TWI708846B - 培養基組成物的製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明係提供預先去除在具有陰離子性官能基之高分子化合物中所包含之2價金屬陽離子，調製該高分子化合物的乾燥粉末，將該乾燥粉末與培養基進行混合之培養基組成物的製造方法等。又，本發明係提供具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法，其特徵為：將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水中懸浮物、與將2價金屬陽離子交換成1價金屬陽離子之陽離子交換體進行混合，而獲得經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物。

Description

培養基組成物的製造方法

本發明係關於使用提高對水溶解性之具有陰離子性官能基之高分子化合物，用於將動植物細胞及/或組織，特別是以三次元或浮游狀態進行培養之培養基組成物的製造方法。

近年，用以使在動物、或植物體內扮演不同角色之各種各樣的器官、組織、及細胞在活體外增殖或維持之技術正逐漸發展中。將此等器官、組織在活體外予以增殖或維持，係分別稱為器官培養、組織培養，將從器官、組織分離出之細胞在活體外予以增殖、分化或維持係稱為細胞培養。細胞培養係將分離出之細胞在培養基中在活體外予以增殖、分化或維持之技術，且已成為用以詳細解析活體內的各種器官、組織、細胞的機能及構造所不可或缺者。又，藉由該技術所培養之細胞及/或組織，已利用於化學物質、醫藥品等的藥效及毒性評估、或酵素、細胞增殖因子、抗體等有用物質之大量生產、對因疾病或缺陷所缺失之器官、組織、細胞進行修補之再生醫療、植物之 品種改良、基因重組作物之作成等各種各樣的領域中。

來自動物的細胞，從其性狀可大致二分為浮游細胞及黏著細胞。浮游細胞係在生育/增殖時不需要支架之細胞，黏著細胞係在生育/增殖時需要支架之細胞，而構成生物體之大部分細胞為後者的黏著細胞。黏著細胞的培養方法，係已知有單層培養、分散培養、包埋培養、微載體培養、及球體培養等。

單層培養係以由玻璃或經施行各種表面處理之合成高分子材料所構成之培養容器、或稱為餵養細胞之輔助細胞作為支架而將目標細胞培養成單層狀之方法，一般而言最普及。舉例而言，已開發出使用對聚苯乙烯實施各種表面處理(電漿處理、電暈處理等)者、經塗覆膠原蛋白、纖連蛋白(fibronectin)、聚離胺酸等細胞黏著因子者或預先接種餵養細胞者等之各種形狀或性狀的培養容器之培養方法。然而，單層培養係由於其二次元的培養環境與在活體內的環境完全不同，因而無法長期維持細胞在活體內所具有之特異性機能，無法再構築與活體內同樣的組織，且由於每一定面積的細胞數有所限制，故不適於細胞之大量培養等而會造成問題(專利文獻1)。又，在餵養細胞上培養目標細胞之方法，會有餵養細胞與目標細胞間之分離而造成問題之情況(非專利文獻1)。

分散培養係將細胞接種於培養基中後，在經實施阻礙細胞附著之表面處理之培養容器中，藉由持續攪拌該培養液而阻礙細胞對培養容器之黏著，以浮游狀態 培養黏著細胞之方法。然而，利用該方法所培養之黏著細胞由於無法對支架進行黏著，因而無法應用於為了細胞增殖而必須對支架進行黏著之細胞。又，由於利用剪切力進行持續破碎而無法發揮本來的細胞機能，因而會有無法大量地培養具有機能的細胞之情況(非專利文獻2)。

包埋培養係在瓊脂、甲基纖維素、膠原蛋白凝膠、明膠、纖維蛋白、瓊脂糖、海藻酸鹽等固形或半固體的凝膠基材中埋入細胞，使其固定而進行培養之方法。該方法能夠將細胞以近似活體內之形式進行三次元培養，且由於凝膠基材本身亦有促進細胞的增殖或分化之情況，因而相較於單層培養或分散培養而言，能夠在保持細胞的機能之情形下將細胞高密度地進行培養(專利文獻2、3)。再者，亦已開發出以在此等凝膠基材中埋入細胞之狀態作成大小為100至300μm之微膠囊，並一邊使該微膠囊分散、一邊在水溶液培養基中培養細胞之方法(非專利文獻3)。然而，此等方法具有在凝膠基材不穿透可見光時會無法進行培養細胞的繼時性觀察，因包含凝膠基材的培養基或微膠囊之黏度高而必須進行用以從該培養基中回收細胞之酵素處理(例如，在膠原蛋白凝膠之情況係膠原蛋白酶處理)等繁雜且對細胞造成障礙之操作，長期培養時所需的培養基交換係較困難等問題。近年，雖然已開發出藉由熱或剪切力等處理而能夠從凝膠基材中進行細胞回收之技術，但熱或剪切力等會對細胞機能造成不良影響，而且關於該凝膠基材對生物體的安全性仍不明確(專利文獻4、5， 非專利文獻4、5、6、7)。又，雖然在食品領域中已開發出用以使切成小塊的果實或蔬菜等粒狀食品均勻地分散、浮游並防止其沉澱或上浮的溶膠(sol)狀食品，但該溶膠狀食品並未考慮將經分散之粒狀食品進行回收，亦未探討是否能夠將細胞或組織以浮游狀態進行培養(專利文獻6)。

微載體培養係在稍微比水重的微粒子(以下，亦稱為微載體)之表面上使細胞增殖成單層，將該微粒子在燒瓶等培養容器內進行攪拌，施行呈浮游狀態之培養。通常，該方法中所使用之微載體係直徑100至300μm，表面積3000至6000cm²/g，比重1.03至1.05之球狀粒子，且由葡聚糖、明膠、海藻酸或聚苯乙烯等素材所構成。在微載體之表面，為了使細胞易於附著，亦可賦予膠原蛋白、明膠或二甲基胺基乙基等荷電基。該方法係由於能夠使培養面積極度增大，因而可應用於細胞之大量培養(專利文獻7、8)。然而，難以使目標細胞大略均勻地附著在所有的微載體，又，因攪拌中的剪切力而使細胞從微載體脫離並使細胞受到障礙等亦會造成問題(非專利文獻8)。

球體培養係使目標細胞形成由數十至數百個所構成之凝集塊(以下，亦稱為球體)後，將該凝集塊在培養基中靜置或震盪而培養之方法。已知球體係細胞密度高，可再構築近似活體內環境之細胞-細胞間相互作用及細胞構造體，相較於單層培養、分散培養法而言，能夠在保持長期維持細胞機能之情形下進行培養(非專利文獻9、10)。然而，球體培養係由於在球體的尺寸過大之情況下， 球體內部的營養分之供給及老廢物之排出會變得困難，因而無法形成較大的球體。又，所形成之球體由於必須在培養容器之底面以分散狀態進行培養，因而難以增加每一定體積的球體數，不適於大量培養。再者，球體之作成方法，係已知有懸滴培養、在細胞非黏著表面之培養、在微孔板內之培養、旋轉培養、利用細胞的支架之培養、由離心力或超音波、電場/磁場所致之凝集等，但此等方法係操作繁雜，難以回收球體，也難以控制尺寸及大量生產，對細胞之影響不明，需要特殊的專用容器或裝置等而會造成問題(專利文獻9)。

另一方面，對於植物，亦可將細胞、經除去細胞壁而得之原生質體、或植物的葉、莖、根、生長點、種子、胚、花粉等器官、組織、癒傷組織(callus)以無菌的狀態進行培養增加。使用此種植物的組織或細胞之培養技術，亦可進行植物的品種改良或有用物質的生產。用以使植物的細胞或組織在短期間大量地增殖之手法，係已知有將植物細胞或組織在液體培養基進行懸浮培養之方法(非專利文獻11)。為了達成該等良好的增殖，是以充分的氧供給及均勻的混合狀態之維持、進而以防止細胞的破損等係屬重要。對培養液之氧供給及細胞或組織之懸浮，係有組合通氣及機械性攪拌而施行之情況、及僅藉由通氣而施行之情況，但前者會有以由攪拌所致之細胞或組織的破損為原因而導致增殖不良之情況，另一方面，後者雖然細胞或組織的剪切較少，但會有在高密度培養中難以維持均勻 的混合狀態之情況，因而存在有細胞或組織發生沉降而使增殖效率低下等問題。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2001-128660號公報

[專利文獻2]日本專利特開昭62-171680號公報

[專利文獻3]日本專利特開昭63-209581號公報

[專利文獻4]日本專利特開2009-29967號公報

[專利文獻5]日本專利特開2005-60570號公報

[專利文獻6]日本專利特開平8-23893號公報

[專利文獻7]日本專利特開2004-236553號公報

[專利文獻8]國際專利公開第2010/059775号

[專利文獻9]日本專利特開2012-65555號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Klimanskaya等人，Lancet 2005，365：1636-1641

[非專利文獻2] King等人，Curr Opin Chem Biol. 2007，11：394-398

[非專利文獻3] Murua等人，J. of Controlled Release 2008，132：76-83

[非專利文獻4] Mendes，Chemical Society Reviews 2008，37：2512-2529

[非專利文獻5] Moon等人，Chemical Society Reviews 2012，41：4860-4883

[非專利文獻6] Pek等人，Nature Nanotechnol. 2008，3：671-675

[非專利文獻7] Liu等人，Soft Matter 2011，7：5430-5436

[非專利文獻8] Leung等人，Tissue Engineering 2011，17：165-172

[非專利文獻9] Stahl等人，Biochem. Biophys. Res. Co mm. 2004，322：684-692

[非專利文獻10] Lin等人，Biotechnol J. 2008，3：1172-1184

[非專利文獻11] Weathers等人，Appl Microbiol Biotechnol 2010，85：1339-1351

為了解決上述問題，本發明者等人深入探討的結果，發現藉由將包含脫醯化結冷膠(gellan gum)等具有陰離子性官能基之高分子化合物的構造體混合在液體培養基中，便能夠在不會實質上提高該液體培養基的黏度之情形下，以使動植物細胞及/或組織靜置之狀態進行浮游培養，藉由使用此培養基組成物進行培養，將使細胞的增殖活性亢進。

在開發此培養基組成物之過程中，發現脫醯化結冷膠等具有陰離子性官能基之高分子化合物的對水 溶解性較低，為了獲得所期望的培養基組成物，必須以高溫條件等將具有陰離子性官能基之高分子化合物溶解於水性溶媒等新的問題點。

於是，本發明之目的係提供提高上述具有陰離子性官能基之高分子化合物的對水溶解性，使前述化合物與培養基之混合及溶解更簡便之培養基組成物的製造方法等。

本發明者等人為了解決上述課題而進行深入探討，結果發現在具有陰離子性官能基之高分子化合物中微量混入的2價金屬陽離子係使對水溶解性低下的原因。此外，發現若藉由利用螯合劑或離子交換樹脂進行處理而預先去除所混入之2價金屬陽離子，則使該高分子化合物乾燥而成之粉末亦溶解在室溫的水或冷水中，藉由將如此獲得之水溶液與液體培養基進行混合，便可在不會實質上提高該液體培養基的黏度之情形下使細胞及/或組織以浮游狀態均勻地分散，遂完成本發明。

即，本發明係如下述：

(1)一種培養基組成物的製造方法，係能夠使細胞或組織浮游而進行培養之培養基組成物的製造方法，其包含：將實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物與培養基進行混合。

(2)一種培養基組成物的製造方法，係能夠使細胞或組織 浮游而進行培養之培養基組成物的製造方法，其包含：對具有陰離子性官能基之高分子化合物施行2價金屬陽離子除去處理，而獲得經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物；以及將該高分子化合物與培養基進行混合。

(3)如(2)所述之培養基組成物的製造方法，其中，2價金屬陽離子除去處理係藉由螯合劑或陽離子交換體而施行。

(4)如(2)所述之培養基組成物的製造方法，其中，2價金屬陽離子除去處理係藉由將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水中懸浮物、與陽離子交換體進行混合而施行。

(5)如(4)所述之培養基組成物的製造方法，其中，在10至70℃，將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水中懸浮物、與陽離子交換體進行混合。

(6)如(1)至(5)中任一項所述之培養基組成物的製造方法，其中，前述2價金屬陽離子係從由鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子所組成之群組中選出之至少1種。

(7)如(1)至(6)中任一項所述之培養基組成物的製造方法，其中，高分子化合物為脫醯化結冷膠或其鹽。

(8)如(1)至(7)中任一項所述之培養基組成物的製造方法，其中，將前述高分子化合物的水溶液與培養基的水溶液進行混合。

(9)如(8)所述之培養基組成物的製造方法，其中，在進行混合前，將該各水溶液進行過濾滅菌。

(10)如(8)所述之培養基組成物的製造方法，其中，將前述 高分子化合物的水溶液進行高壓釜滅菌。

(11)如(8)所述之培養基組成物的製造方法，其中，將前述高分子化合物的水溶液與培養基的水溶液一邊攪拌、一邊混合。

(12)如(8)所述之培養基組成物的製造方法，其中，利用均質攪拌器一邊攪拌、一邊混合。

(13)如(3)所述之培養基組成物的製造方法，其中，螯合劑為乙二胺四醋酸。

(14)如(3)所述之培養基組成物的製造方法，其中，陽離子交換體為鈉型。

(15)一種培養基添加劑，係用於調製能夠使細胞或組織浮游而進行培養之培養組成物者，其係實質上不含有2價金屬陽離子，且含有呈已滅菌狀態的具有陰離子性官能基之高分子化合物。

(16)如(15)所述之培養基添加劑，其為水溶液。

(17)如(15)所述之培養基添加劑，其中，前述具有陰離子性官能基之高分子化合物為脫醯化結冷膠或其鹽。

(18)一種培養基添加劑的製造方法，係用於調製能夠使細胞或組織浮游而進行培養之培養基組成物的培養基添加劑的製造方法，其包含：對具有陰離子性官能基之高分子化合物施行2價金屬陽離子除去處理，而獲得經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物；以及利用噴霧乾燥或凍結乾燥使該高分子化合物乾燥。

(19)如(18)所述之培養基添加劑的製造方法，其中，前述 具有陰離子性官能基之高分子化合物為脫醯化結冷膠或其鹽。

(20)一種具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法，其特徵為：將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水中懸浮物、與將2價金屬陽離子交換成1價金屬陽離子之陽離子交換體進行混合，而獲得經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物。

(21)如(20)所述之具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法，其中，前述陽離子交換體為鈉型。

(22)如(20)或(21)所述之具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法，其中，在10至70℃，將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水中懸浮物、與前述陽離子交換體進行混合。

(23)如(20)至(22)中任一項所述之具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法，其中，前述2價金屬陽離子係從鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子所組成之群組中選出之至少1種。

(24)如(20)至(23)中任一項所述之具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法，其中，高分子化合物為脫醯化結冷膠或其鹽。

(25)如(20)至(24)中任一項所述之具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法，其中，水中懸浮物中的具有陰離子性官能基之高分子化合物的含量為0.5至2.0%(w/v)。

本發明係提供使藉由去除2價金屬陽離子而提升對水溶解性的具有陰離子性官能基之高分子化合物乾燥而獲得之粉末與培養基進行混合之培養基組成物的製造方法等。藉由使用本發明之製造方法，可不需要高壓釜處理等加熱處理，而簡便地在不會實質上提高液體培養基的黏度之情形下使細胞及/或組織以浮游狀態均勻地分散，並可調製培養基組成物。

第1圖係顯示利用培養基組成物培養HepG2細胞的球體，結果球體係均勻地分散，且能夠以浮游狀態進行培養之圖。

第2圖係顯示利用培養基組成物培養HeLa細胞的球體，結果球體係均勻地分散，且能夠以浮游狀態進行培養之圖。

第3圖係顯示利用培養基組成物培養HeLa細胞的球體，並對本球體進行顯微鏡觀察，結果相較於既存的培養基而言，球體彼此間的匯集受到抑制之圖。

第4圖係顯示利用培養基組成物培養附著有HepG2細胞之微載體，結果HepG2細胞能夠在微載體上進行增殖之圖。

第5圖係顯示在培養基組成物中添加HeLa細胞的球體時，球體係均勻地分散，且呈浮游狀態之圖。

第6圖係顯示藉由培養基組成物形成HeLa細胞的球 體之圖。

第7圖係顯示作為構造體之一態樣的薄膜之圖。脫醯化結冷膠對培養基組成物的濃度為0.02%(重量/容量)。

第8圖係顯示藉由培養基組成物形成HepG2細胞的球體之圖。

第9圖係顯示將附著有HepG2細胞之塗覆層黏蛋白(laminin)的GEM利用培養基組成物進行培養時之浮游狀態之圖。

第10圖係顯示將包埋有HepG2細胞之海藻酸珠粒利用培養基組成物進行培養時之浮游狀態之圖。

第11圖係顯示將包埋有HepG2細胞之膠原蛋白凝膠膠囊利用培養基組成物進行培養時之浮游狀態之圖。

第12圖係顯示利用培養基組成物將來自水稻的癒傷組織進行培養時之浮游狀態之圖。

以下，進一步詳細說明本發明。

針對本說明書中所使用之用語，係如以下所定義。

本發明中之細胞係指構成動物或植物之最基本的單位，且在細胞膜的內部保有細胞質及各種細胞小器官作為其要素者。此時，內含DNA的核可包含在細胞內部，亦可不包含在細胞內部。舉例而言，本發明中之來自動物的細胞中，可包含：精子或卵子等生殖細胞、構成生物體之體細胞、幹細胞、前驅細胞、從生物體分離出之癌細胞、從生物體分離出並獲得不死化能力而在體外安定維 持之細胞(細胞株)、從生物體分離出並人為地達成基因突變之細胞、從生物體分離出並人為地將核進行交換而成之細胞等。就構成生物體之體細胞之例而言，雖然並不受以下所限定，但可包含：纖維母細胞、骨髓細胞、B淋巴球、T淋巴球、嗜中性球、紅血球、血小板、巨噬細胞、單核球、骨細胞、骨髓細胞、周細胞、樹突狀細胞、角質細胞、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、肝實質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神經系統細胞、神經膠細胞、神經元、寡樹突細胞、小神經膠質細胞、星狀膠細胞、心臟細胞、食道細胞、肌肉細胞(例如，平滑肌細胞或骨骼肌細胞)、胰臟β細胞、黑色素細胞、造血前驅細胞、及單核細胞等。該體細胞可包含例如從皮膚、腎臟、脾臟、腎上腺、肝臟、肺、卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臟、膀胱、前列腺、睪丸、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等的任意組織所採取之細胞。幹細胞係指兼具複製自體本身之能力及分化成其他複數種系統的細胞之能力之細胞，就其例而言，雖然並不受以下所限定，但可包含：胚胎幹細胞(ES細胞)、胚胎腫瘤細胞、胚胎生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系統幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、肌幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等。前驅細胞係指處於從前述幹細胞分化成特定的體細胞或生殖細胞之途中的階段之細胞。癌細胞係指從體細胞衍生而 獲得無限的增殖能力之細胞。細胞株係指藉由在活體外的人為操作而獲得無限的增殖能力之細胞，就其例而言，雖然並不受以下所限定，但可包含：CHO(中國倉鼠卵巢細胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人類胎兒腎細胞)、HeLa(人類子宮癌細胞株)、HepG2(人類肝癌細胞株)、UT7/TPO(人類白血病細胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(註冊商標)、Vero等。

本發明中之來自植物的細胞中，可包含從植物體的各組織分離出之細胞，亦可包含從該細胞以人為方式去除細胞壁而成之原生質體。

本發明中之組織係指數種具有不同性質或機能之細胞以一定的樣式集合而成之構造單位，動物的組織之例可包含上皮組織、結締組織、肌組織、神經組織等。植物的組織之例可包含分裂組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔軟組織(parenchyma)、脫分化(dedifferentiation)而成之細胞塊(癒傷組織)等。

培養細胞及/或組織時，所培養之細胞及/或組織可從前述所記載之細胞及/或組織中任意地選擇而進行培養。細胞及/或組織可由動物或植物體直接採取。細胞及/或組織係藉由實施特定的處理而從動物或植物體衍生、成長，或亦可使其轉形後進行採取。此時，該處理可在活體內，亦可在活體外。作為動物，可列舉例如魚類、兩生類、爬蟲類、鳥類、泛甲殼類、六足類、哺乳類等。 作為哺乳動物之例，雖然並無限定，但可列舉大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、松鼠、倉鼠、田鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨、犬、貓、山羊、牛、馬、綿羊、豬、象、普通狨(common marmoset)、松鼠猴、獼猴、黑猩猩及人類。作為植物，只要是所採取之細胞及/或組織能夠進行液體培養者，並無特別限定。可列舉例如生產生藥類(例如，皂素、生物鹼類、小蘗鹼、莨菪苷、植物固醇等)之植物(例如，藥用人參、長春花、莨菪、黃連、顛茄等)、或生產成為化妝品/食品原料之色素或多醣體(例如，花青素、紅花色素、茜草色素、番紅花色素、黃酮類等)之植物(例如，藍莓、紅花、染色茜草(Rubia tinctorum)、番紅花等)、或生產醫藥品原體之植物等，但不限定於該等。

本發明中之細胞及/或組織之浮游，係指細胞及/或組織呈現未對培養容器進行黏著之狀態(非黏著)。再者，本發明中，在使細胞及/或組織進行增殖、分化或維持時，在不伴隨著對液體培養基組成物之來自外部的壓力或振動、或在該組成物中的震盪、旋轉操作等之情形下，細胞及/或組織亦在該液體培養基組成物中均勻地分散且呈浮游狀態之狀態係稱為「浮游靜置」，並將以該狀態培養細胞及/或組織稱為「浮游靜置培養」。又，「浮游靜置」中，能夠浮游之時間，係可包含至少5至60分鐘、1小時至24小時、1日至21日，但只要能保持浮游狀態，即不限定於此等時間。

藉由本發明之製造方法所製造之培養基組 成物，係含有能夠使細胞或組織浮游而進行培養(較佳係能夠進行浮游靜置培養)之構造體及培養基之組成物。

該培養基組成物較佳係在培養時之培養基組成物的交換處理及培養終了後能夠進行細胞或組織的回收之組成物，更佳係在細胞或組織的回收時，不需要溫度變化、化學處理、酵素處理、剪切力之任一者之組成物。

「能夠使細胞或組織浮游而進行培養之構造體」係指由特定化合物所形成，且顯示出使細胞及/或組織均勻地浮游之效果者。更詳細而言，可包含使高分子化合物經由離子所集合而成者，或高分子化合物形成三次元網絡者等。又，多醣類經由金屬陽離子而形成微膠體係屬公知(例如，日本專利特開2004-129596號公報)，本發明之構造體中，亦可包含該微膠體作為一態樣。

又，作為高分子化合物經由離子所集合而成者，其一態樣可列舉如薄膜狀的構造體。

關於該構造體的大小，在利用過濾器進行過濾之情況下，以通過孔徑為0.2μm至200μm的過濾器者係較佳。作為該孔徑的下限，更佳係超過1μm，若考慮到使細胞或組織安定地浮游，再佳係超過5μm。作為該孔徑的上限，更佳係100μm以下，若考慮到細胞或組織的大小，再佳係70μm以下。

「特定化合物」係指具有當與液體培養基進行混合時，會形成不定形的構造體，且該構造體在該液體中均勻地分散，不會實質上提高該液體的黏度，而實質上保持細胞及/ 或組織，並防止其沉降之效果者。「不會實質上提高液體的黏度」係意指液體的黏度不超過8mPa．s。此時的該液體的黏度(即，藉由本發明之製造方法所製造之培養基組成物的黏度)為8mPa．s以下，較佳為4mPa．s以下，更佳為2mPa．s以下。再者，只要是顯示出會在液體培養基中形成該構造體，且在不會實質上提高該液體的黏度之情形下使細胞及/或組織均勻地浮游(較佳係使其浮游靜置)之效果者，關於特定化合物的化學構造、分子量、物性等並無任何限制。

包含構造體之液體的黏度係可藉由例如後述之實施例所記載之方法進行測定。具體而言，可在37℃條件下使用E型黏度計(東機產業股份公司製，TV-22型黏度計，機種：TVE-22L，錐形轉子：標準轉子1°34’×R24，旋轉數100rpm)進行測定。

作為「特定化合物」之例，雖然並無特別限制，但可列舉高分子化合物，較佳係可列舉具有陰離子性官能基之高分子化合物。

作為陰離子性官能基，可列舉羧酸、磺酸、磷酸及該等鹽，羧酸或其鹽係較佳。

本發明中所使用之高分子化合物，可使用由來自前述陰離子性官能基之群組中之1種或2種以上所構成者。

作為本發明中所使用之高分子化合物的較佳具體例，雖然並無特別限制，但可列舉由單糖類(例如，三碳糖、四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖等)聚合10個以上而成之 多醣類，更佳係可列舉具有陰離子性官能基之酸性多醣類。此處所謂的酸性多醣類，只要是在其構造中具有陰離子性官能基則無特別限制，例如為具有糖醛酸(例如，葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)之多醣類、在構造中的一部分具有硫酸或磷酸之多醣類、或持有該兩者的構造之多醣類，而不僅是從天然獲得之多醣類，亦可包含藉由微生物產生之多醣類、依基因步驟而產生之多醣類、或使用酵素以人工合成之多醣類。更具體而言，可例示由來自透明質酸、結冷膠、脫醯化結冷膠(DAG)、鼠李聚糖膠(rhamsan gum)、迪特膠(diutan gum)、黃原膠、鹿角菜膠、三仙膠、己糖醛酸、褐藻多醣、果膠、果膠酸、果膠酯酸、硫酸乙醯肝素、肝素、硫酸類肝素、硫酸角質、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖及該等之鹽所組成之群組中之1種或2種以上所構成者。

作為此處所謂的鹽，可列舉：鋰、鈉、鉀等鹼金屬之鹽；鈣、鋇、鎂等鹼土金屬之鹽；鋁、鋅、銅、鐵等之鹽；銨鹽；四乙基銨、四丁基銨、甲基三丁基銨、鯨蠟基三甲基銨、苄基甲基己基癸基銨、膽鹼等四級銨鹽；與吡啶、三乙基胺、二異丙基胺、乙醇胺、二乙醇胺、胺基丁三醇(tromethamine)、葡甲胺(meglumine)、普魯卡因(procaine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)等有機胺所成之鹽；與甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸等胺基酸所成之鹽等。

此等高分子化合物或多醣類的重量平均分子量較佳為10,000至50,000,000，更佳為100,000至20,000,000，再佳 為1,000,000至10,000,000。舉例而言，該分子量可利用經由凝膠滲透層析(GPC)所進行之聚三葡萄糖換算而測定。

本發明中，可將上述多醣類組合使用複數種(較佳為2種)。多醣類組合的種類，只要是能夠在液體培養基中形成上述構造體，且在不會實質上提高該液體培養基的黏度之情形下使細胞及/或組織均勻地浮游(較佳係使其浮游靜置)者，則無特別限定，但較佳係該組合至少包含DAG或其鹽。即，合適的多醣類組合中，係包含DAG或其鹽、及DAG或其鹽以外之多醣類(例如，黃原膠、海藻酸、鹿角菜膠、迪特膠、甲基纖維素、刺槐豆膠或該等鹽)。作為具體的多醣類組合，可列舉DAG與鼠李聚糖膠、DAG與迪特膠、DAG與黃原膠、DAG與鹿角菜膠、DAG與三仙膠、DAG與刺槐豆膠、DAG與κ-鹿角菜膠、DAG與海藻酸鈉、DAG與甲基纖維素等，但不限定於此等。

作為「特定化合物」的更佳具體例，可列舉透明質酸、脫醯化結冷膠、迪特膠、鹿角菜膠及黃原膠以及該等鹽，若考慮到能夠降低培養基組成物的黏度之方面及細胞或組織的回收較容易之方面，則最佳例可列舉脫醯化結冷膠或其鹽。

本發明中之脫醯化結冷膠，係指以1-3鍵結之葡萄糖、1-4鍵結之葡萄糖醛酸、1-4鍵結之葡萄糖及1-4鍵結之鼠李糖之4分子糖作為構成單位之直鏈狀高分子多醣類，且係在以下之通式(I)中，R1、R2同時為氫原子，n為2以上之整數所表示之多醣類。惟，R1亦可包含甘油基， R2亦可包含乙醯基，而乙醯基及甘油基的含量較佳為10%以下，更佳為1%以下。

前述構造體係依據特定化合物而作成各式各樣的形態，而若針對脫醯化結冷膠之情況進行記載，則脫醯化結冷膠係在與液體培養基進行混合時，攝入液體培養基中之金屬陽離子(例如鈣離子)，形成經由該金屬陽離子而成之不定形的構造體，而使細胞及/或組織浮游。由脫醯化結冷膠所調製之本發明之培養基組成物的黏度為8mPa．s以下，較佳為4mPa．s以下，若考慮到細胞或組織的回收較容易之方面，則更佳為2mPa．s以下。

雖然「特定化合物」亦可藉由化學合成法獲得，但當該化合物為天然物時，則較佳係藉由使用慣用技術從含有該化合物之各種植物、各種動物、各種微生物中進行萃取及分離精製而獲得。在該萃取中，若使用水或超臨界氣體，則可效率良好地對該化合物進行萃取。舉例而言，就結冷膠的製造方法而言，只要利用發酵培養基將生產微生物進行培養，以通常的精製方法將在菌體外生產之黏膜物進行回收、乾燥、粉碎等步驟後，作成粉末狀即可。又，在脫醯化結冷膠之情況，則只要在將黏膜物進行回收時實施鹼處理，將鍵結於1-3鍵結之葡萄糖殘基的甘 油基及乙醯基予以脫醯化後進行回收即可。就精製方法而言，例如係藉由將利用經由液-液萃取、分別沉澱、結晶化、各種離子交換層析、使用Sephadex LH-20等之凝膠過濾層析、活性碳、矽膠等的吸附層析或薄層層析而進行之活性物質的吸脫附處理、或使用逆相管柱之高速液體層析等予以單獨地或依任意順序組合，並且反覆使用，便可將雜質去除精製。關於結冷膠的生產微生物之例，雖然並不限定於此，但可列舉伊樂鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)及該微生物的基因發生突變之微生物。

此外，在脫醯化結冷膠之情況，可使用市售者，例如三晶股份公司製「KELCOGEL(CP Kelco公司的註冊商標)CG-LA」、三榮源FFI股份公司製「KELCOGEL(CP Kelco公司的註冊商標)」等。

在培養基中之特定化合物的濃度，只要是成為0.0005%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.001%至0.4%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.1%(重量/容量)，再佳為0.005%至0.05%(重量/容量)即可。舉例而言，在脫醯化結冷膠之情況，只要在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.003%至0.5%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.1%(重量/容量)，再佳為0.01%至0.05%(重量/容量)，最佳為0.01%至0.02%(重量/容量)即可。在黃原膠之情況，只要在培養基中添加0.001%至5.0%(重量/容量)，較佳為0.01%至1.0%(重量/容量)，再更佳為0.05%至0.5%(重量/容量)，最佳為0.1%至0.2%(重量/容量)即可。在κ-鹿角菜膠及刺槐豆膠 混合系統之情況，只要在培養基中添加0.001%至5.0%(重量/容量)，較佳為0.005%至1.0%(重量/容量)，更佳為0.01%至0.1%(重量/容量)，最佳為0.03%至0.05%(重量/容量)即可。

將上述多醣類組合使用複數種(較佳為2種)之情況，該多醣類的濃度係可在該多醣類組合能夠在液體培養基中形成上述構造體且在不會實質上提高該液體培養基的黏度之情形下使細胞及/或組織均勻地浮游(較佳係使其浮游靜置)之範圍內，進行適宜設定。舉例而言，在使用DAG或其鹽、與DAG或其鹽以外的多醣類之組合之情況，DAG或其鹽的濃度可例示0.005至0.02%(重量/容量)，較佳為0.01至0.02%(重量/容量)，DAG或其鹽以外的多醣類的濃度可例示0.005至0.4%(重量/容量)，較佳為0.1至0.4%(重量/容量)。具體的濃度範圍之組合可例示以下者。

DAG或其鹽：0.005至0.02%(較佳為0.01至0.02%)(重量/容量)

DAG以外的多醣類

黃原膠：0.1至0.4%(重量/容量)

海藻酸鈉：0.1至0.4%(重量/容量)(較佳為0.0001至0.4%(重量/容量))

天然結冷膠：0.0001至0.4%(重量/容量)

刺槐豆膠：0.1至0.4%(重量/容量)

甲基纖維素：0.1至0.4%(重量/容量)(較佳為0.2至0.4%(重量/容量))

鹿角菜膠：0.05至0.1%(重量/容量)

迪特膠：0.05至0.1%(重量/容量)

尚且，該濃度可利用以下之式算出。

濃度(%)=特定化合物的重量(g)/培養基組成物的容量(ml)×100

前述化合物亦可藉由化學合成法進一步轉變成別種衍生物，依此而獲得之該衍生物亦可在本發明中有效地使用。具體而言，在脫醯化結冷膠之情況，將相當於該通式(I)所示之化合物的R1及/或R2之羥基置換成C1-3烷氧基、C1-3烷基磺醯基、葡萄糖或果糖等單糖殘基、蔗糖、乳糖等寡醣殘基、甘胺酸、精胺酸等胺基酸殘基等而成的衍生物亦可使用於本發明中。又，亦可使用1-乙基-3-(3-二-甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)等交聯劑使該化合物進行交聯。

本發明中所使用之特定化合物或其鹽可依據製造條件而以任意的結晶形之形式存在，並可以任意的水合物之形式存在，此等結晶形或水合物及該等混合物亦含括在本發明之範圍中。又，亦有以包含丙酮、乙醇、四氫呋喃等有機溶媒的溶媒合物之形式存在之情形，此等形態皆包含在本發明之範圍中。

本發明中所使用之特定化合物亦可以藉由環內或環外異構化所生成之互變異構物、幾何異構物、互變異構物或幾何異構物之混合物、或該等混合物之形式存在。本發明之化合物無論是否藉由異構化所生成，在具有 不對稱中心時，可以經解析之光學異構物或以任意的比率包含該等之混合物之形式存在。

在本發明之培養基組成物中，含有金屬陽離子，例如2價金屬陽離子(鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子等)，較佳為鈣離子。在一態樣中，此乃由於因包含金屬陽離子，故使具有陰離子性官能基之高分子化合物經由金屬陽離子而集合；使具有陰離子性官能基之高分子化合物形成三次元網絡；或者使具有陰離子性官能基之高分子化合物經由金屬陽離子而形成微膠體，藉此而形成能夠使細胞或組織浮游而進行培養之構造體。

在藉由本發明之製造方法所製造之培養基組成物中，亦可包含後述之細胞外基質、黏著分子等。

本發明亦包含：使用該培養基組成物使細胞或組織增殖之培養方法、將所獲得之細胞或組織藉由例如過濾、離心或磁性分離而進行回收之方法、使用該培養基組成物製造球體之方法。

本發明中所使用之由特定化合物所構成之構造體，係在將細胞及/或組織在活體外進行培養時，顯示出使該細胞及/或組織在含有該特定化合物的構造體之液體中浮游之效果(較佳為使其浮游靜置之效果)者。藉由該浮游效果，相較於單層培養而言，可增加每一定體積的細胞及/或組織而進行培養。又，習知的浮游培養方法中，在伴隨著旋轉或震盪操作之情況下，會有由於對細胞及/或組織之剪切力發生作用，因而有細胞及/或組織的增殖率或回 收率較低，或細胞的機能受損之情況，但若藉由使用本發明之含有特定化合物的構造體之培養基組成物，便可在未施行震盪等操作之情形下就使細胞及/或組織均勻地分散，因此，可在沒有細胞機能的損失之情形下輕易且大量地取得目標之細胞及/或組織。又，在包含習知的凝膠基材之培養基中，在將細胞及/或組織進行浮游培養時，會有細胞及/或組織的觀察或回收係較困難、或是回收時使其機能受損之情況，但若藉由使用本發明之含有特定化合物的構造體之培養基組成物，即可將細胞及/或組織進行浮游培養，且在不會使其機能受損之情形下進行觀察、回收。又，包含習知的凝膠基材之培養基會有黏度較高而難以交換培養基之情況，但本發明之含有特定化合物的構造體之培養基組成物則因呈低黏度，故可使用吸量管或泵等而輕易地將培養基進行交換。

藉由本發明之方法所培養之來自人類的細胞及/或組織，可對具有疾病或障礙之患者以治療目的進行移植。此時，作為治療對象之疾病或障礙的種類、前處置方法及細胞移植方法可由當事者適宜選擇。對所移植之細胞的接受者之植活及從疾病或障礙之恢復、或伴隨移植之副作用的有無、治療的效果係可藉由移植治療中之一般方法適宜檢查、進行判斷。

再者，由於細胞及/或組織可效率良好地增殖，故藉由本發明之製造方法所製造之培養基組成物係可使用於作為細胞的研究用試藥。舉例而言，當解明調節細 胞或組織的分化或增殖之因子時，係對使細胞與目標因子共存而進行培養時之細胞的數目或種類、細胞表面分化標記或表現基因的變化進行解析，而此時若藉由使用本發明之培養基組成物，則不僅可使作為解析對象之細胞的數目效率良好地增幅，亦可效率良好地進行回收。解明作為目標之因子時之培養條件、培養裝置、培養基的種類、本發明化合物的種類、特定化合物的含量、添加物的種類、添加物的含量、培養時間、培養溫度等可從本說明書中所記載之範圍由當事者適宜選擇。藉由培養所增殖或出現之細胞係可使用該領域中標準的顯微鏡進行觀察。此時，針對所培養之細胞，亦可使用特異性抗體進行染色。依目標因子而變化之表現基因，係可從所培養之細胞中萃取RNA(核糖核酸)並藉由北方墨點法、RT-PCR法等進行檢測。又，細胞表面分化標記可使用特異性抗體藉由ELISA或流式細胞儀進行檢測，觀察對由目標因子所致之分化或增殖之效果。

使用本發明之培養方法將細胞及/或組織進行培養時，可使用一般用於細胞培養中之培養皿、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(Teflon)(註冊商標)袋、盤皿、培養盤、組織培養用盤、多盤(multidish)、微板、微孔板、多板、多孔板、腔室玻片、試管、托架、培養袋、滾瓶(roller bottle)等培養器材進行培養。此等培養器材的材質並無特別限制，但可列舉例如玻璃、聚氯乙烯、纖維素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚碸、聚胺基甲 酸酯、聚酯、聚醯胺、聚苯乙烯、聚丙烯等塑膠等。又，亦可對此等塑膠實施各種表面處理(例如，電漿處理、電暈處理等)。再者，對此等培養器材，亦可預先塗覆細胞外基質或細胞黏著分子等。作為此種塗覆材料，可列舉膠原蛋白I至XIX、纖連蛋白、玻連蛋白(vitronectin)、層黏蛋白-1至12、巢蛋白(nidogen)、肌腱蛋白(tenascin)、血小板反應蛋白(thrombospondin)、馮威里氏(von Willebrand)因子、造骨蛋白(osteopontin)、纖維蛋白原、各種彈性蛋白、各種蛋白多醣、各種鈣黏蛋白、橋粒芯膠黏蛋白(desmocollin)、橋粒芯蛋白(desmoglein)、各種整合蛋白、E-選擇蛋白(E-selectin)、P-選擇蛋白(P-selectin)、L-選擇蛋白(L-selectin)、免疫球蛋白、透明質酸、超家族、基質膠、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸、甲殼素、殼聚醣、瓊脂糖(sepharose)、海藻酸凝膠、水凝膠(hydrogel)，進而此等的切割片段等。此等塗覆材料亦可使用藉由基因重組技術而使胺基酸序列發生人為改變者。又，亦可使用用以阻止對細胞及/或組織的培養器材之黏著的塗覆材料。作為此種塗覆材料，可列舉矽、聚(甲基丙烯酸2-羥基甲酯)、聚(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼)等，但不限於此等。

細胞及/或組織的培養亦可藉由能夠一邊在機械性控制下於密閉環境下自動地實行細胞接種、培養基交換、細胞影像取得、培養細胞回收並控制pH、溫度、氧濃度等，一邊以高密度進行培養之生物反應器或自動培養裝置施行。作為使用此等裝置在培養途中補給新的培養基 並將所要求物質在不會過量或不足之情形下供給至細胞及/或組織之手法，係有流加培養(feeding culture)、連續培養及灌流培養，任一手法皆可用於本發明之培養方法中。

使用本發明中之特定化合物將細胞及/或組織進行培養時，可將培養細胞及/或組織時所使用之培養基、與上述經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物進行混合而調製培養基組成物。本發明係提供該培養基組成物的製造方法。

作為培養基，可列舉例如Dulbecco改良Eagles培養基(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM)、Ham F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、McCoy 5A培養基(McCoy’s 5A medium)、Eagles MEM培養基(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)、α MEM培養基(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；α MEM)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、Iscove改良Dulbecco培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、William培養基E、IPL41培養基、Fischer’s培養基、StemPro34(Employer公司製)、X-VIVO 10(Cambrex公司製)、X-VIVO 15(Cambrex公司製)、HPGM(Cambrex公司製)、StemSpan H3000(Stemcell Technologies公司製)、StemSpanSFEM(Stemcell Technologies公司製)、StemlineII(Sigma-Aldrich公司製)、QBSF-60(Quality Biological公司製)、StemProhESCSFM(Employer公司製)、mTeSR1或2培 養基(Stemcell Technologies公司製)、Sf-900II(Employer公司製)、Opti-Pro(Employer公司製)等。

在細胞及/或組織係來自植物之情況，可列舉通常可用於植物組織培養中之Murashige-Skoog(MS)培養基、Linsmaier-Skoog(LS)培養基、White培養基、Gamborg B5培養基、Nitsch培養基、Heller培養基、Moller培養基等基本培養基，或在將此等培養基成分修正至最適濃度而成之修正培養基(例如，使氨態氮濃度成為一半等)中，以適當濃度添加植物生長激素類及視需要之細胞分裂激素類等植物生長調節物質(植物激素)而成之培養基作為培養基。在此等培養基中，可視需要而進一步補充酪蛋白分解酵素、玉米浸漬液、維生素類等。作為植物生長激素類，可列舉例如3-吲哚乙酸(IAA)、3-吲哚丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)等，但不限定於該等。植物生長激素類係可例如以約0.1至約10ppm的濃度添加至培養基中。作為細胞分裂激素類，可列舉例如裂殖素(kinetin)、苄基腺嘌呤(BA)、玉米素(zeatin)等，但不限定於該等。細胞分裂激素類係可例如以約0.1至約10ppm的濃度添加至培養基中。

上述培養基中，熟習該項技術者亦可視目的而自由地添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生物質、血清、脂肪酸、糖等。在來自動物的細胞及/或組織培養時，熟習該項技術者亦可視目的而組合添加一種以上其他化學成分或生物體成分。作為可添 加至來自動物的細胞及/或組織之培養基中之成分，可列舉胎牛血清、人類血清、馬血清、胰島素、運鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、瓊脂、瓊脂糖、膠原蛋白、甲基纖維素、各種細胞介素(cytokine)、各種激素、各種增殖因子、各種細胞外基質或各種細胞黏著分子等。作為可添加至培養基中之細胞介素，可列舉例如介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10(IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12(IL-12)、介白素-13(IL-13)、介白素-14(IL-14)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、單核球群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、flk2/flt3配體(FL)、白血病細胞阻礙因子(LIF)、抑瘤素M(OM)、紅血球生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)等，但不限於此等。

作為可添加至培養基中之激素，可列舉褪黑激素、血清素、甲狀腺素、三碘甲狀腺素、腎上腺素、正腎上腺素、多巴胺、抗穆勒氏管激素(anti-Mullerian hormone)、脂聯素、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone)、血管收縮素原及血管收縮素、抗利尿激素、心房利尿鈉肽、降鈣素、膽囊收縮素、促腎上腺皮質素釋放 激素(corticotropin-releasing hormone)、紅血球生成素、卵泡刺激激素、胃泌素、飢餓素、升糖素、促性腺素釋放激素、生長激素釋放激素、人類絨毛膜性促性腺素、人類胎盤性泌乳素、生長激素、抑制素、胰島素、類胰島素生長因子、瘦體素、黃體形成激素、黑色素細胞刺激激素、催產素、副甲狀腺激素、催乳素、分泌素、體抑素、血小板生成素、甲狀腺刺激激素、促甲狀腺素釋放激素、皮質醇、醛固酮、睪固酮、去氫表雄固酮、雄烯二酮、二氫睪固酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、助孕酮、鈣化三醇、鈣化二醇、前列腺素、白三烯素、前列環素、血栓素、催乳素釋放激素、促脂素、腦利尿鈉肽、神經肽Y、組織胺、內皮素、胰臟多肽、腎素、及腦啡肽(enkephalin)，但不限於此等。

作為可添加至培養基中之增殖因子，可列舉轉形生長因子-α(TGF-α)、轉形生長因子-β(TGF-β)、巨噬細胞炎症蛋白-1 α(MIP-1 α)、上皮細胞增殖因子(EGF)、纖維母細胞增殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神經細胞增殖因子(NGF)、肝細胞增殖因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶連結素I、蛋白酶連結素II、血小板衍生性生長因子(PDGF)、膽鹼激導性分化因子(CDF)、趨化素、Notch配體(Deltal等)、Wnt蛋白、類血管生成素蛋白2、3、5或7(Angpt 2、3、5、7)、類胰島素生長因子(IGF)、類胰島素生長因子結合蛋白(IGFBP)、多效生長因子(Pleiotrophin)等，但不限於此等。

又，亦可添加藉由基因重組技術而使此等細胞介素或增殖因子的胺基酸序列發生人為改變者。其例可列舉IL-6/可溶性IL-6受體複合體或Hyper IL-6(IL-6與可溶性IL-6受體之融合蛋白)等。

作為各種細胞外基質或各種細胞黏著分子之例，可列舉膠原蛋白I至XIX、纖連蛋白、玻連蛋白、層黏蛋白-1至12、巢蛋白、肌腱蛋白、血小板反應蛋白、馮威里氏(von Willebrand)因子、造骨蛋白、纖維蛋白原、各種彈性蛋白、各種蛋白多醣、各種鈣黏蛋白、橋粒芯膠黏蛋白、橋粒芯蛋白、各種整合蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、免疫球蛋白超家族、基質膠、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸、甲殼素、殼聚醣、瓊脂糖、透明質酸、海藻酸凝膠、各種水凝膠，進而此等的切割片段等。

作為可添加至培養基中之抗生物質之例，可列舉磺胺製劑、青黴素、苯氧乙基青黴素(phenethicillin)、二甲苯青黴素(methicillin)、苯唑青黴素(oxacillin)、氯苯唑青黴素(cloxacillin)、二氯苯唑青黴素(dicloxacillin)、氟氯苯唑青黴素(fluocloxacillin)、乙氧萘青黴素(nafcillin)、胺苄青黴素(ampicillin)、青黴素、胺羥苄青黴素(amoxicillin)、環青黴素(cyclacillin)、羧苄青黴素(carbenicillin)、羧噻吩青黴素(ticarcillin)、氧哌嗪青黴素(piperacillin)、苯咪唑青黴素(azlocillin)、硫苯咪唑青黴素(meczlocillin)、甲亞胺青黴素(mecillinam)、氮脒青黴素(amdinocillin)、頭孢菌素(cephalosporin)及其衍生物、歐索 林酸(oxolinic acid)、氨氟沙星(amifloxacin)、替馬沙星(temafloxacin)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、吡咯嘧啶酸(piromidic acid)、環丙沙星(ciprofloxacin)、西諾沙星(cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、羅索沙星(rosaxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、吡哌酸(pipemidic acid)、舒巴克坦(sulbactam)、克拉維酸(clavulanic acid)、β-溴青黴烷酸(β-bromopenicillanic acid)、β-氯青黴烷酸(β-chloropenicillanic acid)、6-乙醯基亞甲基青黴烷酸(6-acetylmethylene penicillanic acid)、頭孢噁唑(cephoxazole)、舒他西林(sultampicillin)、氨卓西林(adinocillin)及舒巴克坦(sulbactam)之甲醛水合物酯、三唑巴坦(tazobactam)、氨曲南(aztreonam)、磺胺菌素(sulfazecin)、異磺胺菌素(isosulfazecin)、諾卡黴素(norcardicin)、間羧基苯基、苯基乙醯胺基膦酸甲酯、氯四環素(chlortetracycline)、羥四環素(oxytetracycline)、四環素(tetracycline)、脫甲氯四環素(demeclocycline)、脫氧羥四環素(doxycycline)、甲烯土黴素(metacycline)、以及米諾環素(minocycline)。

較佳態樣中，培養基係含有金屬陽離子(例如2價金屬陽離子(鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子等)，較佳為鈣離子)。鈣離子可含有0.1至10mM，較佳為0.5至3.0mM。此乃由於因包含金屬陽離子，而使具有陰離子性官能基之高分子化合物經由金屬陽離子所集 合；使具有陰離子性官能基之高分子化合物形成三次元網絡；或者，使具有陰離子性官能基之高分子化合物經由金屬陽離子而形成微膠體，藉此可形成能夠使細胞或組織浮游而進行培養之構造體。

本發明之製造方法，其特徵為使用經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)作為具有陰離子性官能基之高分子化合物。由於市售的具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)一般係對水呈難溶解性，故會有為了使其溶解於水中，而需要高壓釜等加熱處理之情況。本發明者等人追究此種難水溶性之原因，而發現混入至該高分子化合物中的2價金屬陽離子即為其原因，藉由除去2價金屬陽離子混入物，便使具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)的水溶性提升，在添加至液體培養基中時，便成功地輕易形成能夠使細胞或組織浮游而進行培養之構造體。

作為2價金屬陽離子，可列舉鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子、銅離子等。其中，鈣離子的混入量係經減少。

在一態樣中，可使用實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)。「實質上不含2價金屬陽離子」係指處理後之該高分子化合物中之全體的2價金屬陽離子為900ppm以下，較佳為600ppm以下，更佳為300ppm以下，最佳為不 含2價金屬陽離子。尤其Ca係通常為500ppm以下，較佳為300ppm以下，更佳為100ppm以下，且Mg係通常為300ppm以下，較佳為200ppm以下，更佳為100ppm以下。在更進一步的局面中，鈣離子混入量係例如為750ppm以下，較佳為500ppm以下，更佳為300ppm以下，再佳為100ppm以下，最佳為50ppm以下，鎂離子混入量係例如為300ppm以下，較佳為Mg係200ppm以下，更佳為Mg係100ppm以下，再佳為50ppm以下，最佳為25ppm以下。

實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物中的2價金屬陽離子混入量，在使用DAG之情況，處理DAG中之Ca係通常為500ppm以下，較佳為300ppm以下，更佳為100ppm以下，且Mg係通常為300ppm以下，較佳為200ppm以下，更佳為Mg係100ppm以下。在更進一步的局面中，處理DAG中之鈣離子混入量係例如為750ppm以下，較佳為500ppm以下，更佳為300ppm以下，再佳為100ppm以下，最佳為50ppm以下，鎂離子混入量係例如為300ppm以下，較佳為Mg係200ppm以下，更佳為Mg係100ppm以下，再佳為50ppm以下，最佳為25ppm以下。處理DAG最佳係不含2價金屬陽離子。

依此，藉由減少2價金屬陽離子的混入量，舉例而言，若為脫醯化結冷膠，則可於100ml之純水中，在25℃，使1500mg以上之脫醯化結冷膠粉末完全地溶解。

一般而言，由於市售的具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)中，混入不少2 價金屬陽離子，因而必須自其中除去2價金屬陽離子。從而，在一態樣中，本發明之製造方法係包含：對具有陰離子性官能基之高分子化合物施行2價金屬陽離子除去處理之步驟。藉由此種2價金屬陽離子除去處理，可獲得經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(較佳係實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物)。

作為除去2價金屬陽離子之方法，可列舉陽離子交換體處理、螯合劑處理、沉澱法、溶媒萃取法、離子交換膜法等，但不限定於此等。

若考慮到對培養基組成物之混入，則以進行陽離子交換體處理係較佳。

陽離子交換體可為將2價金屬陽離子交換成1價金屬陽離子之陽離子交換體。

作為陽離子交換體，可列舉弱酸性陽離子交換樹脂、強酸性陽離子交換樹脂、螯合樹脂等。

此等陽離子交換樹脂雖然並無特別限定，但可使用氫型、鈉型，若考慮到操作性，則鈉型係較佳。又，若使用氫型陽離子交換樹脂，則由於處理後之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)中的陰離子性官能基並非為鹽，而是呈酸的構造，因而此處理後之高分子化合物的水溶液呈酸性，會有發生由該高分子化合物的酸所致之水解之風險。因此，在經由氫型陽離子交換樹脂之處理後，通常需要經由鹼之中和處理。相對於此，若使用鈉型陽離子交換樹脂， 則由於處理後之高分子化合物中的陰離子性官能基係呈鈉鹽的構造，故即便未進行中和處理，處理後之高分子化合物的水溶液亦不會呈強酸性，可減低由該高分子化合物的酸所致之水解之風險。

又，亦可將氫型、鈉型陽離子交換樹脂變換成鉀型或銨型而使用。

使高分子化合物與離子交換樹脂接觸之手法雖然並無特別限定，但有管柱式及批次式的手法。

管柱式係將陽離子交換樹脂填充至管柱中，使高分子化合物的溶液流佈，並採取溶出之液。批次式係將陽離子交換樹脂與高分子化合物的溶液以使樹脂會浮游之程度的強度進行攪拌或震盪，並使其進行既定的時間反應後，採取上清液或經去除樹脂而成之濾液。

陽離子交換體處理可藉由將具有陰離子性官能基之高分子化合物與陽離子交換體進行混合，使混入至該高分子化合物中的2價金屬陽離子吸附至陽離子交換體，並將從混合物中除去2價金屬陽離子而成之上述高分子化合物進行單離而施行。陽離子交換體係熟習該項技術者所週知者，亦可使用常用之物。

舉例而言，在鈉型陽離子交換樹脂(批次式)之情況，係藉由將該陽離子交換樹脂與高分子化合物進行混合並加溫，在室溫放冷後，採取上清液或經去除樹脂而成之濾液，將其添加至低級醇(例如，異丙醇)中並將所產生之浮游性固形份進行擰絞而除去水分，並使其乾燥(例如，在真空烘 箱中)，便可獲得經除去2價金屬陽離子而成之上述高分子化合物的乾燥粉末。

又，在鈉型陽離子交換樹脂(管柱式)之情況，係藉由將陽離子交換樹脂填充至管柱中，使該分子化合物的溶液流佈，採取溶出之液，將其添加至低級醇(例如，異丙醇)中並將所產生之浮游性固形份進行擰絞而除去水分，並使其乾燥(例如，在真空烘箱中)便可獲得經除去2價金屬陽離子而成之上述高分子化合物的乾燥粉末。

又，在氫型陽離子交換樹脂(批次式)之情況，藉由將該陽離子交換樹脂與高分子化合物進行混合並加溫，在室溫放冷後，利用鹼進行中和(例如，鋰、鈉、鉀、銣、銫之1價氫氧化物鹽的水溶液等)，將其添加至低級醇(例如，異丙醇)中並將所產生之浮游性固形份進行擰絞而除去水分，並使其乾燥(例如，在真空烘箱中)，便可獲得經除去2價金屬陽離子而成之上述高分子化合物的乾燥粉末。

作為弱酸性陽離子交換樹脂，可列舉Amberlite(註冊商標)(CG-50 Type I、IRC50、IRC76、IRC86、IRP64)、Diaion TM(CWK30/S、WK10、WK20、WK40、WK100、WT01S)、DOWEX(註冊商標)(MAC-3)等，但不限定於此等。

作為強酸性陽離子交換樹脂，可列舉Amberlite(註冊商標)(200、200C、IR120H、IR122Na、15、1200H、IRN77、CG-120、IRP69)、Amberjet(註冊商標)(1200)、Amberlyst(註冊商標)(15(Dry)、16、36)、Diaion(註冊商標)(EXC04、HPK25、PK208、PK212、PK216、PK220、PK228L、RCP160M、 SK1B、SK1BS、SK104、SK110、SK112、SK116、UBK510L、UBK555)、DOWEX(註冊商標)(50Wx2、50Wx4、50Wx8、DR-2030、DR-G8、HCR-W2、MSC、650C、650C UPW、G-26、88、88、M-31、99K/320、99K/350、Marathon C、N-406)、Lewatit(註冊商標)(MonoPlusS100、MonoPlusSP112)等，但不限定於此等。

作為螯合樹脂，可列舉Amberlite(註冊商標)(IRC-748)、Ambersep(註冊商標)(GT74)、Sumichelate(註冊商標)(MC700、MC760、MC850、MC900、MC960、CR2)、Diaion TM(CR11)、DOWEX(註冊商標)(M4195)、Duolite(註冊商標)(C467、GT73、C548、C747)、Lewatit(註冊商標)(TP207、TO208、TP260)等，但不限定於此等。

在批次式處理中，在例如使用DAG作為高分子化合物之情況，樹脂量係相對於DAG 1g而通常為0.5至10ml，較佳為1至10ml，更佳為1至5ml，再佳為2至4mL，DAG處理濃度為0.001%至5.0%(w/v)，較佳為0.1至2.0%(w/v)，更佳為0.1至1.5%(w/v)，再佳為0.1至1.0%(w/v)，處理溫度係通常為10至120℃，較佳為25至120℃，更佳為40至70℃，處理時間係通常為0.5小時至24小時，較佳為0.5小時至2小時，更佳為0.5小時至1小時。

在管柱式處理中，在使用DAG作為高分子之情況，樹脂量係相對於DAG 1g而為1至10ml，較佳為1至5ml，更佳為2至4mL，DAG處理濃度為0.001%至5.0%，較佳為0.1至1.0%，處理溫度為5至40℃，較佳為10至30℃， 處理時間為0.5小時至24小時，較佳為0.5小時至1小時。

在一態樣中，將具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)的水中懸浮物與陽離子交換體(例如，陽離子交換樹脂)進行混合，以使樹脂會浮游之程度的強度進行攪拌或震盪(批次法)。前述懸浮物包含具有陰離子性官能基之高分子化合物的不溶物。本態樣係在以下方面具有特徵：具有陰離子性官能基之高分子化合物並未完全溶於水中，在保持懸浮狀態之情形下，將該懸浮物與陽離子交換體進行混合。該懸浮物中的具有陰離子性官能基之高分子化合物可因包含2價金屬陽離子混入物而對水呈難溶解性。對水呈難溶解性的具有陰離子性官能基之高分子化合物中，可包含例如超過2000ppm(例如，2700ppm)之2價金屬陽離子(例如，鈣離子)。作為陽離子交換體，雖然可使用上述者，但較合適係使用鈉型陽離子交換體(例如，陽離子交換樹脂)。如上述，此乃由於即便未進行中和處理，處理後之高分子化合物的水溶液亦不會呈強酸性，可減低由該高分子化合物的酸所致之水解之風險。又，若利用質子型陽離子交換體進行處理，則尤其在低溫(30℃以下)時，會有高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)易於凝膠化、在將交換體除去時之濾紙會發生堵塞等造成操作性低下之情況，而藉由使用鈉型陽離子交換體，便可避免該種風險。具有陰離子性官能基之高分子化合物與陽離子交換樹脂之混合，為了有效率地進行2價金屬陽離子的除去，亦可在加熱條件下施行，但並非必要。該溫度 係通常為10至90℃，較佳為10至70℃、20至70℃、30至70℃、30至60℃、30至50℃、或30至40℃。尤其是在30至70℃之溫度中，2價金屬陽離子的除去效率優異。在不包含具有陰離子性官能基之高分子化合物的不溶物，並將該高分子化合物的水溶液利用陽離子交換樹脂進行處理之情況，將具有陰離子性官能基之高分子化合物溶解於水時、及利用陽離子交換樹脂進行處理時共計2次，必須進行加熱處理。相對於此，在本態樣中，由於將具有陰離子性官能基之高分子化合物的懸浮液利用陽離子交換樹脂進行直接處理，故懸浮液中的2價金屬陽離子藉由陽離子交換樹脂而被除去之反應、及藉由2價金屬陽離子的除去而增加水溶性的具有陰離子性官能基之高分子化合物對水的溶解係同時進行，所以，即便施行加熱處理亦以1次完成，可達成處理時間的縮短及處理作業的簡化。再者，在不包含具有陰離子性官能基之高分子化合物的不溶物，並將該高分子化合物的水溶液利用陽離子交換樹脂進行處理之情況，將對水呈難溶解性的具有陰離子性官能基之高分子化合物首先溶解於水中時，會有需要在高溫(例如，90℃以上)加熱之情況，而在本態樣中，不需要到達該種程度的加熱，而是在更溫和的條件(例如，10至70℃)，同時進行2價金屬陽離子經由陽離子交換樹脂的除去、及具有陰離子性官能基之高分子化合物對水的溶解。因此，可避免因加熱所致之具有陰離子性官能基之高分子化合物的分解。又，在不包含具有陰離子性官能基之高分子化合物的 不溶物，並將該高分子化合物的水溶液利用陽離子交換樹脂進行處理之情況，例如，在脫醯化結冷膠之情況，僅使處理對象的水溶液中之脫醯化結冷膠濃度上升至0.5%(w/v)左右便屬困難，而在本態樣中，可將處理對象的懸浮液中之脫醯化結冷膠含量提高至超過0.5%(w/v)，例如，可提高至0.6%(w/v)以上、0.7%(w/v)以上、0.8%(w/v)以上。上限值係只要在陽離子交換樹脂處理後可使具有陰離子性官能基之高分子化合物全部溶解於水中，即無特別限定，但例如為2.5%(w/v)以下，較佳為2.0%(w/v)以下，更佳為1.5%(w/v)以下，再佳為1.0%(w/v)以下。藉由使用本態樣之方法，可改善2價金屬陽離子除去步驟的容積效率。在本態樣中，陽離子交換樹脂之處理時間並無特別限定，但通常為0.5小時至24小時，較佳為0.5小時至2小時，更佳為0.5小時至1小時。藉由本態樣之方法之處理，可獲得經除去2價金屬陽離子而成之具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)的水溶液。本發明亦提供此種從具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)中將2價金屬陽離子(例如，鈣離子)除去之方法。該方法可為具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)的精製方法、或實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，脫醯化結冷膠)的製造方法。

作為經除去2價金屬陽離子而成之高分子化合物的上述取出方法，可使陽離子交換體處理後之溶液 乾燥而獲得經除去2價金屬陽離子而成之上述高分子化合物的粉末。又，藉由將該溶液添加至低級醇(例如，異丙醇)中並將所產生之浮游性固形份進行擰絞而除去水分，並使其乾燥(例如，在真空烘箱中)，便可獲得經除去2價金屬陽離子而成之上述高分子化合物的粉末。舉例而言，在使用DAG作為高分子化合物之情況，該異丙醇量係相對於DAG溶液而為2至10倍，較佳為3至5倍，DAG的處理濃度為0.001%至5.0%，較佳為0.1至1.0%，處理溫度為0至40℃，較佳為10至25℃，處理時間為0.5小時至12小時，較佳為0.5小時至1小時。

作為所獲得之固形份的乾燥方法，可列舉噴霧乾燥、凍結乾燥、經由薄膜離心蒸發器進行之乾燥、攪拌乾燥、靜置乾燥等。乾燥後之粉體亦可予以粉碎使用。

若考慮到乾燥後之對水溶解性，則噴霧乾燥、凍結乾燥係較佳。又，若考慮到乾燥後之粉碎並非必要之方面，則噴霧乾燥係較佳。

螯合劑處理可藉由將具有陰離子性官能基之高分子化合物與螯合劑進行混合，使混入至該高分子化合物中的2價金屬陽離子吸附至螯合劑而形成錯合物，並從混合物中將經除去2價金屬陽離子而成之上述高分子化合物進行單離而施行。作為螯合劑，只要是能夠與2價金屬陽離子形成錯合物，並可將其從具有陰離子性官能基之高分子化合物中去除者，即無特別限定，可列舉例如有機系胺基羧酸鹽等。可列舉例如乙二胺四醋酸(EDTA)、乙二 胺四醋酸二鈉(EDTA．2Na)、乙二醇四醋酸(EGTA)、氮基三醋酸(NTA)、二伸乙三胺5醋酸(DTPA)、L-麩胺酸二醋酸(GLDA)等，但較佳為乙二胺四醋酸二鈉(EDTA．2Na)。

舉例而言，使上述高分子化合物與螯合劑在水中進行反應。將該混合液在室溫放冷後利用鹼進行中和(例如，鋰、鈉、鉀、銣、銫之1價氫氧化物鹽的水溶液等)，將其添加至低級醇(例如，異丙醇)中並將所產生之浮游性固形份進行擰絞而除去水分，並使其乾燥(例如，在真空烘箱中)。由於2價金屬陽離子與螯合劑之錯合物及過剩的螯合劑係仍維持溶解於水中，藉由此一連串操作，便可獲得經除去2價金屬陽離子而成之上述高分子化合物的乾燥粉末。

藉由將任意形狀之經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(較佳為實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物)與培養基進行混合，可製造能夠使細胞或組織浮游而進行培養之培養基組成物。該高分子化合物的形狀可為諸如粉末、錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑等經製劑化之固體、諸如經適切的溶媒及溶解劑溶解之溶液或懸浮液等液體、或使其結合至基板或單體之狀態。作為進行製劑化時之添加物，可列舉：對羥基苯甲酸酯類等防腐劑；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等賦形劑；硬脂酸鎂、滑石等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等黏合劑；脂肪酸酯等界面活性劑；甘油等可塑劑等。此等添加物並不限定 於上述者，只要是熟習該項技術者可加以利用之物，便可自由地選擇。

又，經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物亦可視需要而實施滅菌處理。滅菌方法並無特別限制，可列舉例如放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌、過濾器滅菌等。施行過濾器滅菌(以下，亦有稱為過濾滅菌之情況)時之過濾器部分的材質並無特別限制，但可列舉例如玻璃纖維、尼龍、PES(聚醚碸)、親水性PVDF(聚偏二氟乙烯)、纖維素混合酯、纖維素醋酸酯、聚四氟乙烯等。過濾器的細孔大小並無特別限制，但較佳為0.1μm至10μm，更佳為0.1μm至1μm，最佳為0.1μm至0.5μm。此等滅菌處理下，經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物係可呈固形，亦可呈溶液之狀態。

在一態樣中，可將經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(較佳為實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物)的水溶液(將其作為培養基添加劑)使用於本發明之製造方法中。該水溶液可藉由將經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物的固體(例如，粉末)溶解於生理性水性溶媒中而獲得。如上述，由於經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物係對水溶解性較高，故不需要進行加熱處理，便可溶解於水性溶媒中。尤其是在DAG之情況，可製作水 溶液中之DAG的濃度為1.0至1.5%(重量/容量)之高濃度溶液(市售的DAG不僅必須進行加熱處理以便溶解，且若在1%以上之高濃度則藉由加熱處理而使其溶解，但放冷至室溫時會發生凝膠化，故而有操作性不良之困難點)。

溶解時之溫度，例如，對於水，為5至60℃，較佳為5至40℃，再佳為10至30℃。

作為水性溶媒之例，可列舉水、二甲基亞碸(DMSO)等，但不限於此等。作為水性溶媒，水係較佳。

水性溶媒中，亦可包含適切的緩衝劑或鹽。該水性溶媒中，可包含亦可不包含2價金屬陽離子，但較佳態樣中，不包含2價金屬陽離子。此乃由於在水性溶媒中不包含2價金屬陽離子時，在該水溶液中，具有陰離子性官能基之高分子化合物係難以形成能夠使細胞或組織浮游而進行培養之構造體，而能夠以溶解於水中之狀態安定地保存。

水溶液中的具有陰離子性官能基之高分子化合物的濃度，只要該高分子化合物能夠安定地溶解，則無特別限定，但例如為0.0001%至1.5%(重量/容量)，較佳為0.01%至0.5%(重量/容量)，更佳為0.01%至0.3%(重量/容量)。

上述培養基添加劑中，亦可進一步添加諸如提高具有陰離子性官能基之高分子化合物的效果且降低使用時的濃度之添加物。作為此種添加劑之例，可將瓜爾膠(guar gum)、羅望子膠(tamarind gum)、海藻酸丙二醇酯、刺槐豆膠、阿拉伯膠、塔拉膠(tara gum)、羅望子膠、甲基纖維素等多醣類混合1種以上。

亦可將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水溶液進行滅菌(過濾、高壓釜滅菌等)。可將經滅菌之前述水溶液與液體培養基(培養基的水溶液)進行混合而使用。或者，亦可在將前述高分子化合物的水溶液、與將粉末培養基溶於水中所調製之液體培養基(培養基的水溶液)進行混合後，進行滅菌而使用。前述水溶液及液體培養基之滅菌亦可在進行混合前，個別地施行。

滅菌方法可列舉上述方法，但過濾滅菌係較佳。過濾滅菌的細孔大小係如上述，但通常在過濾滅菌步驟中，可使用孔徑0.22μm之膜片過濾器。較佳為孔徑0.1μm。

舉例而言，在使用DAG作為高分子化合物之情況，DAG水溶液的可過濾滅菌的濃度範圍為0.0001至2%，實際上，0.0001至1%係較佳。

在一態樣中，將經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，DAG)(較佳為實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物)的水溶液進行高壓釜滅菌，並將其與無菌的液體培養基進行混合。藉由使用經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(例如，DAG)的水溶液，在低濃度(例如，0.03%(重量/容量)以下，較佳為0.001%至0.03%(重量/容量)，更佳為0.005至0.03%(重量/容量))進行高壓釜滅菌時，可避免發生與液體培養基進行混合時以浮游狀態維持細胞及/或組織之機能低下之風險。

此外，為了使培養基組成物中的具有陰離子性官能基之高分子化合物的濃度成為在不會實質上提高液體培養基的黏度之情形下能夠使細胞及/或組織均勻地浮游(較佳為使其浮游靜置)的濃度，係將經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(較佳為實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物)、與培養細胞及/或組織時所使用之培養基進行混合。較佳係將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水溶液進行滅菌，並與液體培養基(培養基的水溶液)進行混合。

混合比率係具有陰離子性官能基之高分子化合物的水溶液：液體培養基(培養基的水溶液)為1：99至99：1，較佳為10：90至90：10，更佳為20：80至80：20。

混合順序係可將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水溶液添加至液體培養基(培養基的水溶液)中，亦可將液體培養基(培養基的水溶液)添加至具有陰離子性官能基之高分子化合物的水溶液中。

此種具有陰離子性官能基之高分子化合物的濃度係如上述。舉例而言，以使培養基組成物中的具有陰離子性官能基之高分子化合物濃度成為0.0005%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.001%至0.4%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.1%(重量/容量)，再佳為0.005%至0.05%(重量/容量)之方式，將經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(較佳為實質上不含2價金屬陽離子的 具有陰離子性官能基之高分子化合物)、與培養細胞及/或組織時所使用之培養基進行混合。

舉例而言，在脫醯化結冷膠之情況，只要在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.003%至0.5%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.1%(重量/容量)，再佳為0.01%至0.05%(重量/容量)，最佳為0.01%至0.02%(重量/容量)即可。在黃原膠之情況，只要在培養基中添加0.001%至5.0%(重量/容量)，較佳為0.01%至1.0%(重量/容量)，更佳為0.05%至0.5%(重量/容量)，最佳為0.1%至0.2%(重量/容量)即可。在κ-鹿角菜膠及刺槐豆膠混合系統之情況，只要在培養基中添加0.001%至5.0%(重量/容量)，較佳為0.005%至1.0%(重量/容量)，更佳為0.01%至0.1%，最佳為0.03%至0.05%(重量/容量)即可。

尚且，該濃度可利用以下之式算出。

濃度(%)=特定化合物的重量(g)/培養基組成物的容量(ml)×100

藉由將經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(較佳為實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物)、與培養基進行混合，便可在培養基中形成能夠使細胞或組織浮游而進行培養之構造體，而獲得本發明之培養基組成物。由於在培養基中通常包含對於「由具有陰離子性官能基之高分子化合物經由金屬陽離子所集合；由具有陰離子性官能基之高分子化合物而形成三次元網絡；或者是由具 有陰離子性官能基之高分子化合物經由金屬陽離子而形成微膠體」而言為充分濃度的金屬陽離子，故僅藉由將經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物添加至培養基中，便可獲得本發明之培養基組成物。

雖然例示本發明之培養基組成物的製造方法，但本發明不受此所限定。將經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物(較佳為實質上不含2價金屬陽離子的具有陰離子性官能基之高分子化合物)添加至離子交換水或超純水中。此外，將該特定化合物在能夠溶解的溫度(例如，5至60℃，較佳為5至40℃，再佳為10至30℃)進行攪拌而使其溶解至成為透明的狀態。

溶解後，施行滅菌(例如，在121℃於20分鐘的高壓釜滅菌、過濾器過濾)。一邊將靜置培養時所使用之任意的培養基進行攪拌(例如，均質攪拌器等)，一邊在該培養基中添加前述滅菌後之水溶液，以使其均勻之方式與該培養基進行混合。本水溶液與培養基之混合方法並無特別限制，可列舉例如利用吸量(pipetting)等手動之混合、使用磁力攪拌器或機械攪拌器、均質攪拌器、均質機等機器之混合。又，在混合後，亦可將本發明之培養基組成物以過濾器進行過濾。進行過濾處理時所使用之過濾器的細孔大小為5μm至100μm，較佳為5μm至70μm，更佳為10μm至70μm。

舉例而言，在調製脫醯化結冷膠之情況， 係以成為0.0001%至1.5%(重量/容量)，較佳為0.01%至0.5%(重量/容量)，更佳為0.01%至0.3%(重量/容量)之方式在離子交換水或超純水中添加經減少2價金屬陽離子混入量的脫醯化結冷膠(較佳為實質上不含2價金屬陽離子的脫醯化結冷膠)。此外，只要是能夠將前述脫醯化結冷膠溶解的溫度則為幾度皆可，但係以在5至60℃，較佳為5至40℃，再佳為10至30℃進行攪拌而使其溶解至成為透明的狀態。溶解後，藉由例如在121℃進行20分鐘高壓釜或過濾器過濾，而施行滅菌。例如一邊將DMEM/F12培養基等液體培養基利用均質攪拌器等進行攪拌，一邊將本水溶液以成為所期望的最終濃度之方式添加至該培養基中(例如，在最終濃度為0.015%之情況，0.3%水溶液：培養基之比率為1：20)，並使其均勻地混合。或者，將DMEM/F12培養基等液體培養基以成為所期望的最終濃度之方式利用吸量管添加至本水溶液中(例如，在最終濃度為0.015%之情況，0.3%水溶液：培養基之比率為1：20)，並利用吸量使其均勻地混合。本水溶液與培養基之混合方法並無特別限制，可列舉例如利用吸量等手動之混合、使用磁力攪拌器或機械攪拌器、均質攪拌器、均質機等機器之混合。又，在混合後，亦可將培養基組成物以過濾器進行過濾。進行過濾處理時所使用之過濾器的細孔大小為5μm至100μm，較佳為5μm至70μm，更佳為10μm至70μm。

利用本發明之方法所培養之細胞及/或組織的形態或狀態，係可由熟習該項技術者任意地選擇。作為 其較佳具體例，雖然並無特別限制，但可列舉：細胞及/或組織單獨分散於培養基組成物中之狀態、細胞及/或組織黏著於載體表面上之狀態、細胞及/或組織包埋於載體內部中之狀態、由複數個細胞集合並形成細胞塊(球體)之狀態、或由2種以上之細胞集合而形成細胞塊(球體)之狀態等，更佳為細胞及/或組織黏著於載體表面上之狀態、細胞及/或組織包埋於載體內部中之狀態、由複數個細胞集合並形成細胞塊(球體)之狀態、或由2種以上之細胞集合而形成細胞塊(球體)之狀態，再佳為細胞及/或組織黏著於載體表面上之狀態、由複數個細胞集合並形成細胞塊(球體)之狀態、或由2種以上之細胞集合而形成細胞塊(球體)之狀態。此等狀態之內，由於形成細胞塊(球體)之狀態係可再構築近似活體內環境之細胞-細胞間相互作用及細胞構造體，並能夠在保持長期維持細胞機能之情形下進行培養，又，細胞的回收比較容易，因而可列舉為利用本發明之方法進行培養之最佳狀態。

作為使細胞及/或組織載持於表面上之載體，可列舉各種由高分子所構成之微載體或玻璃珠粒、陶瓷珠粒等。作為該高分子之例，可使用乙烯系樹脂、胺基甲酸酯樹脂、環氧樹脂、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯聚酯、聚醯胺、聚醯亞胺、矽樹脂、酚樹脂、三聚氰胺樹脂、脲樹脂、苯胺樹脂、離子聚合物樹脂、聚碳酸酯、膠原蛋白、葡聚糖、明膠、纖維素、海藻酸鹽及此等混合物等。該載體亦可經提高細胞的黏著、或提高來自細胞的物質釋 放之化合物所塗覆。作為此種塗覆材料之例，可列舉聚(單硬脂醯基甘油酯共琥珀酸)、聚-D,L-乳酸交酯-共-乙交酯、透明質酸鈉、正異丙基丙烯醯胺、膠原蛋白I至XIX、纖連蛋白、玻連蛋白、層黏蛋白-1至12、巢蛋白、肌腱蛋白、血小板反應蛋白、馮威里氏(von Willebrand)因子、造骨蛋白、纖維蛋白原、各種彈性蛋白、各種蛋白多醣、各種鈣黏蛋白、橋粒芯膠黏蛋白、橋粒芯蛋白、各種整合蛋白、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、免疫球蛋白超家族、基質膠、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸、甲殼素、殼聚醣、瓊脂糖、海藻酸凝膠、各種水凝膠，進而此等的切割片段等。此時，亦可組合2種以上之塗覆材料。又再者，對於將細胞及/或組織載持於表面上而成之載體的培養所使用之培養基，可混合1種以上之瓜爾膠、羅望子膠、刺槐豆膠、阿拉伯膠、塔拉膠、羅望子膠、甲基纖維素等多醣類。又，該載體亦可含有磁性體材料，例如肥粒鐵。該載體的直徑為數10μm至數100μm，更佳為100μm至200μm，其比重較佳係接近於1，更佳為0.9至1.2，特佳為約1.0。作為該載體之例，雖然不限於此，但可列舉Cytodex 1(註冊商標)、Cytodex 3(註冊商標)、Cytoline 1(註冊商標)、Cytoline 2(註冊商標)、Cytopore 1(註冊商標)、Cytopore 2(註冊商標)(以上，GE Healthcare Life Sciences)、Biosilon(註冊商標)(NUNC)、Cultispher-G(註冊商標)、Cultispher-S(註冊商標)(以上，Thermo SCIENTIFIC)、HILLEXCT(註冊商標)、ProNectinF-COATED(註冊商標)、及HILLEXII(註冊商標) (SoloHill Engineering)等。該載體亦可視需要而實施滅菌處理。滅菌方法並無特別限制，可列舉例如放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌及乾熱滅菌等。作為使用該載體將動物細胞進行培養之方法並無特別限制，可使用採用通常的流動層型培養槽或填充層型培養槽之培養方法等。此時，由於使細胞及/或組織載持於表面上而成之載體係可藉由使用本發明之含有特定化合物之構造體的培養基組成物而在未施行震盪等操作之情形下均勻地分散，因而可在無細胞機能損失之情形下將目標細胞及/或組織進行培養。由本法所培養之細胞及/或組織，係可藉由在培養後在使其維持載持於載體之情形下施行離心或過濾處理而予以回收。此時，亦可在添加所使用之液體培養基後，施行離心或過濾處理。舉例而言，進行離心時之重力加速度(G)為100至400G，進行過濾處理時所使用之過濾器的細孔大小為10μm至100μm，但不限制於此等。又，若預先使載體中內含肥粒鐵等具有磁性之材料，則可藉由磁力將所培養之載體進行回收。由本法所培養之細胞及/或組織，係可藉由使用各種螯合劑、熱處理或酵素從載體剝離而進行回收。

將細胞及/或組織包埋於載體內部中時，可選擇由各種高分子所構成之材料作為該載體。作為此種高分子之例，可列舉膠原蛋白、明膠、海藻酸鹽、殼聚醣、瓊脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸、纖維蛋白黏著劑、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物、蛋白多醣、葡糖胺聚糖、聚胺基甲酸酯 發泡體等海綿狀物、DseA-3D(註冊商標)、聚N-取代丙烯醯胺衍生物、聚N-取代甲基丙烯醯胺衍生物及此等共聚物、聚乙烯基甲基醚、聚環氧丙烷、聚環氧乙烷、聚乙烯醇部分乙醯化物等溫度感受性高分子、聚丙烯醯胺、聚乙烯醇、甲基纖維素、硝基纖維素、丁酸纖維素、聚環氧乙烷、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)/聚己內酯等水凝膠。又，亦可使用2種以上此等高分子而製作用以包埋細胞之載體。再者，該載體中，除了此等高分子以外，亦可具有生理活性物質。作為此生理活性物質之例，可列舉細胞增殖因子、分化誘導因子、細胞黏著因子、抗體、酵素、細胞介素、激素、凝集素(lectin)、或細胞外基質等，亦可含有此等之複數種。又再者，對於在包埋細胞及/或組織而成之載體的培養時所使用之培養基，可混合1種以上之瓜爾膠、羅望子膠、海藻酸丙二醇酯、刺槐豆膠、阿拉伯膠、塔拉膠、羅望子膠、甲基纖維素等增黏劑。

使細胞及/或組織包埋於此等載體中之方法並無特別限制，但亦可使用例如將細胞與前述高分子的混液吸引至注射器中並經由25G至19G左右之注射針滴加至培養基中，或使用微吸量管滴加至培養基中等方法。此處所形成之珠粒狀載體的尺寸係依在滴加細胞與前述高分子混合液時所使用之器具前端的形狀而決定，較佳為數10μm至數1000μm，更佳為100μm至2000μm。能夠利用珠粒狀載體進行培養之細胞數並無特別限制，但只要配合此珠粒尺寸自由地選擇即可。舉例而言，在直徑約2000μm 之珠粒狀載體之情況，可將直至500萬個為止之細胞包埋至此尺寸之珠粒狀載體中。又，細胞在載體內可一個一個地分散，亦可形成由複數個細胞集合而成之細胞塊。此時，由於包埋有細胞及/或組織之載體係可藉由使用本發明之含有特定化合物之構造體的培養基組成物而在未施行攪拌等操作之情形下均勻地分散，因而可在無細胞機能損失之情形下將目標細胞及/或組織進行培養。由本法所培養之細胞及/或組織係可藉由在培養後以包埋於載體中之狀態施行離心或過濾處理而予以回收。此時，亦可在添加所使用之液體培養基後，施行離心或過濾處理。舉例而言，進行離心時之重力加速度(G)為100至400G，進行過濾處理時所使用之過濾器的細孔大小為10μm至100μm，但不限制於此等。由本法所培養之細胞及/或組織係可藉由使用各種螯合劑、熱或酵素等處理來分解載體而使其分散並進行回收。

使細胞凝集塊(球體)形成之方法並無特別限制，熟習該項技術者可適宜選擇。作為其例，可列舉使用具有細胞非黏著表面的容器之方法、懸滴法、旋轉培養法、3次元支架法、離心法、使用經由電場或磁場之凝集之方法等。舉例而言，針對使用具有細胞非黏著表面的容器之方法，可將目標細胞在經實施阻礙細胞黏著之表面處理之培養容器中進行培養而使球體形成。在使用此細胞非黏著性培養容器之情況，首先，在採取目標細胞後調製其細胞浮游液，並接種於該培養容器中而進行培養。若持續 培養約一週，則細胞會自發性地形成球體。作為此時所使用之細胞非黏著性表面，可使用在一般所使用之培養皿等培養容器之表面塗覆有阻礙細胞黏著的物質者等。作為此種物質可列舉瓊脂糖、瓊脂、聚-HEMA(聚-(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼與其他單體(例如甲基丙烯酸丁酯等)之共聚物等，但只要沒有細胞毒性，則不限定於此等。

又，作為使細胞凝集塊(球體)形成之方法，亦可使用NATURE BIOTECHNOLOGY,VOL.28,NO.4,APRIL 2010,361-366、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,689-700、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,572-579、Stem Cell Research,7,2011,97-111、Stem Cell Rev and Rep,6,2010,248-259等中所記載之方法。

又，在使球體形成之培養時所使用之培養基中，亦可含有提早球體的形成、或促進其維持之成分。作為具有此種效果之成分之例，可列舉二甲基亞碸、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、血漿銅藍蛋白(ceruloplasmin)、觸酶、過氧化酶、L-抗壞血酸、L-抗壞血酸磷酸酯、生育酚、類黃酮、尿酸、膽紅素、含硒化合物、運鐵蛋白、不飽和脂肪酸、白蛋白、茶鹼、佛司可林(forskolin)、升糖素、二丁醯cAMP等。作為含硒化合物，可列舉亞硒酸鈉、硒酸鈉、二甲基硒、硒化氫、硒甲硫胺酸、Se-甲基硒半胱胺酸、胱硒醚(selenocystathionine)、硒半胱胺酸、硒高半胱胺酸、腺苷-5’-磷硒酸、Se-腺苷基硒甲硫胺酸、Y27632、Fasudil (HA1077)、H-1152、Wf-536等ROCK阻礙劑。又，為了獲得目標尺寸之均勻的細胞凝集塊，亦可在所使用之細胞非附著性培養容器上，導入與目標細胞凝集塊同一直徑之複數個凹槽。只要此等凹槽係相互連接，或者在目標細胞凝集塊的直徑之範圍內，則在將細胞進行接種時，所接種之細胞不會在凹槽與凹槽之間形成細胞凝集塊，而會確實地在凹槽之中形成因應其容積的大小之細胞凝集塊，可獲得均勻尺寸之細胞凝集塊集團。作為此時之凹槽形狀，半球或圓錐狀係較佳。

或者，亦可基於具有細胞黏著性之支撐體使球體形成。作為此種支撐體之例，可列舉膠原蛋白、聚輪烷(polyrotaxane)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、水凝膠等。

又，藉由與餵養細胞共同培養，亦可使球體形成。作為用於促進球體形成之餵養細胞，任何黏著性細胞皆可使用，但較合適以因應各種細胞之餵養細胞為宜。雖然並無限定，但在例如使來自肝臟或軟骨之細胞的球體形成之情況，作為其餵養細胞之例，可列舉COS-1細胞或血管內皮細胞作為合適的細胞種。

再者，亦可使用本發明之含有特定化合物之構造體的培養組成物使球體形成。此時，只要以使該特定化合物的濃度成為0.0005%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.001%至0.3%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.1%(重量/容量)，再佳為0.01%至0.05%(重量/容量)之方式，將該特定化合物添加 至球體形成時所使用之培養基中即可。球體可藉由在包含該特定化合物之構造體的培養基中使目標細胞均勻地分散並靜置培養3日至10日而調製。此處所調製之球體可藉由施行離心或過濾處理而予以回收。舉例而言，進行離心時之重力加速度(G)為100至400G，進行過濾處理時所使用之過濾器的細孔大小為10μm至100μm，但不限制於此等。又，可使用將特異性結合至目標細胞之抗體塗覆於表面上而成之磁性微粒子，藉由磁力將所培養之球體進行回收。作為此種磁性微粒子之例，可列舉Dynabeads(Veritas公司製)、MACS微珠粒(Miltenyi Biotec公司製)、BioMag(Techno Chemical公司製)等。

球體的大小係依細胞種及培養時間而異，並無特別限定，但呈球形狀或橢圓球形狀時係具有20μm至1000μm，較佳為40μm至500μm，更佳為50μm至300μm的直徑。

此種球體係即便持續保持靜置培養，亦能夠在10日以上，較佳為13日以上，更佳為30日以上之期間保持增殖能力，但若藉由進一步在靜置培養中定期地施行機械性分割，或藉由進一步施行單細胞化處理及凝集，便能夠實質上無期限地保持增殖能力。

球體之培養中所使用之培養容器，只要是一般可進行動物細胞之培養者，則無特別限定，但可列舉例如燒瓶、盤狀物、培養盤、組織培養用盤、多盤、微板、微孔板、多板、多孔板、腔室玻片、培養皿、試管、托架、培養袋、 滾瓶等。

球體之靜置培養中所使用之培養基係可包含細胞黏著因子，作為其例，可列舉基質膠、膠原蛋白凝膠、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層黏蛋白、纖連蛋白。此等細胞黏著因子亦可組合添加2種以上。又再者，對於球體之培養中所使用之培養基，可進一步混合瓜爾膠、羅望子膠、海藻酸丙二醇酯、刺槐豆膠、阿拉伯膠、塔拉膠、羅望子膠、甲基纖維素等增黏劑。

由於藉由使用本發明之含有特定化合物之構造體的培養基組成物，便可在未施行震盪等操作之情形下均勻地在培養液中進行分散，因而可在無細胞機能損失之情形下將目標細胞及/或組織以球體形式進行培養。由本法所靜置培養之球體係可藉由在培養後施行離心或過濾處理而予以回收。此時，亦可在添加所使用之液體培養基後，施行離心或過濾處理。舉例而言，進行離心時之重力加速度(G)為100至400G，進行過濾處理時所使用之過濾器的細孔大小為10μm至100μm，但不限制於此等。又，可使用將特異性結合至目標細胞之抗體塗覆於表面上而成之磁性微粒子，藉由磁力將所培養之球體進行回收。作為此種磁性微粒子之例，可列舉Dynabeads(Veritas公司製)、MACS微珠粒(Miltenyi Biotec公司製)、BioMag(Techno Chemical公司製)等。所回收之球體可進一步藉由使用各種螯合劑、熱、過濾器或酵素等處理來分解而使其以單一細胞形式分散。

作為將來自植物之細胞及/或組織進行靜置 培養時之方法，可培養屬於未進行分化的植物細胞塊之癒傷組織。癒傷組織之衍生係可針對所使用之植物種分別藉由公知的方法施行。舉例而言，將已分化之植物體的一部分組織(例如，根、莖、葉的切片、種子、生長點、胚、花粉等)表面，視需要使用70%酒精或1%次氯酸鈉溶液等進行滅菌後，使用刀具等切出適當大小之組織片(例如，約1至約5mm見方之根切片)，藉由使用無塵實驗台等之無菌操作，將該組織片接種至預先滅菌之癒傷組織衍生培養基中而在適當條件下進行無菌培養。此處所衍生之癒傷組織，可為了立即大量增殖而進行液體培養，或者亦可藉由在繼代用培養基中進行繼代培養而以種株形式維持。繼代培養可使用液體培養基及固形培養基之任一者而施行。

使用本發明之培養基組成物開始靜置培養時所接種之植物細胞塊的量，係因應目標細胞的增殖速度、培養樣式(批次培養、流加培養、連續培養等)、培養時間等而變動，例如，在培養癒傷組織等植物細胞塊之情況，係以使細胞塊的濕重量相對於本發明之培養基組成物而成為4至8(重量/容積(w/v))%，較佳為5至7(w/v)%之方式接種至本發明之培養基組成物中。培養時之植物細胞塊的粒徑為3mm至40mm，較佳為3mm至20mm，更佳為5mm至15mm。此處，「粒徑」係例如在植物細胞塊呈球形時則意指其直徑，在呈橢圓球形時則意指其長徑，在其他形狀時亦同樣地意指可取得之最大長度。

將細胞及/或組織進行培養時的溫度，若為 動物細胞則通常為25至39℃，較佳為33至39℃。CO₂濃度係通常在培養環境中為4至10體積%，較佳為4至6%體積。培養時間通常為3至35日，但只要配合培養目的自由地設定即可。植物細胞的培養溫度通常為20至30℃，若光為必要時，則只要在照度2000至8000米燭光之照度條件下進行培養即可。培養時間通常為3至70日，但只要配合培養目的自由地設定即可。

利用本發明之方法將細胞及/或組織進行培養時，只要對本發明之培養組成物添加另行調製而成之細胞及/或組織，並以可均勻地分散之方式進行混合即可。此時之混合方法並無特別限制，可列舉例如利用吸量等手動之混合、使用攪拌子、旋渦混合器(vortex mixer)、微板混合器、震盪機等機器之混合。混合後可使培養液處於靜置狀態，亦可視需要而將培養液旋轉、震盪或攪拌。其旋轉數及頻度只要配合熟習該項技術者之目的而適宜設定即可。又，在靜置培養的期間必須進行培養基組成物之更換時，只要是在藉由施行離心或過濾處理將細胞及/或組織與培養基組成物予以分離後，將新的培養基組成物添加至細胞及/或組織中即可。或者，只要藉由施行離心或過濾處理將細胞及/或組織適宜濃縮後，將新的培養基組成物添加至此濃縮液中即可。舉例而言，進行離心時之重力加速度(G)為100至400G，進行過濾處理時所使用之過濾器的細孔大小為10μm至100μm，但不限制於此等。又，可使用將特異性結合至目標細胞之抗體塗覆於表面上而成之磁性微 粒子，藉由磁力將所培養之細胞及/或組織進行分離。作為此種磁性微粒子之例，可列舉Dynabeads(Veritas公司製)、MACS微珠粒(Miltenyi Biotec公司製)、BioMag(Techno Chemical公司製)等。此等培養基組成物之更換亦可在機械性控制下於密閉環境下藉由可行的生物反應器或自動培養裝置施行。

又，本發明係提供具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法。

若加以詳述，則為一種具有陰離子性官能基之高分子化合物的精製方法，其係將具有陰離子性官能基之高分子化合物的水中懸浮物，藉由將2價金屬陽離子交換成1價金屬陽離子之陽離子交換體進行處理，而獲得經減少2價金屬陽離子混入量的具有陰離子性官能基之高分子化合物。

本發明之精製方法之較佳態樣係與上述除去2價金屬陽離子之方法相同。

以下係藉由具體敘述本發明之培養基組成物之實施例而進一步詳細說明本發明，但本發明並不受此等所限定。

[實施例]

[參考例1：包含經高溫加熱處理之脫醯化結冷膠的培養基之黏度測定及細胞浮游試驗]

[含有脫醯化結冷膠的培養基之調製及黏度測定]

使脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製) 以成為0.4%(w/v)之方式懸浮於純水中後，在90℃加熱攪拌並使其溶解。將本水溶液一邊攪拌、一邊放冷至室溫，在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌。在300mL高型燒杯中裝入2倍濃度之DMEM/F-12培養基(Aldrich公司製)50mL及滅菌水47.5mL，在室溫一邊利用均質攪拌器(3000rpm)進行攪拌、一邊添加脫醯化結冷膠水溶液2.5mL，藉由持續保持攪拌1分鐘而調製脫醯化結冷膠最終濃度0.01%培養基組成物。同樣地調製以最終濃度成為0.02、0.03、0.05%(w/v)之方式添加脫醯化結冷膠水溶液之培養基組成物。本培養基組成物的黏度係在37℃條件下使用E型黏度計(東機產業股份公司製，Viscometer TVE-22L，標準轉子1°34’×R24)，以旋轉數100rpm測定5分鐘。

[含有脫醯化結冷膠的培養基之細胞浮游試驗]

將人類子宮頸癌細胞株HeLa(DS Pharma Biomedical公司製)以成為250000個/mL之方式懸浮於包含10%(v/v)胎牛血清之EMEM培養基(WAKO公司製)中，將本懸浮液10mL接種於EZ SPHERE(旭硝子公司製)中後，於CO₂保溫箱(5% CO₂)內培養3日。將此處所獲得之球體(直徑100至200μm)的懸浮液10mL進行離心處理(200G，5分鐘)而使球體沉降，藉由去除上清液而調製球體懸浮液1.0mL。繼而，將上述所調製之含有脫醯化結冷膠的培養基逐步裝入1.0mL至1.5mL Eppendorf試管中，並進一步添加HeLa細胞球體懸浮液10μL。藉由輕敲使細胞塊分散，在37℃進行保溫 培養，並以目視觀察1小時後之細胞的分散狀態。

[參考比較例：含有甲基纖維素、膠原蛋白的培養基之調製]

[含有甲基纖維素的培養基之調製]

在200mL茄狀燒瓶中裝入DMEM/F-12培養基(Aldrich公司製)100mL，並添加甲基纖維素(M0387，Aldrich公司製)0.1g。一邊以冰浴進行冷卻、一邊攪拌，使甲基纖維素溶解。使用本溶液，調製以使最終濃度成為0.1、0.3、0.6、1.0%(w/v)之方式添加甲基纖維素水溶液而成之培養基組成物。

[含有膠原蛋白的培養基之調製]

在0.3%細胞基質型I-A(新田明膠公司製)6.5mL中裝入10倍濃度之DMEM/F-12培養基(Aldrich公司製)1mL、再構成用緩衝液(新田明膠公司製)1mL及純水1.5mL，一邊在冰中進行攪拌、一邊調製含有0.2%之膠原蛋白的培養基。同樣地，調製以使最終濃度成為0.01、0.05、0.1、0.2%(w/v) 之方式添加膠原蛋白而成之培養基組成物。

針對上述所調製之培養基組成物，亦與含有脫醯化結冷膠的培養基同樣地實施HeLa細胞球體之浮游試驗及黏度測定。惟，1.0%(w/v)甲基纖維素的黏度係由裝置的測定範圍以50rpm進行測定。

[參考試驗例]

以下之參考試驗例中，於CO₂保溫箱中之CO₂的濃度(%)係以環境中之CO₂的體積%表示。又，PBS係意指磷酸緩衝生理食鹽水(Sigma-Aldrich Japan公司製)，FBS係意指胎牛血清(Biological Industries公司製)。又，(w/v)係表示每1體積的重量。

[參考試驗例1：使單一細胞分散時之細胞增殖試驗]

將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)以成為0.3%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解，將本水溶液在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌。使用本溶液，調製在包含10%(v/v)胎牛血清及10ng/mL之血小板生成素(WAKO公司製)的IMDM培養基(Gibco公司製)中添加最終濃度0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠而成之培養基組成物。繼而，將人類白血病細胞株UT7/TPO以20000細胞/mL之方式接種至上述已添加有脫醯化結冷膠之培養基組成物中後，以每1孔成為5mL之方式分注至6孔平底微板(Corning公司製)之孔中。同樣地，將人類子宮頸癌細胞株HeLa(DS Pharma Biomedical公司製)，以20000細胞/mL之方式，接種至在包含10%(v/v)胎牛血清的EMEM培養基(WAKO公司製)中添加有0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)而成之培養基組成物中後，以每1孔成為5mL之方式分注至6孔平底微板(Corning公司製)之孔中。將此等細胞懸浮液於CO₂保溫箱(5% CO₂)內以靜 置狀態進行培養3日。然後，將培養液的一部分進行回收，同量添加台盼藍(trypan blue)染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。

其結果，確認到UT7/TPO細胞及HeLa細胞能夠藉由使用上述培養基組成物而以浮游狀態均勻地進行培養，且利用該培養基組成物進行增殖。浮游靜置培養3日後之UT7/TPO細胞及HeLa細胞的細胞數示於表4。

[參考試驗例2：將來自細胞株之球體進行培養時之細胞增殖試驗]

將人類肝癌細胞株HepG2(DS Pharma Biomedical公司製)以250000個/mL之方式懸浮於包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)中，將本懸浮液10mL接種至EZ SPHERE(旭硝子公司製)中後，於CO₂保溫箱(5% CO₂)內培養7日。同樣地，將人類子宮頸癌細胞株HeLa(DS Pharma Biomedical公司製)以250000個/mL之方式懸浮於包含10%(v/v)胎牛血清的EMEM培養基(WAKO公司製)中，將本懸浮液10mL接種至EZ SPHERE(旭硝子公司製)中後，於CO₂保溫箱(5% CO₂)內培養7日。將此處所獲得之各細胞株之球體(直徑100至200μm)的懸浮液2.5mL進行離心處理(200G，5分鐘)，而使球體沉降並去除上清液。 繼而，在本球體(約800個)中添加上述培養基10mL而使其懸浮後，移至平底試管(BM機器公司製)中。同樣地，使用在上述培養基中添加0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)而成之培養基組成物，作成球體的懸浮液，並移至平底試管(BM機器公司製)中。尚且，添加有0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠而成之培養基組成物，係可藉由先將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)以成為0.3%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解，將本水溶液在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌後，以1/20稀釋添加至包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基中，而調製之。

在37℃於CO₂保溫箱(5% CO₂)內將上述球體懸浮液靜置培養3日後，藉由添加2倍容量之培養基並施行離心處理(200G，5分鐘)而使球體沉降，並去除上清液。此處，分取球體的一部分，以光學顯微鏡(OLMPUS公司製，CK30-F100)觀察其形狀。繼而，所回收之球體以PBS 10mL洗淨1次後，添加1mL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫5分鐘。添加上述培養基9mL後，藉由離心處理(200G，5分鐘)將細胞進行回收。對此處所獲得之細胞懸浮液2mL的一部分，同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞及死細胞數。

其結果，確認到HepG2細胞及HeLa細胞的 球體能夠藉由使用上述培養基組成物而以浮游狀態進行培養，且利用該培養基組成物，細胞係效率良好地進行增殖。而且，確認到該培養基組成物相較於既存的培養基而言，係使細胞增殖時死細胞的比例較少，細胞增殖的促進效果優異。此時，利用既存的培養基所培養之球體係沉降於培養容器的底面。再者，將所培養之球體的形狀以光學顯微鏡觀察，結果在該培養基組成物中未見到球體彼此間的匯集，相對於此，在既存的培養基中則觀察到球體彼此間的匯集。

關於HepG2細胞及HeLa細胞，將以不含脫醯化結冷膠的培養基進行培養時之細胞數設為1時之相對細胞數示於表5。又，將以不含脫醯化結冷膠的培養基進行培養時之死細胞率(死細胞數/活細胞數)設為1時之相對死細胞率示於表6。又，將以該培養基組成物培養HepG2細胞及HeLa細胞的球體時之浮游狀態分別示於第1圖及第2圖。再者，所培養之HeLa細胞的球體之形狀示於第3圖。

[參考試驗例3：將附著於微載體上之細胞株進行培養時之細胞增殖試驗]

將微載體Cytodex(註冊商標)1(GE Healthcare Life Sciences公司製)以成為0.02g/mL之方式懸浮於PBS中並靜置1晚後，捨棄上清液，並利用新的PBS將本微載體洗淨2次。然後，再度利用PBS以成為0.02g/mL之方式使其懸浮，並在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌。繼而，將本微載體以70%乙醇洗淨2次，以PBS洗淨3次後，以成為0.02g/mL之方式懸浮於包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)中。使用本微載體懸浮液，調製包含120mg之Cytodex(註冊商標)1及4000000個HepG2細胞的DMEM培養基(含有10%(v/v)胎牛血清)20mL，將本細胞懸浮液於預先經矽塗覆劑(旭Techno Glass公司製)處理之燒杯中在37℃一邊利用攪拌子進行攪拌(100rpm)、一邊進行培養6小時。此處，以顯微鏡確認HepG2細胞係黏著於微載體。繼而，將黏著有細胞之微載體以包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基洗淨2次，並懸浮於相同培養基3mL中。

在包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基20mL或在本培養基中添加0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠 (KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)而成之培養基組成物中，分別添加上述微載體懸浮液300μL，在37℃培養3日。此時，不含脫醯化結冷膠的培養液係一邊利用攪拌子進行攪拌(100rpm)、一邊進行培養。培養後，以顯微鏡確認微載體上的細胞之附著狀態後，利用離心處理(200G，5分鐘)使微載體沉降。利用PBS 10mL將本微載體洗淨後，添加1mL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫5分鐘。再者，添加包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基9mL後，使用篩網尺寸70μm之細胞濾網(BD Falcon公司製)除去微載體。藉由離心處理(200G，5分鐘)從此處所獲得之濾液中回收細胞。將本細胞懸浮於500μL之培養基中，對其一部分同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。其結果，不含脫醯化結冷膠的培養液包含123,000個細胞，而包含脫醯化結冷膠的培養液則包含1,320,000個細胞。如上述，確認到包含該特定化合物之構造體的培養基組成物係即便使用微載體實施細胞培養，相較於既存的培養基而言，細胞增殖的促進效果仍較優異。使用包含該特定化合物之構造體的培養基組成物來實施微載體培養3日時之HepG2細胞之附著狀態示於第4圖。

[參考試驗例4：使用來自細胞株之球體之細胞浮游試驗]

將黃原膠(KELTROL CG，三晶股份公司製)以成為1%(w/v)的濃度之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一 邊在90℃進行加熱一邊拌而予以溶解。使用本水溶液，調製使黃原膠最終濃度為0.1、0.15、0.2%(w/v)之DMEM/F-12培養基組成物。又，藉由在90℃進行加熱而調製包含0.2%(w/v)之κ-鹿角菜膠(GENUGEL WR-80-J，三晶股份公司製)及0.2%(w/v)之刺槐豆膠(GENUGUM RL-200-J，三晶股份公司製)的水溶液，使用本水溶液，調製包含0.03、0.04、0.05%(w/v)之κ-鹿角菜膠及刺槐豆膠的DMEM/F-12培養基(Sigma公司製)組成物。

使用與參考試驗例2同樣的方法作成HeLa細胞的球體，在上述所調製之培養基1mL中分別添加數10個球體後，在37℃靜置1小時，以目視觀察球體細胞之浮游狀態。其結果，確認到HeLa細胞的球體在所有上述培養基組成物中皆維持於浮游狀態。再者，確認到在本細胞懸浮液中添加等量之培養基後，藉由離心處理(300至400G，5分鐘)，HeLa細胞的球體便會沉降，即可進行回收。在該培養基組成物中培養HeLa細胞的球體時之浮游狀態分別示於第5圖。又，利用與分析例1同樣的方法所測定之黏度示於表7、8。

[參考試驗例5：使用經過濾器過濾的培養基組成物之細胞浮游試驗]

使用與參考試驗例2同樣的方法調製含有0.015%之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)的DMEM/F-12培養基組成物。繼而，將本培養基組成物1mL使用70μm、40μm之過濾器(BD Falcon公司製)、30μm、20μm之過濾器(As One公司製)、10μm之過濾器(Partec公司製)、5μm、1.2μm、0.45μm、0.2μm之過濾器(Sartorius Stedim Japan公司製)分別進行過濾。對上述濾液添加約數十個經使用與參考試驗例2同樣的方法作成之HepG2細胞的球體後，在37℃靜置1小時，以目視觀察球體細胞之浮游狀態。其結果，確認到HepG2細胞的球體在通過10μm以上之過濾器的培養基組成物中是維持於浮游狀態，但在通過5μm以下之過濾器之培養基組成物中會發生沉澱。再者，確認到此處呈浮游狀態之HepG2細胞的球體係藉由在室溫實施300G、5分鐘之離心處理，或添加等量的培養基後在室溫實施200G、5分鐘之離心處理便會發生沉降， 即可進行回收。

[參考試驗例6：球體形成試驗]

使用與參考試驗例2同樣的方法調製含有0.01%之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)及10%(v/v)胎牛血清的EMEM培養基(WAKO公司製)之組成物。繼而，將HeLa細胞以成為1000個/mL的濃度之方式進行添加後，分注至24孔盤(Corning公司製)中。將本盤在37℃浮游靜置培養9日後，以顯微鏡確認球體的形成。再者，藉由300G、5分鐘之離心處理使球體細胞沉降，以PBS 5mL洗淨1次後，添加100μL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，並在37℃保溫5分鐘。對此處所獲得之細胞懸浮液100μL添加包含10%(v/v)胎牛血清的EMEM培養基100μL，對其一部分的細胞懸浮液，同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。其結果，確認到HeLa細胞增加至170000個/mL。在該培養基組成物中形成之HeLa細胞的球體示於第6圖。

[參考試驗例7：構造體之光學顯微鏡觀察]

使脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)以成為0.4%(w/v)之方式懸浮於純水中後，在90℃加熱攪拌並使其溶解。在300mL高型燒杯中裝入2倍濃度之DMEM/F-12培養基(Aldrich公司製)95mL，在室溫一邊以磁力攪拌器進行攪拌、一邊添加脫醯化結冷膠水溶液5mL，藉由持續保持5分鐘攪拌而調製脫醯化結冷膠最終 濃度0.02%培養基組成物。再者，將該培養基組成物藉由均質攪拌器(3000rpm)攪拌5分鐘。藉由光學顯微鏡(KEYENCE公司，BIOREVO BZ-9000)觀察所調製之培養基組成物。所觀察之構造體示於第7圖。

[參考試驗例8：經由粉培養基與DAG之混合過熱而進行調製]

將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)20mg、及DMEM/F-12培養基(Life Technologies公司製)1.58g裝入200mL三角燒瓶中，注入純水100mL。在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌，調製脫醯化結冷膠濃度為0.02%之DMEM/F-12培養基組成物。在所調製之培養基中，添加葡聚糖珠粒Cytodex1(尺寸200μm，GE Healthcare Life Sciences公司製)，以目視確認珠粒之分散狀態。將浮游分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估。結果示於表9。

[參考試驗例9：將多醣類混合而成之培養基組成物之調製]

將黃原膠(KELTROL CG，三晶股份公司製)以成為0.5%(w/v)的濃度之方式懸浮於純水中後，藉由一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解。同樣地，針對海藻酸鈉(Duck海藻酸NSPM，Food Chemifa製)、刺槐豆膠(GENUGUM RL-200-J，三晶股份公司製)、κ-鹿角菜膠(GENUGEL WR-80-J，三晶股份公司製)、迪特膠(KELCO CRETE DG-F，三晶股份公司製)，製作0.5%(w/v)的水溶液。

將本水溶液與0.2或0.1%(w/v)脫醯化結冷膠溶液與10倍濃度之DMEM/F-12培養基進行混合，在80℃過熱30分鐘。放冷至室溫後，添加7.5%碳酸氫鈉水溶液，調製含有最終濃度0.01、0.02%(w/v)之脫醯化結冷膠及最終濃度0.1、0.2、0.3、0.4%(w/v)之其他多醣的DMEM/F-12培養基組成物。又，與前述同樣地調製包含脫醯化結冷膠的培養基後，添加甲基纖維素(cP400，WAKO股份公司製)的粉末。在冰浴中進行攪拌，使甲基纖維素溶解，調製含有最終濃度0.01、0.02%(w/v)之脫醯化結冷膠及最終濃度0.1、0.2、0.3、0.4%(w/v)之其他甲基纖維素的DMEM/F-12培養基組成物。

在上述所調製之培養基中，添加聚苯乙烯珠粒(尺寸500至600μm，Polysciences Inc.製)，以目視確認珠粒之分散狀態。將浮游分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估。結果示於表10。

[參考試驗例10：混合有多醣類之培養基組成物之黏度測定]

利用與參考試驗例9之多醣混合系統同樣的方法，調製包含最終濃度為0.005、0.01%(w/v)之脫醯化結冷膠及其他多醣的DMEM/F-12培養基。多醣係以最終濃度為黃原膠、海藻酸鈉、刺槐豆膠是0.1%(w/v)、甲基纖維素是0.2%(w/v)、κ-鹿角菜膠及迪特膠是0.05%(w/v)之方式調製。各培養基組成物之狀態及以與分析例1同樣的方法所測定之黏度係示於表11至16。

[參考試驗例11：變更2價金屬陽離子濃度而成之培養基組成物之調製]

使用不含氯化鈣、硫酸鎂、氯化鎂的DMEM/F-12(D9785，Aldrich製)，與參考試驗例8之方法同樣地調製包含0.02%(w/v)之脫醯化結冷膠的DMEM/F-12培養基組成物。又，調製以最終濃度成為DMEM/F-12培養基的規定量之方式添加氯化鈣或硫酸鎂、氯化鎂而成之DMEM/F-12培養基組成物。由DMEM/F-12培養基的規定組成，各自之最終濃度係設為氯化鈣0.116g/L、硫酸鎂0.049g/L、氯化鎂0.061g/L。

在所調製之培養基組成物中添加葡聚糖珠粒Cytodex1(GE Healthcare Life Sciences公司製)，在2日後以目視確認 珠粒之分散。將浮游分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估。結果示於表17。

[參考試驗例12：後添加2價金屬陽離子而成之培養基組成物之調製]

調製使0.1%(w/v)脫醯化結冷膠溶液及5倍濃度之DMEM/F-12培養基(不含氯化鈣、硫酸鎂、氯化鎂，D9785，Aldrich製)、氯化鈣1167mg、硫酸鎂489mg、氯化鎂287mg溶解於純水300mL中而成之鹽溶液。在200mL之高型燒杯中裝入脫醯化結冷膠水溶液及純水，使用錨型攪拌葉片以200rpm攪拌溶液。添加將培養基液與水進行混合而成之A液，保持攪拌10分鐘。其次，添加鹽溶液，進而添加7.5%碳酸氫鈉水溶液1.6mL，調製包含最終濃度0.02%之脫醯化結冷膠的DMEM/F-12培養基組成物。各液之混合量係示於表中。在調製4小時後，針對6支培養基組成物，施行聚苯乙烯珠粒及Cytodex1之分散評估。結果示於表18、19。

[參考試驗例13：各種培養基組成物之調製]

調製0.1%(w/v)脫醯化結冷膠溶液及高濃度之培養基液。高濃度之培養基液係調製10倍濃度之MEM(M0268，Aldrich製)、RPMI-1640(R6504，Aldrich製)及5倍濃度之 DMEM(高壓滅菌對應培養基，Nissui製)。將0.1%(w/v)脫醯化結冷膠溶液與各高濃度培養基、濃度調整用純水進行混合，在80℃過熱30分鐘。放冷至室溫後，添加7.5%碳酸氫鈉水溶液，分別調製含有最終濃度0.01、0.02、0.03%(w/v)之脫醯化結冷膠的培養基組成物。

針對所調製之9支培養基組成物，將聚苯乙烯珠粒及葡聚糖珠粒Cytodex1之浮游分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估。結果示於表20、21。

[參考試驗例14：包含脫醯化結冷膠的培養基組成物之粒度分佈測定]

仿效參考例1，調製包含0.038%(w/v)之脫醯化結冷膠的DMEM/F-12培養基組成物。培養基係使用均質攪拌器以3000rpm及6000rpm攪拌1分鐘而調製。針對本培養基組成物之粒度分佈，係使用Beckman Coulter(株)製Multisizer 4(利用庫爾特原理之精密粒度分佈測定裝置)進行測定，求出體積基準粒度分佈之中徑(d50)。結果示於表22。

[參考試驗例15：脫醯化結冷膠之磷酸化]

在玻璃製之100mL試驗管中，秤取脫醯化結冷膠1g及純水40mL，在100℃加熱30分鐘，調製懸浮液。在此懸浮液中，添加磷酸水溶液(85%)1g，加熱回流5小時。然後，將經一邊攪拌12小時一邊放冷至室溫所獲得之白色懸浮液注入至99%乙醇(500mL)中。將所產生之綿狀白色固體進行過濾後，使其乾燥，而獲得呈脫醯化結冷膠之磷酸化物形式之淡褐色固體(0.4g)。是否導入有磷酸基，係可藉由傅立葉轉換紅外分光分析(島津製作所股份公司製，IR-Prestage 21)進行確認(1700cm-1；P-OH，1296cm-1，1265cm-1；P=O)。將淡褐色固體藉由微波加熱分解裝置 (ETHOS TC，Milestone General製)予以分解後，藉由感應耦合電漿發光分光分析裝置(ICP-OES)(SPS 5520，SII Nanotechnology公司製)測定磷原子的含有率，結果為3.5wt%(n=2)。

[參考試驗例16：包含經磷酸化之脫醯化結冷膠的培養基組成物之調製]

將任意量之經磷酸化之脫醯化結冷膠(30mg)、及DMEM/F-12培養基(Life Technologies公司製)1.56g裝入200mL三角燒瓶中，注入純水100mL。在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌，調製脫醯化結冷膠濃度為0.03%之DMEM/F-12培養基組成物。在所調製之培養基中，添加葡聚糖珠粒Cytodex1(GEHealthcare Bioscience公司製)，以目視確認珠粒之分散狀態。在0.03%(w/v)之經磷酸化之脫醯化結冷膠濃度中，可辨認出珠粒之分散狀態。

[參考試驗例17：包含脫醯化結冷膠的培養基組成物之調製]

依下表中所示之比例添加脫醯化結冷膠水溶液及培養基溶液而進行混合，評估調製脫醯化結冷膠濃度為0.02%之DMEM/F-12培養基組成物時之聚苯乙烯珠粒(尺寸500至600μm，Polysciences Inc.製)之分散狀態。結果示於表23、24。藉由靜置1日以上，在所有條件下，苯乙烯珠粒係分散。

[參考試驗例18：使用過濾器的培養基組成物之調製]

將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)以最終濃度成為0.02或0.04%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由在90℃加熱30分鐘或在121℃加熱20分鐘而予以溶解。再者，將本水溶液100mL以孔徑為0.22μm之聚醚碸製膜片過濾器(Corning公司製)進行過濾。繼而，將本濾液與2至4倍濃度之DMEM/F-12培養基(Sigma-Aldrich公司製)進行混合後，以輕度混合器(SI-24，Taitech公司製)震盪1小時，分別調製包含最終濃度0.01或0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠的培養基組成物(例如，將0.02%(w/v)脫醯化結冷膠水溶液與2倍濃度之DMEM/F-12培養基逐步混合25mL，調製0.01%(w/v)之脫醯化結冷膠培養基組成物50mL)。使用與參考試驗例2同樣的方法作成HepG2細胞的球體，在上述所調製之培養基1mL中分別添加數10個球體後，在37℃靜置，以目視觀察1小時及1晚後之球體細胞之浮游狀態。其結果，確認到HepG2細胞的球體在所有上述培養基組成物中皆維持於浮游狀態。再者，確認到在所有培養基組成物中，在添加2倍容量之培養基後，藉由將本細胞懸浮液進行離心處理(500G，5分鐘)，HepG2細胞的球體便會沉降，細胞係可進行回收。以目視確認1晚後之球體之分散狀態時，將浮游分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估。結果示於表25。

[參考試驗例19：將來自細胞株之球體進行培養時之細胞增殖試驗]

將人類胎兒腎細胞株HEK293(DS Pharma Biomedical公司製)以成為250000個/mL之方式懸浮於包含10%(v/v)胎牛血清的EMEM培養基(WAKO公司製)中，將本懸浮液10mL接種至EZ SPHERE(旭硝子公司製)中後，於CO₂保溫箱(5% CO₂)內培養2日。將此處所獲得之HEK293細胞的球體(直徑100至200μm)的懸浮液10mL進行離心處理(200G，5分鐘)而使球體沉降並去除上清液後，懸浮於1mL中。繼而，在本球體懸浮液200μL(細胞數約200000個)中添加上述培養基10mL而使其懸浮後，移至平底試管(BM 機器公司製)中。同樣地，使用在上述培養基中添加0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)而成之培養基組成物，作成球體的懸浮液，移至平底試管(BM機器公司製)中。尚且，添加有0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠而成之培養基組成物，係可藉由先將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)以成為0.3%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解，並將本水溶液在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌後，以1/20稀釋添加至包含10%(v/v)胎牛血清的EMEM培養基中，而調製之。

在37℃於CO₂保溫箱(5% CO₂)內將上述球體懸浮液靜置培養5日後，藉由添加2倍容量之培養基並施行離心處理(500G，5分鐘)而使球體沉降，並去除上清液。繼而，將所回收之球體以PBS 10mL洗淨1次後，添加1mL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫5分鐘。添加上述培養基9mL後，藉由離心處理(500G，5分鐘)將細胞進行回收。對此處所獲得之細胞懸浮液2mL的一部分，同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞及死細胞數。尚且，作成不含脫醯化結冷膠的培養基組成物作為對照，施行同樣的實驗。

其結果，確認到HEK293細胞的球體係能夠藉由使用該培養基組成物而以浮游狀態進行培養，且利用該培養基組成物，細胞係效率良好地進行增殖。而且，確 認到該培養基組成物係相較於不含脫醯化結冷膠的培養基而言，使細胞增殖時死細胞的比例較少，細胞增殖的促進效果優異。此時，利用既存的培養基所培養之球體係沉降於培養容器的底面。

關於HEK293細胞，以不含脫醯化結冷膠的培養基進行培養時之細胞數設為1時之相對細胞數示於表26。又，以不含脫醯化結冷膠的培養基進行培養時之死細胞率(死細胞數/活細胞數)設為1時之相對死細胞率示於表27。

[參考試驗例20：將昆蟲細胞進行培養時之細胞增殖試驗]

將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)以成為0.3%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解，將本水溶液在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌。使用本溶液，調製在 Sf-900(註冊商標)IIISFM培養基(Gibco公司製)中添加最終濃度0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠而成之培養基組成物。繼而，將來自Spodoptera frugiperda之Sf9細胞(Gibco公司製)以成為100000細胞/mL之方式接種至上述經添加脫醯化結冷膠而成之培養基組成物中後，以每1孔成為1mL之方式分注至24孔平底微板(Corning公司製)之孔中。將此等細胞懸浮液於保溫箱內在25℃靜置培養5日。然後，回收培養液的一部分，同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。尚且，作成不含脫醯化結冷膠的培養基組成物作為對照，施行同樣的實驗。

其結果，確認到Sf9細胞能夠藉由使用該培養基組成物而以浮游狀態均勻地進行培養，且利用該培養基組成物進行增殖。再者，確認到該培養基組成物係相較於不含脫醯化結冷膠的培養基而言，使細胞增殖時細胞增殖的促進效果優異。浮游靜置培養5日後之Sf9細胞的細胞數示於表28。

[參考試驗例21：將CD34陽性細胞進行培養時之細胞增殖試驗]

將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)以成為0.3%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解，將本水溶液在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌。使用本溶液，調製在StemSpan SFEM培養基(StemCell Technologies公司製)中添加最終濃度0.015%(w/v)之脫醯化結冷膠、20ng/mL之血小板生成素(WAKO公司製)及100ng/mL之幹細胞因子(SCF，WAKO公司製)而成之培養基組成物。繼而，來自人類臍帶血之CD34陽性細胞(Lonza公司製)以成為10000細胞/mL之方式接種至上述經添加脫醯化結冷膠而成之培養基組成物中後，以每1孔成為1mL之方式分注至24孔平底微板(Corning公司製)之孔中。將此等細胞懸浮液在37℃於CO₂保溫箱(5% CO₂)內靜置培養7日。然後，回收培養液的一部分，同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。又，藉由在剩餘的培養液中添加3倍容量之培養基並施行離心處理(500G，5分鐘)而使所有細胞沉降。尚且，作成不含脫醯化結冷膠的培養基組成物作為對照，施行同樣的實驗。

其結果，確認到CD34陽性細胞係能夠藉由使用該培養基組成物而以浮游狀態均勻地進行培養，且利用該培養基組成物進行增殖。再者，確認到該培養基組成物係相較於不含脫醯化結冷膠的既存的培養基而言，具有同等以上之細胞增殖促進效果。又，確認到藉由離心處理，細胞便會沉降，細胞即可進行回收。將以不含脫醯化結冷 膠的培養基進行培養時之細胞數設為1時，在浮游靜置培養7日後由CD34陽性細胞所增殖之細胞之相對細胞數示於表29。

[參考試驗例22：球體形成試驗]

使用與參考試驗例2同樣的方法，調製含有0.015%之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)及10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)之組成物。繼而，將HepG2細胞以成為15000個/mL的細胞濃度之方式進行添加後，分注1mL至24孔盤(Corning公司製)中。將本盤在37℃浮游靜置培養7日後，以顯微鏡確認球體的形成。再者，藉由400G、5分鐘之離心處理而使球體細胞沉降，PBS 5mL洗淨1次後，添加100μL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫5分鐘。對此處所獲得之細胞懸浮液100μL添加包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基100μL，對其一部分的細胞懸浮液，同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。其結果，確認到HepG2細胞係在該培養基組成物形成球體，且細胞數亦增加至80800個/mL。在該培養基組成物中形成之 HepG2細胞的球體示於第8圖。

[參考試驗例23：使用來自細胞株之球體之細胞浮游試驗]

將迪特膠(KELKO-CRETE DG，三晶股份公司製)以成為0.3%(w/v)的濃度之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解。使用本水溶液，調製使迪特膠最終濃度為0.1%(w/v)之DMEM/F-12培養基組成物。又，藉由在90℃進行加熱而調製包含0.5%(w/v)之天然型結冷膠(KELCOGEL HT，三榮源FFI股份公司製)的水溶液，使用本水溶液調製包含0.05、0.1%(w/v)之天然型結冷膠的DMEM/F-12培養基(Sigma公司製)組成物。

使用與參考試驗例2同樣的方法作成HeLa細胞的球體，在上述所調製之培養基1mL中分別添加數10個球體後，在37℃靜置1小時，以目視觀察球體細胞之浮游狀態。其結果，確認到HeLa細胞的球體在所有上述培養基組成物中皆維持於浮游狀態。再者，確認到藉由將包含0.1%(w/v)之迪特膠的本細胞懸浮液進行離心處理(200G，5分鐘)，HeLa細胞的球體便會沉降，細胞即可進行回收。

[參考試驗例24：使用具有細胞黏著能力的磁性珠粒之細胞浮游試驗1]

將經層黏蛋白或纖連蛋白塗覆之GEM(註冊商標，Global Eukaryotic Microcarrier，GL Sciences股份公司製) 懸浮溶液以每500μL逐步分注至1.5mL容量之微試管(Eppendorf公司製)中，使用磁石台架(TA4899N12，多摩川精機股份公司製)從上述GEM懸浮溶液中使GEM聚集並除去溶媒。再者，藉由含有10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)500μL將GEM洗淨2次後，懸浮於同上培養基500μL。將本懸浮液每1孔分注50μL至作為細胞低黏著盤之Sumilon Celltight Plate 24F(住友Bakelite股份公司製)中。繼而，以成為250000細胞/mL之方式添加另行調製之HepG2細胞，以同上培養基使最終容量成為500μL/孔。將本細胞懸浮液以手動攪拌後，將本盤於CO₂保溫箱(5% CO₂)內靜置一晚。以顯微鏡確認在GEM上的細胞之黏著後，將細胞懸浮液移至1.5mL容量之微試管(Eppendorf公司製)中，使用上述磁石台架使附著細胞的GEM聚集並除去上清液。

使用與參考試驗例2同樣的方法，調製含有0.015%之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)及10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)之組成物。分別將本培養基組成物或不含脫醯化結冷膠的同上培養基1mL添加至上述所調製之附著有HepG2細胞的GEM(層黏蛋白或纖連蛋白塗覆)中，使其懸浮後，移至Sumilon Celltight Plate 24F中。繼而，將本盤於CO₂保溫箱(5% CO₂)內靜置6日後，將細胞培養液移至1.5mL容量之微試管(Eppendorf公司製)中，一邊緩慢地吸量至上述磁石台架上、一邊使附著細胞的GEM聚集並除去上清液。將本 GEM以PBS 1mL洗淨1次，添加200μL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫10分鐘。對此處所獲得之細胞懸浮液200μL添加包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基800μL，對其一部分的細胞懸浮液，同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。

其結果，確認到黏著有HepG2細胞之GEM能夠藉由使用該培養基組成物而以浮游狀態進行培養，且利用該培養基組成物，細胞係效率良好地進行增殖。而且，確認到該培養基組成物係相較於不含脫醯化結冷膠的既存的培養基而言，細胞增殖的促進效果優異。又，確認到能夠藉由使用磁力而從該培養基組成物中使附著有HepG2細胞的GEM聚集，進一步可從本GEM中回收HepG2細胞。

以含有或非含有脫醯化結冷膠的培養基將HepG2細胞在GEM上培養6日時之細胞數示於表30。又，將附著有HepG2細胞之塗覆層黏蛋白的GEM利用該培養基組成物進行培養時之浮游狀態示於第9圖。

[參考試驗例25：使用具有細胞黏著能力的 磁性珠粒之細胞浮游試驗2]

與參考試驗例24同樣地，將經纖連蛋白塗覆之GEM(註冊商標，Global Eukaryotic Microcarrier，GL Sciences股份公司製)懸浮於MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡股份公司製)中。將本懸浮液每1孔分注50μL至作為細胞低黏著盤之Sumilon Celltight Plate 24F(住友Bakelite股份公司製)中。繼而，以成為250000細胞/mL之方式添加另行調製之來自人類骨髓之間葉系幹細胞(Cell Applications公司製)，與參考試驗例24同樣地，使本盤於CO₂保溫箱(5% CO₂)內靜置一晚，調製黏著有間葉系幹細胞之GEM。

使用與參考試驗例2同樣的方法，調製含有0.015%之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)的MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡股份公司製)之組成物。分別將本培養基組成物或不含脫醯化結冷膠的同上培養基1mL添加至上述所調製之附著有間葉系幹細胞的GEM(纖連蛋白塗覆)中，使其懸浮後，移至Sumilon Celltight Plate 24F中。繼而，將本盤於CO₂保溫箱(5% CO₂)內靜置4日後，將細胞培養液移至1.5mL容量之微試管(Eppendorf公司製)中，一邊緩慢地吸量至上述磁石台架上、一邊使附著細胞的GEM聚集並除去上清液。將本GEM以PBS 1mL洗淨1次，添加200μL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫10分鐘。對此處所獲得之細胞懸浮液200μL添加包含 10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基800μL，對其一部分的細胞懸浮液同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。

其結果，確認到黏著有間葉系幹細胞之GEM能夠藉由使用該培養基組成物而以浮游狀態進行培養，且利用該培養基組成物，細胞係效率良好地進行增殖。而且，確認到該培養基組成物係相較於不含脫醯化結冷膠的既存的培養基而言，細胞增殖的促進效果優異。又，確認到能夠藉由使用磁力而從該培養基組成物中使附著有間葉系幹細胞的GEM聚集，進一步可從本GEM中回收間葉系幹細胞。

以含有或非含有脫醯化結冷膠的培養基將間葉系幹細胞在GEM上培養4日時之細胞數示於表31。

[參考試驗例26：使用海藻酸珠粒之細胞浮游試驗]

以下試驗係以PG Research股份公司製海藻酸三次元培養套組之方法為基準而實施。將另行調製之HepG2細胞以成為400000細胞/mL之方式添加至海藻酸鈉溶液(PG Research股份公司製)2.5mL中，進而以成為5μg/mL之方 式添加人類重組層黏蛋白511(Veritas股份公司製)，調製細胞懸浮液。針對本細胞懸浮液，以安裝有探針之5mL注射器(Terumo股份公司製)進行回收後，於本注射器安裝22G注射針(Terumo股份公司製)。繼而，對分別添加有氯化鈣水溶液(PG Research股份公司製)2mL之24孔平底微板(PG Research股份公司製)之孔，各添加本細胞懸浮液10滴。在室溫靜置10分鐘之後確認海藻酸珠粒之形成後，除去氯化鈣溶液，添加PBS 2mL並在室溫靜置15分鐘。再者，除去PBS後，添加包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)2mL並在室溫靜置15分鐘。除去培養基後，分別將使用與參考試驗例2同樣的方法所調製之含有0.03%之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)及10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)之培養基組成物或不含脫醯化結冷膠的同上培養基1mL添加至各孔中，於CO₂保溫箱(5% CO₂)內靜置培養8日。尚且，培養基更換係在培養第4日實施。

將所培養之海藻酸珠粒使用1mL容量之吸頭移至1.5mL容量之微試管(Eppendorf公司製)中後，將檸檬酸鈉溶液(PG Research股份公司製)1mL添加至各試管中，在室溫攪拌15分鐘而使海藻酸珠粒溶解。繼而，藉由300G、3分鐘之離心處理而使細胞沉降，並除去上清液。對本細胞添加200μL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫5分鐘。對此處所獲得之細胞懸浮液200μL添加包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM 培養基800μL，對其一部分的細胞懸浮液，同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。

其結果，確認到包埋有HepG2細胞之海藻酸珠粒能夠藉由使用該培養基組成物而以浮游狀態進行培養，且利用該培養基組成物，細胞係效率良好地進行增殖。而且，確認到該培養基組成物係相較於不含脫醯化結冷膠的既存的培養基而言，細胞增殖的促進效果優異。

以含有或非含有脫醯化結冷膠的培養基將HepG2細胞在海藻酸珠粒內培養8日時之細胞數示於表32。又，將包埋有HepG2細胞之海藻酸珠粒利用該培養基組成物進行培養時之浮游狀態示於第10圖。

[參考試驗例27：使用膠原蛋白凝膠膠囊之細胞浮游試驗]

將A：組織培養用膠原蛋白Cellmatrix(註冊商標)Type I-A(細胞基質，新田明膠股份公司製)、B：10倍濃度之DMEM/F-12培養基(Aldrich公司製)、C：再構成用緩衝液(在0.05N氫氧化鈉溶液100mL中添加碳酸氫鈉2.2g，HEPES(添加4-(2-羥乙基)-1-哌

乙磺酸))4.77g並經過濾滅菌者) 分別一邊在水中冷卻一邊以成為A：B：C=8：1：1之方式進行混合。再者，以成為5μg/mL之方式添加人類重組層黏蛋白511(Veritas股份公司製)，調製膠原蛋白混合溶液500μL。對本混合溶液，以成為200000細胞/mL之方式添加另行調製之HepG2細胞，並使用安裝有25G注射針(Terumo股份公司製)之1.5mL注射器(Terumo股份公司製)回收全量。繼而，對預先在37℃保溫之添加有含有10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)10mL之平底試管(BM機器公司製)，使用上述注射器逐步滴加1滴細胞懸浮液。在37℃水浴中保溫10分鐘，確認直徑2mm左右之不定形的膠原蛋白凝膠膠囊之形成後，利用與參考試驗例2同樣的方法，以最終濃度成為0.04%之方式添加脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)，輕輕攪拌而使上述膠囊浮游。繼而，於CO₂保溫箱(5% CO₂)內將本試管靜置培養5日。

對包含膠原蛋白凝膠膠囊的培養液添加PBS 25mL，藉由400G、5分鐘之離心處理而使膠原蛋白凝膠膠囊沉降，並除去上清液。再度添加PBS 25mL並施行離心處理，以殘量成為5mL之方式除去上清液。對本液添加1%(W/V)之膠原蛋白酶L(新田明膠股份公司製)20μL後，在37℃震盪2小時。確認膠原蛋白凝膠之溶解後，添加PBS 10mL，藉由400G、5分鐘之離心處理而使細胞沉降，並除去上清液。對本細胞添加1mL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫5分鐘。對此 處所獲得之細胞懸浮液添加包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基4mL，藉由400G、5分鐘之離心處理而使細胞沉降，並除去上清液。將所獲得之細胞懸浮於2mL之同上培養基中，對其一部分同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。

其結果，確認到包埋有HepG2之膠原蛋白凝膠膠囊能夠藉由使用該培養基組成物而以浮游狀態進行培養，且利用該培養基組成物，細胞係效率良好地進行增殖。而且，確認到該培養基組成物係相較於不含脫醯化結冷膠的既存的培養基而言，細胞增殖的促進效果優異。

以含有或非含有脫醯化結冷膠的培養基將HepG2細胞在膠原蛋白凝膠膠囊內培養5日時之細胞數示於表33。又，將包埋有HepG2細胞之膠原蛋白凝膠膠囊利用該培養基組成物進行培養時之浮游狀態示於第11圖。

[參考試驗例28：使用過濾器的球體之回收試驗]

使用與參考試驗例2同樣的方法，調製含有0.015%之脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)及10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)之組成物。又，調製不含脫醯化結冷膠的同上培養基作為對照。使用與參考試驗例2同樣的方法作成HepG2細胞的球體，在上述所調製之培養基1mL中分別以成為86000個的細胞數之方式添加球體後，在37℃靜置1小時，以目視觀察球體細胞之浮游狀態。再者，在篩網尺寸為40μm之細胞濾網(Becton Dickinson公司製)上添加本細胞懸浮液，將球體捕捉至過濾器上。繼而，藉由從過濾器的背面使PBS 10mL流入而將球體回收至15mL試管中，並以300G、5分鐘之離心處理而使球體沉降。除去上清液後，對球體添加500μL之胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四醋酸)溶液(WAKO公司製)，在37℃保溫5分鐘。對此處所獲得之細胞懸浮液添加包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基1mL，對其一部分同量添加台盼藍染色液(Invitrogen公司製)後，以血球計算板(ERMA販賣股份公司製)測定活細胞數。其結果，確認到HepG2細胞的球體在上述培養基組成物中是維持於浮游狀態。再者，確認到藉由將包含0.015%之脫醯化結冷膠的本球體懸浮液進行過濾器處理，使HepG2細胞的球體可以與不含脫醯化結冷膠的培養基同等的回收率將細胞進行回收。將使用不含脫醯化結冷膠的培養基經過濾器回收之HepG2細胞數設為1時，從包含脫醯化結冷膠的培養基所回收之相對細胞數示於表34。

[參考試驗例29：使用各種多醣類之混合劑的球體之細胞浮游試驗]

使用與參考試驗例9同樣的方法，調製將黃原膠(KELTROL CG，三晶股份公司製)、海藻酸鈉(Duck海藻酸NSPM，Food Chemifa製)、刺槐豆膠(GENUGUM RL-200-J，三晶股份公司製)、甲基纖維素(cP400，WAKO股份公司製)、κ-鹿角菜膠(GENUGEL WR-80-J，三晶股份公司製)、果膠(GENU pectin LM-102AS，三晶股份公司製)或迪特膠(KELCO CRETE DG-F，三晶股份公司製)及脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)進行組合並混合而成之DMEM/F-12培養基組成物。使用與參考試驗例2同樣的方法作成HepG2細胞的球體，在上述所調製之培養基1mL中分別添加數10個球體後，在37℃靜置，以目視觀察1小時及1晚後之球體細胞之浮游狀態。其結果，確認到HepG2細胞的球體在所有上述培養基組成物中皆維持於浮游狀態。再者，確認到在所有培養基組成物中，在添加2倍容量之培養基後，藉由將本細胞懸浮液進行離心處理(500G，5分鐘)，HepG2細胞的球體便會沉降，細胞即可進行回收。以目視確認1晚後之球體之分散狀態時，將浮游 分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估之結果示於表35及表36。尚且，表中之-表示未實施。

[珠粒與細胞之分散性比較1]

針對上述(比較例)所調製之含有脫醯化結冷膠的培養基及含有甲基纖維素的培養基，將葡聚糖珠粒Cytodex(註冊商標)1(GE Healthcare Life Sciences公司製)與HeLa細胞球體之分散狀態進行比較。結果示於表中。由於Cytodex1與HeLa細胞球體之分散狀態係極為相關，因而可使用Cytodex1作為細胞球體模型。

[珠粒與細胞之分散性比較2]

針對參考試驗例9所調製之含有多醣及脫醯化結冷膠的培養基，將聚苯乙烯珠粒(尺寸500至600μm，Polysciences Inc.製)與HepG2細胞球體之分散狀態進行比較。將浮游分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估。結果示於表中。由於聚苯乙烯珠粒與HepG2細胞球體之分散狀態係極為相關，因而可使用聚苯乙烯珠粒作為細胞球體模型。

[參考試驗例30：來自水稻之植物癒傷組織之浮游培養試驗]

將經鹽水選種所精選之水稻日本晴的完熟種子(由湖東農業協同組合購入)50粒移至50mL聚苯乙烯試管(BD Falcon公司製)中，以滅菌水50mL洗淨後，在70%乙醇水30mL中攪拌1分鐘。除去乙醇水後，添加Kitchen Haiter(花王股份公司製)30mL，攪拌1小時。除去Kitchen Haiter後，以滅菌水50mL洗淨4次。將此處經滅菌之種子置床於包含2μg/mL之2,4-二氯苯氧基乙酸(Sigma-Aldrich公司製)及瓊脂的Murashige-Skoog基礎培養基(M9274，Sigma-Aldrich公司製)1.5mL/孔(24孔平底微板(Corning公司製))上。以30℃，16小時暗處/8小時暗處之條件培養3週，採取在種子的胚盤上所增殖之乳白色的癒傷組織(1至2mm)。

將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)以成為0.3%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，藉由一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解，將本水溶液在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌。使用本溶 液，調製在包含2μg/mL之2,4-二氯苯氧基乙酸(Sigma-Aldrich公司製)的Murashige-Skoog基礎培養基(M9274，Sigma-Aldrich公司製)中添加最終濃度0.03%(w/v)之脫醯化結冷膠而成之培養基組成物。將上述所調製之癒傷組織15個添加至本培養基組成物10mL/平底試管(BM機器公司製)中，在25℃進行震盪培養7日。其結果，確認到來自水稻之癒傷組織係能夠藉由使用該培養基組成物而以浮游狀態進行培養，利用該培養基組成物可維持癒傷組織。將來自水稻之癒傷組織利用該培養基組成物進行培養時之浮游狀態示於第12圖。

[實施例1：脫2價鹽DAG之調製方法(EDTA．2Na處理NaOH中和)]

在300mL之茄狀燒瓶中，添加脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)1.0g、乙二胺四醋酸二鈉(純正化學股份公司製)0.74g、及純水200mL並使其懸浮，在設定於110℃之油浴中，加熱30分鐘。在室溫放冷1小時後，使用1N(當量濃度)的氫氧化鈉水溶液，一邊利用pH試紙進行確認、一邊進行中和。將此中和溶液逐步少許添加至裝有200mL之異丙醇之500mL燒杯中。將所產生之浮游性固形份利用58μm之篩網進行擰絞而除去水分，使所獲得之固體在設定於50℃之真空烘箱中乾燥，而獲得目標固體0.86g。

[實施例2：脫2價鹽DAG之調製方法(EDTA．2Na處理KOH或LiOH中和)]

在300mL之茄狀燒瓶中，添加脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)1.0g、乙二胺四醋酸二鈉(純正化學股份公司製)0.74g、及純水200mL並使其懸浮，在設定於110℃之油浴中，加熱30分鐘。在室溫放冷1小時後，使用1N的氫氧化鉀或鋰水溶液，一邊利用pH試紙進行確認、一邊進行中和。將此中和溶液逐步少許添加至裝有200mL之異丙醇之500mL燒杯中。將所產生之浮游性固形份利用58μm之篩網進行擰絞而除去水分，使所獲得之固體在設定於50℃之真空烘箱中乾燥，在利用氫氧化鉀中和之情況下是獲得0.88g之白色固體，在利用氫氧化鋰中和之情況下則是獲得1.04g之白色固體。

[實施例3：脫2價鹽DAG之調製方法(氫型陽離子交換樹脂，批次式)]

在200mL之茄狀燒瓶中，添加脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)0.5g、及純水100mL並使其懸浮，在設定於110℃之油浴中，加熱30分鐘。放冷至50℃後，添加陽離子交換樹脂Dowex 50x8(Dow Chemical股份公司製)10g，一邊保持在50℃以上，一邊利用氫氧化鉀水溶液進行中和。在室溫放冷1小時後，將此中和溶液逐步少許添加至裝有200mL之異丙醇之500mL燒杯中。將所產生之浮游性固形份利用58μm之篩網進行擰絞而除去水分，使所獲得之固體在設定於50℃之真空烘箱中乾燥，而獲得目標固體0.31g。

[實施例4：脫2價鹽DAG之調製方法(鈉型 陽離子交換樹脂，管柱式)]

在填有離子交換樹脂5mL之管柱中，花費1小時使0.5%脫醯化結冷膠水溶液50mL流佈。離子交換樹脂係使用鈉型的DOWEX 50Wx8(Dow Chemical股份公司)、SUMICHELATE MC700(住化Chemtex公司製)、DUOLITE C467(住化Chemtex公司製)。將溶出液滴加至200mL之異丙醇中，藉由過濾而採取所析出之凝膠狀固體。將所產生之凝膠狀固體利用58μm之篩網進行擰絞而除去水分，使所獲得之固體在設定於50℃之真空烘箱中乾燥，而獲得白色固體。以使白色固體濃度成為1%之方式，對白色固體20mg添加超純水2mL，在室溫(25℃)進行1小時旋渦混合處理，調查對水溶解性。白色固體之產量及溶解試驗之結果示於以下。

(DUOLITE C467之金屬定量結果)

將樣品溶液進行適宜稀釋，以感應耦合電漿發光分光分析裝置(ICP-OES；SPS 5520，SII Nanotechnology公司製)進行定量。

[實施例5：脫2價鹽DAG之調製方法(鈉型陽離子交換樹脂，批次式)]

裝入0.5%脫醯化結冷膠水溶液200mL及DUOLITE C467 5mL量，一邊間歇地攪拌、一邊在70℃靜置24小時。藉由吸引過濾而除去DUOLITE C467，將濾液滴加至異丙醇中。藉由過濾所析出之凝膠狀固體而採取之，在50℃真空乾燥。以使白色固體濃度成為1%之方式，對白色固體20mg添加超純水2mL，在室溫(25℃)進行30分鐘旋渦混合處理，結果溶解。

(DUOLITE C467之金屬定量結果)

將樣品溶液進行適宜稀釋，以感應耦合電漿發光分光分析裝置(ICP-OES；SPS 5520，SII Nanotechnology公司製)進行定量。

[實施例6：脫2價鹽DAG之調製方法(鈉型陽離子交換樹脂，管柱式，經由噴霧乾燥法之乾燥)]

將脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)25g及離子交換水4975mL裝入燒杯中，加熱至95℃使其溶解，製作0.5%脫醯化結冷膠溶液。使脫醯化結冷膠溶液在填有DUOLITE C467(商品名：住化Chemtex公司製)500ml之管柱中以流速80ml/分鐘流通。將溶出液藉由Spray Dry FOC-20-LS型(大川原化工機股份公司製)進行噴霧乾燥，獲得球狀粉體。此時，脫醯化結冷膠溶液係以10kg/小時進行供給，噴霧器旋轉數設為10,000至22,000rpm，乾燥送風溫度設為130℃。以雷射繞射散射法粒度分佈計(LS13 320：Beckman Coulter公司製)進行測定，結果粉體的粒徑d50為7至12μm。

[實施例7：使用上述DAG之DMEM培養基之作成(過濾滅菌)]

使經施加實施例1之處理之脫醯化結冷膠17mg在室溫(25℃)溶解於純水100mL中。將此溶液使用滅菌過濾器(孔洞尺寸0.22μm)進行滅菌，另一方面，在DMEM的粉末培養基(Life Technologies公司)及碳酸氫鈉中，添加相當於調製培養基時之推薦值的10分之1量的純水，以10倍的濃度調製10mL水溶液後，使用滅菌過濾器(孔洞尺寸0.22μm)進行滅菌。將先前經滅菌之脫醯化結冷膠溶液90mL秤取至經滅菌之培養基瓶中，於此添加10倍濃度之DMEM培養基後，將瓶搖晃，予以充分地混合，而調製脫醯化結冷膠濃度為0.015%(w/v)之目標DMEM培養基100mL。

[實施例8：使用上述DAG之DMEM培養基之作成(高壓釜滅菌)]

使經施加實施例2之處理之脫醯化結冷膠300mg在室溫(25℃)溶解於純水20mL後，利用高壓釜(121℃，20分鐘)進行滅菌。將RPMI1640液體培養基(Life Technologies公司)198mL裝入500mL之高型燒杯中，將經高壓釜處理之先前的脫醯化結冷膠水溶液2mL一邊利用均質攪拌器進行激烈攪拌(3000rpm)、一邊進行添加。利用均質攪拌器進一步以3000rpm進行1分鐘攪拌，而調製脫醯化結冷膠濃度為0.015%(w/v)之目標RPMI1640培養基202mL。

[實施例9：使A549細胞分散時之細胞增殖試驗]

將實施例1及2所調製之2價離子除去脫醯化結冷膠 分別以成為0.3%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，一邊在37℃進行加熱、一邊使其溶解。然後，利用0.22μm直徑過濾器(Millipore公司製)進行過濾滅菌。

將本溶液添加至包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)中，藉由吸量進行混合，而調製經添加最終濃度0.015%(w/v)之上述脫醯化結冷膠而成之培養基組成物。繼而，將人類肺癌細胞株A549(DS Pharma Biomedical公司製)以成為20000細胞/mL之方式接種至上述培養基組成物中後，以每1孔成為100μL之方式分注至96孔平底超低黏著表面微板(Corning公司製，# 3474)之孔中。尚且，將A549細胞懸浮於以同濃度添加有未經2價離子除去處理之脫醯化結冷膠之培養基組成物中而成者予以分注，作為比較對象。又，將A549細胞懸浮於不含脫醯化結冷膠之同上培養基中而成者予以分注，作為陰性對照。繼而，將本盤於CO₂保溫箱(37℃，5% CO₂)內以靜置5日狀態進行培養。對培養5日後之培養液添加WST-8溶液(同仁化學研究所股份公司製)20μL後，在37℃保溫培養100分鐘，以吸光度計(Molecular Devices公司製，SPECTRA MAX 190)測定450nm之吸光度，藉由減去僅有培養基之吸光度而測定活細胞數。

其結果，確認到A549細胞能夠藉由使用本發明之培養基組成物，而在使細胞凝集塊的大小不會變得過剩之情形下，以均勻地分散之狀態進行培養，並利用該培養基組成物有效率地進行增殖。此時，在經除去2價離 子而成之脫醯化結冷膠與無處理的脫醯化結冷膠之間，關於對細胞增殖之效果並未發現差異。靜置培養5日後之450nm之吸光度(相當於A549細胞之細胞數)示於表44。又，以光學顯微鏡(OLMPUS公司製，CK30-F100)觀察細胞凝集塊，將浮游分散狀態設為○，沉降狀態設為×而進行評估之結果示於表44。

[實施例10：使A549細胞分散時之細胞增殖試驗]

將實施例4(DUOLITE C467處理)所調製之2價離子除去脫醯化結冷膠分別以成為0.3%(w/v)之方式懸浮於超純水(Milli-Q水)中後，一邊在25℃利用攪拌子進行攪拌、一邊使其溶解，利用0.22μm直徑過濾器(Millipore公司製)進行過濾滅菌。將本溶液添加至包含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基(WAKO公司製)中，藉由吸量進行混和，而調製添加有最終濃度0.015%(w/v)之上述脫醯化結冷膠而 成之培養基組成物。繼而，將人類肺癌細胞株A549(DS Pharma Biomedical公司製)以成為100000細胞/mL之方式接種至上述培養基組成物中後，以每1孔成為100μL之方式分注至96孔平底超低黏著表面微板(Corning公司製，# 3474)之孔中。尚且，將A549細胞懸浮於以同濃度添加有未經2價離子除去處理之脫醯化結冷膠之培養基組成物中而成者予以分注，作為比較對象。又，將A549細胞懸浮於不含脫醯化結冷膠之同上培養基中而成者予以分注，作為陰性對照。繼而，將本盤於CO₂保溫箱(37℃，5% CO₂)內以靜置6日狀態進行培養。對6日培養後之培養液添加ATP測定試藥(CellTiter-Glo(商標)，Promega公司製)100μL後，在25℃保溫培養15分鐘，以多板讀取器(Molecular Devices公司製，FlexStation 3)測定發光量(RLU)，藉由減去僅有培養基之RLU而測定活細胞數。

其結果，確認到A549細胞能夠藉由使用本發明之培養基組成物，而在使細胞凝集塊的大小不會變得過剩之情形下，以均勻地分散之狀態進行培養，並利用該培養基組成物有效率地進行增殖。此時，在除去2價離子而成之脫醯化結冷膠與無處理的脫醯化結冷膠之間，關於對細胞增殖之效果並未發現差異。靜置培養6日後之RLU(相當於A549細胞之細胞數)示於表45。

[實施例11：使用上述DAG及其他多醣類之培養基組成物之作成]

將黃原膠(San Ace NXG-C，三榮源股份公司製)以成為0.5%(w/v)的濃度之方式懸浮於純水中後，藉由一邊在90℃進行加熱一邊攪拌而予以溶解。同樣地，針對瓜爾膠(Bis top D-2029，三榮源股份公司製)，製作0.5%(w/v)的水溶液。將本水溶液與0.2或0.1%(w/v)之脫二價陽離子處理DAG溶液、及10倍濃度之DMEM/F-12培養基、用於濃度調製之水進行混合，在80℃過熱30分鐘。放冷至室溫後，添加7.5%碳酸氫鈉水溶液，調製含有最終濃度0.01、0.02%(w/v)之脫醯化結冷膠及最終濃度0.1、0.2、0.3、0.4%(w/v)其他多醣的DMEM/F-12培養基組成物。

[實施例12：珠粒分散試驗]

在實施例11所調製之培養基中，添加聚苯乙烯珠粒(尺寸500至600μm，Polysciences Inc.製)，以目視確認珠粒之分散狀態。將浮游分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估。

[比較例1：使用未處理DAG之培養基的製造方法(過濾滅菌)]

(含有脫醯化結冷膠的DMEM/Ham's F12培養基之作成)

使脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)120mg懸浮於純水72mL中，在90℃加熱攪拌1小時並使其溶解。於此添加純水，調製脫醯化結冷膠為0.017%(w/v)之溶液720mL後，使用滅菌過濾器(孔洞尺寸0.22μm)進行滅菌。另一方面，在DMEM/Ham's F12等量混合的粉末培養基(Life Technologies公司)及碳酸氫鈉中添加相當於培養基調製時之推薦值的10分之1量的純水，以10倍的濃度調製80mL水溶液後，使用滅菌過濾器(孔洞尺寸0.22 μm)進行滅菌。將此等於滅菌條件下，一邊在25℃進行攪拌、一邊進行混合，而調製脫醯化結冷膠濃度為0.015%(w/v)之目標培養基800mL。

[比較例2：使用未處理DAG之培養基的製造方法(高壓釜滅菌)]

(含有脫醯化結冷膠的DMEM/Ham’s F12培養基之作成)

此脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)0.30g懸浮於純水200mL中，利用高壓釜(121℃，20分鐘)進行加熱滅菌，調製脫醯化結冷膠濃度為0.015%(w/v)的水溶液。在DMEM/Ham’s F12等量混合的粉末培養基(Life Technologies公司)及碳酸氫鈉中添加相當於培養基調製時之推薦值的90%之純水，以稍高濃度調製液體培養基180mL後，使用滅菌過濾器(孔洞尺寸0.22μm)進行滅菌。一邊將此利用均質攪拌器進行激烈攪拌(3000rpm)、一邊以約10秒添加先前調製之脫醯化結冷膠水溶液20mL，進一步一邊以3000rpm進行攪拌1分鐘、一邊進行混合，而調製脫醯化結冷膠濃度為0.015%(w/v)之培養基200mL。

[實施例13：脫2價鹽DAG之調製方法(鈉型陽離子交換樹脂，批次式，同時進行DAG溶解及陽離子交換樹脂處理)]

以使脫醯化結冷膠濃度成為0.5%(w/v)之方式，在300mL之四口燒瓶中裝入脫醯化結冷膠(CG-LA，三晶股份公司)1.0g及純水200mL、螯合樹脂Duolite C467(Na)(住化 Chemtex)4mL。加溫至70℃，使用Tornado攪拌器以100rpm攪拌1小時。其次，使用桐山濾紙5B將樹脂濾除，將濾液注入至500mL之異丙醇中。將所析出之纖維狀固體進行回收，在50℃真空乾燥。然後，使用混合器進行粉碎，獲得白色粉末。又，將攪拌時之溫度設為50℃、30℃、23℃、10℃而施行同樣的操作，獲得白色固體。

[實施例14：脫2價鹽DAG之調製方法；使DAG的濃度增加之情況(鈉型陽離子交換樹脂，批次式，同時進行DAG溶解及陽離子交換樹脂處理)]

以使脫醯化結冷膠濃度成為1%(w/v)之方式，在300mL之四口燒瓶中裝入脫醯化結冷膠(CG-LA，三晶股份公司)2.0g及純水200mL、螯合樹脂Duolite C467(Na)(住化Chemtex)4mL。加溫至70℃，使用機械攪拌器在100rpm攪拌1小時。其次，使用桐山濾紙5B將樹脂濾除，將濾液注入至500mL之異丙醇中。將所析出之纖維狀固體進行回收，在50℃真空乾燥。然後，使用混合器進行粉碎，獲得白色粉末。又，將脫醯化結冷膠之量設為4.0g而施行同樣的操作，獲得白色固體。

[實施例15：脫2價鹽DAG之調製方法；增加樹脂使用量之情況(鈉型陽離子交換樹脂，批次式，同時進行DAG溶解及陽離子交換樹脂處理)]

以使脫醯化結冷膠濃度成為2%(w/v)之方式，在300mL之四口燒瓶中裝入脫醯化結冷膠(CG-LA，三晶股份公司)4.0g及純水200mL、螯合樹脂Duolite C467(Na)(住化 Chemtex)8mL。加溫至70℃，使用機械攪拌器在100rpm攪拌1小時。其次，使用桐山濾紙5B將樹脂濾除，將濾液注入至500mL之異丙醇中。將所析出之纖維狀固體進行回收，在50℃真空乾燥。然後，使用混合器進行粉碎，獲得白色粉末。又，將脫醯化結冷膠之量設為5.0g而施行同樣的操作，獲得白色固體。

[實施例16：脫2價鹽DAG之調製方法；減少樹脂使用量之情況(鈉型陽離子交換樹脂，批次式，同時進行DAG溶解及陽離子交換樹脂處理)]

以使脫醯化結冷膠濃度成為1.0%(w/v)之方式，在300mL之四口燒瓶中裝入脫醯化結冷膠(CG-LA，三晶股份公司)2.0g及純水200mL、螯合樹脂Duolite C467(Na)(住化Chemtex)1mL。加溫至70℃，使用機械攪拌器在100rpm攪拌1小時。其次，使用桐山濾紙5B將樹脂濾除，將濾液注入至500mL之異丙醇中。將所析出之纖維狀固體進行回收，在50℃真空乾燥。然後，使用混合器進行粉碎，獲得白色粉末。

[實施例17：脫2價鹽DAG之調製方法；加長樹脂處理時間之情況(鈉型陽離子交換樹脂，批次式，同時進行DAG溶解及陽離子交換樹脂處理)]

以使脫醯化結冷膠濃度成為1.0%(w/v)之方式，在300mL之四口燒瓶中裝入脫醯化結冷膠(CG-LA，三晶股份公司)1.0g及純水200mL、螯合樹脂Duolite C467(Na)(住化Chemtex)8mL。在23℃，使用機械攪拌器以100rpm攪拌5 小時。其次，使用桐山濾紙5B將樹脂濾除，將濾液注入至500mL之異丙醇中。將所析出之纖維狀固體進行回收，在50℃真空乾燥。然後，使用混合器進行粉碎，獲得白色粉末。

[比較例3]

以使脫醯化結冷膠濃度成為0.5%(w/v)之方式，在300mL之四口燒瓶中裝入脫醯化結冷膠(CG-LA，三晶股份公司)1.0g及純水200mL。加溫至100℃，使用機械攪拌器在100rpm攪拌1小時。其次，使用桐山濾紙5B進行過濾，將濾液注入至500mL之異丙醇中。將所析出之纖維狀固體進行回收，在50℃真空乾燥。然後，使用混合器進行粉碎，獲得白色粉末。

[比較例4]

以使脫醯化結冷膠濃度成為0.5%(w/v)之方式，在300mL之四口燒瓶中裝入脫醯化結冷膠(CG-LA，三晶股份公司)1.0g及純水200mL、強酸性陽離子交換樹脂(H型)DOWEX^TM(Dow Chemical公司)4mL。在100℃，使用機械攪拌器在100rpm攪拌1小時。其次，使用桐山濾紙5B將樹脂濾除，將濾液注入至500mL之異丙醇中，但並未發現固體析出。

[比較例5]

以使脫醯化結冷膠濃度成為0.5%(w/v)之方式，在300mL之四口燒瓶中裝入脫醯化結冷膠(CG-LA，三晶股份公司)1.0g及純水200mL、強酸性陽離子交換樹脂(H型) DOWEX^TM(Dow Chemical公司)4mL。在23℃，使用機械攪拌器在100rpm攪拌1小時。其次，雖然嘗試使用桐山濾紙5B樹脂將樹脂濾除，但濾紙發生堵塞，無法完成過濾操作。

針對實施例13至17、以及比較例3至5之產量示於以下。

[溶解性試驗]

針對實施例13至17以及比較例3之藉由各處理所獲 得之DAG粉末，調查在室溫之對水溶解性。在Maruemu螺管No.1中裝入各粉末20mg及純水2mL，藉由在室溫旋渦混合1小時而進行攪拌。溶解性係藉由目視確認。結果示於以下。

[金屬定量]

對於實施例13至17以及比較例3之藉由各處理所獲得之DAG粉末添加酸並進行加熱分解，將經超純水進行適宜稀釋之溶液以感應耦合電漿發光分光分析裝置(ICP-OES)(SPS 5520，SII Nanotechnology)進行分析。結果示於以下。

[實施例18：脫2價鹽DAG之調製方法(鈉型陽離子交換樹脂，批次式；透析處理)]

添加脫醯化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)300mg、超純水(Milli-Q水)30mL、DUOLITE C467 0.5g，在70℃加熱攪拌1小時而使其溶解。然後放冷至室溫，藉由吸引過濾而除去DUOLITE C467。使濾液在水中進行透析1日。對所獲得之水溶液施行凍結乾燥，獲得187mg之白色固體。

[實施例19：使用脫2價鹽脫醯化結冷膠之DMEM培養基之作成(過濾器滅菌)]

將實施例18所調製之脫2價鹽脫醯化結冷膠以成為0.3%之方式添加至水中，使其在100℃加熱分散。然後在室溫靜置。將溶液使用滅菌過濾器(孔洞尺寸0.22μm)進行滅菌。

另一方面，在DMEM/F12的粉末培養基(Sigma-Aldrich公司)及碳酸氫鈉中添加相當於培養基調製時之推薦值的2分之1量的純水，使用滅菌過濾器(孔洞尺寸0.22μm)進行滅菌。

使脫醯化結冷膠溶液、MilliQ水及培養基以1：9：10之體積比進行混合，調製脫醯化結冷膠濃度為0.015%(w/v)之目標DMEM/F12培養基。

[實施例20：使用脫2價鹽脫醯化結冷膠之DMEM培養基之作成(高壓釜滅菌)]

將實施例18所調製之脫2價鹽脫醯化結冷膠以成為0.3%之方式添加至水中，使其在100℃加熱分散。然後在室溫靜置。將所獲得之溶液在121℃進行20分鐘高壓釜滅菌。

另一方面，在DMEM/F12的粉末培養基(Sigma-Aldrich公司)及碳酸氫鈉中添加相當於培養基調製時之推薦值的2分之1量的純水，使用滅菌過濾器(孔洞尺寸0.22μm)進行滅菌。

使脫醯化結冷膠溶液、MilliQ水及經滅菌之培養基以1：9：10之體積比進行混合，調製脫醯化結冷膠濃度為0.015%(w/v)之目標DMEM/F12培養基。

[實施例21：珠粒分散試驗]

在實施例19及20所調製之培養基中，添加聚苯乙烯珠粒(尺寸200μm，Polysciences Inc.製)，以目視確認珠粒之分散狀態。將浮游分散狀態設為○，一部分沉降/分散狀態設為△，沉降狀態設為×而進行評估。

[產業上之可利用性]

本發明係提供一種培養基組成物的製造方法，其係在使用具有陰離子性官能基之高分子化合物的培養基組成物中，提高該高分子化合物之對水溶解性，而更簡便地施行前述化合物與培養基之混合。藉由該方法，可更簡便地製造能夠將細胞及/或組織進行浮游培養之培養基組成物，因而本發明係在產業上極為有用的發明。

包含此處所述之專利及專利申請案說明書之所有刊物中所記載之內容係皆引用於本文中，藉此，以與其全部內容所明示者為相同程度地併入本說明書中。

本申請案係以在日本申請之日本專利特願2014-010841(申請日：2014年1月23日)、及日本專利特願2014-170992(申請日：2014年8月25日)為基礎，其內容係 全部包含在本說明書中。

本案之第1圖至第12圖為實施例所得到之培養狀態照片圖，並不足以代表本案申請專利範圍所請製造方法及精製方法之步驟內容特徵、以及所請培養基添加劑之組成。故本案無指定代圖。

Claims (14)

1. 一種培養基組成物的製造方法，係能夠使細胞或組織浮游而進行培養且於25℃之黏度為8mPa‧s以下之培養基組成物的製造方法，其包含：將實質上不含2價金屬陽離子的脫醯化結冷膠(gellan gum)或其鹽與培養基進行混合。
2. 一種培養基組成物的製造方法，係能夠使細胞或組織浮游而進行培養且於25℃之黏度為8mPa‧s以下之培養基組成物的製造方法，其包含：對脫醯化結冷膠或其鹽施行2價金屬陽離子除去處理，而獲得經減少2價金屬陽離子混入量的脫醯化結冷膠或其鹽；以及將該脫醯化結冷膠或其鹽與培養基進行混合。
3. 如申請專利範圍第2項所述之培養基組成物的製造方法，其中，2價金屬陽離子除去處理係藉由螯合劑或陽離子交換體施行。
4. 如申請專利範圍第2項所述之培養基組成物的製造方法，其中，2價金屬陽離子除去處理係藉由將脫醯化結冷膠或其鹽的水中懸浮物與陽離子交換體進行混合而施行。
5. 如申請專利範圍第4項所述之培養基組成物的製造方法，其中，在10至70℃，將脫醯化結冷膠或其鹽的水中懸浮物與陽離子交換體進行混合。
6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之培養基組成物的製造方法，其中，前述2價金屬陽離子係從由 鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子所組成之群組中選出之至少1種。
7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之培養基組成物的製造方法，其中，將前述脫醯化結冷膠或其鹽的水溶液與培養基的水溶液進行混合。
8. 如申請專利範圍第7項所述之培養基組成物的製造方法，其中，在進行混合前，將該各水溶液進行過濾滅菌。
9. 如申請專利範圍第7項所述之培養基組成物的製造方法，其中，將前述脫醯化結冷膠或其鹽的水溶液進行高壓釜滅菌。
10. 如申請專利範圍第7項所述之培養基組成物的製造方法，其中，利用均質攪拌器一邊攪拌、一邊混合。
11. 如申請專利範圍第3項所述之培養基組成物的製造方法，其中，螯合劑為乙二胺四醋酸。
12. 如申請專利範圍第3項所述之培養基組成物的製造方法，其中，陽離子交換體為鈉型。
13. 一種培養基添加劑之用途，該培養基添加劑係用於調製能夠使細胞或組織浮游而進行培養且於25℃之黏度為8mPa‧s以下之培養基組成物，該培養基添加劑實質上不含有2價金屬陽離子，且含有經滅菌的脫醯化結冷膠或其鹽。
14. 如申請專利範圍第13項所述之培養基添加劑之用途，其中，該培養基添加劑為水溶液。

Images