PT97197A - Factor de supressao do colapso respiratorio - Google Patents

Description

AMGEN, INC, e CORNELL RESEARCH FOUNDATION, INC. "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM FACTOR POLIPEPTÍDICO DE SUPRESSÃO DO COLAPSO RESPIRATÓRIO E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE O CONTÊM" A presente invenção refere-se a novos fac_ tores que são polipéptidos com capacidade para inibirem a activa ção ou inverterem a activação pré-existente de células fagocíti-cas (macrófagos e neutrófilos), a métodos para a preparação destes factores e a métodos e a composições para o tratamento de doenças utilizando estes factores.

Antecedentes da invenção

As células fagocíticas (macrófagos e neu trófilos) são activadas por diversos estímulos ambientais e citoquinas para matarem células tumorais e agentes patogéni-cos microbianos por libertação de intermédios oxigenados reactivos (por exemplo, peróxido de hidrogénio) durante um colapso respiratório ou por libertação de intermédios azotados reac_ tivos (por exemplo, óxido nítrico).

As citoquinas que aumentam a citotoxici-dade e a função antimicrobiana dos macrófagos e dos neutrófilos têm sido estudadas exaustivamente. Mais recentemente, iden-tificaram-se citoquinas que bloqueiam a indução da activação dos macrófagos. Estas incluem o factor de crescimento trans-formante (TGF)- β , (Tsunawaky et al.·, Nature 334 (1988), 260); a interleuquina (IL)-4 (Abramson et al., Clin. Res., 3? (1989) 825Α (abstract)) e o péptido gene-relacionado de calcitonina (CGRP) (Nong et al.} J. Immunol. 143 (1989) 45).

Foi descrita a supressão da actividade do colapso respiratório de macrófagos peritoniais de murganho por meio condicionado por células de tumor (TMC) (Szurdo--Sudol et al., Fed. Proc., 41 (1982) (abstrat)) e observou-se com meio condicionado por uma diversidade de linhas de células tumorais murinas (Szuro-Sudol e Nathan, J. Exp..Med. 156 (1982) 945; Nelson et al., Aust J. Exp.

Biol. Med. 60, (1982) 493; e linhas de células tumorais humanas (Szuro-Sudol, Deactivation of Macrophages by Products of Other Cells, Ph. D. Thesis, Rockefeller Univer-sity, 1985). 0 tratamento de macrófagos com meio condicio nado por células tumorais não só suprime a produção dos intermédios oxigenados reactivos, mas também suprime a exterminação de alguns agentes patogénicos microbianos. A activação das células fagocíticas e a libertação de produtos tóxicos durante o ataque respiratório pode ser prejudicial às células normais e tem sido implicada nas respostas inflamatórias (Gallin et al., Inflam mation, Basic Principies and Clinicai Correlates, Raven Press, New York, 1988). Portanto, a administração de composições que suprimem activação fagocítica proporciona um meio para a redução de situações inflamatórias. 0 pedido de Patente de invenção europeia N^ 269408 aqui incorporado como - 3 - /

referência descreve a utilização de factor de crescimento transformante β> (TGF- j3) para o tratamento de doenças inflamatórias, mas não no que diz respeito à supressão do ataque respiratório.

Um objectivo da presente invenção é propor cionar factores novos que inibem a activação ou invertem a activação já existente de macrófagos e neutrófilos. É ainda um objectivo da presente invenção a utilização destes novos factores para o tratamento de doenças caracterizadas por inflamação.

Resumo da invenção A presente invenção diz respeito a novos poli péptidos, aqui referidos como factorde supressão do colapso respiratório ou RBSF com capacidade para inibir a activação dos fagócitos. Estes polipéptidos apresentam a propriedade de inibir o colapso respiratório fagocítico inibindo, portanto, a libertação de intermédios azotados e oxigenados tóxicos a partir dos fagócitos. Estes intermédios tóxicos proporcionam uma defesa contra doenças e infecçSes, aniquilando as células tumorais e os agentes patogénicos microbianos. Contudo, a libertação prolongada de intermédios oxigenados e azotados pode ser prejudicial para as células normais. Portanto, pode utilizar-se RBSF para tratar as doenças que resultam da activação fagocitária prolongada. A presente invenção proporciona um método -4-

para a produção de RBSF que compreende os passos de cultura de uma linha de células que produz RBSF e isolamento de RBSF a partir do meio de cultura condicionado das células. Pode utilizar-se qualquer linha de células produtora de RBSF. Por exemplo, a linha de células P815, uma linha de células de mastocitoma de murganho, ou a linha de células K562 humana derivada de um doente com leucemia mielógena crónica. A presente invenção também proporciona um método para a purificação de um polipéptido com as proprieda-dsde de RBSF sendo o referido polipéptido distinto de TGF- 3, IL 4, ou CGRP. 0 método de purificação de RBSF compreende os passos de filtração por gel, cromatografia de permuta iónica e um ou mais passos de cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa. A presente invenção também se refere a composições aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico de RBSF e a métodos de tratamento que compreendem a administração de uma dose eficaz sob o ponto de vista terapêutico de RBSF. 0 RBSF é eficaz como um agente anti-inflamatório, como factor de cicatrização de feridas e como immunossupres-sor, quando administrado em quantidades compreendidas entre 0,1 e 1000 jig/kg de peso de corpo.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 representa o fraccionamento de

RBSF por cromatografia em Sephacryl S-400.

Figura 2 representa a eluição de RBSF de uma coluna Biogel P60.

Figura 3 representa a eluição de RBSF de uma coluna de permuta aniónica Mono Q.

Figura 4 representa o fraccionamento de RBSF por cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa de difenilo (RPHPLC).

Figura 5 representa HPLC de fase inversa CU de RBSF utilizando um pico bioactivo de RPHPLC C4 de difenilo .

Figura 6 mostra um segundo fraccionamento de RPHPLC C4 de RBSF utilizando um pico bio-activo da primeira coluna C4.

Figura 7 mostra a inibição por RBSF e TGF-Ji da libertação de macrófagos de peróxido de hidrogénio.

Figura 8 representa a inibição por RBSF e TGF-da libertação de macrófagos de nitritos induzida por interferon-garaa e pela associação de interferon-gama e de factor-alfa de necrose de tumor.

Figura 9 representa a estimulação da capta- - 6 - Ρ » • .% ção de timidina por fibroblastos de rim de rato normal na presença de RBSF e TGF- βΊ.

Figura 10 representa a inibição da captação de timidina por células epiteliais do pulmão de rato na presença de RBSF e TGF- J31.

Figura 11 apresenta a inibição da captação de timidina por esplenócitos de murganhos estimulados por concanavalina A na presença de RBSF e TGF-,/31.

Figura 12 representa a incapacidade de RBSF para competir com TGF-./31 na ligação com fibroblastos e células epiteliais.

Figura 13 representa a supressão por RBSF humano da libertação de H2°2 P°r neutrófilos activados.

Figura 14 mostra o fraccionamento em Biogel ΡβΟ de RBSF humano.

Figura 15 mostra uma análise de SDS-PAGE de fracções Biogel P60.

Figura 16 representa a cromatografia SP--5PW de RBSF humano utilizando fracções Biogel P60 activas.

Figura 17 mostra uma análise de SDS-PAGE de fracçães SP-5PW.

Descrição pormenorizada da invenção A supressão do colapso respiratório define--se aqui como a supressão da libertação de intermédios oxigenados ou azotados reactivos por fagócitos activados, por exemplo, macrófagos e neutrófilos. Previamente, a supressão da libertação de oxigénio reactivo demonstrou-se pela ex posição de macrófagos em meio condicionado de células tumo-rais (TCM). A presente invenção proporciona factores que são isentos de outros componentes em TCM e que tem a capacidade para inibir a libertação de intermédios oxigenados reactivos pelos macrófagos que foram activados por diversos agentes solúveis e agentes de desafio microbianos (ver Exemplo 2), Além disso, também se verificou que os polipéptidos da presente invenção inibem a libertação de intermédios azotados reactivos provocados pelo tratamento de macrófagos com ^ -interferon ou a associação de y -interferon e TNF-oe’ (ver Exemplo 3). A libertação prolongada de intermédios oxigenados ou azotados é prejudicial para as células normais e é suprimida pelo tratamento com uma quantidade eficaz de RBSF. A actividade biológica de RBSF não se limita à inibição da actividade dos macrófagos. Tal como se descreve no Exemplo 4, descobriu-se agora que o RBSF purificado pode afectar a proliferação de linhas de células não mielói- 8 \ des. Ο HBSF estimula a proliferação de fibroblastos de rim e inibe a proliferação de células epiteliais pulmonares e de linfócitos--T. A acção estimuladora de RBSF sobre os fibroblastos é utilizável para acelerar a cicatrização de feridas, enquanto a acção inibidora dos linfócitos-T é útil para suprimir as respostas imunológicas.

Descreve-se um método para a produção de RBSF. Este método compreende os passos de cultura de uma linha de células que produz RBSF e de isolamento de RBSF a partir de meio condicionado pelas células. Em certas variantes da presente invenção, a linha de células é, por exemplo, P815, uma linha de células de mastoeitoma de murganho ou K562, uma linha de células humanas proveniente de um doente com leucemia mieloide crónica.

Também se proporciona, através da presente invenção, um método para purificar RBSF a partir do meio de cultura. 0 método inclui os passos de: cromatografia de filtração por gel do material que contém RBSF (por exemplo, Sephacryl S400 ou Biogel P60), cromatografia de permuta iónica do material que contém RBSF (por exemplo Mono Q),cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa difení-lica de um material que contém RBSF e dois fraccionamentos sequenciais do material que contém RBSF numa coluna de fase inversa. Os pormenores para a aplicação deste método são fornecidos no Exemplo 1. Neste processo, a presença de RBSF foi detectada pelo ensaio de libertação de d®s macr°- - 9 -

fagos descritos no Exemplo 1.

Purificou-se o RBSF preparado por este método mais de 6 000 vezes partindo de TCM (ver o Quadro 1). 0 RBSF purificado é definido como uma banda principal única na electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacril-amida (SDS-PAGE) de cerca de 13 000 daltons. Alternativamente, define-se RBSF purificado como um pico único de ac-tividade na cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (ver Figura 6A) e como uma banda principal única em SDS-PAGE com cerca de 13 000 daltons (ver Figura 6C).

Verificou-se que o RBSF é um factor novo distinto de outros factores, tais como TGF-β1 que se sabe suprimirem o colapso respiratório de fagócitos activados. 0 RBSF suprime o colapso respiratório de células fagocíticas na presença de interferon-gama, factor de activação fagoci-tário, enquanto o TGF-J3 não suprime o colapso respiratório quando está presente o interferon-gama. Tal como se descreve no Exemplo 5, os anticorpos que se ligam especificamente a TGF-J3 1 não conseguem neutralizar a capacidade de RBSF purificado para suprimir a libertação pelos macrófagos de intermédios oxigenados. Além disso o RBSF purificado não consegue competir com TGF- β*\ na ligação a fibroblastos de rim e a células epiteliais pulmonares, que são linhas de cé lulas que exprimem receptores de TGF-β . 0 peso mole cular de RBSF distingue-o de outros dois factores conhecidos por suprimirem a actividade dos macrófagos, IL-4, que tem cerca de 4 500 daltons.

Os factores da presente invenção tam bém abrangera variações na estrutura primária (isto é, na sequência de aminoácidos) de RBSF. Estas variantes incluem as formas precursoras de RBSF que têm outros aminoácidos na extre midade amino e que são processadas durante a secreção de célu las hospedeiras e de variantes alélicas. A presente invenção também proporciona formas quimicamente modificadas de RBSF que exibem solubilidade estabilidade e/ou a semi-vida da circulação acrescidas quando comparadas com RBSF não modificado. Estas modificações incluem por exemplo, ligações por covalência a polietilenoglicol (ver a patente de invenção norte-americana N2 4.179.337 aqui referida).

Os factores da presente invenção podem ser ligados por covalência a um grupo de referência reactivo (por exemplo, 1-125) ou não reactivo (por exemplo, um reagente de coloração fluorescente) para se obter reagentes aplicáveis na detecção ou quantificação de RBSF em tecidos solidos e em amostras líquidas.

Ainda abrangido pela presente invenção são composições farmacêuticas contendo quantidades tera-peuticamente eficazes de RBSF conjuntamente com agentes dissolventes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou veículos apropriados. As quantidades terapeuti- - 11

camente eficazes de RBSF (por exemplo, as que reduzem o nivel de actividade de colapso respiratório) numa composição farmacêutica podem ser determinadas pelos técnicos, considerando variáveis tais como a semi-vida das preparações de RBSF, a via de administração e a situação clínica a tratar. De uma maneira geral, quantidades eficazes sob o ponto de vista terapêutico variarão entre 0,1 e 1000 jag/kg de peso do corpo. As composições com RBSF administram-se por perfusão contínua, em composições de libertação prolongada, em "spray” para aeros sol ou por injecção. A presente invenção proporciona a aplicação de RBSF sozinha ou em associação com outras terapêu ticas para o tratamento de doenças caracterizadas por inflamação resultante da activação fagocitária excessiva. Estas doenças incluem, mas não estão limitadas, as seguintes: artrite reumatóide e outras doenças artríticas incluindo a inflamação induzida por cristal (Gallin et al., Inflammation, Basic Principies and Chimical Correlates, Nova Iorque Raven Press, 1988, pp. 751-783); asma (Cathoun et al., Am. Rev. Respir. Pis, 135 (1987), 224A (abstract); Serhan et al., PNAS, 8j_ (1984), 5335-53395 enfisema (Mittman et al., 1986); lup .s eritematoso generalizado; síndrome de dificuldade respiratória do adulto (Gallin et al., supra, pp. 815--824); doença inflamatória do intestino (Jorizzo et al.,

Arch Intern. Med., 144 (1984), 738-740) psoríase (Cram et al., J. Am. Acad. Dermatol 4 (1981)1; e sarcoidose (Robin- 12 son et al., J. clin. Invest., 75 (1985) 1488-1495).

Além disso, a presente invenção proporciona a aplicação de RBSF sozinho ou em associação com outros agentes terapêuticos, tais como um antagonista para os factores que, quando administrados, podem promover efeitos nocivos associados à activação dos macrófagos. Em particular, pode utilizar-se RBSF para contrariar os efeitos da activação dos macrófagos resultantes de tratamentos com ^ -inter feron, a associação de -β-interferon com TNF, M-CSF, G-CSF ou GM-CSF. A presente invenção abrange o uso de RBSF sozinho ou em associação com outra terapêutica para o tratamento de feridas. A administração de RBSF na ferida acelera a regeneração dos tecidos pela estimulação da proliferação de fibroblastos e pela supressão da libertação de moléculas tóxicas pelos macrófagos no sítio da ferida.

Também é abrangida pela presente invenção a aplicação de RBSF sozinho ou em associação com outra terapêutica para inibir a proliferação de linfó-citos T, actuando deste modo como um imunossupressor.

Os exemplos seguintes são apresenta dos para melhor compreensão da presente invenção, mas não devem ser considerados como limitativos do seu âmbito.

Exemplo 1

Purificação e caracterização de RBSF a partir do melo de cultura de células de mastocitoma P 815 murina A. Bioensaio para a supressão da actividade do colapso respiratório

Lavaram-se macrófagos activados provenientes de cavidades peritoniais de murganhos fêmea CD1 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) com meio essencial mínimo de Eagle, variante o< ( o( MEM) (KC Biologicals', Lemxa,, KS) 3 a 4 dias após a injecção de 1 ml de caseinato de sódio a 6 % autoclavado (grau prático, Eastman, Kodak Co.

Rochester,NY) em solução normal -de cloreto de sódio, do modo descrito por de La Harpe et al., J. Immunol. Methods 78, ( 1985) 223). Centrifugaram-se as células C 1070 g, duran- te 10 minutos a 4°C ) e ressuspenderam-se em MEM contendo 10 % de soro de equino inactivado pelo calor (HyClone Laboratories, Logan UT) com 100 U/ml de penicilina e 100 μβ/ταί de estreptomicina. Este meio será referido como M-10. Adi-cionaram-se 2 x 103 células em 25 pl a cada cavidade de placas de 96 cavidades (Costar Data Packaging, Cambridge, MA) contendo amostras de teste e este soro de equino de modo a obter um volume final 135-150 jal e uma concentração final de soro de equino de 10 %. Incubaram-se as células durante uma noite em C02 a 5 % à temperatura de 37°C e analisaram-se relativamente à libertação de moc*° descrito por de - 14

la Harpe et al., supra, 1985. Resumidamente, lavaram-se as placas em solução de cloreto de sódio e incubaram-se as células aderentes em tampão de fosfato Krebs-Ringer com glucose e 100 ng/ ml de acetomiristato de forbol como um "despoletador" do colapso respiratório. A oxidação do indicador fluorescente de escopoletina por , catalisada por peroxidase de rábano foi controlada fluorometricamente durante 45 a 90 minu tos, a proteína celular nas mesmas cavidades foi determinada por espectrofotometria e calculados os nmoles de H202 libertados por miligrama de proteína de células aderentes. Ensaiou -se um intervalo de volumes de fracções contendo RBSF; o volume da amostra de teste necessário para inibir em 50 % a capacidade de libertação de foi determinada por inter polação e definida como uma unidade. Para se obter a activi-dade específica de RBSF dividiram-se as unidades por ml da amostra de teste por mg de proteína por ml da amostra de teste. A actividade específica foi cerca de 10 vezes maior quando se incubaram os macrófagos em RBSF durante 48 horas em vez de 24 horas (Szuro-Sudol et al., supra 1983; Tsuna-waki et al., supra, 1988); por comodidade utilizou-se o ensaio menos demorado. B. Meio condicionado de células tumorais (TCM)

Cultivaram-se células de mastoci-toma de murganho P815 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) com uma densidade inicial de 1,5 x 10^/ml em o{ -MEM. Após 48 horas, centrifugou-se o meio (5225 x g, 30 min., 4°C) e esterilizou-se o sobrenadante por filtração (0,45 u, Millex-HA; Millipore, Bedford, MA) e conservou-se à temperatura de 4°C.

C. Concentração de actividade de RBSF de TCM

Utilizaram-se alternativamente três métodos. (1) Adicionou-se lentamente sulfato de amónio sólido a TCM à temperatura de 4°C, com agitação constante, mantendo-se o pH a 7,0 com hidróxido de sódio até 70 % da saturação (p/p). Agitou-se a solução durante 4 a 6 horas e recolheu-se por centrifugação o precipitado (12 100 x g, durante 30 minutos à temperatura de 4°C). Dissolveu-se o aglomerado em tampão de fosfato 20 mM, pH 7,2, e dialisou-se completamente contra o mesmo e finalmente contra PBS (GIBC0, Grand Island, NY). Cen trifugou-se o dialisado (12 100 x g, 10 minutos, 4°C) e esterilizou-se por filtração 0 sobrenadante e conservou-se à temperatura de -20°C. (2) Concentrou-se TCM por ultrafiltração em membranas YM- -300, YM-100, YM-10 ou YM-5 (Amicon, Lexington, MA) sob atmosfera de azoto à temperatura de 4°C com agitação lenta. Reservaram-se o filtrado e a porção 16 - retida no filtro. (3) Extraiu-se TCM com etanol ácido de acordo com o método de Roberts et al., proc. Nat. Acad. Sei. USA, 77 (1980) 3494) com pequenas modificações. Resumidamente, misturou-se durante uma noite à temperatura de 4°C 1 volume de meio celular tumoral condicionado (TCM) ou da frac-ção retida obtida após ultrafiltração através de membranas YM-100 ou YM-5 com 3 volumes de ácido clorídrico 0,23 N em etanol a 95% (em algumas experiências este continha 86 mg/litro de fluoreto de fenilmetilsul-fonilo [PMSF]). As proteínas insolúveis em ácido foram rejeitadas após centrifugação (5225 x g, durante 10 minutos à temperatura de 4°C) e o pH do sobrenadante ajustado para 3-4 com hidróxido de amónio. Concentraram-se depois proteínas solúveis em ácido por adição de 2 volumes de éter anidro (Baker Laboratories, Phil-lipsburg, NJ) e 1 volume de etanol para um volume de sobrenadante. Após 24 horas à temperatura de -20°C precipitaram-se as proteínas que se pseolheram por cen trifugação (5225 x g, durante 20 minutos à temperatura o de 4 C) e rejeitou-se o sobrenadante. Dissolveu-se o precipitado em ácido acético 1M e dialisou-se contra o mesmo durante uma noite à temperatura de 4°C. Rejei-tou-se o material insolúvel e liofilizou-se o sobrenadante (Savant Instrument Co, Farmingdale NY) e con ·. o servou-se a temperatura de -20 C. - 17

D

Cromatografia em Sephaoryl S400 0 RBSF concentrado pelos métodos (1) ou (2) foi fraccionado numa coluna de 1,50 x 50 cm de S-400 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) equilibrada com PBS à temperatura de 4°C e com um caudal de 10 ml/ /hora. Recolheram-se fracções de 4 ml e analisaram-se alxquo tas relativamente à actividade de RBSF, teor de proteína e migração de polipéptido em electroforese sobre dodecilsulfa-to de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Realizou-se as mesmas três análises sobre as fracções provenientes de cada um dos procedimentos cromatográficos seguintes. A actividade de RBSF detectou-se no volume vazio (peso molecular de 450 Kilodaltons) e nas últimas fracções (peso molecular compreendido entre 12 e 25 kilodaltons (ver Figura 1)). E. Cromatografia em Biogel P60

Dissolveu-se em ácido acético 1M RBSF liofilizado extraído pelo método (3)· Removeu-se o pre cipitado por centrifugação e clarificou-se depois o sobrena-dante por filtração (0,45^) e aplicou-se numa coluna de 1,5 x 100 cm de Biogel P60 (Biorad Laboratories, Richmond, CA) equilibrada com ácido acético 1M, à temperatura ambiente. Eluiram-se fracções de 6 ml em ácido acético 1M com um caudal de 20 ml/hora. A maior parte da actividade de RBSF eluiu num largo pico entre a ubiquitina (marcador de 8,7 kilodaltons) e quimotripsingénio (marcador de 25 kilo-daltons) como se apresentou na Figura 2A. SDS-PAGE sob condições de redução (Figura 2B) detectou muito poucos poH péptidos nas fracções activas, predominando nestes menos de 14 kilodaltons. F. Cromatografia de permuta iónica

Reuniram-se as fracções activasda ooIub. de Biogel P60, secaram-se e reconstituiram-se com tampão de clori^ drato de histidina 10 mM, pH 6,0 contendo azida de sódio 1mM e PMSF 0,5 mM (tampão A) e aplicou-se numa coluna Mono Q (Pharmacia, HR 5/5) equilibrada com tampão A e com um caudal de 0,25 ml/minuto. Eluiram-se as proteínas ligadas em fracções de 0,5 ml durante 30 minutos com um gradiente linear de cloreto de sódio crescente até 1M em tampão A. A seta na Figura 3 indica o início do gradiente. Recolheu-se a actividade de RBSF no fluxo de passagem e incluiu-se algumas das primeiras fracções como se mostra na Figura 3· G. Cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (RPHPLC)

Aplicou-se RBSF proveniente da fase de Mono Q a uma coluna de difenilo de fase inversa de 4,6 mm de D.I. x 25 cm (poro de 5 μ), (Vydac, Hesparia, CA) equilibrada com ácido trifluoroacético a 0,1 % (TFA) (Pierce

Chemical Co., Rockford, IL) com um caudal de 1 ml/minuto. As proteínas ligadas eluiram durante 30 minutos num gradiente crescente de acetonitrilo em TFA a 0,1 %. Observou-se o per fil de eluição a 214 e a 280 nm, recolhendo fracções de 1ml que se secaram e reconstituíram em TFA a 0,1 %. A actividade de RBSF eluiu numa fracção única a 54 + 3 % de acetonitrilo (Figura 4A). A análise desta fracção num minigel Phast system reduzido (Pharmacia) revelou uma única banda a 11--13 kilodaltons (Figura 4B). Contudo, um gel grande de gradiente 10-25 % resolveu esta banda em quatro fracções e reve lou uma quinta de 55 kilodaltons (Figura 4C). A fracção bioactiva foi depois purificada por dois fraccionamentos sequenciais em uma coluna RP C4, (4,6 x 50 mm; poro de 6,5 ji) (Synchrom, Lafayette, IN), equilibrada com TFA a 0,1 % (fase A). A fase B foi acetonitrilo a 100 % em TFA a 0,1 %. A eluição foi observada a 214 e a 280 nm; recolhendo-se fracções de 1 ml. No primeiro fraccionamento, a actividade de RBSF eluiu num pico único com acetonitrilo a 50 + 2/¾ (Figura 5). Como revelou a análise em SDS.PAGE, a actividade de RBSF nas fracções 49 e 50 correspondia aos polipéptidos com cerca de 13 kilodantons (Figura 5). Num segundo fraccionamento em C4, o pico único de actividade de RBSF (Figura 6A) correspondia a um pico de absorvância único (Figura 6B). SDS-PAGE corado com prata revelou uma banda de cerca de 13 kilodaltons (Figura 6C). Embora não visível na fotografia, o RBSF purificado a partir 20 20

desta e de duas outras preparações continha quantidades variá veis de uma proteína de 66 kilodalítons que foi identificada como albumina pela sequenciação de aminoácidos. H. Electroforese e imunomancha

Realizou-se SDS-PAGE (Geles de 15 x x 17 x 0,08 cm) pelo método de Laemmli (21). Fixaram-se as proteínas com metanol a 30 % e ácido acético a 10 % e visua-lizaram-se por coloração com prata com modificações menores do método de Morrissey (22). Para as imunomanchas, as proteí nas não fixadas, incluindo TGF- β 1 de plaquetas porcinas puro (R & D Systems, Mineapolis, MN), TGF-J2> 1 humano recom-binante puro (Genentech, Inc., South San Francisco, CA) e CGRP murino puro (Península Laboratories, Belmont, CA), foram transferidas para nitrocelulose (0,22 ;im, Schlei-cher and Schuell, Keene, NH) de acordo com o método de Tow-bin et al., (Proc. Natl. Acad. Sol, USA, 76 (1979) 4350). 0 tampão detransferência continha 0,1 % de SDS em glicina 40 mM, Tris 25 mM, metanol a 20 %, pH, 8,3· Após a tra. -ferência, visualizaram-se as proteínas com negro de amido ou vermelho de Ponceau e bloquearam-se durante uma noite num tampão de bloqueio (leite seco magro a 5 % em solução de cloreto de sódio tamponada com Tris, 20 mM, pH 7,5, contendo 0,2 % de Tween 20 ) à temperatura de 4°C. Incubaram--se as manchas com IgG de peru anti-TGF βΊ , e IgG de peru não imune (National Câncer Institute, Bethesda, MD) anti- 21 corpo IgG de coelho purificado para a ubiquitina e conjugados ubiquitina-proteína (Medicai College of Wisconsin, Mil-wankee, WI), um anti-soro de coelho e um mAb de murganho para p15E de retrovírus (Duke University, Durham, NC) ou

IgG de coelho não imune durante 2 a 3 horas à temperatura o de 37 C. Lavaram-se as manchas 3 vezes com tampão do bloqueio e, em seguida, incubaram-se em IgG de coelho anti-IgG de peru (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) ou IgS de oolura anfci-Ig} de coeQho (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), ligada com fosfa-tase alcalina. Os imunocomplexos foram visualizados após reacção com fosfato de indolilo e nitroazul de tetrazólio (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) em tampão de acetato de veronal de pH 9,6.

Cada uma das imunomanchas era negativa quando se analisaram as amostras de RBSF. I. Avaliação da concentração de proteína

Determinou-se a proteína pelo método de Lowry et al., (J. Biol. Chem. 193, (1959) 265) utili zando albumina de soro de bovino como padrão. A concentração da proteína nas fracções de RBSF de grande pureza foi determinada por análise de aminoácidos após hidrólise com áci do clorídrico 6N. J. Controlo da contaminação de lipopolissacarídeos bacte- 22 22

rianos (LPS) A água utilizada para a preparação de todos os reagentes foi purificada por osmose inversa e redistilada em vidro pouco antes da sua utilização . 0 mate rial de vidro foi esterilizado durante 4 horas à temperatura o de 180 C. Em alguns casos, o LPS foi removido das colunas cromatográficas por tratamento com hidróxido de sódio 0,1N (26). A contaminação com LPS das fracções de RBSF, meio de cultura e reagentes de tratamento e de ensaio foi controlada por um ensaio de lisado com limulus amebócito cromogénico (Whittaker, MA Bioproducts, Walkersville, MD) com uma sensibilidade de cerca de 10 pg/ml. Rejeitaram-se as amostras contendo :> 0,3 ng/ml de LPS. 0 controlo da contaminação com lipopolissacarídeos é essencial, visto que o lipopoli^ sacarídeo é também um supressor potente da actividade de colapso respiratório de macrófagos.

K. Resumo da purificação de RBSF

No Quadro 1 apresenta-se um resumo da purificação de RBSF'. QUADRO 1

Resumo da purificação de RBSF

Actividade específica Recuperação Número de

Estádio r 1 2 (U/mg de proteína) (%) vezes de purificação TCM 9^ + 0,8 (7) 100 1,0 3 Extracto 222 + 21 (4) 106 + 11 23,7 Filtração por gel4 1008 + 174 (4) 46 + 8 108 Permuta anió- . 5 nica 1860 (2) 45 198 RPHPLC (difenilo) 6060 (2) 14 647 RPHPLC (C4)ê 57 534 + 3318 (3)7 2 6140

Media + SEM para vários lotes de TCM representados entre parênteses. Sete lotes foram processados por meio de filtração por gel e três por RPHPLC. Os resultados são apresentados para .menos fracções nos casos em que a actividade RBSF não foi medida em doses suficientes para permitir a indicação de unidades ou em que a proteína não foi medida. 2

Com referência a TCM 3

Extracção com etanol-ácido e precipitação com éter dietílico ^Biogel P60 -Έοηο Q 6 °Dois fraccionamentos em série 7

Corrigido para a contaminação de 50 % de albumina estimada. Exemplo 2

Inibição por RBSF e TGF-J^ s da libertação por macrófagos de intermédios oxigenados reactivos

Condicionou-se meio οζ -MEM suplementado com 10 % de soro de equino (Hyclone Laboratories, Logan,UT) por uma linha de mastocitoma P815 murina do modo descrito no Exemplo 1. Para as experiências com neutralização por anticorpos anti-TGF- β , preparou-se TCM isenta de soro (para evitar uma fonte exógena de TGF-3) e acidificou-se, neutralizou-se e dializou-se do modo descrito por Tsunawaki et al., supra, 1989, para activar moléculas relacionadas com TGF-β latentes e, em seguida, utilizou-se como uma frac-ção retida após filtração numa membrana YM-5 (extensão de peso molecular nominal 5 kilodaltons) (Amicon, Danvers, MA). Alternativamente, tal como se referiu, purificou-se RBSF a • Ρ

partir de TCM contendo soro mediante um procedimento em sete passos: extracção com ácido-etanol, precipitação com éter dietílico, cromatografia de exclusão de tamanhos, cromatoí .= grafia de permuta aniónica e 3 fases de cromatografia de fase inversa. Para os estudos de ligação a recep· tor, purificou-se RBSF apenas em 5 passos. A purificação foi observada por meio do ensaio de libertação de por

macrófagos, descrito em seguida, em que 1 unidade de RBSF se define como o volume necessário para inibir em 50 ? a libertação de Ho0 induzida por éster de forboL por macrófa- <- C. gos activados in vivo, após uma incubação de 24 horas em um volume final de 0,135 - 0,150 ml. Isto corresponde a 6,7 - 7,4 U/ml. Quando purificado, 1 unidade corresponde a cerca de 17,4 ng. A potência aparente de RBSF aumenta 10 vezes pelo prolongamento do bioensaio até 48 horas ( Szuro -Sudol & Nathan, supra, 1982). 0 TGF-^ humano (50 jig/ml ) TGF-j3 2 (20 pg/ral) e TGF-^ (30 jag/ml) eram proteínas re- combinantes purificadas até à homogeneidade a partir de células de ovários de hamster Chinês (Graycar et al., Mol.Endo-crinol. 3 (1989), 1977). Salvo indicação em contrário,nas referências à potência relativa das citoquinas, esta é baseada nas concentrações molares que originam 50 % da estimulação ou da inibição máximas.

Foi descrito em pormenor o ensaio em placa de microteste fluorescente para a libertação de Por / macrofagos peritoniais de murganho activados com caseinato (de La Harpe et al., supra, 1985). Adicionaram-se citoqui- 26

nas de teste a cultura de células peritoniais em o('-MEM com 10 % de soro de equino durante 24 horas. As monocamadas de células aderentes foram, em seguida, lavadas e colocadas em solução de cloreto de sódio tamponado com fosfato de Kreb*s-Ringer contendo glucose, azida de sódio para inibir a catalase, escopoletina como indicador fluorescente, peroxidase de rábano para catalisar a oxidação da escopoletina por e ace4omiristato de forbol para desencadear o colapso respiratório. A perda de fluorescência da escopoletina foi registada durante 1-3 horas, após as quais a quantidade de proteína celular aderente a cada cavidade no inicio do ensaio foi determinada do modo descrito anteriormente, sem se retirar o meio de ensaio. Os resufcados foram expressos em nmoles de por de proteína celular

aderente por unidade de tempo. A supressão da libertação de #2®2 "a^ófagos por RBSF apresenta-se na Figura 7B. A supressão da libertação de por adição de TGF-J3, TGF- ou TGF-j3^ está representada na Figura 7A, para comparação .

Exemplo 3

Inibição por RBSF e TGF-^s da libertação por maerófagos de intermédios azotados reactivos

Purificou-se RBSF a partir de meio condicio nado de células de mastocitoma Ρδ15, pelos procedimentos descritos no Exemplo 1. A sua actividade específica foi de - 27 - 5,7 x 10 unidades/mg de proteína. Define-se uma unidade "de RBSF como a quantidade de RBSF num volume de cultura final de 0,15 ml que origina 50 % de supressão da capacidade libertação de macróf’a-gos após uma incubação durante 24 ho ras. Uma unidade de RBSF por cavidade é equivalente a 6,7 unidades/ml. A potência de RBSF no ensaio para a supressão da capacidade libertadora de I^O d°s macrófagos aumenta1 por um factor cerca de 10 quando a incubação com os macrófa-gos se prolonga até 48 horas. 0 interferon-^ murino (5,2 x 10 unida-des/mg de proteína) e TNF-o< humano (4 x 10 unidades/mg de proteína) eram provenientes de Genentech , Inc. (South San Francisco, CA). 0 TGF-J3.J humano (50 μg/ml ) (Derynck et al., Nature, 31b ( 1985), 701 ), TGF-j3^ humano (30 pg/ /ml), Derynck et al., EMBO J. 7 (1988)) foram segregados por células de ovários de hamster Chinês transfectadas com vector de expressão utilizando o promotor citomegalovírus. Estes foram purificados até à homogeneidade aparente (Gray- g car et al., supra, 1989). Q IL-4murina (10 unidades/mg de proteínas) era proveniente de Immunex, Seattle, WA. 0 nível de contaminação com endotoxina (LPS) foi avaliado através de um ensaio de lisado com limu-lus amebócito cromogénico, do modo descrito no Exemplo 1. Todas as citoquinas nas diluições testadas continham menos de 20 pg/ml de LPS contaminante, excepto a IL-4 em que a quantidade de LPS foi cerca de 70 pg/ml na concentração mais alta testada. 0 LPS preparado por extracção por fenol a partir de Esoherichia coli 0111: ou de Salmonella minnesota (tipo selvagem) foi fornecido por List Biologi-cals Laboratories, Campbell, CA.

Cultura de macrófagos. Os murganhos CD1 fêmeas (8-12 semanas de idade) eram de Charles River Breeding Laboratories (Wilmington, MA), e foram mantidos no Research Animal Resource Center, no Cornell University Medicai College. Lavaram-se os macrófagos das cavidades peritoniais 4 dias após a injecção interperitonial de 2 ml de caldo de tiogli-colato a 4 %, do modo descrito por Ding et al., J. Immu-nol. 141 , 2407)· As monocamadas aderentes foram obtidas por placagem de 1 x 10 células/cavidade em placas de 96 cavidades (Costar Data Packaging, Cambridge, MA) em meio completo, constituído por o( MEM com 8 % de soro de vitela fetal inactivado pelo calor (Hyclone Laboratories, Logan, UT), 50 U/ml de penicilina e 50 ^ig/ml de estreptomicina. 0 nível de LPS no meio completo foi ^20 pg/ml. Após incu bação durante 2 horas à temperatura de 37°C em atmosfera de 5 % de C02/95 % de ar, retiraram-se as células não ade rentes por aspiração e adicionou-se meio completo recente mente preparado com citoquinas.

Ensaio para NOõ e NO^. A acumulação de nitrito no meio foi determinada por um ensaio colorimétrico automático com base na reacção de Griess (Green et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78 (1981), 7764). Em resumo, fizeram-se rea gir as amostras com sulfanilamida a 1 %, naftiletileno a 0,1 % - dicloridrato de diamina e 2,5 % de H^PO^, à temperatura ambiente durante 10 minutos e determinou-se a concentração de NOg por absorvância a 550 nm em comparação com padrões de nitrito de sódio. Quando apropriado, reduziu-se o nitrato da amostra para nitrito do modo descrito por Green et al., supra, 1981. Os resultados são expressos em nmoles de nitrito ou em nmoles de nitrito mais nitrato, por 10 células plaqueadas inicialmente.

Em todas as experiências, determinou-se também e substraiu--se o teor de nitrito das cavidades que continham um meio isento de células. A supressão por RBSF e TGF-^S , TGF-/^, TGF-fl 2 ^a libertação de nitrito induzida por y -interfe-ron apresenta-se na Figura 8A. A supressão de libertação de nitrito induzida por y -interferon mais TNF-o< apresenta-se na Figura 8B.

Exemplo 4

Actividade de RBSF em linhas de células não mielóides

Preparam-se citoquinas do modo descrito no Exemplo 2. - 30 -

A. Estimulação da proliferação de fibroblastos por RBSF

0 ensaio mitogénico em células NRK49-F foi efectuado essencialmente do modo descrito por Assoian et al., J. Biol. Chem., 258 (1983) 7155). Incubaram-se 3 4 x 10 células em οζ -MEM com soro de vitela a 10 % (BCS; Hy-Clone) durante uma noite em cavidades de fundo plano de 6 mm de diâmetro em placas com 96 cavidades (Cos-tar Data Packaging, Cambridge, MA). No dia seguinte, lavaram-se as células duas vezes com c^MEM e incubaram-se durante 2 dias em c<MEM com 0,2 % de BCS, à temperatura de 37°C, numa atmosfera com 5 % de C02· Em seguida, incubaram-se as células cujo crescimento foi interrompido, com citoquinas durante 24 horas. Quatro horas antes do fim da 3 jncubação, adicionou-se 1 ^iCi de H-metil-timidina (2 Ci/ /mmole, Dupont-New England Nuclear, Wilmington, DE), (Volume final, 200 jul) (utilizou-se a mesma quantidade da mes 3 ma preparação de H-timidina nos ensaios descritos em seguida). Para a contagem da cintilação líquida, lavaram-se as células com o( MEM e precipitou-se o DNA com TCA a 10 % arrefecido, lavou-se com etanol a 90 % e solubilizou-se com hidróxido de sódio 0,5 N.

Na Figura 9, apresenta-se a estimulação 3 da captação de H-timidina por fibroblastos de rim murino por RBSF e por TGF-/?1. - 31 B. Inibição da proliferação de células epiteiiais por

RBSF

Utilizaram-se células epiteiiais de marta (American Type Culture Collection CCL64) do modo des crito por Tucker et al., Science 236 (1984) 705). Cultiva- ram-se 3x10^ células em 200 μΐ de o< MEM com 1 % de BC-S durante uma noite à temperatura de 37°C e numa atmosfera com 5 % de C^· Lavaram-se as células e em seguida incubaram-se com citoquinas num volume total de 150 ^il durante 3 24 horas. Adicionou-se H-timidina durante as últimas 4-8 horas de incubação e preparou-se o DNA para a contagem de cintilação líquida, tal como se referiu anteriormente. A inibição por RBSF e TGF-β da capta-

O ção de JH-timidina nas células epiteiiais de marta, está representada na Figura 10.

C. Inibição da proliferação de células T

Sacrificaram-se por deslocação cervical murganhos BALB/C ou C57BL/6 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) e retiraram-se assepticamente os baços. Prepararam-se suspensões de células únicas do modo descrito por Kehrl et al., J.Exp. Med., 163 (1986) 1037 e suspen deram-se as células em í?<-MEM com 10 % de BCS. Cultivaram--se 5x10 células em cavidades de fundo plano com 6 mm de diâmetro em placas de 96 cavidades com 4 pg de concana- valina A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) com um volume total de 250 μΐ, durante 24 horas, seguida por uma lavagem com metil- cc-D-manosido 0,3M (Sigma) em 0(-MEM. Adicionaram-se citoquinas no o< -MEM com BCS a 1 % incubaram-se as placas durante 72 horas à temperatura de 37°C e numa atmo£ 3 fera com 5 % de CCt,. Adicionou-se H-timidina durante as últimas 24 horas, após o que as amostras foram submetidas a um classificador celular semi-automático(Cambridge, Technology Inc., Watertown, MA) para contagem da cintilação líquida. A inibição por RBSF e TGF-/) da capta- 3 ção de H-timidina nas células de baço de murganho estimulada com concanavalina A mitogénica de linfócitos-T selectiva, está representada nas Figuras 11B e 11 A, res-pectivamente.

Exemplo 5

Ausência de relação entre RBSF e TGF-/? s A. Incapacidade de anticorpos anti-TGF-/3 para neutralizar RBSF purificado A preparação de citoquinas e de anticorpos e os ensaios para a libertação de por macró- fagos estão descritos no Exemplo 1. Incubou-se RBSF,puri ficado de acordo com o método descrito no Exemplo 1, com o - 33

anticorpo anti-TGF-/? de peru que se liga especificamente a TGF- B ^ . 0 Quadro 2 demonstra que o anticorpo neutralizou completamente a actividade de TGF-β ^ nos macrófagos acti-vados mas não tive qualquer efeito sobre a actividade de RBSF nos macrófagos activados. QUADRO 2

Incapacidade do anticorpo anti-TGF-β para neutralizar RBSF purificado

Citoquina TGF-J3 13

Anticorpo Libertação de H202

Ig pré-imune 5 Ig imune 413 + 41 93 + 7 403 + 10

RBSF 6

IgG pré-imune

IgG imune 481 + 93 333 + 22 276 + 12 316 + 21

Os macrófagos foram incubados em M10, sozinho ou com as citoquinas indicadas, durante 24 horas, lavado e provoca- 1 2 - 34 - do cora acetomiristato de forbol.

Nmole/mg de proteína em 60 minutos (média + SEM de ensaios em triplicado) 3 3,5 ng/ml de TGF-^9 ^ puro proveniente de plaquetas porcinas. 4

Purificado mediante precipitação com sulfato de amónio de soro de peru e incluído no bioensaio a 40 ^ig/ml. 5

IgG de perú purificada N2 121, incluída no bioensaio a 64 jil/ml, suficiente para neutralizar completamente 10 ng/ml de TGF-y# neste ensaio. 6

Preparação final de uma segunda coluna , diluída até 0,26 ng/ml para provocar uma inibição parcial para aumentar a possibilidade da actividade inibidora neutralizante. B. Estudo de neutralização de anticorpo

Obtiveram-se anti-soros anti-TGF-/} provenientes de perus e coelhos do modo descrito por Daniel-pour et al., J.Cell Physiol, 138 (1989) 79. Incubaram- -se TCM acidificado transitoriamente, meio de controlo aci difiçado transitoriamente e TGF-β ^ ou TGF-/32 diluído em meio de controlo, com soro de coelho pré-imunizado ou imunizado (diluição final a 1:250) durante 30 minutos à temperatura de 37°C, seguido de adição de 25 jal de uma suspensão a 50 % de proteína-A agarose (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N). Em seguida, incubou-se a mistura - 35 -

durante 30 minutos com agitação intermitente e depois centri-fugou-se. Esterilizou-se o sobrenadante por filtração e ana lizou-se para determinação da actividade inibidora residual no ensaio de libertação de por macrófagos descrito em seguida. Alternativamente,incubaram-se as amostras para ensaio com o anti-soro de peru ou soro não imunizado (1: 125) durante 30 minutos à temperatura de 37°C e adicionaram-se directamente às culturas de macrófagos. 0 Quadro 3 demonstra que os anticorpos para TGF-/3 ^ e/ou TGF-y3 2nâ:o t®111 a°Çã0 sobre a actividade de RBSF nos macrófagos activados. Nesta experiência o RBSF é analisado em TCM e não é purificado. QUADRO 3

Incapacidade de anti-soros anti-TGF->0 para neutralizar ou imuno-depletar RBSF

Anticorpo Amostra

Meio de controlo TCM TGF-jg TGF-^ (8 (100 pl) (100 jul) (1 ng/ml) (hg/ml) H202 , nmol/mg proteína/180 min# celular

Nenhum 458 + 42 .Δ 47 + 7 47+2 44+6

Coelho pré-imunizado-f-f ’ 403 + 14 43 + 6 24 + 7 ND** - 36 - QUADRO 3 (Cont.)

Anticorpo

Amostra Meio de controlo TCM* TGF-^ tgf-^2 (8 (100 μΐ) (100 jAl) (1 ng/ml) ng/ml) , nmol/mg celular proteína/180 min#

Peru pré-imuni- 18+1 ND 211+8 ND 246 + 1 ND 601 + 42 ND ND 512 + 34 379 QÇ-TGF-/^ 2 tur 32 485 + 20 33 + 1 87 + 14 + 12 * para tornar moléculas semelhantes a TGF-/0 mais reactivas com anticorpos, o TCM e o meio de controlo foram acidificados, neutralizados e dialisados. zaao j-]· 463 + 16 e< -TGF- β 1 coe Har 572 + 31 o<-TGF-/3 1 per 367 427 + 43 <Á -TGF-/3 1 per 121 427 + 43 «•-TGF-/? 2 coe Sam 315 + 16 50 + 11 10 + 5 62 + 7 74+122 28 + 4

Anti-soros e soros de controlo utilizados para imuno -depleção a 1:250 (coelho) ou para neutralização a 1:125 (peru). A actividade em meio de controlo não tratado foi de 481 + +14. Os resultados são a média + SEM de 3 experiências, cada uma em triplicado. tt

Mistura de soros pre-imunizados de cada animal cujo anti--soro foi utilizado. % # Não determinado. C. Ligagão com receptores de TGF-/3 .

Iodaram-se 5 pg de TGF-y^^ recombinante pu rificado em veículo isento de proteína com 125· isento de veí-

I culo (Amersham, Arlington Heighst, IL) utilizando cloramina T (Sigma) do modo descrito por Frolik et al., 1984; Massague, 1987, até uma actividade espefífica de 133 ^Ci/jig, com base em 60 % de recuperação. Avaliou-se a ligação não específica na presença de um excesso de 100 a 200 vezes de TGF-não marcado por iodo radioactivo. A ligação com células NRK-49F e com células epiteliais de pulmão de marta realizou-se em cavidades de 16 mm de diâmetro em placas de 24 cavidades. Incubaram-se as monocamadas confluentes em tampão de ligação (o<f-MEM com 0,1 % de albumina de soro de bovino em Hepes 25 mM, pH 7,5) durante 2 horas à temperatura de 37°C e lavaram-se duas vezes com tampão de ligação antes da adição de 1 pr citoquinas como competidores potenciais de ligação de -'I TGF-^-i 100 pM num volume final de 375 jil. Após 1 hora à - 38

ο temperatura de 37 C, colocaram-se as placas sobre gelo. Lavaram-se as monocamadas 4 vezes com tampão de ligação arrefecido com gelo e solubilizaram-se em 1 % de Triton X-100, 10 % de glicerol e Hepes 25 mM, pH 7,5, para contagem γ . A ligação à linha de células de pituitária GH^ (American Type Culture Collection) foi testada do modo descrito por Chei-fetz et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 17225. Com base na ligação específica saturável de cloramina-T-TGF-marcado com iodo radioactivo a células NRK-49F (Figura 12), escolheu-se uma concentração de 100 pM de ^I-TGF-/^ ^ para estudar a capacidade de outras citoquinas para competirem com a sua ligação. Nos fibroblastos de rim de murino normal (Figura 12A) e nas células epiteliais de pulmão de marta (Figura 12B) TGF-/^ 2 e TGF-^ em um excesso molar de 40 a 50 vezes, cada um, diminuíram a ligação de TGF-/3 em cerca de 70-75 %. Em contraste, com concentrações que foram bio-activas nos mesmos tipos de células, o RBSF não mostrou inibição dependente da dose da ligação de TGF-y@^.

Exemplo 6

Identificação de uma linha de células humanas com activi-dade de supressão de colapso respiratório

Analisou-se a capacidade de quatro linhas de células humanas para suprimirem a libertação de H202 por macrófagos activados. Estas foram U937 (ATCC N2 CRL-1593) provenientes de um doente com linfoma histtócítico, HL-60 - 39 - (ATCC N2 CCL-240) provenientes de um doente com leucemia pro-mielocítica, TEF-1 (ATCC TIB-202) provenientes de um doente com leucemia monocítica e K-562 (ATCC NS CCL-243) provenientes de um doente com leucemia mielóide crónica. As linhas de células foram testadas e verificou-se serem negativas na presença de micoplasma e vírus (teste MAP), por microbio-logical Associates (Rockville, MD).

Preparou-se TCM a partir de linhas de células humanas por cultura das células em meio RFMI-1640 í.Cibco, Grand Island, NY) suplementado com L-glutamina até 2 mM e soro de equino até 10 %. Após incubação à temperatura o

dê 37 C durante quatro a cinco dias, aglomeraram-se as células por centrifugação a baixa velocidade. Analisou-se o TCM proveniente de cada linha de células relativamente à supressão do colápso respiratório e á presença de LPS, do modo descrito no Exemplo 1. Das quatro linhas de células humanas testadas, apenas o TCM proveniente de K562 evidenciou uma inibição de pelo menos 50 % da libertação de H,^. 0 TCM proveniente de outras linhas de células testadas teve pouca acção sobre a libertação de í^P^·

Exemplo 7

Supressão da actividade de colapso respiratório nos neutrofilos

Preparou-se meio condicionado por células - 40 -

de mastoeitoma de murganho P815 e células humanas K562 do modo descrito no Exemplo 6. A libertação de por neutró- filos bovinos que foram ou não tratados com jf -interferon foi analisada como uma função de quantidades crescentes de TCM do modo descrito no Exemplo 1. A supressão por TCM humano , mas não de murganhos da libertação de P^013 neutró- filos bovinos está representada na Figura 13. F 250 refere-se a TCM de células P815.

Exemplo 8

Purificação de RBSF a partir de meio de oultura da linha de células de leucemia humana K562

A. Bioensaio para actividade de RBSF

Observou-se a actividade de RBSF durante a purificação de acordo com o método descrito no Exemplo 1.

B. TCM

Cultivaram-se células K562, uma linha de células humana proveniente de um doente com leucemia mielóide , 5 crónica, com uma densidade inicial de 1 x 10 /ml em meio RPMI-1640 (Gibco, Grand Island,NY) suplementado com L-glu- tamina até 2 mM e soro de equino até 1 %. Incubaram-se as células à temperatura de 37°C durante quatro ou cinco dias antes da recolha. c.

Concentração da actividade de RBSF de TCM

Concentraram-se 65 litros de TCM por meio deum aparelho de ultrafiltração Pelicon até 3,2 litros e dia-lisou-se contra duas mudanças de 40 litros de ácido acético 1M/etanol a 40 % à temperatura de 4°C durante 40 horas. Cen-trifugou-se o material precipitado resultante e aproveitou-se o sobrenadante contendo RBSF activo. 0 aglomerado da centrifugação, que também exibia actividade de RBSF significativa, foi retomado com ácido acético 1M contendo etanol a 50 % e reextraído do modo descrito anteriormente. Dializaram-se os sobrenadantes resultantes contra 40 litros de ácido acético 1M. Este material concentrado continha 8,1 g de proteína total. D. Cromatografia em Biogel P60

Introduziram-se 200 mg de proteína, proveniente da extracçâo com ácido acético/etanol, em uma coluna de 1,95 litros de Biogel P60. Equilibrou-se a coluna com áci do acético 1M e eliminaram-se as proteínas com um caudal de cerca de 1 ml/minuto. Recolheram-se fracções e analizsram-se em relação ao material com absorção no ultravioleta a 280 nm e à actividade de RBSF (Figura 14), que neste exemplo é expresso como uma grandeza de fluorescência, que se relaciona com a libertação de , tal como se descreve no Exemplo 1.

Reuniram-se as fracções activas, (cerca de 275 ml) e concentrou-se por liofilização. A Figura 15 mostra a análise em SDS- - 42 -

-PAGE das fracções da coluna de Biogel P60. As fracções activas 80 a 96 eram predominantemente de polipéptidos que tinham um peso molecular inferior a cerca de 25 kilodaltons.

Para a purificação em grande escala, introduziram-se 1,75 g de proteína proveniente da extracçâo com ácido acético/etanol (cerca de 20 a 50 % da quantidade total extraída) de uma só vez, numa coluna de Biogel P60 com um leito de 13,6 litros. Foram necessárias quatro ou cinco impregnações para processar todo o extracto do ácido acético /etanol. Equilibou-se a coluna com ácido acético 1M e elui-ram-se as proteínas em caudal de cerca de 15 ml/minuto. Recolheram-se fracções de 50 ml e analisou-se 1 ml de cada fracção para determinação da absorvãncia a 280 nm e da acti-vidade de RBSF. Reuniram-se as fracções activas (1,8 litros por ensaio) e concentrou-se 50 a 100 vezes por liofilização ou por filtração através duma membrana filtrante YM-5 (Amicon, Danvers, MA) depois da adição de PEG-600 a 0,01 % para impedir a ligação de RBSF ao filtro. E. Cromatografia de permuta iónica

Dialisaram-se as fracções activas provenientes de 1,9 litros da cromatografia em Biogel P60, contra histidina 10 mM, pH 6,0, e aplicaram-se numa coluna de DEAE-SPW (3,7 ml de resina), equivalente a Mono Q, equilibrada no mesmo tampão. Tal como se descreveu no Exemplo 1, a - 43 - actividade RBSF não foi retida na coluna, sob estas condições. As proteínas ligadas eluiram com um gradiente linear de cloreto de sódio de zero a 2 M em tampão de histidina.

Aplicou-se o material proveniente do fluxo a uma coluna SP-5PW (3,7 ml de resina) sob as mesmas condições utilizadas na coluna de DEAE-5PW e eluiram-se as proteínas ligadas num gradiente de cloreto de sódio semelhante ao utilizado com a coluna de DEAE. Analisaram-se as fracções para determinação da absorvância a 280 nm (Figura 16) e, em seguida, reuniram-se e concentraram-se antes do ensaio para a actividade de RBSF. A mistura A continha o material do fluxo proveniente da coluna SP-5PW, a mistura B continha as fracções 1 a 4, a mistura C continha as fracções 5 a 6, a mistura D continha as fracções 8 e 9 e a mistura E continha as fracções 10 e 11. A análise de SDS-PAGE destas misturas apresenta-se na Figura 17. As misturas D e E apresentaram ambas actividade de RBSF, com actividade mais alta na mistura E. A mistura E é predominantemente um único polipé-ptido com peso molecular de cerca de 13 kilodaltons.

Com base nesta observação, reuniram-se e concentraram-se as fracções activas provenientes dos 13,6 litros. A cromatografia em biogel P60 aplicou-se directamente a uma coluna SP-5PW sob as condições citadas anteriormente.

Um gradiente linear de cloreto de sódio de zero a 0,4 M eluiu o total do material com absorção a 280 nm que se tinha'ligado à coluna. As fracções recolhidas durante a eluição do gradi- - 44

% ente foram analisadas para determinação da actividade RBSF. 0 material proveniente da mistura E (ceroa de 3 pg) foi'; concentrado e aplicado a uma coluna de fase inversa difení-lica, equilibrada com TFH a 0,1 %, e eluiu num gradiente crescente de acetonitrilo em TF A a 0,1 /5, tal como se descreve no Exemplo 1. As fracções activas que eluiram da coluna de fase inversa difenílica foram em seguida purificadas numa coluna de fase inversa equilibrada com TFA a 0,1 % (fase A). A fase B era acetonitrilo a 100 % em TFÁ a 0,1 %. Em: ambos os passos analisaram-se as fracções para determinação da absorvãncia no ultravioleta e da actividade de RBSF.

Exemplo 9

Sequência dos aminoácidos do péptido triptioo de RBSF humano

Reduziram-se aproximadamente 3 pg da mistura E descrita no Exemplo 7 com ditiotreitol e alquilaram-se com iodoácétato para os resíduos de cisteína carboximetilados. Digeriu-se a proteína modificada com tripsina durante 14 horas e cromatografaram-se os fragmentos trípticos por HPLC de fase inversa. Detectaram-se várias fracções do péptido principal. A sequência do fragmento T-21 é : (Q)

A-G-L-H-S-P-T-P - (C)-V

Embora a presente invenção tenha sido descrita relativamente aos seus aspectos preferidos, considera--se que ocorrerão aos técnicos outras variantes e modificações. - 45 - - 45 -

Portanto, entende-se que as reivindèéaçdes apensas abrangem estas variantes equivalentes que estão dentro do âmbito da presente invenção tal como reivindicada.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. - Processo para a preparação de um factor de supressão do colapso respiratório purificado, caracterizado pelo facto: a) de se cultivar uma linha de células que produz o factor de supressão do colapso respiratório; e b) de se isolar o factor de supressão do colapso respiratório do meio de cultura da linha de células.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o factor obtido ter um peso molecu lar de cerca de 13000 daltons tal como determinado por SDS-PAGE.
3. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se associar covalentemente o factor obtido com um composto marcado que permite a detecção do factor.
4. 4.- Processo de acordo com. a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o factor em questão ser um factor

   de supressão do colapso respiratório murino.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo facto de o factor em questão ser o factor de supressão do colapso respiratório humano.
6. 6. - Anticorpo, caracterizado pelo facto de ligar especificamente o factor de supressão do colapso respiratório.
7. 7. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de ser monoclonal.
8. 8. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a linha de células da fase (a) ser K562 (A.T.C.C. N2 CCL-243).
9. 9. - Método de acordo com a reivindicação 1, cara£ terizado pelo facto de a fase (b) compreender: submeter material que contém factor de supressão do colapso respiratório a filtração sobre gel; submeter o material filtrado sobre gel a croma tografia de permuta iónica; e submeter o material de permuta iónica a um ou -48- mais ciclos de cromatografia líquida de fase inversa-alta pressão.
10. 10.- Processo para a preparação de composições far macêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um factor preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1 com diluentes, adjuvantes ou veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.
11. 11.- Método para o tratamento de uma perturbação inflamatória em um mamífero, nomeadamente uma perturbação inflamatória resultante de uma doença autoimune, podendo a doen ça autoimune ser artrite reumatõide ou lúpus eritematoso sistémico, de tuna inflamação pulmonar e das passagens aéreas distais, podendo a perturbação inflamatória ser asma, enfisema, sarcoidose ou síndroma da exaustão respiratória no adulto, de uma inflamação da pele ou do tegumento, podendo a doença inflamatória ser psoríase, de doenças inflamatórias do intestino ou da administração de um factor macrófago de activação, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade tera peuticamente eficaz compreendida entre 0,1 e 1000 ^ug/kg de peso do corpo de um factor preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1. -49-
12. 12.- Métoác de acordo com a reivindicação 11, ca-ractarizaco pelo facto de o factor macrófagc de activaçãc sar gaua-interíeron ou uma combinação de gama-interferon e factor alfa da necrose tumoral.
13. 13. - Método para o tratamento de uma ferida em um mamífero, caracterizado pelo facto de se administrar a esse mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz compreendida entre 0,1 e 1000 jig/kg de peso do corpo de um factor preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1.
14. 14. - Método para a supressão da resposta imune em um mamífero, caracterizado pelo facto de se administrar a es· se mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz compreendida entre 0,1 e 1000 ^u.g/kg de peso do corpo de um factor preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1. 9 Agente Oficial da Propriedade Industrial \