CN111838136A - 间充质干细胞低温保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞低温保存液及其制备方法，所述间充质干细胞低温保存液包括体积配比为1:50～1:5的人血白蛋白注射液和0.9％氯化钠注射液混合液；其中，每500mL所述0.9％氯化钠注射液混合液包括0.13～0.2g氯化钾和0.12～0.2g氯化钙。本发明技术方案，通过优化间充质干细胞低温保存液结构解决了传统间充质干细胞低温保存液因使用冻存保护剂而严重损害人体健康的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存技术领域，特别涉及一种间充质干细胞低温保存液及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cells)来源于发育早期的中胚层，是一种多功能干细胞，具有多向分化潜能、造血支持和促进细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带。神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复、自身免疫性疾病等方向，具有长远的医学发展前景。
间充质干细胞需要在GMP环境下大规模制备，之后运输到医院用于临床治疗。间充质干细胞在GMP环境下处理后，并不能即时输注，过渡期间必须使用可被临床输注的保存液进行运输。目前常用的方法为冻存运输，此方法需要使用冻存保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、甲醇、聚合物羟乙基淀粉等。但是，常用的冻存保护剂对人体有或多或少的不良影响，诸如，DMSO具有毒性，注射入人体后会引起恶心、呕吐、皮疹、腹痛、血压过低、严重神经系统疾病、肾衰竭、心血管疾病等不良反应。因此，寻找一种不含冻存保护剂的方式保护运输间充质干细胞，对于间充质干细胞的临床应用具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种间充质干细胞低温保存液及其制备方法，旨在解决传统间充质干细胞低温保存液使用冻存保护剂对人体健康损害较大的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种间充质干细胞低温保存液，所述间充质干细胞低温保存液包括体积配比为1:50～1:5的人血白蛋白注射液和0.9％氯化钠注射液混合液；
其中，每500mL所述0.9％氯化钠注射液混合液包括0.13～0.2g氯化钾和0.12～0.2g氯化钙。
可选地，所述氯化钙为分析纯试剂或优级纯试剂。
本发明提供了一种如上所述的间充质干细胞低温保存液的制备方法，其特征在于：
将氯化钾和氯化钙溶解于0.9％氯化钠注射液中，混匀，得0.9％氯化钠注射液混合液；
取人血白蛋白注射液加入所述0.9％氯化钠注射液混合液，混匀，得目的间充质干细胞低温保存液。
本发明还提供了一种如上所述的间充质干细胞低温保存液在间充质干细胞保存中的应用。
本发明还提供了一种如上所述的间充质干细胞低温保存液制备的间充质干细胞注射液，所述间充质干细胞注射液中的间充质干细胞浓度为2*105～1*106个/mL。
可选地，所述间充质干细胞为人的间充质干细胞。
本发明还提供了一种如上所述的间充质干细胞低温保存液制备的间充质干细胞注射液的制备方法，向所述间充质干细胞低温保存液中加入间充质干细胞，至细胞浓度为2*105～1*106个/mL，制成单细胞悬液，得间充质干细胞注射液。
相较于现有技术，本发明取得了以下有益效果：
本发明技术方案中，通过使用人血白蛋白注射液和0.9％氯化钠注射液混合液制得的低温保存液保存人的间充质干细胞，避免使用具有毒副作用和对细胞造成损伤的冻存保护剂，且避免了冻存解冻步骤，极大地提高了临床安全性和简便性；同时延长了干细胞活性维持时间，保证36小时运输后细胞活性保持在85％以上，其仍能满足临床使用要求；该低温保存液具有安全性高、便于运输、细胞活性高、成本低廉、制剂可直接回输等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中不同间充质干细胞低温保存液下的细胞活率统计图；
图2为本发明一实施例中A保存液低温保存运输间充质干细胞24小时后的贴壁图；
图3为本发明一实施例中B保存液低温保存运输间充质干细胞24小时后的贴壁图；
图4位本发明一实施例中C保存液低温保存运输间充质干细胞24小时后的贴壁图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
参见图1至图4，本发明提出一种间充质干细胞低温保存液，所述间充质干细胞低温保存液包括体积配比为1:50～1:5的人血白蛋白注射液和0.9％氯化钠注射液混合液；
其中，每500mL所述0.9％氯化钠注射液混合液包括0.13～0.2g氯化钾和0.12～0.2g氯化钙。
可选地，所述氯化钙为分析纯试剂或优级纯试剂。
本发明提供了一种如上所述的间充质干细胞低温保存液的制备方法，其特征在于：
将氯化钾和氯化钙溶解于0.9％氯化钠注射液中，混匀，得0.9％氯化钠注射液混合液；
取人血白蛋白注射液加入所述0.9％氯化钠注射液混合液，混匀，得目的间充质干细胞低温保存液。
本发明还提供了一种如上所述的间充质干细胞低温保存液在间充质干细胞保存中的应用。
本发明还提供了一种如上所述的间充质干细胞低温保存液制备的间充质干细胞注射液，所述间充质干细胞注射液中的间充质干细胞浓度为2*105～1*106个/mL。
可选地，所述间充质干细胞为人的间充质干细胞。
本发明还提供了一种如上所述的间充质干细胞低温保存液制备的间充质干细胞注射液的制备方法，向所述间充质干细胞低温保存液中加入间充质干细胞，至细胞浓度为2*105～1*106个/mL，制成单细胞悬液，得间充质干细胞注射液。
为进一步阐述说明本发明提供的间充质干细胞低温保存液的效果，选用以下实施例组进行详细阐述。应当理解，下列实施例组仅用于说明本发明中低温保存液的效果，并不限制本发明。
实施例1不同间充质干细胞低温保存液的制备
按表1中各成分和比例配置A、B、C三种间充质干细胞保存液，各配制500mL，备用。
表1间充质干细胞低温保存液的配方
实施例2三种不同间充质干细胞低温保存液的细胞活率
2.1实验操作：取冻存间充质干细胞(MSC)，并于37℃水浴锅中快速复苏，然后转移至0.9％氯化钠溶液中，吹打混匀，离心8min，洗涤3次；取3支离心管，分别标记为A、B、C，并向每试管内分装3*107个细胞，离心10min，去上清液，收集沉淀细胞；另取9支50mL离心管，分别标记为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3(三组平行实验)，并于每支离心管中加入20mL对应编号的沉淀细胞，并加入如表1所示的对应序号的间充质干细胞低温保存液，定容至100mL；将上述间充质干细胞制剂放入4℃冰箱中，按表2所示取样，并测定细胞数和细胞活率，得到如表2表3和图1所示的结果。
表2三种不同间充质干细胞低温保存液下的细胞活率
表3本发明间充质干细胞低温保存液的活细胞数及活率测定
2.2结果分析：由上表2表3和图1可知，在由生理盐水和2％人血白蛋白配制得到的A间充质干细胞低温保存液的保存下，24小时后，细胞活率下降至80％左右；在由林格氏液(500mL0.9％氯化钠注射液含氯化钾0.15g，氯化钙0.14g)和2％人血白蛋白配制得到的B间充质干细胞低温保存液的保存下，24小时后，细胞活率仍可达到95％，在36小时后，细胞的活率可达89％；在由0.3％玻璃酸钠、生理盐水和2％人血白蛋白配制得到的C间充质干细胞低温保存液的保存下，24小时后，细胞活率下降至85％左右，在36小时后，细胞的活率降至81％。说明，本发明中保护的间充质干细胞低温保存液在2～8℃下保存，24小时内细胞活率大于90％，36小时内细胞活率大于85％，远远高于常用间充质干细胞保存液保存下的细胞活率。
实施例3不同保存液下24小时后细胞的贴壁实验
3.1操作步骤：取实施例2中24小时时的悬液10mL，离心10min，弃上清液，并加入少量MSC培养基重悬，再加入T-75培养瓶培养，并补液至20mL，观察细胞贴壁生长的情况，结果如图2至图4所示。
3.2结果分析：由图2至图4可知，A组的细胞极少贴壁，B组和C组的细胞贴壁，其中，B组细的贴壁形态较C组细胞的贴壁形态好。
综上，可知，在由本发明配制的间充质干细胞低温保存液下于2～8℃低温保存的间充质干细胞，在24小时后，细胞的存活率依然保持在95％左右，且细胞贴壁生长活力较好，有利于临床；在36小时后，细胞的存活率依然保持在88％左右，细胞死亡率较低。本发明保护的间充质干细胞低温保存液具有安全性高、便于运输、细胞活性高、成本低廉、制剂可直接回输等优点。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种间充质干细胞低温保存液，其特征在于：所述间充质干细胞低温保存液包括体积配比为1:50～1:5的人血白蛋白注射液和0.9％氯化钠注射液混合液；
其中，每500mL所述0.9％氯化钠注射液混合液包括0.13～0.2g氯化钾和0.12～0.2g氯化钙。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞低温保存液，其特征在于，所述氯化钙为分析纯试剂或优级纯试剂。
3.一种如权利要求1或2所述的间充质干细胞低温保存液的制备方法，其特征在于：
将氯化钾和氯化钙溶解于0.9％氯化钠注射液中，混匀，得0.9％氯化钠注射液混合液；
取人血白蛋白注射液加入所述0.9％氯化钠注射液混合液，混匀，得目的间充质干细胞低温保存液。
4.一种如权利要求1或2所述的间充质干细胞低温保存液在间充质干细胞保存中的应用。
5.一种如权利要求1或2所述的间充质干细胞低温保存液制备的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述间充质干细胞注射液中的间充质干细胞浓度为2*105～1*106个/mL。
6.如权利要求5所述的间充质干细胞低温保存液，其特征在于，所述间充质干细胞为人的间充质干细胞。
7.一种如权利要求1或2所述的间充质干细胞低温保存液制备的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，向所述间充质干细胞低温保存液中加入间充质干细胞，至细胞浓度为2*105～1*106个/mL，制成单细胞悬液，得间充质干细胞注射液。
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