210M)와 같은 벡터로부터 발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "융합 단백질"은, 예를 들어, 적어도 하나의 표적 결합 부위를 갖는 면역글로불린 항원-결합 도메인, 및 적어도 하나의 이종성 부분, 즉, 자연에서 자연적으로 연결되지 않은 부분을 포함하는 키메라 분자를 지칭한다. 아미노산 서열은 일반적으로 융합 폴리펩티드에 함께 취해진 분리된 단백질에 존재할 수 있거나 이들은 보통 동일한 단백질 내에 존재할 수 있으나 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치된다. 융합 단백질은, 예를 들어, 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 요망되는 관계로 코딩되는 폴리뉴클레오티드를 생성 및 번역함에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "암을 감소시키는"은 종양 덩어리의 크기 또는 부피의 감소, 대상체에서 전이된 종양의 수의 감소, 암 세포의 증식 상태의 감소(암 세포가 증가하는 정도) 등을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "분리된" 및 "분리된 세포 집단"은 대상체에서 발견되는 조직 또는 상태로부터 제거된 세포 또는 복수의 세포를 지칭한다. 상기 용어는 비제한적으로 세포 표면 마커, 염료와 같은 리포터 마커 또는 표지와 같은 파라미터에 따라 분리된 세포를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현된" 또는 "발현"은 유전자의 2개의 핵산 가닥 중 하나의 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 RNA 핵산 분자를 제공하기 위한 유전자로부터의 전사를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "발현된" 또는 "발현"은 또한 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 일부 또는 단편을 제공하기 위한 상기 RNA 핵산 분자로부터의 번역을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소로부터 전사 개시 부위를 결정하는 DNA 서열을 지칭한다. "프로모터-근위 요소"는 약 200개 염기쌍의 전사 시작 부위 내의 조절 서열일 수 있다.
용어 "재조합 세포"는 자연에서 서로 공유적으로 연결되지 않은 핵산 세그먼트의 새로운 조합을 갖는 세포를 지칭한다. 핵산 세그먼트의 새로운 조합은 당업자가 이용할 수 있는 광범위한 핵산 조작 기술을 사용하여 유기체 내로 도입될 수 있다. 재조합 세포는 단일 진핵생물 세포, 또는 단일 원핵생물 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 재조합 세포는 유전체외 벡터를 보유할 수 있다. 유전체외 핵산 벡터는 세포의 유전체에 삽입되지 않는다. 재조합 세포는 유전체내 벡터 또는 이의 일부를 추가로 보유할 수 있다. 용어 "유전체내"는 재조합 세포의 유전체 내에 통합된 핵산 작제물을 정의한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 핵산" 및 "재조합 DNA"는 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 자연적으로 발견되지 않는 적어도 2개의 핵산 서열의 조합을 나타낸다. 핵산 서열은 핵산 벡터, 유전자 발현 조절 요소, 복제 기점, 발현시 항생제 내성을 부여하는 적합한 유전자 서열, 단백질-코딩 서열 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기술에 의해 생성되어, 그 위치, 순도 또는 구조에 있어서 자연 발생 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 의미하고자 한다. 일반적으로, 그러한 재조합 폴리펩티드는 자연에서 일반적으로 관찰되는 것과 상이한 양으로 세포에 존재할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "작동 가능하게" 또는 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 요망되는 기능을 수행하기 위한 코딩 및 제어 서열의 배치를 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 코딩 서열은 DNA 중합효소가 프로모터 서열에 결합하여 코딩 서열을 코딩된 단백질로 번역될 수 있는 mRNA로 전사시킬 때 세포에서 전사 조절 영역에 작동 가능하게 결합되거나 전사 조절 영역의 제어 하에 있다. 제어 서열은 이들이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 이와 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재된 아직 번역되지 않은 전사된 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
용어 "이종성" 및 "외인성"은 이들이 코딩 서열 및 제어 서열과 같은 핵산 서열과 관련될 때, 재조합 작제물의 영역 또는 특정 염색체 유전자좌와 정상적으로 관련되지 않고/거나, 특정 세포와 정상적으로 관련되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 작제물의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 분자와 관련하여 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내의 핵산 또는 또 다른 핵산 분자에 부착된 핵산의 식별 가능한 세그먼트이다. 예를 들어, 작제물 끝 부분의 이종성 영역은 자연에서 코딩 서열과 관련하여 발견되지 않는 서열의 측면에 위치하는 코딩 서열을 포함할 수 있었다. 이종성 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물(예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 숙주 세포에 정상적으로 존재하지 않는 작제물로 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 목적을 위해 이종성으로 간주될 것이다.
바람직하게는, 프로모터는 서열의 첨가 또는 결실에 의해 변형되거나, 자연 및 합성 서열 뿐만 아니라 합성 및 자연 서열의 조합일 수 있는 서열을 포함하는 대안적인 서열로 대체될 것이다. 많은 진핵생물 프로모터는 TATA 박스 및 상류 프로모터 요소의 두 가지 유형의 인지 서열을 함유한다. 전사 개시 부위의 상류에 위치하는 전자는 올바른 부위에서 전사를 개시하기 위해 RNA 중합효소를 유도하는데 관여하는 한편, 후자는 전사 속도를 결정하는 것으로 보이며 TATA 박스의 상류에 있다. 인핸서 요소는 또한 연결된 프로모터로부터 전사를 자극할 수 있으나, 다수는 특정 세포 유형에서만 배타적으로 기능한다. 바이러스, 예를 들어, SV40, 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 CMV 프로모터로부터 유래된 많은 인핸서/프로모터 요소는 광범위한 세포 유형에서 활성이며, "항시적" 또는 "유비쿼터스"라고 불린다. 클로닝 부위에 삽입된 핵산 서열은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 열린 해독틀을 가질 수 있고, 단, 코딩 서열이 관심 폴리펩티드를 코딩하는 경우, 적절한 mRNA 분자의 생산을 차단할 수 있고/거나 비정상적으로 스플라이스되거나 비정상적인 mRNA 분자를 생산할 수 있는 잠재 스플라이스 부위는 없어야 한다.
종결 영역은 비교적 상호교환 가능한 것으로 보이므로, 주로 사용되는 종결 영역은 편리한 것 중 하나일 것이다. 종결 영역은 의도된 관심 핵산 서열에 고유할 수 있거나, 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표적화 치료제"는 면역 시스템의 임의의 양태를 표적화하는 임의의 치료 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 단일 가닥, 이중 가닥, 원형, 또는 슈퍼코일드 DNA 또는 RNA로 구성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 전형적인 벡터는 기능적 유전자 발현을 허용하기 위해 적절한 거리에서 작동 가능하게 연결된 다음의 요소로 구성될 수 있다: 복제 기점, 프로모터, 인핸서, 5' mRNA 선도 서열, 리보솜 결합 부위, 핵산 카세트, 종결 및 폴리아데닐화 부위, 및 선택 가능한 마커 서열. 이러한 요소들 중 하나 이상은 특정 적용에서 생략될 수 있다. 핵산 카세트는 발현되는 핵산 서열을 삽입하기 위한 제한 부위를 포함할 수 있다. 기능적 벡터에서, 핵산 카세트는 번역 개시 및 종결 부위를 포함하는 발현되는 핵산 서열을 함유한다.
벡터는 특정 코딩 서열이 적절한 조절 서열을 갖는 벡터 내에 위치하도록 작제되고, 제어 서열에 관한 코딩 서열의 위치 및 배향은 코딩 서열이 제어 또는 조절 서열의 "제어" 하에 전사되도록 하는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위해 특정 관심 단백질을 코딩하는 서열의 변형이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 서열이 적절한 배향으로 제어 서열에 부착될 수 있도록 서열을 변형하거나; 해독틀을 유지시킬 필요가 있을 수 있다. 제어 서열 및 다른 조절 서열은 벡터 내로의 삽입 전에 코딩 서열에 라이게이션될 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열은 제어 서열 및 제어 서열의 조절 제어에 의해 및 하에 해독틀 내에 있는 적절한 제한 부위를 이미 함유하는 발현 벡터로 직접 클로닝될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "렌티바이러스-기반 벡터"는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 부위-특이적 방식으로 숙주 유전체에 작동 가능하게 삽입하도록 설계된 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 렌티바이러스-기반 표적화 벡터는, 예를 들어, HIV-1, HIV-2, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 또는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)에 기반할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 렌티바이러스-기반 표적화 벡터는 HIV-기반 표적화 벡터이다. 이 벡터는 HIV의 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
용어 "형질전환", "형질도입" 및 "형질도입"은 모두 수령 세포 또는 세포들로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 나타낸다.
약물 내성 면역요법과 면역 체크포인트 억제제의 조합
암에 대한 화학요법 치료의 주요 한계는 바람직하지 않은 감염을 달리 피하거나 암 세포에 대한 방어를 제공할 면역적격 세포의 사멸 및 효과적인 면역 시스템의 손실을 초래하는 약물 유도된 면역 독성이다. 화학요법의 심각한 독성 효과를 극복하기 위한 한 가지 전략은 약물 내성을 부여하는 cDNA 서열을 발현하도록 설계된 레트로바이러스 벡터의 도입에 의해 세포독성 면역적격 세포를 선택적으로 유전적으로 변형시키는 것이고, 이는 화학치료제의 동시 투여에 저항할 수 있는 암 세포를 능동적으로 표적화할 수 있다.
면역 체크포인트 단백질은 면역 시스템에서 T 세포 기능을 조절한다. T 세포는 세포-매개 면역에서 중심적인 역할을 한다. 체크포인트 단백질은 T 세포로 신호를 보내어 T 세포 기능을 본질적으로 차단하거나 억제하는 특정 리간드와 상호작용한다. 암 세포는 이들의 표면에서 높은 수준의 체크포인트 단백질의 발현을 유도함에 의해, 종양 미세환경으로 들어가는 T 세포의 표면에서 발현 체크포인트 단백질을 발현시키는 T 세포의 제어를 발생시키는 이러한 시스템을 이용하여, 항암 면역 반응을 억제한다. 이와 같이, 체크포인트 단백질의 억제는 T 세포 기능의 회복 및 암 세포에 대한 면역 반응을 일으킬 것이다. 체크포인트 단백질의 예는 CTLA-4, PDL1(B7-H1, CD274), PDL2(B7-DC, CD273), PD1, B7-H3(CD276), B7-H4(B7-S1, B7x, VCTN1), BTLA(CD272), HVEM, TIM3(HAVcr2), GAL9, LAG3(CD223), VISTA, KIR, 2B4(CD244; CD2 패밀리의 분자에 속하고 모든 NK, γδ, 및 기억 CD8+(αβ) T 세포 상에서 발현된다), CD160(BY55로도 지칭됨), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나제, OX40, A2aR 및 다양한 B-7 패밀리 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)은 T 세포 및 프로-B 세포에서 발현되고 이들의 운명/분화에 역할을 담당하는 288개 아미노산 세포 표면 단백질 분자이다. PD-1은 B7 패밀리의 구성원인 PD-L1 및 PD-L2의 2개의 리간드를 갖는다. PD-L1 단백질은 LPS 및 GM-CSF 치료에 반응하여 대식세포 및 수지상 세포(DC)에서, 그리고 TCR 및 B 세포 수용체 신호전달시 T 세포 및 B 세포에서 상향조절된다. PD-1은 T 세포 반응을 소극적으로 조절한다.
PD-1은 면역 감시로부터 종양-특이적 이탈의 역할을 한다. PD-1은 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 둘 모두에서 종양-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)에서 고도로 발현된다는 것이 입증되었다. PD-1은 또한 흑색종 침윤성 T 림프구(TIL)에서 상향조절된다[Dotti (2009) Blood 114 (8): 1457-58]. 종양은 PD-1 리간드 PDL-1 및 PDL-2를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, PDL-1은 아교모세포종, 특히 중간엽 서브타입에서 발견된다. (Nat Rev Neurol 2015: 11:504-515). CTL에서 PD-1의 상향조절과 조합된, 종양에 의한 PDL-1 및 PDL-2의 발현은 T 세포 기능의 상실 및 효과적인 항-종양 반응을 매개하는 CTL의 무능력에서의 기여 인자일 수 있다. 연구자들은 림프구 맥락수막염 바이러스(LCMV)에 만성적으로 감염된 마우스에서, 항-PD-1 항체의 투여가 PD-1-PDL 상호작용을 차단하였고 일부 T 세포 기능(증식 및 사이토카인 분비)을 회복시킬 수 있었고, 바이러스 부하를 감소시킴을 보여주었다(Barber et al (2006) Nature 439 (9): 682-687).
종양 세포 자체는 PD-L1을 발현하고 이 메커니즘을 통해 T 세포 반응을 제한한다고 생각된다. PD-1의 억제는 B16 흑색종 모델에서 이펙터 T 세포를 증식시키고 T 조절 세포 집단을 제한하는 것이 추가로 밝혀졌다. PD-1, CTLA-4 또는 IDO(인돌아민 2,3-디옥시게나제)의 차단은 IL-2 생산을 회복시키고 종양 미세환경에 존재하는 CD8+ T 세포의 증가된 증식을 가능하게 한다. 항-PDL1 치료는 항원-특이적 백신-생성된 CD8+ T 세포를 구제하고 증식을 허용하여 종양을 거부하는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 PD-1/ PD-L1 축이 활성화된 종양-특이적 T 세포를 조절함을 시사한다.
흑색종, 비소세포폐암, 및 신세포 암종의 임상 시험에서 항-PD-1 차단된 일부 환자에서 항-종양 반응이 나타났다. 진행된 흑색종, 비소세포폐암, 전립선암, 신세포암, 방광암, 및 결장직장암의 경우에 PD-1 억제에 의한 상당한 이점이 또한 기술되었다. 뮤린 모델에서의 연구는 신경아교종 치료에 대한 이 증거를 적용하였다. IDO, CTLA-4, 및 PD-L1 억제제의 조합 치료를 투여했을 때 종양-침윤성 Treg의 감소 및 생존율 증가가 기술되었다.
몇몇 PD-1 억제제는 임상 시험에서 현재 시험 중이다. CT-011은 PD-1에 대한 인간화된 IgG1 모노클로날 항체이다. 자가 줄기 세포 이식술을 받은 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL)을 갖는 대상체에서 II상 임상 시험이 최근에 완료되었다. 예비 결과는 추적 기간의 끝에, 대조군에서의 47%에 비해, 대상체의 70%가 무진행 상태였고, 대조군에서의 62%에 비해, 대상체의 82%가 살아 있음을 나타내었다. 이 시험은 CT-011이 PD-1 기능을 차단할 뿐만 아니라, 자연 살해 세포의 활성도 증가시킴으로써, 항종양 면역 반응을 강화시킴을 밝혀내었다.
BMS 936558은 PD-1 제제를 표적화하는 완전한 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. I상 시험에서, 진행성, 난치성 악성종양을 갖는 대상체에서 BMS-936558의 격주 투여는 지속적인 부분적 또는 완전 퇴행을 보여주었다. 가장 현저한 반응률은 흑색종(28%) 및 신세포 암종(27%)을 갖는 대상체에서 관찰되었으나, 비소세포폐암(NSCLC)을 갖는 대상체에서도 실질적인 임상 활성이 관찰되었고, 일부 반응은 1년 넘게 지속되었다. 이것은 또한 비교적 잘 용인되었다; 등급3의 부작용은 대상체의 14%에서 발생하였다.
BMS 936559는 PD-1 리간드인 PD-L1을 표적화하는 완전한 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. I상 결과는 이 약물의 격주 투여가, 특히 흑색종을 갖는 대상체에서, 지속적인 반응을 유도하였음을 보여주었다. 진행-단계의 NSCLC, 흑색종, RCC, 또는 난소암을 갖는 대상체의 암 유형에 따라 객관적인 반응률은 6% 내지 17%의 범위였고, 일부 대상체는 1년 이상 지속되는 반응을 경험하였다.
MK 3475는 진행성, 국소 진행된, 또는 전이성 암종, 흑색종, 또는 NSCLC를 갖는 대상체에서 약물의 투여, 안전성, 및 용인성을 평가하는 5-부분 연구에서 I상 개발의 인간화된 IgG4 항-PD-1 모노클로날 항체이다.
MPDL 3280A는 진행성 고형 종양을 갖는 대상체에서 화학요법의 유무와 함께, 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR)를 표적화하는 베바시주맙(bevacizumab)과 함께 그리고 BRAF V600-돌연변이체 전이성 흑색종을 갖는 대상체에서 BRAF 억제제 베무라페닙(vemurafenib)과 함께 I상 시험을 받은, PD-L1도 표적화하는 모노클로날 항체이다.
AMP 224는 PD-L2/PD-1 상호작용을 차단할 가능성이 있는 제2 PD-1 리간드인 PD-L2, 및 IgG1의 세포외 도메인의 융합 단백질이다. AMP-224는 현재 진행된 암을 갖는 대상체에서 단일요법으로서 I상 시험을 진행 중이다.
Medi 4736은 진행된 악성 흑색종, 신세포 암종, NSCLC, 및 결장직장암을 갖는 대상체에서 I상 임상 시험의 항-PD-L1 항체이다.
CTLA4(세포독성 T-림프구-관련 단백질)는 면역 시스템을 하향조절하는 단백질 수용체이다. CTLA4는 T 세포의 표면에서 발견되며, 항원에 대한 세포성 면역 공격을 발생시킨다. T 세포 공격은 T 세포 상의 CD28 수용체를 자극함에 의해 작동할 수 있다. T 세포 공격은 CTLA4 수용체를 자극함에 의해 끊길 수 있다. T 세포의 표면 상의 CTLA-4를 표적화하는 모노클로날 항체인 혁신 신약 면역치료제인 이필리무맙(ipilimumab)(YERVOY®)은 흑색종의 치료를 위한 것이었다.
바람직하게는, 본 발명은 약물-내성 면역적격 세포 및 면역 체크포인트 억제제와 함께 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 생물학적 치료제 또는 소분자이다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 완전한 인간 항체, 융합 단백질 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, OX40, B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질을 억제한다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, OX40, A2aR, B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질의 리간드와 상호작용한다.
바람직하게는, 치료제는 화학치료제, 면역자극제, T 세포 성장 인자, 인터류킨, 항체, 백신 또는 이의 임의의 조합이다. 바람직하게는, 인터류킨은 IL-7 또는 IL-15이다. 바람직하게는, 인터류킨은 당화된 IL-7이다.
바람직하게는, 약물-내성 면역적격 세포, 치료제, 및 체크포인트 억제제는 동시에 투여되거나, 하나씩, 또는 하나 뒤에 다른 2개를 동시에, 또는 동시에 2개 이후에 세 번째가 뒤따르는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 바람직하게는, 약물-내성 면역적격 세포는 치료제 및 면역 체크포인트 억제제 전에 투여된다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 γδ T-세포, NK 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 γδ T-세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 50% 내지 약 95%의 γδ T-세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 집단은 γδ T-세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상의 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 약 5% 내지 약 25%의 NK 세포를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 세포독성 면역 세포의 분리된 조성물은 γδ T-세포, NK 세포 또는 이의 임의의 조합을 포함하고 선택적으로 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 비제한적으로 포함하는 다른 면역적격 세포를 추가로 포함하며, 조성물에 존재하는 세포독성 면역 세포의 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 이상의 초과는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현시킨다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 세포독성 면역 세포의 분리된 조성물은 γδ T-세포, NK 세포 또는 이의 임의의 조합을 포함하고, γδ T-세포(존재시)의 적어도 약 50% 이상 및 NK 세포(존재시)의 약 50% 초과는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현시킨다. 바람직하게는, 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드는 O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), 디하이드로폴레이트 환원효소의 약물 내성 변이체(L22Y-DHFR), 티미딜레이트 신타제, 다중 약물 내성-1 단백질(MDR1)이다.
바람직하게는, 본 발명은 화학치료제 및 γδ T-세포, NK 세포 또는 이의 임의의 조합을 포함하고 추가로 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 조작된 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 비제한적으로 포함하는 다른 면역적격 세포를 선택적으로 포함하는 면역적격 세포의 화학요법 내성 조성물과 함께 면역 체크포인트 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 약물-내성 γδ T-세포, NK 세포 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 조성물의 생체외 생성 및 증식은, 이러한 환경에서, 화학요법 및 체크포인트 억제제와 동시에 면역적격 세포-기반 요법의 투여를 가능하게 하여, 항-종양 면역을 수립하고 유지하면서 잠재적으로 종양 제거를 개선시킬 수 있고, 이는 아마도 장기간 종양 제거로 이어질 수 있다. 바람직하게는, 면역적격 세포는 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개 이상의 상이한 종양 인지 모이어티를 발현하도록 유전적으로 공학처리되고, 각 종양 인지 모이어티는 종양 항원을 인지한다.
바람직하게는, 본 발명은 암, 및 특히 암성 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 약물 내성을 일으키거나 달리 화학치료제를 피하는 암성 세포를 효과적으로 제거하기 위해 암성 세포를 사멸시키거나 이의 증식을 감소시킬 수 있는 화학치료제와 면역요법 및 면역 체크포인트 억제제의 사용을 조합시킨다. 본 발명의 방법은, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 7,078,034호에 Lamb L. S. 등에 의해 기술된 대로, 치료되는 환자 또는 다른 공급원으로부터의 γδ T-세포를 비제한적으로 포함하는 세포독성 면역 세포를 분리시키는 것을 제공한다. 이후 분리된 세포는 선택된 화학치료제에 대한 내성을 세포에 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 이후 암, 및 특히 종양 치료를 필요로 하는 환자는 화학치료제 및 체크포인트 억제제의 전, 후, 또는 함께 트랜스펙션된 T-세포의 용량 또는 용량들을 투여받을 수 있다. 표적화된 암 세포에 독성이면서 세포의 증식 및 생존력을 감소시킬 상기 제제 자체는 또한 종양의 미세 환경을 유도하여 국소 종양-유래된 면역억제를 감소시키고 종양 내로의 세포의 이동 뿐만 아니라 암 세포의 세포 표면에 스트레스-관련 단백질의 형성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스펙션된 γδ T-세포는 그러한 스트레스-관련 리간드를 인지하고 이에 따라 표적화할 수 있는 특성을 가지므로, 암 세포를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화한다.
바람직하게는, γδ T-세포, NK 세포 또는 이의 조합을 포함하는 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포는, 예를 들어, 비제한적으로 종양 덩어리 내로의 직접 주입, 종양 덩어리로 진입하는 혈관으로의 전달, 또는 둘 모두의 조합에 의해 표적화된 종양에 직접 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포는 종양 덩어리, 절제 후 강내(intracavity), 복강내 또는 심실내 삽입된 캐뉼러형 바늘 또는 카테터를 통한 직접 이식에 의해 환자의 뇌에서 아교모세포종 덩어리에 직접 전달될 수 있는 것으로 고려된다.
바람직하게는, 대상 인간 또는 동물 환자에서 암을 치료하기 위해 면역요법 및 화학요법을 조합시킨 일부 프로토콜에서, 사이토카인(IL-2, IL-12, GM-CSF 등)을 환자에게 전달하여 세포독성 림프구의 형성을 부스팅할 수 있다. 다른 방법에서, 항-CD137 특이적 항체를 사용할 수 있다. CD137은 종양 괴사 인자(TNF)/신경 성장 인자(NGF) 수용체 패밀리의 구성원이고 활성화된 T- 및 B-림프구 및 단핵구에 의해 발현된다; 이의 리간드는 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 항-CD137 모노클로날 항체는 활성화된 T-세포 및 새롭게 분리된 마우스 수지상 세포(DC)와 같은 CD137-발현 면역 세포에 특이적으로 결합하여, 종양 세포에 대한 면역 반응, 특히 세포독성 T 세포 반응을 자극할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 세포독성 면역 세포의 집단을 수득하는 단계로서, 상기 분리된 세포독성 면역 세포가 치료제에 내성이도록 유전적으로 변형된, 단계; 유효량의 치료제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계; 분리된 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포의 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계로서, 그 결과 상기 세포독성 면역 세포가 종양에 전달되는, 단계; 및 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 환자에게 추가로 투여하여, 환자에서 암을 감소시키는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 세포독성 면역 세포는 γδ T-세포이다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포는 γδ T-세포 및 자연 살해(NK) 세포이다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포는 γδ T-세포, NK 세포이고 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 비제한적으로 포함하는 다른 면역적격 세포를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포는 암을 갖는 환자로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포는 암 환자 이외의 공급원으로부터 분리될 수 있다.
바람직하게는, 세포독성 면역 세포는 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래된 γδ T-세포이다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포는 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래된 γδ T-세포 및 NK 세포이다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포는 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래되고 γδ T-세포, NK 세포이며 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 비제한적으로 포함하는 다른 면역적격 세포를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다능성 줄기 세포는 암을 갖는 환자로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는, 다능성 줄기 세포는 암 환자 이외의 공급원으로부터 분리될 수 있다.
바람직하게는, 치료제는 세포가 이종성 핵산을 수용하고, 이종성 핵산이 세포에서 발현될 때, 상기 치료제에 대한 내성을 나타내는 세포를 특징으로 한다. 바람직하게는, 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 세포독성 화학치료제일 수 있다: 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드); 대사 길항제(예를 들어, 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이의 유도체); DNA 탈메틸화제(항대사물질로도 공지됨; 예를 들어, 아자시티딘); 치환된 뉴클레오티드; 치환된 뉴클레오시드; 항종양 항생제(예를 들어, 미토마이신, 아드리아마이신); 식물-유래된 항종양제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈덴신, TAXOL®, 파클리탁셀, 아브락산); 시스플라틴; 카르보플라틴; 에토포시드 등. 그러한 제제는 항암제 트리메토트렉세이트(TMTX); 테모졸로미드; 랄티트렉시드; S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR); 6-벤질구아니딘(6-BG); 니트로소우레아[예를 들어, 비스-클로로니트로소우레아(BCNU; 카르무스틴), 로무스틴 (CCNU) +/- 프로카르바진 및 빈크리스틴(PCV 요법), 포테무스틴]; 시타라빈; 및 캄프토테신; 및 이의 임의의 치료학적 유도체를 추가로 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 치료제에 내성이도록 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포의 집단을 수득하는 단계는, 예를 들어, 대상체로부터 혈액 또는 종양 생검을 포함하는 조직 샘플을 비제한적으로 포함하는 생물학적 샘플을 수득함에 의해, 인간 대상체 또는 동물 대상체와 같은 대상체로부터 세포독성 면역 세포의 집단을 수득하는 것을 포함한다. 샘플은 세포독성 면역 세포 및 다른 면역적격 세포에 대해 선택적으로 농축될 수 있고/거나 샘플에 존재하는 세포는 샘플에 존재하는 세포의 집단을 증가시키기 위해 선택적으로 증식될 수 있다. 세포는 바람직하게는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종성 핵산 서열을 포함하는 벡터로 안정하게 트랜스펙션되거나 유전자 편집되고, 이 때 상기 이종성 핵산 서열은 화학치료제와 같은 하나 이상의 치료제에 대한 세포 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 안정하게 트랜스펙션된 세포독성 면역 세포의 집단은 생존 가능하게 유지될 수 있다.
바람직하게는, 치료제는 트리메토트렉세이트 또는 메토트렉세이트일 수 있고, 이종성 핵산 서열은 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 이의 유도체를 코딩한다. 바람직하게는, 치료제는 테모졸로미드 또는 이의 치료적 활성 유도체일 수 있고, 이종성 핵산 서열은 O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제 또는 이의 유도체를 코딩할 수 있다. 바람직하게는, 화학치료제는 시스플라틴, 독소루비신 또는 파클리탁셀 또는 이의 치료적 활성 유도체일 수 있고, 이종성 핵산 서열은 다중 약물 내성-1 단백질(MDR1) 또는 이의 유도체를 코딩할 수 있다.
바람직하게는, 분리된 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포, 치료제, 및 면역 체크포인트 억제제는 환자에 공동-투여될 수 있다. 바람직하게는, 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포, 치료제, 및 면역 체크포인트 억제제는 환자에 순차적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포, 치료제, 및 면역 체크포인트 억제제는 환자에 동시에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포는 종양 내 또는 근위 혈관으로 직접 환자에 투여되어 종양 내로 유도된다. 바람직하게는, 종양은 아교모세포종이다.
바람직하게는, 면역 체크포인트 억제제는 생물학적 치료제 또는 소분자일 수 있다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 완전한 인간 항체, 융합 단백질, 항원-결합 단편 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, OX40, B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질을 억제한다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, OX40, B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질의 리간드와 상호작용한다. 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 트레멜리무맙(CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 모노클로날 항체(항-B7-H1; MEDI4736), MK-3475(PD-1 차단제), OPDIVO®/니볼루맙(항-PD1 항체), CT-011(항-PD1 항체), BY55 모노클로날 항체, AMP224(항-PDL1 항체), BMS-936559(항-PDL1 항체), MPLDL3280A(항-PDL1 항체), MSB0010718C(항-PDL1 항체) 및 YERVOY®/이필리무맙(항-CTLA-4 체크포인트 억제제)을 포함한다. 체크포인트 단백질 리간드는 PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CD28, CD86 및 TIM-3를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명은 CTLA-4를 억제하는 면역 체크포인트 억제제 약물 부류의 용도를 제공한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 항-CTLA4 길항제는 항-CTLA4 항체, 인간 항-CTLA4 항체, 마우스 항-CTLA4 항체, 포유동물 항-CTLA4 항체, 인간화된 항-CTLA4 항체, 모노클로날 항-CTLA4 항체, 폴리클로날 항-CTLA4 항체, 키메라 항-CTLA4 항체, MDX-010(이필리무맙), 트레멜리무맙, 항-CD28 항체, 항-CTLA4 어드넥틴, 항-CTLA4 도메인 항체, 단일쇄 항-CTLA4 단편, 중쇄 항-CTLA4 단편, 경쇄 항-CTLA4 단편, 및 공동-자극 경로를 작용시키는 CTLA4의 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 추가적인 항-CTLA4 길항제는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CD28 항원의 이의 인지체 리간드에 결합하는 능력을 파괴하고, CTLA4의 이의 인지체 리간드에 결합하는 능력을 억제하고, 공동-자극 경로를 통해 T 세포 반응을 증가시키고, B7의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, B7의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, CD80의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, CD80의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, CD86의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, CD86의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, 그리고 공동-자극 경로가 일반적으로 활성화되는 것을 파괴할 수 있는 임의의 억제제. 이는 필수적으로 다른 항-CTLA4 길항제 중에서, 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4의 소분자 억제제; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 항체; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 안티센스 분자; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 어드넥틴, 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4의 RNAi 억제제(단일 및 이중 가닥 둘 모두)를 포함한다.
바람직하게는, 면역자극제, T 세포 성장 인자 및 인터류킨은 체크포인트 억제제 및 약물-내성 면역요법과 함께 사용될 수 있다. 면역자극제는 임의의 그 구성요소의 활성화를 유도하거나 활성을 증가시킴에 의해 면역 시스템을 자극하는 물질(약물 및 영양소)이다. 면역자극제는 박테리아 백신, 집락 자극 인자, 인터페론, 인터류킨, 다른 면역자극제, 치료용 백신, 백신 조합물 및 바이러스 백신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. T 세포 성장 인자는 T 세포의 증식을 자극하는 단백질이다. T 세포 성장 인자의 예는 Il-2, IL-7, IL-15, IL-17, IL21 및 IL-33을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 적어도 하나의 체크포인트 억제제, 및 γδ T-세포, NK 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 세포독성 면역 세포의 분리된 집단을 포함하는 조성물을 제공하고, 이 때 세포독성 면역 세포의 집단의 약 5% 초과 및 바람직하게는 약 50% 초과는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현시킨다. 바람직하게는, 조성물은 적어도 하나의 체크포인트 억제제, 및 γδ T-세포 및 NK 세포를 포함하는 세포독성 면역 세포의 분리된 집단을 포함하는 조성물을 제공하고, 이 때 세포독성 면역 세포의 집단의 약 50% 내지 약 95%는 γδ T-세포이고 세포독성 면역 세포의 집단의 약 5% 내지 약 25%는 NK 세포이다.
바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같은 치료제, 면역 체크포인트 억제제, 생물학적 치료제 또는 약학적 조성물은, 예를 들어, 경구 또는 비경구로, 예를 들어, 정맥내, 근내, 피하, 안와내, 수정체낭내, 복강내, 직장내, 수조내, 종양내, 도관내, 피내를 포함하는 다양한 경로에 의해 또는, 예를 들어, 피부 패치 또는 경피적 이온삼투압을 각각 사용하여 피부를 통해 수동적으로 또는 촉진된 흡수에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 치료제, 체크포인트 억제제, 생물학적 치료제 또는 약학적 조성물은 또한 병리학적 상태의 부위로, 예를 들어, 종양에 공급되는 혈관 내로 정맥내 또는 동맥내 투여될 수 있다.
바람직하게는, 면역 체크포인트 억제제는 0.0001 mg/kg 미만, 0.0001-0.001 mg/kg, 0.001-0.01 mg/kg, 0.01-0.05 mg/kg, 0.05-0.1 mg/kg, 0.1-0.2 mg/kg, 0.2-0.3 mg/kg, 0.3-0.5 mg/kg, 0.5-0.7 mg/kg, 0.7-1 mg/kg, 1-2 mg/kg, 2-3 mg/kg, 3-4 mg/kg, 4-5 mg/kg, 5-6 mg/kg, 6-7 mg/kg, 7-8 mg/kg, 8-9 mg/kg, 9-10 mg/kg, 적어도 10 mg/kg, 또는 이의 용량의 임의의 조합으로 투여된다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 일주일에 적어도 1회, 일주일에 적어도 2회, 일주일에 적어도 3회, 2주마다 적어도 1회, 또는 매월 또는 여러 달마다 적어도 1회 투여된다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 단일 용량, 2회 용량, 3회 용량, 4회 용량, 5회 용량, 또는 6회 이상의 용량으로 투여된다.
바람직하게는, 본 발명은 암 세포의 생존을 억제하는 특징을 갖는 세포독성 치료제, 세포독성 면역 세포가 치료제에 내성이도록 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포의 분리된 집단, 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 환자에서 암을 치료하기 위한 시스템을 제공한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 γδ T-세포, NK 세포 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 γδ T-세포 및 자연 살해 세포를 포함하고 선택적으로 다른 면역적격 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있고, 이 때 상기 이종성 핵산 서열은 세포에서 발현시 치료제에 대한 내성을 세포에 부여하는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 세포독성 화학치료제이다: 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드); 대사 길항제(예를 들어, 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이의 유도체); DNA 탈메틸화제(항대사물질로도 공지됨; 예를 들어, 아자시티딘); 치환된 뉴클레오티드; 치환된 뉴클레오시드; 항종양 항생제(예를 들어, 미토마이신, 아드리아마이신); 식물-유래된 항종양제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈덴신, TAXOL®, 파클리탁셀, 아브락산); 시스플라틴; 카르보플라틴; 에토포시드 등. 그러한 제제는 항암제 트리메토트렉세이트(TMTX); 테모졸로미드; 랄티트렉시드; S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR); 6-벤질구아니딘(6-BG); 니트로소우레아[예를 들어, 비스-클로로니트로소우레아(BCNU; 카르무스틴), 로무스틴 (CCNU) +/- 프로카르바진 및 빈크리스틴(PCV 요법), 포테무스틴]; 시타라빈; 및 캄프토테신; 및 이의 임의의 치료학적 유도체를 추가로 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 치료제는 트리메토트렉세이트 또는 메토트렉세이트이고, 이종성 핵산 서열은 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 이의 유도체를 코딩한다. 바람직하게는, 치료제는 테모졸로미드 또는 이의 치료적인 제제 유도체이고, 이종성 핵산 서열은 O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 또는 이의 유도체를 코딩한다. 바람직하게는, 치료제는 니트로소우레아 또는 이의 치료적인 제제 유도체이고, 이종성 핵산 서열은 O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 또는 이의 유도체를 코딩한다.
바람직하게는, 면역 체크포인트 억제제는 생물학적 치료제 또는 소분자이다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 완전한 인간 항체, 융합 단백질, 항원-결합 단편 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, OX40, B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질을 억제한다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, OX40, B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질의 리간드와 상호작용한다. 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 트레멜리무맙(CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 모노클로날 항체(항-B7-H1; MEDI4736), MK-3475(PD-1 차단제), OPDIVO®/니볼루맙(항-PD1 항체), CT-011(항-PD1 항체), BY55 모노클로날 항체, AMP224(항-PDL1 항체), BMS-936559(항-PDL1 항체), MPLDL3280A(항-PDL1 항체), MSB0010718C(항-PDL1 항체) 및 YERVOY®/이필리무맙(항-CTLA-4 체크포인트 억제제)을 포함한다. 체크포인트 단백질 리간드는 PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CD28, CD86 및 TIM-3를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명은 CTLA-4를 억제하는 체크포인트 억제제 약물 부류의 용도를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 항-CTLA4 길항제는 항-CTLA4 항체, 인간 항-CTLA4 항체, 마우스 항-CTLA4 항체, 포유동물 항-CTLA4 항체, 인간화된 항-CTLA4 항체, 모노클로날 항-CTLA4 항체, 폴리클로날 항-CTLA4 항체, 키메라 항-CTLA4 항체, MDX-010(이필리무맙), 트레멜리무맙, 항-CD28 항체, 항-CTLA4 어드넥틴, 항-CTLA4 도메인 항체, 단일쇄 항-CTLA4 단편, 중쇄 항-CTLA4 단편, 경쇄 항-CTLA4 단편, 및 공동-자극 경로를 작용시키는 CTLA4의 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 추가적인 항-CTLA4 길항제는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CD28 항원의 이의 인지체 리간드에 결합하는 능력을 파괴하고, CTLA4의 이의 인지체 리간드에 결합하는 능력을 억제하고, 공동-자극 경로를 통해 T 세포 반응을 증가시키고, B7의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, B7의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, CD80의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, CD80의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, CD86의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, CD86의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, 그리고 공동-자극 경로가 일반적으로 활성화되는 것을 파괴할 수 있는 임의의 억제제. 이는 필수적으로 다른 항-CTLA4 길항제 중에서, 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4의 소분자 억제제; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 항체; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 안티센스 분자; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 어드넥틴, 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4의 RNAi 억제제(단일 및 이중 가닥 둘 모두)를 포함한다.
바람직하게는, 면역자극제, T 세포 성장 인자 및 인터류킨이 사용될 수 있다. 면역자극제는 임의의 그 구성요소의 활성화를 유도하거나 활성을 증가시킴에 의해 면역 시스템을 자극하는 물질(약물 및 영양소)이다. 면역자극제는 박테리아 백신, 집락 자극 인자, 인터페론, 인터류킨, 다른 면역자극제, 치료용 백신, 백신 조합물 및 바이러스 백신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. T 세포 성장 인자는 T 세포의 증식을 자극하는 단백질이다. T 세포 성장 인자의 예는 Il-2, IL-7, IL-15, IL-17, IL21 및 IL-33을 포함한다.
바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같은 치료제, 체크포인트 억제제, 생물학적 치료제 또는 약학적 조성물은, 예를 들어, 경구 또는 비경구로, 예를 들어, 정맥내, 근내, 피하, 안와내, 수정체낭내, 복강내, 직장내, 수조내, 종양내, 도관내, 피내를 포함하는 다양한 경로에 의해 또는, 예를 들어, 피부 패치 또는 경피적 이온삼투압을 각각 사용하여 피부를 통해 수동적으로 또는 촉진된 흡수에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 치료제, 체크포인트 억제제, 생물학적 치료제 또는 약학적 조성물은 또한 병리학적 상태의 부위로, 예를 들어, 종양에 공급되는 혈관 내로 정맥내 또는 동맥내 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법을 실시함에 있어서 투여되는 제제의 총 양은 단일 용량으로서, 볼루스(bolus)로서 또는 비교적 단시간에 걸친 주입에 의해 대상체에게 투여될 수 있거나, 분획화된 치료 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있고, 다중 용량은 장기간에 걸쳐 투여된다. 당업자는 대상체에서 병리학적 상태를 치료하기 위한 조성물의 양이 대상체의 연령 및 일반적인 건강상태 뿐만 아니라 투여 경로 및 투여될 치료 횟수를 포함하는 많은 인자에 의존한다는 것을 알 것이다. 이러한 인자에 비추어, 숙련된 기술자는 필요에 따라 특정 용량을 조정할 것이다.
바람직하게는, 체크포인트 억제제는 0.0001 mg/kg 미만, 0.0001-0.001 mg/kg, 0.001-0.01 mg/kg, 0.01-0.05 mg/kg, 0.05-0.1 mg/kg, 0.1-0.2 mg/kg, 0.2-0.3 mg/kg, 0.3-0.5 mg/kg, 0.5-0.7 mg/kg, 0.7-1 mg/kg, 1-2 mg/kg, 2-3 mg/kg, 3-4 mg/kg, 4-5 mg/kg, 5-6 mg/kg, 6-7 mg/kg, 7-8 mg/kg, 8-9 mg/kg, 9-10 mg/kg, 적어도 10 mg/kg, 또는 이의 용량의 임의의 조합으로 투여된다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 일주일에 적어도 1회, 일주일에 적어도 2회, 일주일에 적어도 3회, 2주마다 적어도 1회, 또는 매월 또는 여러 달마다 적어도 1회 투여된다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 단일 용량, 2회 용량, 3회 용량, 4회 용량, 5회 용량, 또는 6회 이상의 용량으로 투여된다.
바람직하게는, 본 발명은 암 세포의 생존을 억제하고 암 세포에서 스트레스 단백질을 유도하는 특성을 갖는 치료제, 세포독성 면역 세포가 γδ T-세포, NK 세포, 또는 이의 임의의 조합을 포함하고 추가로 다른 면역적격 세포를 선택적으로 포함하며 세포독성 면역 세포의 집단이 치료제에 내성이도록 유전적으로 변형된 세포독성 면역 세포의 분리된 집단, 및 체크포인트 억제제를 포함하는 환자에서 아교모세포종을 치료하기 위한 시스템을 제공한다. 바람직하게는, 세포독성 면역 세포의 집단은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종성 핵산 서열을 포함하고, 이 때 상기 이종성 핵산 서열은 세포에서 발현시 치료제에 대한 내성을 세포에 부여하는 폴리펩티드를 코딩한다.
바람직하게는, 치료제는 알킬화제, 대사 길항제, 항종양 항생제, 및 식물-유래된 항종양제로 구성된 군으로부터 선택되는 세포독성 화학치료제이다.
바람직하게는, 치료제는 트리메토트렉세이트(TMTX), 메토트렉세이트(MTX), 테모졸로미드, 랄티트렉시드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR), 캄프토테신, 6-벤질구아니딘, 시타라빈, 및 이의 임의의 치료학적 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 치료제는 트리메토트렉세이트 또는 메토트렉세이트이고, 이종성 핵산 서열은 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 이의 유도체를 코딩한다.
바람직하게는, 면역 체크포인트 억제제는 생물학적 치료제 또는 소분자일 수 있다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 완전한 인간 항체, 융합 단백질, 항원-결합 단편 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, OX40, B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질을 억제한다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, OX40, B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질의 리간드와 상호작용한다. 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 트레멜리무맙(CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 모노클로날 항체(항-B7-H1; MEDI4736), MK-3475(PD-1 차단제), OPDIVO®/니볼루맙(항-PD1 항체), CT-011(항-PD1 항체), BY55 모노클로날 항체, AMP224(항-PDL1 항체), BMS-936559(항-PDL1 항체), MPLDL3280A(항-PDL1 항체), MSB0010718C(항-PDL1 항체) 및 YERVOY®/이필리무맙(항-CTLA-4 체크포인트 억제제)을 포함한다. 체크포인트 단백질 리간드는 PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CD28, CD86 및 TIM-3를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명은 CTLA-4를 억제하는 면역 체크포인트 억제제 약물의 특정 부류의 용도를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 항-CTLA4 길항제는 항-CTLA4 항체, 인간 항-CTLA4 항체, 마우스 항-CTLA4 항체, 포유동물 항-CTLA4 항체, 인간화된 항-CTLA4 항체, 모노클로날 항-CTLA4 항체, 폴리클로날 항-CTLA4 항체, 키메라 항-CTLA4 항체, MDX-010(이필리무맙), 트레멜리무맙, 항-CD28 항체, 항-CTLA4 어드넥틴, 항-CTLA4 도메인 항체, 단일쇄 항-CTLA4 단편, 중쇄 항-CTLA4 단편, 경쇄 항-CTLA4 단편, 및 공동-자극 경로를 작용시키는 CTLA4의 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 추가적인 항-CTLA4 길항제는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CD28 항원의 이의 인지체 리간드에 결합하는 능력을 파괴하고, CTLA4의 이의 인지체 리간드에 결합하는 능력을 억제하고, 공동-자극 경로를 통해 T 세포 반응을 증가시키고, B7의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, B7의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, CD80의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, CD80의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, CD86의 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 파괴하고, CD86의 공동-자극 경로를 활성화하는 능력을 파괴하고, 그리고 공동-자극 경로가 일반적으로 활성화되는 것을 파괴할 수 있는 임의의 억제제. 이는 필수적으로 다른 항-CTLA4 길항제 중에서, 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4의 소분자 억제제; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 항체; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 안티센스 분자; 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대해 유도된 어드넥틴, 공동-자극 경로의 다른 구성원들 중에서, CD28, CD80, CD86, CTLA4의 RNAi 억제제(단일 및 이중 가닥 둘 모두)를 포함한다.
바람직하게는, 면역자극제, T 세포 성장 인자 및 인터류킨이 사용될 수 있다. 면역자극제는 임의의 그 구성요소의 활성화를 유도하거나 활성을 증가시킴에 의해 면역 시스템을 자극하는 물질(약물 및 영양소)이다. 면역자극제는 박테리아 백신, 집락 자극 인자, 인터페론, 인터류킨, 다른 면역자극제, 치료용 백신, 백신 조합물 및 바이러스 백신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. T 세포 성장 인자는 T 세포의 증식을 자극하는 단백질이다. T 세포 성장 인자의 예는 Il-2, IL-7, IL-15, IL-17, IL21 및 IL-33을 포함한다.
바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같은 치료제, 면역 체크포인트 억제제, 생물학적 치료제 또는 약학적 조성물은, 예를 들어, 경구 또는 비경구로, 예를 들어, 정맥내, 근내, 피하, 안와내, 수정체낭내, 복강내, 직장내, 수조내, 종양내, 도관내, 피내를 포함하는 다양한 경로에 의해 또는, 예를 들어, 피부 패치 또는 경피적 이온삼투압을 각각 사용하여 피부를 통해 수동적으로 또는 촉진된 흡수에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 치료제, 체크포인트 억제제, 생물학적 치료제 또는 약학적 조성물은 또한 병리학적 상태의 부위로, 예를 들어, 종양에 공급되는 혈관 내로 정맥내 또는 동맥내 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법을 실시함에 있어서 투여되는 제제의 총 양은 단일 용량으로서, 볼루스로서 또는 비교적 단시간에 걸친 주입에 의해 대상체에게 투여될 수 있거나, 분획화된 치료 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있고, 다중 용량은 장기간에 걸쳐 투여된다. 당업자는 대상체에서 병리학적 상태를 치료하기 위한 조성물의 양이 대상체의 연령 및 일반적인 건강상태 뿐만 아니라 투여 경로 및 투여될 치료 횟수를 포함하는 많은 인자에 의존한다는 것을 알 것이다. 이러한 인자에 비추어, 숙련된 기술자는 필요에 따라 특정 용량을 조정할 것이다.
바람직하게는, 체크포인트 억제제는 0.0001 mg/kg 미만, 0.0001-0.001 mg/kg, 0.001-0.01 mg/kg, 0.01-0.05 mg/kg, 0.05-0.1 mg/kg, 0.1-0.2 mg/kg, 0.2-0.3 mg/kg, 0.3-0.5 mg/kg, 0.5-0.7 mg/kg, 0.7-1 mg/kg, 1-2 mg/kg, 2-3 mg/kg, 3-4 mg/kg, 4-5 mg/kg, 5-6 mg/kg, 6-7 mg/kg, 7-8 mg/kg, 8-9 mg/kg, 9-10 mg/kg, 적어도 10 mg/kg, 또는 이의 용량의 임의의 조합으로 투여된다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 일주일에 적어도 1회, 일주일에 적어도 2회, 일주일에 적어도 3회, 2주마다 적어도 1회, 또는 매월 또는 여러 달마다 적어도 1회 투여된다. 바람직하게는, 체크포인트 억제제는 단일 용량, 2회 용량, 3회 용량, 4회 용량, 5회 용량, 또는 6회 이상의 용량으로 투여된다.
비율, 농도, 양, 및 다른 수치 데이터는 본원에서 범위 형식으로 표현될 수 있음에 유의해야 한다. 그러한 범위 형식은 편의상 및 간결하게 하기 위해 사용된 것이므로, 범위의 한계로서 명시적으로 언급된 수치 값 뿐만 아니라, 각 수치 값 및 하위-범위가 명시적으로 언급된 것처럼 그 범위 내에 포함된 모든 개별적인 수치 값 또는 하위-범위를 포함하도록 유연한 방식으로 해석되어야 함이 이해되어야 한다. 예시를 위해, "약 0.1% 내지 약 5%"의 농도 범위는 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량%의 명시적으로 언급된 농도 뿐만 아니라, 지시된 범위 내의 개별적인 농도(예를 들어, 1%, 2%, 3%, 및 4%) 및 하위-범위(예를 들어, 0.5%, 1.1%, 2.2%, 3.3%, 및 4.4%)도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "약"은 수식되는 수치 값(들)의 ±1%, ±2%, ±3%, ±4%, ±5%, ±6%, ±7%, ±8%, ±9%, 또는 ±10% 이상을 포함할 수 있다. 또한, 어구 "약 'x' 내지 'y'"는 "약 'x' 내지 약 'y'"를 포함한다.
본 발명의 사상 및 원리를 실질적으로 벗어나지 않으면서 상기 기술된 발명에 많은 변형 및 수정이 이루어질 수 있다. 그러한 모든 변형 및 수정은 본 발명의 범위 내에 포함되고 하기 청구 범위에 의해 보호되도록 의도된다.
실시예
하기 실시예는 예시를 위해 제공되며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 - 암 치료 패러다임
화학치료제, 약물-내성 γδ-T 세포 및/또는 약물-내성 자연 살해 세포, 및 면역 체크포인트 억제제(들)를 포함하는 조합 요법을 사용하여 암 환자를 치료한다. 화학치료제는 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드), 대사 길항제(예를 들어, 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이의 유도체), 항종양 항생제(예를 들어, 미토마이신, 아드리아마이신), 식물-유래된 항종양제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈덴신, TAXOL®, 파클리탁셀, 아브락산), 시스플라틴, 카르보플라틴, 에토포시드 등으로부터 선택된다. 그러한 제제는 항암제 트리메토트렉세이트(TMTX), 테모졸로미드, 랄티트렉시드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR), 6-벤질구아니딘(6-BG), 비스-클로로니트로소우레아(BCNU), 시타라빈, 및 캄프토테신, 또는 이의 임의의 치료학적 유도체를 추가로 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 약물-내성 γδ-T 세포 및 자연 살해 세포는 화학치료제에 내성이다. 면역 체크포인트 억제제(들)는 단독으로 또는 다른 면역 체크포인트 억제제와 함께 사용되고, 면역 체크포인트 단백질 CTLA-4, PDL1(B7-H1, CD274), PDL2(B7-DC, CD273), PD1, B7-H3(CD276), B7-H4(B7-S1, B7x, VCTN1), BTLA(CD272), HVEM, TIM3(HAVcr2), GAL9, LAG3(CD223), VISTA, KIR, 2B4(CD244; CD2 패밀리의 분자에 속하고 모든 NK, γδ, 및 기억 CD8+(αβ) T 세포 상에서 발현된다), CD160(BY55로도 지칭됨), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나제, OX40, A2aR 및 다양한 B-7 패밀리 리간드의 억제제로부터 선택된다.
화학요법과 함께 면역 치료 활성의 평가
반응 평가 기준은 고체 종양의 반응 평가 기준에 근거한 평가를 포함한다(WHO; World Health Organization Offset Publication No. 48, 1979); RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors; J Natl Cancer Inst 2000; 92:205-16; Eisenhauer EA et al., Eur J Cancer 2009;45:228-47); Immune-Related Response Criteria (Jedd WE et al., Clin Cancer Res 2009;15(23),7412-7420); and iRANO (Immunotherapy Response Assessment in Neuro-Oncology; Okada H et al., Lancet Oncol 2015 Nov;16(15):e534-42).
결과
약물-내성 γδ-T 세포(및/또는 약물-내성 자연 살해 세포) 및 면역 체크포인트 단백질의 억제제(들)를 추가로 포함하는 조합 요법으로서의 화학요법은 향상되거나 연장된 항-종양 반응; 의학적으로 유익한 반응; 화학요법 단독, 또는 약물-내성 γδ-T 세포(및/또는 약물-내성 자연 살해 세포)와 조합된 화학요법과 비교하여, 부가적이거나 상승적인 항종양 활성; 새로운 병변 없이, 기준선 병변의 수축; 총 종양 부담이 꾸준히 감소할 수 있는 지속적인 안정한 질병; 총 종양 부담의 증가 후 반응; 및 새로운 병변의 존재 하에서의 반응을 발생시킨다. 다른 임상 결과는 종양 크기의 증가에 의해 측정된 바와 같은 종양 침윤성 림프구의 증가; 및 장기 생존 촉진을 포함할 수 있다.
예를 들어, 테모졸로미드(TMZ)-치료된 종양은 MICA, MICB, 및 ULBP1-6과 같이, 종양 세포의 표면에 증가된 수의 스트레스 리간드를 발현시킨다. 종양 세포의 사멸은 약물-내성 γδ-T 세포 및/또는 약물-내성 자연 살해 세포에 의해 촉진되고, 이의 수용체(들), 예를 들어, NKG2D는 종양-특이적 스트레스 리간드를 인지한다. 그러나, 종양 세포는 MICA 및 MICB를 효소적으로 절단하여, 용해성 MICA 및 MICB를 방출시킬 수 있다. 혈장 내의 이펙터 세포 수용체에 의해 결합될 때, 이는 수용체 발현의 하향조절로 이어져 면역 이탈을 발생시킬 수 있다. TMZ와 같은 화학치료제는 혈장 내 용해성 리간드의 농도를 유의하게 증가시키지 않으면서, 종양 조직 상에 스트레스 리간드의 세포 표면 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. CTLA-4의 항체 억제제에 대한 반응자는 MICA와 같은 NKG2D 리간드에 대한 체액 반응을 일으키는 능력을 나타내었다. 이러한 반응은 용해성 MICA를 감소시키고, 이는 종양 표면에서 증폭된 스트레스 리간드 발현을 가능하게 하여 약물-내성 γδ-T 세포 및/또는 약물-내성 자연 살해 세포에 의한 종양 세포 사멸을 향상시킬 수 있다.
실시예 2 - 신경아교종 및 γδ T 세포에서 체크포인트 분자 발현 및 기능의 분석
GMP 제조된 γδ T 세포 및 아교모세포종 종양 세포 상에서 체크포인트 분자 발현을 평가하고, 농축된 γδ T 세포의 기능을 시험관내 평가하였다..
방법
γδ T 세포의 생체외 증식
건강한 공여자로부터의 인간 성분채집술 제품 수집물을 Hemacare(Van Nuys CA)로부터 구입하였다. 제품은 UAB Cell Therapy Laboratory GMP 시설로 옮겨졌다. 정적 배양을 위해: 모든 조작은 클래스 10K/ISO 7 분류된 기류로 둘러싸인 클래스 100 층류 후드에서 수행되었다. 제품을 HBSS(Hank의 균형 염 용액)로 희석시키고(v/v), 단핵 세포를 Ficoll(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) 상에서 밀도 구배 분리에 의해 분리하였다. 간기를 수확하고 HBSS에서 2회 세척하였다. 세포 펠렛을 2mM 졸레드론산(Novartis; Basel HV) 및 100u/mL IL2(Miltenyi Biotec Ltd; Bergisch Gladbach, Germany)가 보충된 CTS™ OpPTmizerMIZER™ T 세포 증식 무혈청 배지(ThermoFisher Scientific; Waltham, MA)에 재현탁시켰다. 세포를 표준 T150 또는 T75 플라스크에서 배양하였다. 폐쇄된 시스템 배양을 위해: 배지, 스톡 및 완충제의 제조를 포함하는 모든 작업은 ISO 7 클린 룸에서 생물안전 작업대 아래에서 GMP 등급 시약을 사용하여 수행되었다. 제품의 자동화 Ficoll 분리 및 배양은 맞춤형 세포 처리 프로그램 및 TS520 튜빙 세트를 사용하여 CLINIMACS PRODIGY®(Miltenyi Biotec Ltd; Bergisch Gladbach, Germany) 생물반응기에서 수행되었다. 이후 세포를 CLINIMACS PRODIGY®의 CentriCult-Unit에서 졸레드로네이트(Zometa; Novartis, Basel) 및 인터류킨-2(Miltenyi Biotec Ltd; Bergisch Gladbach, Germany)의 조합물(ZOL/IL-2)을 사용하여, OpTmizer 무혈청 배양액(Thermo Fisher Scientific;, Waltham, MA)에서 증식시켰다. 배양을 1-2x106개 세포/ml의 밀도로 유지하고 세포가 13일에 수확될 때까지 IL-2 100u/mL를 격일로 보충하였다. 상기 공정은 플라스크의 소규모 배양과 비교하여 증식 및 표현형의 동역학을 결정하기 위해 일정한 간격으로 지속적으로 모니터링되었다. 13일 배양 후, 증식된 γδ T 세포의 표현형을 결정하고 표준 백혈병 세포주 및 신경아교종 종양 세포에 대해 세포독성을 결정하였다.
유세포분석
다중파라미터 유세포분석을 사용하여 공여자 PBMC 및 배양된 생성물에서 표현형 & 기능적 프로파일을 결정하였다. DuraClone T 세포 서브세트(Beckman Coulter) + 항-PD-1, 항-CTLA-4 및 항-PD-L1 패널을 이용하여 체크포인트 분자 및 γδ T 세포 농축물의 발현을 유세포분석을 사용하여 모니터링하였다. 생성물의 샘플을 1일 및 13일 배양하여 분석하였다. 새롭게 분리된 PDX 유래된 아교모세포종 종양 세포를 유세포분석을 사용하여 PD-L1 발현에 대해 분석하였다. PDX 유래된 아교모세포종 세포의 단일 세포 현탁액을 FcR Block(Biolegend)으로 15분 동안 차단한 후, PD-L1 항체 및 개개 아이소형(IgG1)으로 염색하였다. 염색된 세포를 BD fortessa X-20 유세포분석기 상에서 획득하였다.
유세포분석 기반 세포독성 평가
세포 생성물의 효능은 K562 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정을 사용하여 결정되었다. 증식된 γδ T 세포를 유세포분석 기반 세포독성 검정을 사용하여 13일에 인간 백혈병 세포주(K562), 및 종양 세포(JX22T, JX12T 및 JX59T)에 대한 세포독성에 대해 평가하였다. Basic Cytotoxicity Assay Kit(https:// immunochemistry. com)는 CFSE 및 7-AAD의 2개의 형광 시약을 포함한다. 녹색 형광성 막 스테인인 CFSE는 표적 세포(K562)를 표지하는데 사용되었다. 염색되지 않은 이펙터 세포를 이펙터를 증가시키며 표적 비율로 첨가하고, 표적 세포와 4시간 동안 인큐베이션한 다음 적색 형광성 라이브/데드(live/dead) 스테인인 7-AAD를 첨가한 후 획득하고 유세포분석을 사용하여 분석한다. 세포독성은 검출된 적색 채널인 녹색 표적 세포의 백분율로서 계산된다. % 세포독성에 대한 식 = # 죽은 세포 / # 살아 있는 세포 + # 죽은 세포* 100.
결과 & 논의
2명의 건강한 공여자(공여자 1: 043692; 공여자 2: 043988)로부터 새롭게 분리된 PBMC를 시험관내에서 γδ T 세포의 증식에 사용하였다. 유세포분석에 의해 체크포인트 발현 조사시, 본 발명자들은 증식된 γδ T 세포에서 PD-1 및 CTLA-4 및 PD-L1의 상향조절에 주목하였다. 13일에, PD-1은 20% 넘게 증가하며, CTLA-4 발현은 3 내지 6%의 범위였다. 흥미롭게도, PD-L1은 또한 둘 모두의 공여자에서 상향조절되었다(>9%), [도 1-4]. MGMT가 형질도입된 γδ T 세포에서는 형질도입되지 않은 γδ T 세포와 비교하여 체크포인트 분자의 발현 수준에서의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 자극된 배양과 비교시 휴면(IL2 및 ZOL 없음) γδ T 세포에서 PD-1 및 CTLA-4의 중등도 하향조절이 또한 관찰되었다[도 5].
PDX 유래된 신경아교종 세포에서의 PD-L1 발현 또한 유세포분석에 의해 분석되었다. 아이소형 대조군과 비교하여, PD-L1 수용체 발현은 낮거나 검출할 수 없었다. PD-L1 발현의 백분율은 JX12T(0%), JX22T(1.8%) 및 JX59T(10.4%)에서 다양하였다[도 6].
다음으로, 본 발명자들은 면역 억제 수용체의 차단이 암 세포에 대한 세포독성을 증가시키기 위해 γδ T 세포 능력에 어떤 효과를 가졌는지를 조사하였다[도 7]. 신경아교종 종양 세포(JX22T, JX12T, JX59T) 및 K562(만성 골수성 백혈병으로부터 확립된 세포주)를 하나 이상의 체크포인트 항체를 20 μg/ml의 농도로 함유한 검정 혼합물에서, 제조된 γδ T 세포로 20:1 비로 챌린징하였다. 높은 수준의 세포용해 활성은 K562[PD-L1(52%), CTLA-4(5%), CTLA-4+PD-1(7%), PD-1(7)에 대해 관찰되었다. 종양 세포 용해의 완만한 증가는 PD-1(3%), CTLA-4(2) PD-1+ CTLA-4(5) 콤보 및 PD-L1(8) 차단에 대해 JX12T 종양 세포에서 관찰되었다. 그러나, 체크포인트 차단은 JX22T 및 JX59T에 대해 MGMT 변형된 γδ T 세포의 세포독성을 증가시키지 않았다.
아교모세포종 종양 세포가 유의한 수준의 PD-L1을 발현하지 않는다는 본 발명자들의 관찰은 Garg 등이 이미 발표한 보고서와 일치한다[면역-체크포인트 단일요법의 전임상 효능은 아교모세포종에서 상응하는 바이오마커-기반의 임상 예측을 되풀이하지 않는다. OncoImmunology, 2016]. Joseph 등에 의해 이어진 연구는 아교모세포종 종양의 종양 침윤성 골수 세포에서 높은 수준의 PD-L1 발현을 발견하였다[면역억제 종양-침윤성 골수 세포는 아교모세포종에서 PD-1/PD-L1 메커니즘을 통해 적응 면역 내성을 매개한다, Neuro-Oncology 9(6), 796-806, 2017]. 신경아교종 종양 미세환경에서 골수/기질 구획이 높은 수준의 PD-L1을 발현시키고 GMP 제조된 T 세포/γδ T 세포가 PD-1을 상향조절한다는 본 발명자들의 발견 때문에, 본 발명자들은 아교모세포종을 효과적으로 치료하고 높은 객관적 반응률을 달성하기 위해 PD-1, PD-L1 차단 항체 및 테모졸로미드를 사용한 전신 치료 및 MGMT 발현 γδ T 세포의 국소 주입을 포함하는 포괄적인 치료 계획을 제안한다.
본원에서 지칭되는 특허 및 과학 문헌은 당업자가 이용할 수 있는 지식을 확립한다. 본원에 인용된 모든 미국 특허 및 공개되거나 공개되지 않은 미국 특허 출원은 참조로서 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 인용된 다른 모든 출판된 참고문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌은 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명은 특히 이의 바람직한 구체예를 참조로 하여 제시되고 기재되었으나, 첨부된 청구 범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변화가 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 또한 본원에 기술된 구체예들 중 어느 것도 상호 배타적이지 않으며, 첨부된 청구 범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 다양한 방식으로 조합될 수 있음이 이해될 것이다.

Claims (21)

  1. 50 내지 95%의 γδ T-세포를 포함하는 분리된 세포독성 면역 세포의 증식된 집단을 포함하는, 신경아교종 또는 아교모세포종 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 γδ T-세포의 50% 이상이 하나 이상의 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 것이고, 상기 하나 이상의 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드가 O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 또는 P140KMGMT 이고,
    상기 조성물이 상기 γδ T-세포가 내성인 유효량의 화학치료제와 조합하여 사용되고,
    상기 조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 사용되고, 상기 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PDL1 또는 PD1 에 대한 항체이고, 및
    상기 화학치료제가 테모졸로미드인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 분리된 세포독성 면역 세포의 집단이 5 내지 25%의 NK 세포를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 내성을 부여하는 폴리펩티드가 P140KMGMT인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 트레멜리무맙, PD-L1 모노클로날 항체(항-B7-H1; MEDI4736), MK-3475, OPDIVO®/니볼루맙, CT-011, BMS-936559, MPLDL3280A, MSB0010718C, YERVOY®/이필리무맙, 및 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 분리된 세포독성 면역 세포의 집단의 투여 및 면역 체크포인트 억제제의 투여가 동시에 또는 순차적으로 발생하는, 약학적 조성물.
  6. 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제, 및
    50 내지 95%의 γδ T-세포를 포함하는 분리된 세포독성 면역 세포의 증식된 집단을 포함하는, 신경아교종 또는 아교모세포종 치료용 조성물로서,
    상기 γδ T-세포의 50% 초과가, 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 하나 이상의 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드가 O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 또는 P140KMGMT 이고,
    상기 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PDL1 또는 PD1 에 대한 항체인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 세포독성 면역 세포의 집단이 5% 내지 25%의 NK 세포를 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 세포독성 면역 세포가 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래되는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 PD-1 에 대한 항체인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 PDL1 에 대한 항체인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4 에 대한 항체인, 조성물.
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