CN113388576A

CN113388576A - 一种大鼠血管平滑肌细胞培养基及其应用

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Publication number: CN113388576A
Application number: CN202110782107.6A
Authority: CN
Inventors: 郭利伟; 李端; 王艺凯; 李世杰; 杨婷婷
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2021-09-14

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种大鼠血管平滑肌细胞培养基及其应用，其中大鼠血管平滑肌细胞培养基包括DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素‑链霉素混合液和大鼠血小板源性生长因子B。大鼠血小板源性生长因子B能够促进血管平滑肌细胞分裂增生，本发明提供的大鼠血管平滑肌细胞培养基缩短了血管平滑肌原代细胞的培养周期，提高其纯度和活性，并降低培养基的成本。

Description

一种大鼠血管平滑肌细胞培养基及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大鼠血管平滑肌细胞培养基及其应用。

背景技术

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁的主要细胞成分，在动脉粥样硬化、血管成形、术后再狭窄等病理过程的形成和发展中发挥重要作用。体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌原代细胞，是研究VSMCs增殖、迁移以及细胞表型转化的重要基础。目前大鼠胸主动脉VSMCs原代培养方法主要包括酶消化法和组织贴块法。但是存在如下缺点：

第一，现有的酶消化法成本较高，获得的细胞活性较差，易污染；

第二，采用现有组织贴块法获得VSMCs的培养周期长，其中，组织块周围一般要8天左右才有细胞爬出，2周左右细胞开始融合，并且获得细胞纯度较低（只有70%-80%），影响后续研究进展。

第三，为了缩短VSMCs原代培养周期，市场上已出现一些专门用于培养原代平滑肌细胞的原代细胞培养基，但是这些培养基中添加了组织特异性基质成分来提高培养效率，相比于普通的培养基来说，比如DMEM培养基，价格昂贵，大大提高成本。

第四，由于VSMCs具有喜密不喜疏的特点，在采用现有组织贴块法进行VSMCs原代培养的实际操作过程中，组织块很容易脱落，从而造成组织块过于稀疏，致使爬出的细胞数量太少而影响细胞的融合。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种大鼠血管平滑肌细胞培养基，该大鼠血管平滑肌细胞培养基通过组织贴块法培养原代VSMCs，能够缩短培养周期、降低成本。

本发明的目的之二在于提供一种大鼠血管平滑肌细胞培养基在培养大鼠血管平滑肌细胞中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种大鼠血管平滑肌细胞的培养方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种大鼠血管平滑肌细胞培养基，包括DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液和大鼠血小板源性生长因子B。

作为一种实施方式，所述胎牛血清的体积分数为15%～25%，所述青霉素-链霉素混合液的体积分数为0.5%～2%，所述大鼠血小板源性生长因子B的终浓度为5ug/L～20ug/L。

作为一种实施方式，所述胎牛血清的体积分数优选为20%，所述青霉素-链霉素混合液的体积分数优选为1%，所述大鼠血小板源性生长因子B的终浓度优选为10ug/L。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：上述的大鼠血管平滑肌细胞培养基在培养大鼠血管平滑肌细胞中的应用。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：一种大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，包括以下步骤：

步骤1，将细胞培养瓶平向放置，采用鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被细胞培养瓶的瓶壁；

步骤2，获取大鼠胸腹主动脉，清洗并剪成0.8 mm2～1.5mm2的组织块；

步骤3，将步骤2获得的组织块贴放于经步骤1处理的细胞培养瓶之包被有鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的瓶壁上；

步骤4，将经步骤3处理的细胞培养瓶竖向放置，加入如权利要求1至3任一项所述的大鼠血管平滑肌细胞培养基，并竖向置于培养箱中静置培养2h；

步骤5，将经步骤4处理的细胞培养瓶平向放置，使组织块浸没于大鼠血管平滑肌细胞培养基中进行培养，获得大鼠血管平滑肌细胞。

作为一种实施方式，所述步骤1中，采用浓度为0.36 g/L的乙酸将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型稀释至浓度为0.012 mg/mL～0.015 g/L后进行包被处理。

作为一种实施方式，所述步骤2包括如下步骤：

步骤2.1，选择四周龄、重量150g的大鼠，处死后置于75%乙醇中浸泡消毒3 min；

步骤2.2，分离取出大鼠胸、腹主动脉，放入预冷的含双抗的PBS缓冲液中，反复浸洗2～3遍，并去除血管外膜的脂肪和纤维组织；其中，所述双抗为青霉素和链霉素的混合液；

步骤2.3，纵向剪开血管腔，去除血管内皮细胞，采用预冷的含双抗PBS缓冲液洗至少1遍；

步骤2.4，将经步骤2.3处理的血管段置于0.25%胰蛋白酶溶液中预消化10min，然后置入预冷的如权利要求1至3任一项所述的大鼠血管平滑肌细胞培养基中，剪成组织块。

作为一种实施方式，所述步骤3中，任意相邻两个所述组织块之间的距离为3mm～5mm。

作为一种实施方式，所述步骤4中，将所述细胞培养瓶竖向静置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中。

作为一种实施方式，所述步骤5中，培养四天后，第一次更换所述大鼠血管平滑肌细胞培养基，以后每隔五天更换一次所述大鼠血管平滑肌细胞培养基。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：大鼠血小板源性生长因子B是一种重要的促有丝分裂因子，能够刺激胶原酶的活化和胶原的合成，调节细胞外基质的更新，并促进DNA合成和细胞裂解，最终促进血管平滑肌细胞分裂增生。本发明提供的大鼠血管平滑肌细胞培养基，缩短了血管平滑肌原代细胞的培养周期，提高其纯度和活性，并降低培养基的成本。

附图说明

图1为本发明实施例三提供的大鼠腹胸主动脉VSMCs原代培养的结果图；

图2为本发明实施例四提供的大鼠腹胸主动脉VSMCs传代培养的结果图；

图3为本发明实施例五提供的大鼠腹胸主动脉VSMCs鉴定的结果图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

本发明实施例提供一种大鼠血管平滑肌细胞培养基，包括DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液和大鼠血小板源性生长因子B（PDGF-B）。其中，胎牛血清的体积分数为15%～25%，青霉素-链霉素混合液的体积分数为0.5%～2%，PDGF-B的终浓度为5ug/L～20ug/L。PDGF-B是一种重要的促有丝分裂因子，能够刺激胶原酶的活化和胶原的合成，调节细胞外基质的更新，并促进DNA合成和细胞裂解，最终促进血管平滑肌细胞分裂增生，缩短了血管平滑肌原代细胞的培养周期，提高其纯度和活性，并降低了培养基的成本。

其中，DMEM高糖培养基包括无水氯化钙116.6mg/L、L-亮氨酸59.05mg/L、亚油酸0.042mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L、硫辛酸0.105mg/L、九水硝酸铁0.05mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红8.1mg/L、七水硫酸亚铁0.417mg/L、L-苯丙氨酸35.48mg/L、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L、氯化钾311.8mg/L、L-丝氨酸26.25mg/L、丙酮酸钠55mg/L、氯化镁28.64mg/L、L-苏氨酸53.45mg/L、维生素H 0.0035mg/L、无水硫酸镁48.84mg/L、L-丙氨酸4.45mg/L、D-泛酸钙2.24mg/L、氯化钠6999.5mg/L、L-天门冬酰胺7.5mg/L、氯化胆碱8.98mg/L、无水磷酸二氢钠54.35mg/L、L-天门冬氨酸6.65mg/L、叶酸2.65mg/L、磷酸氢二钠71.02mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L、i-肌醇12.6mg/L、七水硫酸锌0.432mg/L、L-谷氨酸7.35mg/L、烟酰胺2.02mg/L、L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L、L-脯氨酸17.25mg/L、盐酸吡哆醛2mg/L、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L、L-色氨酸9.02mg/L、盐酸吡哆醇0.031mg/L、L-谷氨酰胺365mg/L、L-酪氨酸38.4mg/L、核黄素0.219mg/L、甘氨酸18.75mg/L、L-缬氨酸52.85mg/L、盐酸硫胺2.17mg/L、L-组氨酸盐酸盐31.48mg/L、D-葡萄糖3151mg/L、胸苷0.365mg/L、L-异亮氨酸54.47mg/L、次黄嘌呤2mg/L、维生素B₁₂ 0.68mg/L 。

实施例一：

鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被细胞培养瓶。

用预冷的无菌0.36g/L（0.006mol/L）乙酸将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型稀释到 0.012mg/mL，吸取950 uL加入平放的T25细胞培养瓶中，确保鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液铺满T25细胞培养瓶的瓶壁，将T25细胞培养瓶以开盖的状态置于超净台上过夜，晾干鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液。包被好的T25细胞培养瓶 4℃保存备用。T25细胞培养瓶平放是指T25细胞培养瓶的瓶口朝向侧面。

实施例二：

制备大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）培养基。

在DMEM高糖培养基中加入20%（体积比）胎牛血清， 1%（体积比）青霉素-链霉素混合液，按照10 μg/L浓度加入大鼠血小板源性生长因子B（PDGF-B）制成大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）培养基。

实施例三：

大鼠腹胸主动脉VSMCs的原代培养。

1）选择四周龄大小，重量150g左右的雄性 SD大鼠，颈椎脱臼法处死大鼠，置于75%乙醇中浸泡消毒3 min，仰卧固定于超净工作台。

2）用组织剪剪开胸腹部皮肤及肌肉层，换用眼科剪靠近胸部左侧剪开胸骨和膈肌，充分暴露胸腹腔，紧靠脊柱前方用眼科镊及眼科剪小心钝性分离取出胸、腹主动脉，并立即放入预冷的含1%（体积比）双抗的1×PBS缓冲液中。用含双抗的1×PBS缓冲液反复浸洗血管2～3遍，浸洗时用弯头镊子顺血管轻轻滑动挤压血管，以完全洗去血管内外的血污和破损细胞。取两把眼科镊小心夹住血管两侧，尽量剥除血管外膜的脂肪和纤维组织。其中，双抗为青霉素和链霉素的混合液；1×PBS缓冲液的配制方法为NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g和KH₂PO₄ 0.24g混合后，加蒸馏水至1000 mL，混匀。

3）用眼科剪纵向剪开血管腔，眼科弯镊小心擦拭血管内膜层去除血管内皮细胞，并用预冷的含1%双抗1×PBS缓冲液清洗至少1遍。

4）将血管段放入另一个培养皿中，加入2mL～3mL 0.25%胰蛋白酶溶液预消化10min，然后转入预冷含1%（体积比）双抗的DMEM高糖培养基中，用眼科剪将血管段剪成1mm²大小的组织块，并且组织块边缘要保持光滑、整齐，将组织块均匀贴放于鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被好的T25细胞培养瓶的瓶壁上，相邻组织块之间间隔约3mm～5mm。其中，双抗为青霉素和链霉素的混合液。

5）小心竖起细胞培养瓶，向T25细胞培养瓶内加入5mL大鼠VSMCs培养基，竖向放于37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中，绝对静置培养2.0 h，待组织块表面液体减少并自然贴附于瓶壁后，轻轻将T25细胞培养瓶平放使组织块逐渐浸没于大鼠VSMCs培养基中，继续绝对静置培养，避免振动和移动。其中，培养4天时首次更换大鼠VSMCs培养基，之后每隔3天更换大鼠VSMCs培养基。T25细胞培养瓶竖放是指T25细胞培养瓶的瓶口朝上。

图1示出大鼠腹胸主动脉VSMCs原代培养的结果图，其中，图1A为培养3天时的结果图，图1B为培养6天时的结果图，图1C为培养9天时的结果图。从图中可以看出，培养第3天可见血管平滑肌细胞从组织块边缘爬出，细胞形态不规则；培养第6天组织块周围的血管平滑肌细胞出现融合；培养第9天血管平滑肌细胞大量生长，细胞形态大多呈梭形，能够进行消化传代。

实施例四：

大鼠腹胸主动脉VSMCs传代培养。

当细胞达到80～90%融合时可以进行传代培养。用0.25%胰蛋白酶消化，37℃培养箱中1min～2 min直至细胞变圆，将胰蛋白酶消化液从T25细胞培养瓶中吸出至含有2 mL胎牛血清的15 mL离心管中，1000 r/min离心5 min，用大鼠VSMCs培养基重悬细胞，按照1：2或者1：3接种于鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被好的T25细胞培养瓶中进行传代培养，传代培养所用的培养基为本发明提供的大鼠VSMCs培养基，传代培养的条件与实施例三原代培养的条件相同。其中，1：2表示将1个细胞培养瓶里面的血管平滑肌细胞消化处理后，平均给分配到2个同样的细胞培养瓶中进行传代培养；1：3表示将1个细胞培养瓶里面的血管平滑肌细胞消化处理后，平均给分配到3个同样的细胞培养瓶中进行传代培养。

图2 示出大鼠腹胸主动脉VSMCs传代培养的结果图。其中，图2A为传代培养第1天的结果图，图2B为传代培养第3天的结果图。从图中可以看出，采用本发明提供的大鼠VSMCs培养基对大鼠腹胸主动脉VSMCs原代培养后进行传代培养，在传代培养第1天，细胞贴壁就表现良好，并在传代培养第3天出现典型的“峰谷”现象，所获得的细胞均呈梭形条状，细胞形态一致。

实施例五：

大鼠腹胸主动脉VSMCs的鉴定。

1）将第2代大鼠血管平滑肌细胞接种于铺有细胞爬片的24孔细胞培养板中，每孔细胞数调整到1×10⁵个，37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养1～2 天。

2）待细胞长满后，从培养箱中取出细胞，用1×PBS缓冲液洗3遍，用4%多聚甲醛覆盖爬片，室温固定20 min。

3）固定完成后，在摇床上用1×PBS缓冲液清洗3遍，每遍5 min，然后用0.25%TritonX 100 通透细胞膜 30 min。

4）在摇床上用1×PBS缓冲液清洗3遍，每遍5 min，加入10%山羊血清室温封闭1 h，之后血清不用洗掉，加入1:200稀释的抗SMA抗体，4 ℃过夜。

5）在摇床上用1×PBS缓冲液清洗3遍，每遍5 min，之后加入结合有TRITC的山羊抗兔二抗，室温避光孵育1 h后，用同样的方法1×PBS缓冲液清洗3遍，加入DAPI染核，利用1×PBS缓冲液清洗1遍。

6）用显微镊将爬片从24孔板取出，将细胞面放于载玻片上，用抗淬灭剂封片。在荧光显微镜下拍摄同一界面的红色荧光图和蓝色核染图，经Image pro plus 6.0软件将同一部位的两张照片叠加，判断VSMCs纯度。

图3为大鼠腹胸主动脉VSMCs鉴定的结果图。其中，图3A为免疫荧光显示SMA在细胞中的分布结果图；图3B为DAPI核染的结果图；图3C为图3A和图3B的叠加图片。从图中可以看出，采用本发明提供的大鼠VSMCs培养基对大鼠腹胸主动脉VSMCs原代培养后进行传代培养，获得的VSMCs纯度达到了95%以上，基本是核与SMA荧光一一对应。

胶原蛋白Ⅰ型能自我组装成高度有序的结构-胶原纤维，本发明提供的大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，通过采用鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被细胞培养瓶，显著提高了组织块的贴壁能力，有利于合理的控制组织块密度，提高了细胞培养的效率。

PDGF-B是一种重要的促有丝分裂因子，能够刺激胶原酶的活化和胶原的合成，调节细胞外基质的更新，并促进DNA合成和细胞裂解，最终促进血管平滑肌细胞分裂增生。本发明提供的大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，通过采用包含有PDGF-B的大鼠血管平滑肌细胞培养基，培养第3天组织块周围就有细胞爬出，培养第6天就出现细胞融合，缩短了血管平滑肌原代细胞的培养周期，并降低了培养基的成本，并且，最终获得的VSMCs纯度达到了95%以上，有效提高了VSMCs的纯度和活性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种大鼠血管平滑肌细胞培养基，其特征在于，包括DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液和大鼠血小板源性生长因子B。

2.如权利要求1所述的大鼠血管平滑肌细胞培养基，其特征在于，所述胎牛血清的体积分数为15%～25%，所述青霉素-链霉素混合液的体积分数为0.5%～2%，所述大鼠血小板源性生长因子B的终浓度为5ug/L～20ug/L。

3.如权利要求2所述的大鼠血管平滑肌细胞培养基，其特征在于，所述胎牛血清的体积分数优选为20%，所述青霉素-链霉素混合液的体积分数优选为1%，所述大鼠血小板源性生长因子B的终浓度优选为10ug/L。

4.权利要求1至3任一项所述的大鼠血管平滑肌细胞培养基在培养大鼠血管平滑肌细胞中的应用。

5.一种大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2，获取大鼠胸腹主动脉，清洗并剪成0.8 mm²～1.5mm²的组织块；

6.如权利要求5所述的大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤1中，采用浓度为0.36 g/L的乙酸将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型稀释至浓度为0.012 mg/mL～0.015 g/L后进行包被处理。

7.如权利要求5所述的大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤2包括如下步骤：

8.如权利要求5所述的大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤3中，任意相邻两个所述组织块之间的距离为3mm～5mm。

9.如权利要求5所述的大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤4中，将所述细胞培养瓶竖向静置于37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中。

10.如权利要求5所述的大鼠血管平滑肌细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤5中，培养四天后，第一次更换所述大鼠血管平滑肌细胞培养基，以后每隔五天更换一次所述大鼠血管平滑肌细胞培养基。