BR122020000059B1

BR122020000059B1 - Composição que compreende uma matriz biocompatível e um fator de crescimento derivado de plaqueta e kit

Info

Publication number: BR122020000059B1
Application number: BR122020000059-7A
Authority: BR
Inventors: Samuel E. Lynch; Leslie A. Wisner-Lynch; Hans K. Kestler; Yanchun Liu
Original assignee: Biomimetic Therapeutics, Inc
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2009-09-09
Publication date: 2020-12-15
Also published as: AU2009291828B2; CN102231992B; US10556039B2; BRPI0918611B8; US20160184482A1; IL211592A0; JP5816553B2; CA2735885A1; AU2009291828A1; WO2010030714A8; EP2341951A2; JP2018030895A; WO2010030714A3; JP6577232B2; US8870954B2; AU2009291828C1; JP2015178511A; US20200139013A1; US20100174368A1; ZA201101405B

Abstract

a presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de lesões de tendão e ligamento e/ou para o reparo de tendões e ligamentos danificados. a invenção refere-se a composições que compreendem uma matriz biocompatível e um fator de crescimento derivado de plaqueta (pdgf).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do pedido provisório U.S. No 61/191.641, depositado em 9 de setembro de 2008, pedido provisório U.S. No 61/144.088, depositado em 12 de janeiro de 2009, e pedido provisório U.S. No 61/144.126, depositado em 12 de janeiro de 2009; cujos conteúdos estão aqui incorporados, a título de referência na totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] Esta invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de lesões de tendão ou ligamento, como tendões ou ligamentos rompidos, danificados, dilacerados, ou cortados ou separação do tendão ou ligamento do osso, e, em particular, a métodos para o tratamento de lesões de tendão ou ligamento através da administração de composições que compreendem uma matriz biocompatível em combinação com o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Os tendões e ligamentos são fibras rígidas que conectam o músculo ao osso ou um osso a outro osso, mas os tendões e ligamentos podem ser rompidos, danificados ou desprendidos do osso devido a uma variedade de razões. Estas lesões de tendão ou ligamento podem ocorrer, geralmente, por causa ou como resultado de trauma direto ao tendão/ligamento afetado, enfraquecimento do tendão/ligamento devido à idade avançada, carregamento excêntrico, movimentos repetitivos, uso excessivo e/ou estresse ou atividade aumentada. Estas lesões agudas são muito radicais e geralmente deixam o indivíduo incapaz de movimentar a articulação afetada.

[004] As áreas mais comuns de ruptura de tendão, corte de tendão, ou desprendimento do osso são (1) o quadríceps (um grupo de quatro músculos, o vasto lateral, o vasto medial, o vasto intermédio e o reto femoral) que se encontram logo acima da rótula (patela) para formar o tendão patelar; (2) o tendão de Aquiles, localizado na porção de trás (posterior) pé logo acima do calcanhar. O tendão de Aquiles serve como a ligação do músculo da panturrilha (músculo gastrocnêmio) ao calcanhar do pé (o osso calcâneo); (3) o manguito rotador, localizado no ombro e composto de quatro músculos (o supraespinhal (o tendão mais comumente rompido), infraespinhal, músculo redondo menor, e subescapular); (4) o bíceps do braço, que funciona como um flexor do cotovelo. As rupturas do bíceps são classificadas nos tipos proximal (próximo) e distal (distante); e (5) os tendões flexores da mão, como o flexor breve e longo. As áreas mais comuns de ruptura de ligamento, corte de ligamento, ou desprendimento do osso são o ligamento cruzado anterior (ACL), o ligamento cruzado posterior (PCL), e o ligamento colateral medial (MCL). Para quase todas as lesões tendão e ligamento pode haver dor considerável (aguda ou crônica), perda do movimento e fraqueza da articulação ou membro afetado. Para um tendão/ligamento rompido ou desprendido, a cirurgia é o curso de tratamento mais comum de modo a prender o tendão ou ligamento ao seu osso, ou reconectar as extremidades rompidas ou cortadas do tendão/ligamento afetado. Para outras lesões de tendão/ligamento, os tratamentos comuns incluem repouso, gelo, NSAIDs, injeções de corticoesteroides, calor, e ultrassom. Entretanto, apesar de décadas de pesquisa e crescente atenção clínica a estas lesões, seus resultados clínicos ainda são imprevisíveis.

[005] Com relação ao quadríceps, a ruptura do tendão patelar é uma lesão relativamente infrequente, porém desabilitante, que é mais comumente observada em paciente com menos que 40 anos de idade. Ela tende a ocorrer durante atividades atléticas quando uma contração violenta do grupo muscular do quadríceps é suportada pelo joelho flexionado. A ruptura representa, geralmente, o estágio final de uma tendinopatia degenerativa resultante de microtraumas repetitivos ao tendão patelar.

[006] Com relação ao tendão de Aquiles, tanto atletas como não atletas possuem risco para o desenvolvimento de lesões em todas as idades, com a maioria das lesões ocorrendo em homens com idades entre 30 e 50 anos de idade (Boyden, E., et al., Clin Orthop, 317:150158 (1995); Hattrup, S. e Johnson, K, Foot and Ankle, 6: 34-38 (1985); Jozsa, L., et al., Acta Orthop Scandinavica, 60:469-471 (1989)). A tendinite e tendinose de Aquiles também são comuns em indivíduos cujo trabalho impõe estresse sobre seus tornozelos e pés, assim como em "lutadores de final de semana," aqueles que são menos condicionados e participam de atividades atléticas apenas aos finais de semana ou com pouca frequência.

[007] No caso de lesões do manguito rotador, apesar dos avanços na instrumentação e técnicas cirúrgicas, as técnicas atuais não satisfazem a produção de reparo duradouro, com alguns estudos citando taxas de insucesso de até 94%. O insucesso de reparos de tendão pode ser atribuído à cura insatisfatória do tendão danificado e da refixação insatisfatória do tendão lesionado ao osso.

[008] Uma fixação firme do ligamento ao osso também é essencial para muitos procedimentos de reconstrução de ligamento. Procedimentos de substituição de ligamento bem sucedidos, como a reconstrução do ligamento cruzado anterior, exigem fixação de um enxerto de tendão no interior de um túnel do osso e crescimento interno progressivo de osso dentro do tendão para criar uma fixação biológica entre o osso e o tendão. Estudos histológicos e biomecânicos mostram que geralmente são necessários seis a doze semanas após o transplante de um enxerto de tendão para o osso atingir o crescimento interno de osso, fixação do tendão do osso, mineralização, e maior continuidade da fibra de colágeno entre o tendão e o osso. Vide, Rodeo S.A. et al., Tendon-Healing in a Bone Tunnel, 75(12): 1795-1803 (1993).

[009] Consequentemente, existe uma necessidade em fornecer novas composições e novos métodos de tratamento para várias lesões de tendão/ligamento e fixação do tendão/ligamento ao osso para otimizar a resposta de cura associada a reparos cirúrgicos ou outros tratamentos não-cirúrgicos.

[0010] Todas as referências aqui citadas, incluindo, sem limitação, patentes, pedidos de patente, e referências científicas, estão aqui incorporadas, por referência nas suas totalidades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A presente invenção apresenta composições e métodos de tratamento de lesões de tendão ou ligamento.

[0012] Em um aspecto da invenção, é fornecida uma composição que compreende uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas.

[0013] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratamento de uma lesão de tendão ou uma lesão de ligamento que não envolve um osso em um indivíduo, que compreende administrar a um local afetado da lesão do indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende: uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, a etapa de estabilizar mecanicamente a lesão de tendão ou ligamento. Em algumas modalidades, a etapa de estabilizar a lesão de tendão ou ligamento compreende suturar a lesão de tendão ou ligamento, em que o tendão ou ligamento suturado é posicionado para que as extremidades do tendão ou ligamento lesionado sejam substancialmente reaproximadas. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende administrar ao local afetado da lesão do dito indivíduo a quantidade eficaz da composição com o uso de uma seringa.

[0014] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para fixar ou refixar um tendão a um osso em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) a uma interface entre o tendão e o osso, em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas.

[0015] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para fixar ou refixar um ligamento a um osso em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) a uma interface entre o ligamento e o osso, em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas.

[0016] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit para o tratamento de uma lesão de tendão ou ligamento que não envolve um osso em um indivíduo, que compreende um primeiro recipiente que compreende uma matriz biocompatível e um segundo recipiente que compreende uma solução de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas.

[0017] Em ainda um outro aspecto, a invenção fornece um kit para fixar um tendão ou um ligamento a um osso em um indivíduo, que compreende um primeiro recipiente que compreende uma matriz biocompatível e um segundo recipiente que compreende uma solução de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas.

[0018] Qualquer uma das composições descritas na presente invenção pode ser usada em qualquer um dos métodos ou kits aqui descritos. As várias modalidades descritas a seguir podem ser usadas em conjunto com quaisquer aspectos da invenção, como seria evidente para um versado na técnica.

[0019] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 80% a cerca de 95%, cerca de 85% a cerca de 95%, cerca de 85% a cerca de 90%, cerca de 90% a cerca de 92%, ou cerca de 92% a cerca de 95%.

[0020] Em algumas modalidades, os poros possuem uma área média na faixa de cerca de 800 μm2 a cerca de 3.000 μm2, cerca de 13.000 μm2 a cerca de 50.000 μm2, cerca de 2500 μm2 a cerca de 20.000 μm2, cerca de 4500 μm2 a cerca de 20.000 μm2, cerca de 5000 μm2 a cerca de 19.000 μm2, cerca de 6000 μm2 a cerca de 18.000 μm2, cerca de 6000 μm2 a cerca de 15.000 μm2, ou cerca de 5000 μm2 a cerca de 16000 μm2.

[0021] Em algumas modalidades, os poros possuem um perímetro médio na faixa de cerca de 100 μm a cerca de 200 μm, cerca de 400 μm a cerca de 800 μm, cerca de 200 μm a cerca de 500 μm, cerca de 200 μm a cerca de 600 μm, cerca de 300 μm a cerca de 600 μm, ou cerca de 300 μm a cerca de 500 μm.

[0022] Em algumas modalidades, os poros possuem diâmetros médios na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 1 mm. Em algumas modalidades, os poros possuem diâmetros médios de pelo menos cerca de 5 μm, pelo menos cerca de 10 μm, pelo menos cerca de 20 μm, pelo menos cerca de 30 μm, pelo menos cerca de 40 μm, ou pelo menos cerca de 50 μm, cerca de 5 μm a cerca de 500 μm, cerca de 10 μm a cerca de 500 μm, cerca de 50 μm a cerca de 500 μm, cerca de 100 μm a cerca de 500 μm, ou cerca de 100 μm a cerca de 300 μm.

[0023] Em algumas modalidades, os poros compreendem poros interconectados.

[0024] Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, cerca de 50% a cerca de 95%, cerca de 60% a cerca de 95%, cerca de 70% a cerca de 95%, cerca de 80% a cerca de 95%, cerca de 90% a cerca de 95%, cerca de 50% a cerca de 85%, cerca de 60% a cerca de 85%, cerca de 70% a cerca de 85%, ou cerca de 50% a cerca de 80% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, cerca de 50% a cerca de 95%, cerca de 60% a cerca de 95%, cerca de 70% a cerca de 95%, cerca de 80% a cerca de 95%, cerca de 90% a cerca de 95%, cerca de 50% a cerca de 85%, cerca de 60% a cerca de 85%, cerca de 70% a cerca de 85%, ou cerca de 50% a cerca de 80% do PDGF é liberado dentro de cerca de 1 hora, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, ou cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, liberação do PDGF é medida in vivo. Em algumas modalidades, a liberação do PDGF é medida in vitro. Em algumas modalidades, o PDGF é liberado no interior da região circundante. Em algumas modalidades, o PDGF é liberado sobre um tendão ou ligamento lesionado. Em algumas modalidades, o PDGF é liberado sobre a superfície do osso próximo ao ponto de fixação osso-tendão ou osso- ligamento. Em algumas modalidades, o PDGF é liberado no interior do meio circundante.

[0025] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é reabsorvida dentro de cerca de 1 mês, cerca de 3 meses, cerca de 6 meses, ou cerca de 9 meses da administração in vivo. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é reabsorvida dentro de cerca de 30 dias, cerca de 25 dias, cerca de 21 dias, cerca de 18 dias, cerca de 15 dias, cerca de 10 a 14 dias, ou cerca de 10 dias da administração in vivo.

[0026] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende colágeno. Em algumas modalidades, o colágeno compreende colágeno tipo I. Em algumas modalidades, o colágeno é reticulado.

[0027] Em algumas modalidades, o colágeno é solúvel. Em algumas modalidades, o colágeno é insolúvel. Em algumas modalidades, o colágeno compreende um componente monomérico de colágeno solúvel e um componente polimérico de colágeno insolúvel. Em algumas modalidades, a razão entre os monômeros de colágeno solúvel e os polímeros de colágeno insolúvel é de cerca de 1:10, cerca de 1:9, cerca de 1:8, cerca de 1:7, cerca de 1:6, cerca de 1:5, cerca de 1:4, cerca de 1:3, cerca de 1:2, ou cerca de 1:1.

[0028] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende, adicionalmente, um glicosaminoglicano. Em algumas modalidades, o glicosaminoglicano é sulfato de condroitina. Em algumas modalidades, o glicosaminoglicano não é sulfato de condroitina.

[0029] Em várias modalidades, a composição é um gel, partícula, pó, pasta, folha, bloco, emplastro, ou esponja. Em algumas modalidades, a composição é fluxível.

[0030] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é COLLATAPETM. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é BIOBLANKET®. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível não é BIOBLANKET®. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível não oxida PDGF.

[0031] Em algumas modalidades, o PDGF está presente como uma solução que compreende PDGF, em que a concentração de PDGF na solução é de cerca de 0,1 a cerca de 10,0 mg/ml, cerca de 5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml, cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0,4 mg/ml, ou cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml. Em algumas modalidades, a solução de PDGF é de cerca de 0,15 mg/ml, cerca de 0,3 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 2,0 mg/ml, ou cerca de 10,0 mg/ml.

[0032] Em algumas modalidades da presente invenção, o PDGF é um homodímero de PDGF, em outras modalidades, o PDGF é um heterodímero, incluindo, por exemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF- AB, PDGF-CC, PDGF-DD, e misturas e derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o PDGF compreende PDGF-BB. Em outras modalidades, o PDGF compreende um PDGF humano recombinante (rh), tal como PDGF-BB humano recombinante (rhPDGF-BB).

[0033] Em algumas modalidades da presente invenção, o PDGF é um fragmento de PDGF. Em algumas modalidades, o rhPDGF-B compreende os seguintes fragmentos: as sequências de aminoácido 1-31, 1-32, 33-108, 33-109, e/ou 1-108 da cadeia B inteira.

[0034] Em algumas modalidades, as células infiltram a composição da presente invenção dentro de cerca de 3 semanas, cerca de 2 semanas, cerca de 1 semana, cerca de 7 dias, cerca de 6 dias, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, ou cerca de 1 dia(s) após a exposição à composição. Em algumas modalidades, as células são tenócitos. Em algumas modalidades, as células são osteoblastos. Em algumas modalidades, as células são células de ligamento.

[0035] Em algumas modalidades, as composições e os métodos da presente invenção são úteis na fixação de tendões ao osso ou ligamentos ao osso, e podem ser aplicados a qualquer fixação de tendão ou ligamento. Em algumas modalidades, as composições e os métodos da presente invenção intensificam a fixação do tendão ao osso ou a fixação do ligamento ao osso através do fortalecimento do tendão e/ou osso e ligamento e/ou osso no local da fixação do tendão/ligamento ao osso. Outros tipos de tendões e/ou ligamentos danificados ou lesionados, como um tendão/ligamento que exibe laceração, delaminação, e/ou qualquer outro estiramento ou deformação podem, também, ser tratados pelos métodos da invenção. Um único tipo de lesão pode ser tratada, ou mais de um tipo de lesão pode ser tratada simultaneamente. Em algumas modalidades, o tratamento envolve tratar um tendão. Em algumas modalidades, o tratamento envolve tratar um ligamento. Em algumas modalidades, um enxerto de tendão é usado para o tratamento específico dos tecidos do tendão e/ou ligamento. Em outras modalidades, um enxerto de ligamento é usado para o tratamento específico dos tecidos do tendão e/ou ligamento.

[0036] Em algumas modalidades, as composições e os métodos da presente invenção são úteis na fixação ou refixação de tendões ao osso e em quaisquer lesões de tendão que não envolvem um osso. Em algumas modalidades, as composições e os métodos da presente invenção são úteis para acentuar a fixação ou refixação de tendões ao osso e quaisquer lesões de tendão que não envolvem um osso. Em outras modalidades, as composições e os métodos da presente invenção são úteis na fixação ou refixação de ligamentos ao osso e em quaisquer lesões de ligamento que não envolvem um osso. Em outras modalidades, as composições e os métodos da presente invenção são úteis para acentuar a fixação ou refixação de ligamentos ao osso e quaisquer lesões de ligamento que não envolvem um osso.

[0037] Em algumas modalidades, o tendão que pode ser tratado pelas composições e métodos da presente invenção inclui, mas não se limitam aos tendões do subescapular, supraespinhal, infraespinhal, músculo redondo menor, reto femoral, tibial posterior, quadríceps femoral, bíceps braquial, assim como o tendão de Aquiles, o tendão patelar, os tendões abdutor e adutor, ou outros tendões do quadril, o tendão extensor comum, o tendão flexor comum, os tendões flexores digitais superficiais, tendões extensor digital e extensor do dedo mínimo, ou outros tendões do braço e das mãos. Em algumas modalidades, o tendão que pode ser tratado pelas composições e métodos da presente invenção é selecionado do grupo que consiste em: tendão patelar, tendão tibial anterior, tendão de Aquiles, tendão flexor do joelho, tendão semitendinoso, tendão do gracilis, tendão abdutor e tendão adutor. Em algumas modalidades, o tendão que pode ser tratado pelas composições e métodos da presente invenção é selecionado do grupo que consiste em: tendão supraespinhal, tendão infraespinhal, tendão subescapular, tendão do músculo redondo menor (complexo do manguito rotador), tendão flexor, tendão do reto femoral, tendão tibial posterior, e tendão do quadríceps femoral. Em algumas modalidades, o tendão que pode ser tratado pelas composições e métodos da presente invenção é selecionado do grupo que consiste em: tendão patelar, tendão tibial anterior, tendão de Aquiles, tendão flexor do joelho, tendão semitendinoso, tendão do gracilis, tendão abdutor, tendão adutor, tendão supraespinhal, tendão infraespinhal, tendão subescapular, tendão do músculo redondo menor (complexo do manguito rotador), tendão flexor, tendão do reto femoral, tendão tibial posterior, e tendão do quadríceps femoral. Em algumas modalidades, o tendão que pode ser tratado pelas composições e métodos da presente invenção não é selecionado do grupo que consiste em: tendão supraespinhal, tendão infraespinhal, tendão subescapular, tendão do músculo redondo menor (complexo do manguito rotador), tendão flexor, tendão do reto femoral, tendão tibial posterior, e tendão do quadríceps femoral.

[0038] Em algumas modalidades, o ligamento que pode ser tratado pelas composições e métodos da presente invenção é selecionado do grupo que consiste em: ligamento cruzado anterior, ligamento colateral lateral, ligamento cruzado posterior, ligamento colateral medial, ligamento cruzado cranial, ligamento cruzado caudal, ligamento cricotireoideo, ligamento periodontal, ligamento suspensor da lente, ligamento sacroilíaco anterior, ligamento sacroilíaco posterior, ligamento sacrotuberoso, ligamento sacro-espinhoso, ligamento púbico inferior, ligamento púbico superior, ligamento suspensor, ligamento radiocarpal palmar, ligamento radiocarpal dorsal, ligamento colateral ulnar, e ligamento colateral radial.

[0039] Em algumas modalidades, os ossos que podem ser tratados pelas composições e métodos da presente invenção incluem, mas não se limitam, por exemplo, a tíbia, ao fêmur, e ao úmero.

[0040] Em algumas modalidades, a lesão de tendão ou ligamento que não envolve um osso é uma ruptura, corte, laceração, delaminação, estiramento, ou deformação de tendão ou ligamento.

[0041] Em algumas modalidades, a fixação do tendão ao osso é para o tratamento de lesão do manguito rotador. Em algumas modalidades, a fixação do tendão ao osso ou ligamento ao osso é para a reconstrução do ligamento cruzado anterior.

[0042] Em algumas modalidades, é fornecido um método para o tratamento de uma lesão de tendão ou ligamento em um indivíduo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que o PDGF está em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml; e em que a matriz biocompatível forma uma estrutura porosa que compreende poros com um tamanho da área do poro na faixa de cerca de 4500 μm2 a cerca de 20000 μm2 e um tamanho do perímetro do poro na faixa de cerca de 200 μm a cerca de 500 μm.

[0043] Em algumas modalidades, é fornecido um método para o tratamento de uma lesão de tendão ou ligamento em um indivíduo, que compreende administrar a uma local afetado da lesão do dito indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que o PDGF está a uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml; e em que a composição é fluxível.

[0044] Em algumas modalidades, é fornecido um método para fixar um tendão a um osso ou um ligamento a um osso em um indivíduo que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) a uma interface entre o tendão e o osso ou o ligamento e o osso, em que a matriz biocompatível forma uma estrutura porosa que compreende poros com uma porosidade maior que cerca de 85%.

[0045] Em algumas modalidades, é fornecido um método para fixar um tendão a um osso em um indivíduo para reconstrução do ligamento cruzado anterior, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) a uma interface entre o tendão e o osso, em que a matriz biocompatível forma uma estrutura porosa que compreende poros com uma porosidade maior que cerca de 85%.

[0046] Em algumas modalidades da presente invenção, o método pode ser realizado com o uso de técnicas artroscópicos, técnicas endoscópicas, técnicas laparoscópicas, ou quaisquer outras técnicas minimamente invasivas adequadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0047] A figura 1 representa o rhPDGF-BB cumulativo liberado de diferentes matrizes de colágeno ao longo de 24 horas.

[0048] A figura 2 representa a porcentagem de rhPDGF-BB liberado de diferentes matrizes de colágeno ao longo de 24 horas.

[0049] A figura 3 representa a biopotência de rhPDGF-BB após liberação de diferentes matrizes de colágeno.

[0050] A figura 4 representa um exemplo de tendão de Aquiles cortado estabilizado por sutura.

[0051] A figura 5 representa um exemplo de administração de uma composição um tendão de Aquiles lesionado estabilizado de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0052] As figuras 6A a 6B mostram os resultados do pré- condicionamento cíclico (alongamento no condicionamento e alongamento de pico a pico) do tratamento de reparo de tendão de Aquiles A) incluindo dois espécimes afetados por hematoma e B) excluindo dois espécimes afetados por hematoma.

[0053] As figuras 7A e 7B mostram os resultados do teste de resistência à ruptura (força final na ruptura da construção e rigidez global da construção) do tratamento de reparo do tendão de Aquiles.

[0054] A figura 8 mostra os resultados de rigidez do tecido de reparo do tratamento de reparo do tendão de Aquiles incluindo ou excluindo os dois espécimes afetados por hematoma (painel da esquerda e painel da direita, respectivamente).

[0055] As figuras 9A a 9D representam seções histológicas de implantes de colágeno A (painel a), B (painel b), C (painel c), e D (painel d) 3 semanas após a implantação. Legenda: B = osso; C = colágeno; a seta indica colágeno não degradado. Bar de escala = 200 μm

[0056] A figura 10 representa o desprendimento do tendão do extensor longo dos dedos, envolvimento do tendão do extensor longo dos dedos com uma esponja de colágeno, rosqueamento através do túnel do osso tibial, e fixação ao córtex medial. A figura foi retirada de Rodeo S.A. et al., Am. J. Sports Med. 27:476-488 (1999).

[0057] As figuras 11A a 11C representam uma vista lateral do procedimento cirúrgico que inclui a formação de um túnel através da metáfise tibial. A figura foi retirada de Rodeo S.A. et al., J. Bone Joint Surg. Am., 75(12): 1795-1803 (1993).

[0058] A figura 12 representa a orientação dos espécimes histológicos. Cada bloco será divido igualmente longitudinalmente através do túnel do osso e usado para cortar seções transversais e seções longitudinais de extensão completa.

[0059] A figura 13 representa a microtomografia (micro CT) de um espécime. A figura foi retirada de Rodeo S.A. et al., J. Bone Joint Surg. Am., 75(12): 1795-1803 (1993).

[0060] A figura 14 representa um modelo artroscópico do tipo "Bench Top".

[0061] A figura 15 mostra imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura (SEM) de matrizes de BIOBLANKET® a 5% (painel a), 6% (painel b), 7% (painel c), e COLLATAPE® (painel d) semeadas com tenócitos ovinos com a adição de rhPDGF-BB ao meio de cultura a uma concentração final de 30 ng/ml.

[0062] A figura 16 mostra os resultados do pré-condicionamento dinâmico do tratamento de lesão do manguito rotador. Figura 16A: Os grupos com 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB e 0,30 mg/ml de rhPDGF-BB foram submetidos a significativamente mais alongamento no condicionamento do que os grupos apenas com sutura e com sutura + matriz de colágeno. Figura 16B: Não houve qualquer diferença significativa no alongamento de pico a pico entre os grupos.

[0063] A figura 17 mostra os resultados do teste de resistência à ruptura do tratamento de lesão do manguito rotador. Figura 17A: O aumento do reparo com 0,15 mg/ml e 0,30 mg/ml de rhPDGF-BB resultou em um aumento de 63,7% e 63,3% na carga para falha em relação ao grupo apenas com sutura, respectivamente. Figura 17B: Doses menores de rhPDGF-BB de 0,15 mg/ml e 0,30 mg/ml tiveram melhor desempenho que a dose maior de 1,0 mg/ml de PDGF, se manifestando como um aumento de 120% e 119,3%, respectivamente, na carga na ruptura.

[0064] A figura 18 é uma representação gráfica de classificações histopatológicas agrupadas por tratamento de 1) sutura + matriz de colágeno + 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB ou 2) sutura + matriz de colágeno + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB. As médias são mostradas e as barras de erro representam o desvio padrão.

[0065] A figura 19 é uma representação gráfica das classificações histopatológicas agrupadas por tratamento de 1) apenas sutura; 2) sutura + matriz de colágeno em tampão de acetato ou 3) sutura + matriz de colágeno + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB. As médias são mostradas e as barras de erro representam o desvio padrão.

[0066] A figura 20 mostra a região de interdigitação do colágeno do tendão (nos retângulos) com osso na interface de fibrocartilagem (setas). A: sutura + matriz de colágeno, 20X. B: sutura + matriz de colágeno + 0,3 mg/ml (ou 150 μg) de rhPDGF-BB, 20X.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0067] A presente invenção se baseia, em parte, na observação de que matrizes biocompatíveis que compreendem fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) podem ser usadas no tratamento de lesões de tendão ou ligamento que não envolvem o osso e para reparo de tecidos tendão-osso e ligamento-osso.

[0068] A presente invenção usará, exceto onde indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), biologia celular, bioquímica, química de ácido nucleico, e imunologia, que são bem conhecidas dos versados na técnica. A presente invenção também usará, exceto onde indicado em contrário, técnicas e equipamentos convencionais de cirurgia e outros métodos médicos, que são bem conhecidos dos versados na técnica. A menos que definido de outro modo, os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica a qual a invenção pertence.

[0069] Para os propósitos de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e sempre que apropriado, os termos usados no singular incluirão, também, o plural e vice-versa. Caso qualquer definição descrita abaixo entre em conflito com qualquer documento aqui incorporado a título de referência, a definição descrita abaixo prevalecerá.

[0070] Para uso na presente invenção, exceto onde especificado em contrário, o termo "tratamento" ou "tratar" refere-se a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e fator de crescimento derivado de plaqueta, que alivia, retarda a progressão, acelera a cura, melhora a resposta de cura, ou repara uma patologia para a qual o indivíduo está sendo tratado, e/ou que resulta em um ou mais efeitos terapêuticos ou clínicos desejáveis ou que inclui, mas não se limita ao alívio de dor associada com um tendão ou ligamento lesionado, aumento na amplitude de movimento da articulação afetada, e aumento na resistência e fixação do tendão ou ligamento ao tendão ou ligamento ou tendão/ligamento ao osso no local de reparo.

[0071] Uma "quantidade eficaz" refere-se a pelo menos uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado terapêutico ou clínico desejado. Uma quantidade eficaz pode ser fornecida em uma ou mais administrações.

[0072] Para uso na presente invenção, tratamento de "uma lesão de tendão ou uma lesão de ligamento que não envolve um osso" refere-se ao tratamento de um tendão ou ligamento lesionado ou danificado que não envolve osso danificado ou desprendimento do tendão/ligamento do osso. Exemplos desta lesão de tendão ou ligamento incluem, mas não se limitam a tendões/ligamentos cortados, tendões/ligamentos rompidos, tendões/ligamentos que possuem laceração, delaminação, ou qualquer outro estiramento ou deformação. O indivíduo sendo tratado pode ter lesão a um osso ou desprendimento de tendão-osso/ligamento-osso além da lesão de tendão ou ligamento, entretanto, o tratamento de "uma lesão de tendão ou ligamento que não envolve um osso" refere-se ao tratamento específico de tecidos de tendão e/ou ligamento. Deve ser compreendido que em algumas modalidades, um indivíduo pode ser tratado para uma lesão de tendão ou uma lesão de ligamento que não envolve um osso assim como uma lesão que envolve um osso, por exemplo, uma fixação tendão-osso ou ligamento-osso. Em algumas modalidades, apenas uma lesão de tendão ou uma lesão de ligamento que não envolve um osso é tratada.

[0073] Um "indivíduo" refere-se um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda, e animais de zoológico, usados em esportes, ou de estimação, como chimpanzés e outras espécies de símios e macacos, cachorros, cavalos, coelhos, gado, porcos, cabras, ovelha, hamsters, porcos da guiné, gerbils, camundongos, furões, ratos, gatos, e similares. De preferência, o indivíduo é um ser humano. O termo não denota uma idade ou gênero particular.

[0074] "Biorreabsorvível" refere-se à capacidade de uma matriz biocompatível ser reabsorvida ou remodelada in vivo. O processo de reabsorção envolve a degradação e eliminação do material original através da ação dos fluidos corporais, enzimas ou células. O material reabsorvido pode ser usado pelo hospedeiro na formação de novo tecido, ou ele pode ser reutilizado de outro modo pelo hospedeiro, ou ele pode ser excretado.

[0075] As matrizes de colágeno, conforme referidas na presente invenção, incluem materiais sob a forma, por exemplo, de géis, pastas, partículas, pós, lâminas, emplastros, blocos, pasta, ou esponjas. As matrizes de colágeno obtidas comercialmente são geralmente fabricadas a partir de extratos de colágeno de derme bovino e/ou tendão bovino. Em algumas modalidades, a fonte de tendão bovino é o tendão flexor profundo (Aquiles) de bovino. Em algumas modalidades, as matrizes são produzidas a partir de pastas fluidas de colágeno nas quais a concentração do colágeno na pasta fluida é diferente para cada tipo de matriz. Por exemplo, um tipo de matriz de colágeno é produzido a partir de uma pasta fluida com uma concentração de colágeno de 4,5%, esta matriz de colágeno é referida na presente invenção como "colágeno (4,5%)" ou "matriz de colágeno (4,5%)"; um segundo tipo de matriz de colágeno é produzido a partir de uma pasta fluida com uma concentração de colágeno de 5%, esta matriz de colágeno é referida na presente invenção como "colágeno (5%)" ou "matriz de colágeno (5%)"; um terceiro tipo de matriz de colágeno é produzido a partir de uma pasta fluida com uma concentração de colágeno de 6%, esta matriz de colágeno é referida na presente invenção como "colágeno (6%)" ou "matriz de colágeno (6%); e um quarto tipo de matriz de colágeno é produzido a partir de uma pasta fluida com uma concentração de colágeno de 7%, esta matriz de colágeno é referida na presente invenção como "colágeno (7%)" ou "matriz de colágeno (7%). Para qualquer matriz de colágeno, o percentual de colágeno usado na pasta fluida inicial não reflete necessariamente a porcentagem de colágeno na matriz de colágeno final.

[0076] Para uso na presente invenção, o termo, "fixar" ou "fixação", de destina a incluir refixar ou a refixação de um tendão a ou dentro de um osso, ou um ligamento a ou dentro de um osso, e inclui, também, fixar um enxerto (por exemplo, um enxerto de tendão ou ligamento) a um osso. Por exemplo, usando um exemplo não- limitador, quando se faz a reconstrução do ligamento cruzado anterior, o ligamento lesionado pode ser removido do osso, e um enxerto, como um enxerto de tendão ou ligamento, pode ser fixado ao ou dentro do osso no lugar do ligamento original.

[0077] Para uso na presente invenção, a forma no singular "um," "uma", "a" e "o" inclui referências no plural exceto onde indicado em contrário.

[0078] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro inclui (e descreve) aqui modalidades que são direcionadas àquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição se referindo a "cerca de X" inclui a descrição de "X".

[0079] Entende-se que aspectos e modalidades da invenção aqui descritas incluem "compreendendo," "consistindo," e "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades. Composições e métodos da invenção

[0080] São aqui descritos composições e métodos para o tratamento de lesões de tendão ou ligamento que não envolvem um osso em um indivíduo. Em geral, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e PDGF a um indivíduo que tem uma lesão de tendão ou de ligamento. Especificamente, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma composição que compreende uma matriz de colágeno e PDGF ao local da lesão do tendão ou ligamento.

[0081] São também descritos na presente invenção composições e métodos para fixar ou refixar um tendão ou um ligamento a/dentro de um osso em um indivíduo. Em geral, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma composição que compreende uma matriz de colágeno biocompatível e PDGF a uma interface entre o tendão/ligamento e o osso.

Matriz biocompatível

[0082] Uma matriz biocompatível, de acordo com algumas modalidades da presente invenção, compreende uma matriz de suporte. A matriz de suporte, de acordo com algumas modalidades da presente invenção, fornece uma armação ou suporte para que ocorra crescimento de tecido novo, incluindo tendão/ligamento e/ou tecido ósseo.

[0083] A matriz biocompatível, em algumas modalidades, compreende uma matriz de colágeno. O termo "matriz de colágeno" pode se referir, por exemplo, a um gel, pasta, pó, partícula, emplastro, bloco, folha ou esponja de colágeno. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno compreende qualquer tipo de colágeno, incluindo os colágenos tipo I, tipo II, e tipo III. Em algumas modalidades, o colágeno compreende uma mistura de colágenos, tal como uma mistura de colágeno tipo I e colágeno tipo II. Em outras modalidades, o colágeno é solúvel sob condições fisiológicas. Em algumas modalidades, o colágeno é insolúvel sob condições fisiológicas. Em algumas modalidades, o colágeno compreende componentes solúveis e insolúveis. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno compreende um colágeno fibroso, tal como colágeno tipo I bovino solúvel. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno compreende colágeno fibroso e solúvel em ácido derivado de tecido dérmico bovino. Outros tipos de colágeno presentes no osso ou tecidos musculoesqueléticos podem ser empregados. Formas recombinantes, sintéticas e de ocorrência natural de colágeno podem ser usadas na presente invenção. O colágeno pode ser reticulado ou não reticulado.

[0084] O colágeno fibroso adequado para uso na matriz de colágeno pode demonstrar propriedades mecânicas suficientes, incluindo resistência à tração a úmido, para resistir ao processo de sutura e prender uma sutura sem lacerar. Uma matriz de colágeno fibroso pode ter, por exemplo, uma resistência à ruptura a úmido na faixa de, por exemplo, cerca de 0,34 kg (0,75 libra) a cerca de 2,27 kg (5 libras).

[0085] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende um glicosaminoglicano (GAG). Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende colágeno e glicosaminoglicano (GAG), por exemplo, colágeno reticulado e GAG. Em algumas modalidades, o GAG é sulfato de condroitina. Em algumas modalidades, o GAG não é sulfato de condroitina. Outros GAGs incluem, mas não se limitam a, dermatan sulfato, queratan sulfato, heparina, heparan sulfato, hialuronana, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a relação peso/peso entre o colágeno e o GAG é de cerca de 90:10. Em algumas modalidades, a relação peso/peso entre o colágeno e o GAG é de cerca de 92:8. Em algumas modalidades, a relação peso/peso entre o colágeno e o GAG é de cerca de 95:5. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende colágeno reticulado com sulfato de condroitina. Em outras modalidades, a matriz biocompatível compreende colágeno reticulado com GAG, em que o GAG não é sulfato de condroitina.

[0086] Em algumas modalidades, uma matriz de colágeno é obtida a partir de uma fonte comercial, incluindo, mas não se limitando a, COLLATAPE® (Integra LifeSciences Corporation, Plainsboro, NJ); Matriz fluxível para ferimentos INTEGRA (Integra LifeSciences Corporation, Plainsboro, NJ); Cellerate RX, gel para ferimentos de colágeno hidrolisado e colágeno hidrolisada/Ag HyCure (Hymed Group Corporation, Bethlehem, PA); e BIOBLANKETTM e colágeno fluxível P1076 (Kensey Nash Corporation, Exton, PA). Em algumas modalidades, a matriz de colágeno não é BIOBLANKET®. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno não é COLLATAPE®.

[0087] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível da presente invenção é fluxível. Uma matriz biocompatível fluxível, em algumas modalidades, pode ser aplicada ao local desejado através de uma seringa e agulha ou cânula. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível fluxível pode ser aplicada ao local desejado percutaneamente. Em outras modalidades, a matriz biocompatível fluxível pode ser aplicada a um local exposto cirurgicamente. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível fluxível pode ser aplicada a um enxerto de tendão ou ligamento para inserção dentro do túnel de um osso. Em algumas modalidades, tal como em um kit, a matriz biocompatível é fornecida como um pó ou partículas desidratadas, que podem ser tornadas fluxíveis mediante preparação para administração. Por exemplo, uma forma desidratada da matriz biocompatível pode ser preparada para administração pela adição ou mistura com uma quantidade adequada de um tampão de hidratação. O tampão de hidratação pode incluir uma quantidade adequada de PDGF para ser administrada como parte da matriz biocompatível. A quantidade adequada de tampão a ser adicionada é determinada, por exemplo, pela concentração desejada de PDGF, pela concentração desejada de colágeno, pela concentração desejada de GAG, pela característica de fluidez desejada, ou qualquer combinação adequada desses.

[0088] "Fluxível" refere-se a uma característica física de uma substância na qual a substância flui mediante a aplicação de uma força necessária para administrar esta substância através de uma cânula ou passagem similar, mas substância permanece substancialmente imóvel após administração a um local no indivíduo a ser tratado, fornecendo, assim, tratamento contínuo ao local. Um dispositivo exemplificador para administrar uma substância fluxível é uma seringa, cujo êmbolo pode fornecer a força necessária que impulsiona a substância fluxível a ser administrada. Um dispositivo exemplificador adequado pode compreender, adicionalmente, uma agulha ou outra cânula adequada que permite uma liberação e aplicação mais precisa da substância fluxível. O diâmetro do orifício, a composição, a conformação, o comprimento e quaisquer outras características adequadas do dispositivo para administração podem ser selecionadas e usadas. Um versado na técnica compreende que a seleção dos parâmetros particulares de um dispositivo de aplicação adequado se baseia nas características de fluidez da composição. Por exemplo, uma composição relativamente menos fluxível pode ser mais adequada para aplicação por um dispositivo que tem um diâmetro de orifício da cânula relativamente mais largo e/ou cânula mais curta. Em algumas modalidades, a composição fluxível é aplicada através de uma agulha de 21 G, 25 G, ou 27 G. Em algumas modalidades, a aplicação por seringa e/ou agulha permite aplicação da composição fluxível através de injeção percutânea. Em algumas modalidades, a composição fluxível pode ser aplicada por um dispositivo não-canular, tal como uma colher, espátula, escova, ou outro dispositivo similar que permita que a composição seja aplicada ao local desejado.

[0089] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível não oxida PDGF.

[0090] A matriz biocompatível, de acordo com algumas modalidades, pode ser fornecida em um formato adequado para implantação (por exemplo, uma esfera, um cilindro, ou um bloco). Em outras modalidades, a matriz biocompatível pode ser moldada ou extrusada. Em tais modalidades, a matriz biocompatível pode estar sob a forma de uma pasta ou massa. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível pode ser fornecida em um formato predeterminado, incluindo um bloco, uma esfera, ou cilindro, ou qualquer formato desejado, por exemplo, um formato definido por um molde ou um local de aplicação. Uma matriz biocompatível moldável pode facilitar a colocação eficaz das composições da presente invenção dentro e em volta dos tendões, ligamentos, e/ou osso, incluindo locais de fixação do tendão ou ligamento dentro ou ao osso, tal como a inserção de um enxerto de tendão ou ligamento no túnel de um osso. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível moldável pode ser aplicada ao osso e/ou aos tendões e/ou aos ligamentos com uma espátula ou dispositivo equivalente. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível pode ser aplicada aos tendões ou ligamentos por posicioná-la em volta dos tendões ou ligamentos, como enxertos de tendão ou ligamento.

[0091] As matrizes de colágeno da presente invenção podem ser produzidas a partir de extrato de colágeno purificado de derme bovina, tendão bovino (por exemplo, tendão flexor profundo (Aquiles)), ou outras fontes de colágeno adequadas. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno é principalmente colágeno tipo I. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno é produzida a partir de uma pasta fluida de colágeno com qualquer uma das seguintes concentrações de colágeno (p/v): cerca de 4,5%, cerca de 5%, cerca de 6% ou cerca de 7%. Em algumas modalidades, o colágeno é solúvel. Um colágeno solúvel pode dissolver logo após sua implantação introduzindo, assim, macroporosidade na matriz biocompatível. A macroporosidade pode aumentar a condutividade das células (por exemplo, osteoblastos, tenócitos) no interior do material do implante pelo aumento do acesso e, por conseguinte, da atividade de remodelamento das células no local do implante.

[0092] Em algumas modalidades, o colágeno compreende um componente monomérico de colágeno solúvel e um componente polimérico de colágeno insolúvel. Em algumas modalidades, a razão entre os monômeros de colágeno solúvel e os polímeros de colágeno insolúvel é de cerca de 1:10, cerca de 1:9, cerca de 1:8, cerca de 1:7, cerca de 1:6, cerca de 1:5, cerca de 1:4, cerca de 1:3, cerca de 1:2, ou cerca de 1:1.

[0093] Em algumas modalidades preferenciais, a matriz biocompatível forma uma estrutura porosa que compreende poros. Em algumas modalidades, os poros possuem uma área média na faixa de cerca de 800 μm2 a cerca de 3.000 μm2, cerca de 13.000 μm2 a cerca de 50.000 μm2, cerca de 2500 μm2 a cerca de 20.000 μm2, cerca de 3500 μm2 a cerca de 20.000 μm2, 4500 μm2 a cerca de 20.000 μm2, cerca de 5000 μm2 a cerca de 19.000 μm2, cerca de 6000 μm2 a cerca de 18.000 μm2, cerca de 6000 μm2 a cerca de 15.000 μm2, ou cerca de 5000 μm2 a cerca de 16000 μm2. Em algumas modalidades, os poros possuem um perímetro médio na faixa de cerca de 100 μm a cerca de 200 μm, cerca de 400 μm a cerca de 800 μm, cerca de 200 μm a cerca de 500 μm, cerca de 200 μm a cerca de 600 μm, cerca de 300 μm a cerca de 600 μm, ou cerca de 300 μm a cerca de 500 μm. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível possui um tamanho médio de área do poro na faixa de cerca de 4500 μm2 a cerca de 20000 μm2 e um tamanho médio de perímetro do poro na faixa de cerca de 200 μm a cerca de 600 μm. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno compreende poros com um tamanho médio de área do poro na faixa de cerca de 4500 μm2 a cerca de 20000 μm2 e um tamanho médio de perímetro do poro na faixa de cerca de 200 μm a cerca de 500 μm.

[0094] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende uma estrutura porosa que tem poros multidirecionais e/ou interconectados. A estrutura porosa, de acordo com algumas modalidades, pode compreender poros que possuem diâmetros na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 1 mm, por exemplo, pelo menos cerca de 5 μm, pelo menos cerca de 10 μm, pelo menos cerca de 20 μm, pelo menos cerca de 30 um, pelo menos cerca de 40 μm, ou pelo menos cerca de 50 μm.

[0095] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende macroporos que possuem diâmetros na faixa de cerca de 100 μm a cerca de 1 mm. Em outra modalidade, a matriz biocompatível compreende mesoporos que possuem diâmetros na faixa de cerca de 10 μm a cerca de 100 μm. Em uma outra modalidade, a matriz biocompatível compreende microporos que possuem diâmetros menores que cerca de 10 μm. Modalidades da presente invenção contemplam uma matriz biocompatível que compreende macroporos, mesoporos, e microporos ou qualquer combinação dos mesmos.

[0096] Em outras modalidades, a matriz biocompatível compreende uma estrutura porosa que possui poros que não são interconectados. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende uma estrutura porosa que possui uma mistura de poros interconectados e poros que não são interconectados.

[0097] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é porosa e capaz de absorver água em uma quantidade na faixa de cerca de 1x a cerca de 15x a massa da matriz biocompatível. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno é porosa e capaz de absorver água em uma quantidade na faixa de cerca de 1x a cerca de 15x a massa da matriz de colágeno.

[0098] Em algumas modalidades, a estrutura porosa da matriz biocompatível permite que o PDGF seja liberado da matriz em quantidades aumentadas. Em algumas modalidades, a estrutura porosa da matriz de colágeno (5%) libera uma porcentagem maior de PDGF do que uma matriz de colágeno (6%) ou matriz de colágeno (7%) durante um tempo específico, conforme medido in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, a estrutura porosa da matriz biocompatível permite que o PDGF seja liberado da matriz dentro de cerca de 24 horas da administração in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, cerca de 50% a cerca de 95%, cerca de 60% a cerca de 95%, cerca de 70% a cerca de 95%, cerca de 80% a cerca de 95%, cerca de 90% a cerca de 95%, cerca de 50% a cerca de 85%, cerca de 60% a cerca de 85%, cerca de 70% a cerca de 85%, ou cerca de 50% a cerca de 80% do PDGF é liberado da matriz dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, a estrutura porosa da matriz biocompatível permite que o PDGF seja liberado da matriz dentro de cerca de 1 hora, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, ou cerca de 48 horas da administração in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, cerca de 50% a cerca de 95%, cerca de 60% a cerca de 95%, cerca de 70% a cerca de 95%, cerca de 80% a cerca de 95%, cerca de 90% a cerca de 95%, cerca de 50% a cerca de 85%, cerca de 60% a cerca de 85%, cerca de 70% a cerca de 85%, ou cerca de 50% a cerca de 80% do PDGF é liberado dentro de cerca de 1 hora, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, ou cerca de 48 horas. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno é COLLATAPE®. Em algumas modalidades, a matriz de colágeno é uma esponja porosa de colágeno bovino semelhante a COLLATAPE®. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende COLLATAPE® que permite que uma porcentagem mais alta de PDGF seja liberada em comparação a uma matriz de colágeno (5%), matriz de colágeno (6%), ou uma matriz de colágeno (7%).

[0099] Em algumas modalidades, o PDGF é liberado no interior da região circundante. Em algumas modalidades, o PDGF é liberado sobre um tendão ou ligamento lesionado. Em algumas modalidades, o PDGF é liberado sobre a superfície do osso próximo ao ponto de fixação osso-tendão ou osso-ligamento. Em algumas modalidades, o PDGF é liberado no interior do meio circundante.

[00100] Em algumas modalidades, a estrutura porosa da matriz biocompatível permite a infiltração de células nos poros da matriz. Em algumas modalidades, as células infiltram a composição dentro de cerca de 3 semanas, cerca de 2 semanas, cerca de 1 semana, cerca de 7 dias, cerca de 6 dias, cerca de 5 dias, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, ou cerca de 1 dia(s) após a exposição à composição. Em algumas modalidades, as células são tenócitos. Em algumas modalidades, as células são osteoblastos. Em algumas modalidades, as célula são células de ligamento. Em modalidades preferenciais, a matriz biocompatível compreende COLLATAPE® com uma estrutura porosa que permite a infiltração de células nos poros da matriz. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende COLLATAPE® com uma estrutura porosa que permite que um número maior de células infiltre os poros da matriz em comparação a uma matriz de colágeno (5%), matriz de colágeno (6%), ou uma matriz de colágeno (7%). Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende uma matriz de colágeno (5%) com uma estrutura porosa que permite que um número maior de células infiltre os poros da matriz em comparação a uma matriz de colágeno (6%) ou uma matriz de colágeno (7%).

[00101] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99%.

[00102] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é biorreabsorvível. A matriz biocompatível pode, em algumas modalidades, ser reabsorvida no período de um ano após a administração in vivo. Em outras modalidades, a matriz biocompatível pode ser reabsorvida no período de 1, 3, 6, ou 9 meses após a administração in vivo. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é reabsorvida dentro de cerca de 30 dias, cerca de 25 dias, cerca de 21 dias, cerca de 18 dias, cerca de 15 dias, cerca de 10 a 14 dias, ou cerca de 10 dias da administração in vivo. A capacidade de biorreabsorção depende: (1) da natureza do material da matriz (isto é, sua composição química, estrutura física e tamanho); (2) do local no corpo onde a matriz é colocada; (3) da quantidade de material de matriz que é usado; (4) do estado metabólico do paciente (diabético/não-diabético, osteoporótico, fumante, idade avançada, uso de esteroides, etc.); (5) da extensão e/ou tipo de lesão tratada; e (6) do uso de outros materiais além da matriz, tal como outros fatores anabólicos, catabólicos e anticatabólicos do osso.

[00103] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende pelo menos um fosfato de cálcio. Em outras modalidades, a matriz biocompatível compreende uma pluralidade de fosfatos de cálcio. Em algumas modalidades, os fosfatos de cálcio adequados ao uso como um material de matriz biocompatível, possuem uma razão atômica entre o cálcio e o fósforo na faixa de 0,5 a 2,0. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende um aloenxerto. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível se destina ao uso no tratamento de uma lesão de tendão ou ligamento que não envolve um osso, e a matriz não compreende fosfato de cálcio ou um aloenxerto.

[00104] Os fosfatos de cálcio adequados para uso como materiais de suporte de osso incluem, mas não se limitam a fosfato de cálcio amorfo, fosfato monocálcico mono-hidratado (MCPM), fosfato monocálcico anidro (MCPA), di-hidrato de fosfato dicálcico (DCPD), fosfato dicálcico anidro (DCPA), fosfato octacálcico (OCP), fosfato α- tricálcio, β-TCP, hidroxiapatita (OHAp), hidroxiapatita fracamente cristalina, fosfato tetracálcico (TTCP), decafosfato heptacálcico, metafosfato de cálcio, pirofosfato de cálcio desidratado, fosfato de cálcio carbonatado, e pirofosfato de cálcio.

Material de suporte e ligante biocompatível

[00105] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende uma matriz de suporte e um ligante biocompatível. Os ligantes biocompatíveis podem compreender materiais que têm a função de promover coesão entre as substâncias combinadas. Um ligante biocompatível pode, por exemplo, promover adesão entre partículas de um material de suporte de osso na formação de uma matriz biocompatível. Em certas modalidades, o mesmo material pode servir como um material de suporte e como um ligante caso este material aja promovendo a coesão entre as substâncias combinadas e forneça uma estrutura que permita a ocorrência de crescimento de novo tecido, incluindo crescimento de tendão, ligamento, e osso. Vide WO2008/005427 e U.S. n° de série 11/772.646 (Public ação U.S. 2008/00274470).

[00106] Os ligantes biocompatíveis, em algumas modalidades, podem compreender, por exemplo, colágeno, elastina, polissacarídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, proteínas, polipeptídeos, poli(a-hidróxi ácidos), poli(lactonas), poli(aminoácidos), poli(anidridos), poliuretanos, poli(ortoésteres), poli(anidrido-co-imidas), poli(ortocarbonatos), poli(a-hidróxi alcanoatos), poli(dioxanonas), poli(fosfoésteres), ácido poliláctico, poli(L-lactídeo) (PLLA), poli(D,L- lactídeo) (PDLLA), poliglicolídeo (PGA), poli(lactídeo-co-glicólico (PLGA), poli(L-lactídeo-co-D,L-lactídeo), poli(D,L-lactídeo-co- carbonato de trimetileno), ácido poliglicólico, poli(hidróxi butirato) (PHB), poli(ε-caprolactona), poli(δ-valerolactona), poli(Y-butirolactona), poli(caprolactona), ácido poliacrílico, ácido policarboxílico, poli(cloridrato de alilamina), poli(cloreto de dialildimetilamônio), poli(etilenoimina), fumarato de polipropileno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polietileno, polimetilmetacrilato, fibras de carbono, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona), poli(etiloxazolina), copolímeros em bloco de poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno), poli(tereftalato de etileno)poliamida, e/ou copolímeros e/ou misturas dos mesmos.

[00107] Os ligantes biocompatíveis, em outras modalidades, podem compreender ácido algínico, goma arábica, goma guar, goma xantana, gelatina, quitina, quitosano, acetato de quitosano, lactato de quitosano, sulfato de condroitina, N,O-carbóximetil quitosano, um dextrano (por exemplo, α-ciclodextrina, β-ciclodextrina, Y—ciclodextrina, ou dextran sulfato de sódio), cola de fibrina, lecitina, derivados de fosfatidil colina, glicerol, ácido hialurônico, hialuronato de sódio, uma celulose (por exemplo, metil celulose, carbóximetil celulose, hidroxipropilmetil celulose, ou oxietilhidroxietil celulose), uma glicosamina, um proteoglicano, um amido (por exemplo, amido de oxietilhidroxietila ou amido solúvel), ácido láctico, um ácido plurônico, glicerofosfato de sódio, glicogênio, uma queratina, seda, e/ou derivados e/ou misturas dos mesmos.

[00108] Em algumas modalidades, um ligante biocompatível é solúvel em água. Um ligante solúvel em água pode se dissolver da matriz biocompatível logo após sua implantação introduzindo, assim, macroporosidade na matriz biocompatível. A macroporosidade pode aumentar a osteocondutividade do material do implante pelo aumento do acesso e, por conseguinte, da atividade de remodelamento das células (por exemplo, osteoclastos e osteoblastos, tenócitos) no local do implante.

[00109] Em algumas modalidades, um ligante biocompatível pode estar presente em uma matriz biocompatível em uma quantidade na faixa de cerca de 5 por cento, em peso, a cerca de 50 por cento, em peso, da matriz. Em outras modalidades, um ligante biocompatível pode estar presente em uma quantidade na faixa de cerca de 10 por cento, em peso, a cerca de 40 por cento, em peso, da matriz biocompatível. Em uma outra modalidade, um ligante biocompatível pode estar presente em uma quantidade na faixa de cerca de 15 por cento, em peso, a cerca de 35 por cento, em peso, da matriz biocompatível. Em uma outra modalidade, um ligante biocompatível pode estar presente em uma quantidade de 20 por cento, em peso, da matriz biocompatível.

Fator de crescimento derivado de plaqueta

[00110] A invenção proporciona composições e métodos para o tratamento de lesões de tendão ou ligamento em um indivíduo. Em geral, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e PDGF a um indivíduo que tem uma lesão de tendão ou de ligamento. Especificamente, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma composição que compreende uma matriz de colágeno e PDGF ao local da lesão do tendão ou ligamento.

[00111] Uma matriz biocompatível, de acordo com modalidades da presente invenção, compreende uma matriz de suporte e PDGF. Õ PDGF é um fator de crescimento liberado a partir de plaqueta em locais de lesão. O PDGF sinergiza com o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) para promover a neovascularização e estimula a quimiotaxia e proliferação de células derivadas do mesênquima incluindo tenócitos, osteoblastos, condrócitos e células musculares lisas vasculares.

[00112] As composições e métodos fornecidos pela presente invenção compreendem uma matriz biocompatível e uma solução de PDGF, sendo que a solução é dispersa na matriz biocompatível. Em algumas modalidades, o PDGF está presente na solução em uma concentração na faixa de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 10,0 mg/ml, de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, ou de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml, cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0,4 mg/ml, cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml. Em algumas modalidades, o PDGF está presente na solução a uma concentração de 0,15 mg/ml. Em algumas modalidades, o PDGF está presente na solução a uma concentração de 0,3 mg/ml. Em algumas modalidades, o PDGF está presente na solução a uma concentração de 1,0 mg/ml. Em outras modalidades, o PDGF está presente na solução a qualquer uma das seguintes concentrações: cerca de 0,05 mg/ml; cerca de 0,1 mg/ml; cerca de 0,15 mg/ml; cerca de 0,2 mg/ml; cerca de 0,25 mg/ml; cerca de 0,3 mg/ml; cerca de 0,35 mg/ml; cerca de 0,4 mg/ml; cerca de 0,45 mg/ml; cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,55 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,65 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml; cerca de 0,75 mg/ml; cerca de 0,8 mg/ml; cerca de 0,85 mg/ml; cerca de 0,9 mg/ml; cerca de 0,95 mg/ml; cerca de 1,0 mg/ml; cerca de 1,5 mg/ml; ou cerca de 2,0 mg/ml. Deve ser compreendido que estas concentrações são simplesmente exemplos de modalidades particulares, e que a concentração de PDGF podem estar dentro de qualquer uma das faixas de concentração descritas acima.

[00113] Várias quantidades de PDGF podem ser usadas nas composições da presente invenção. As quantidades de PDGF que podem ser usadas incluem, mas não se limitam a quantidades nas seguintes faixas: cerca de 1 μg a cerca de 50 mg, cerca de 10 μg a cerca de 25 mg, cerca de 100 μg a cerca de 10 mg, e cerca de 250 μg a cerca de 5 mg.

[00114] A concentração de PDGF (ou outro fator de crescimento), em modalidades da presente invenção, pode ser determinada com o uso de um imunoensaio ligado à enzima, conforme descrito nas patentes U.S. n° 6.221.625; 5.747.273; e 5.290.708, ou qualquer outro teste conhecido na técnica para determinar a concentração de PDGF. Quando aqui fornecida, a concentração molar de PDGF é determinada com base no peso molecular do dímero de PDGF (por exemplo, PDGF-BB, peso molecular de cerca de 25 kDa).

[00115] Em algumas modalidades da presente invenção, o PDGF compreende homodímeros e heterodímeros de PDGF, incluindo PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, PDGF-DD, e misturas e derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o PDGF compreende PDGF-BB. Em outras modalidades, o PDGF compreende um PDGF humano recombinante, tal como rhPDGF-BB.

[00116] Em algumas modalidades, o PDGF pode ser obtido a partir de fontes naturais. Em outras modalidades, o PDGF pode ser produzido por técnicas de DNA recombinante. Em algumas modalidades, o PDGF ou fragmentos do mesmo pode ser produzido com o uso de técnicas de síntese de peptídeo conhecidas dos elementos versados na técnica, tal como síntese de peptídeo em fase sólida.

[00117] Quando obtido a partir de fontes naturais, o PDGF pode ser derivado de fluidos biológicos. Os fluidos biológicos, de acordo com algumas modalidades, podem compreender qualquer fluido tratado ou não-tratado associado a organismos vivos, inclusive sangue. Os fluidos biológicos podem compreender também componentes do sangue, incluindo concentrado de plaquetas, plaquetas obtidas por aférese, plasma rico em plaquetas, plasma, soro, plasma fresco congelado, e camada de células brancas. Os fluidos biológicos podem compreender plaquetas separadas do plasma e ressuspensas em um fluido fisiológico.

[00118] Quando produzido por técnicas de DNA recombinante, uma sequência de DNA que codifica um único monômero (por exemplo, cadeia B ou cadeia A de PDGF) pode ser inserida em células procarióticas ou eucarióticas cultivadas para expressão para, subsequentemente, produzir o homodímero (por exemplo, PDGF-BB ou PDGF-AA). O PDGF homodimérico produzido por técnicas recombinantes pode ser usado em algumas modalidades. Em outras modalidades, um heterodímero de PDGF pode ser gerado pela inserção de sequências de DNA que codificam ambas as unidades monoméricas do heterodímero em células procarióticas ou eucarióticas cultivadas e permitir que as unidades monoméricas traduzidas sejam processadas pelas células para produzir o heterodímero (por exemplo, PDGF-AB). PDGF-BB humano recombinante disponível para comercialização pode ser obtido a partir de uma variedade de fontes.

[00119] Em algumas modalidades da presente invenção, o PDGF compreende fragmentos de PDGF. Em uma modalidades, o rhPDGF-B compreende os seguintes fragmentos: as sequências de aminoácido 1-31, 1-32, 33-108, 33-109, e/ou 1-108 da cadeia B inteira. A sequência de aminoácido completa (aa 1-109) da cadeia B de PDGF é fornecida na figura 15 da patente U.S. n° 5.516.896 . Deve ser compreendido que as composições de rhPDGF da presente invenção podem compreender uma combinação de rhPDGF-B intacto (aa 1-109) e fragmentos do mesmo. Outros fragmentos de PDGF podem ser empregados, como os apresentados na patente U.S. N° 5.516.896. De acordo com algumas modalidades, o rhPDGF-BB compreende pelo menos 65% de rhPDGF-B intacto (aa 1-109). De acordo com outras modalidades, o rhPDGF-BB compreende pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de rhPDGF-B intacto (aa 1-109).

[00120] Em algumas modalidades da presente invenção, o PDGF pode estar em uma forma altamente purificada. PDGF purificado, para uso na presente invenção, compreende composições que possuem mais que cerca de 95% em peso de PDGF antes da incorporação nas soluções da presente invenção. A solução pode ser preparada com o uso de qualquer tampão ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em outras modalidades, o PDGF pode ser substancialmente purificado. PDGF substancialmente purificado, para uso na presente invenção, compreende composições que possuem cerca de 5% a cerca de 95% em peso de PDGF antes da incorporação nas soluções da presente invenção. Em uma modalidade, PDGF substancialmente purificado compreende composições que possuem cerca de 65% a cerca de 95% em peso de PDGF antes da incorporação nas soluções da presente invenção. Em outras modalidades, PDGF substancialmente purificado compreende composições que possuem cerca de 70% a cerca de 95%, cerca de 75% a cerca de 95%, cerca de 80% a cerca de 95%, cerca de 85% a cerca de 95%, ou cerca de 90% a cerca de 95%, em peso, de PDGF antes da incorporação nas soluções da presente invenção. O PDGF purificado e o PDGF substancialmente purificado podem ser incorporados na matriz de suporte.

[00121] Em uma outra modalidade, o PDGF pode ser parcialmente purificado. PDGF parcialmente purificado, para uso na presente invenção, compreende composições que possuem PDGF no contexto de plasma rico em plaquetas, plasma fresco congelado, ou qualquer outro produto de sangue que exija coleta e separação para produzir PDGF. As modalidades da presente invenção contemplam que qualquer uma das isoformas de PDGF aqui fornecidas, incluindo homodímeros e heterodímeros, pode ser purificada ou parcialmente purificada. As composições da presente invenção que compreendem misturas de PDGF podem compreender isoformas de PDGF ou fragmentos de PDGF em proporções parcialmente purificadas. PDGF parcialmente purificado e purificado, em algumas modalidades, podem ser preparados conforme descrito no documento U.S. n° de série 11/159.533 (publicação U.S. 20060084602).

[00122] Em algumas modalidades, as soluções que compreendem PDGF são formadas pela solubilização de PDGF em um ou mais tampões. Os tampões adequados para uso nas soluções de PDGF da presente invenção podem compreender, mas não se limitam a, carbonatos, fosfatos (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), histidina, acetatos (por exemplo, acetato de sódio), tampões ácidos como ácido acético e HCl, e tampões orgânicos como lisina, tampões de Tris (por exemplo, tris(hidroximetil)aminoetano), ácido N- 2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES), e ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico (MOPS). Os tampões podem ser selecionados com base na biocompatibilidade com PDGF e a capacidade do tampão em impedir modificação indesejável de proteínas. Os tampões podem ser adicionalmente selecionados com base na compatibilidade com os tecidos hospedeiros. Em uma modalidade, tampão de acetato de sódio é usado. Os tampões podem ser empregados em diferentes molaridades, por exemplo, cerca de 0,1 mM a cerca de 100 mM, cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca de 40 mM, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM, ou cerca de 15 mM a cerca de 25 mM, ou qualquer molaridade dentro destas faixas. Em algumas modalidades, um tampão de acetato é empregado em uma molaridade de cerca de 20 mM.

[00123] Em outra modalidade, as soluções que compreendem PDGF podem ser formadas por solubilizar PDGF liofilizado em água, em que antes da solubilização o PDGF é liofilizado a partir de um tampão adequado.

[00124] As soluções que compreendem PDGF, de acordo com modalidades da presente invenção, podem ter um pH na faixa de cerca de 3,0 a cerca de 8,0. Em uma modalidade, uma solução que compreende PDGF tem um pH na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 8,0, com mais preferência, cerca de 5,5 a cerca de 7,0, com a máxima preferência, cerca de 5,5 a cerca de 6,5, ou qualquer valor dentro destas faixas. Em algumas modalidades, o pH de soluções que compreendem PDGF pode ser compatível com a estabilidade prolongada e eficácia do PDGF ou qualquer outro agente biologicamente ativo desejado. O PDGF é geralmente mais estável em um ambiente ácido. Portanto, de acordo com algumas modalidades, a presente invenção compreende uma formulação de armazenamento ácido de uma solução de PDGF. De acordo com algumas modalidades, a solução de PDGF tem, de preferência, um pH de cerca de 3,0 a cerca de 7,0, e, com mais preferência, de cerca de 4,0 a cerca de 6,5. A atividade biológica do PDGF, entretanto, pode ser otimizada em uma solução que tem uma faixa de pH neutro. Portanto, em outras modalidades, a presente invenção compreende uma formulação com pH neutro de uma solução de PDGF. De acordo com esta modalidade, a solução de PDGF tem, de preferência, um pH de cerca de 5,0 a cerca de 8,0, com mais preferência, cerca de 5,5 a cerca de 7,0, com a máxima preferência, cerca de 5,5 a cerca de 6,5.

[00125] Em algumas modalidades, o pH da solução contendo PDGF pode ser alterado para otimizar a cinética de ligação do PDGF a um substrato de matriz. Se desejado, quando o pH do material se equilibrar ao material adjacente, o PDGF ligado pode ser tornar lábil. Em algumas modalidades, o pH de soluções que compreendem PDGF pode ser controlado pelos tampões mencionados na presente invenção. Várias proteínas demonstram diferentes faixas de pH nas quais elas são estáveis. As estabilidades das proteínas se refletem, principalmente, nos pontos isoelétricos e cargas nas proteínas. A faixa de pH pode afetar a estrutura conformacional de uma proteína e a suscetibilidade de uma proteína à degradação proteolítica, hidrólise, oxidação, e outros processos que podem resultar em modificação da estrutura e/ou atividade biológica da proteína.

[00126] Em algumas modalidades, as soluções que compreendem PDGF podem compreender, adicionalmente, componentes adicionais, como outros agentes biologicamente ativos. Em outras modalidades, as soluções que compreendem PDGF podem compreender, adicionalmente, meio de cultura celular, outras proteínas estabilizantes como albumina, agentes bactericidas, inibidores de protease (por exemplo, ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), ácido etileno glicol-bis(beta-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetra-acético (EGTA), aprotinina, ácido E-aminocapróico (EACA), etc.) e/ou outros fatores de crescimento, como fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), fatores de crescimento epidérmicos (EGFs), fatores de crescimento de transformação (TGFs), fatores de crescimento de queratinócitos (KGFs), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGEs), proteínas morfogênicas ósseas (BMPs), ou outros PDGFs incluindo composições de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC e/ou PDGF-DD. Composições compreendendo, adicionalmente, agentes biologicamente ativos

[00127] As composições e métodos da presente invenção, de acordo com algumas modalidades, podem compreender adicionalmente um ou mais agentes biologicamente ativos em adição ao PDGF. Os agentes biologicamente ativos que podem ser incorporados nas composições da presente invenção, em adição ao PDGF, podem compreender moléculas orgânicas, materiais inorgânicos, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos (por exemplo, genes, fragmentos de gene, pequenos ácidos ribonucleicos de interferência (siRNAs), sequências regulatórias de genes, fatores transcricionais nucleares e moléculas antissenso), nucleoproteínas, polissacarídeos (por exemplo, heparina), glicoproteínas, e lipoproteínas. Exemplos não-limitadores de compostos biologicamente ativos que podem ser incorporados nas composições da presente invenção, incluindo, por exemplo, agentes anticâncer, antibióticos, analgésicos, agentes anti-inflamatórios, imunossupressores, inibidores de enzima, anti-histamínicos, hormônios, relaxantes musculares, prostaglandinas, fatores tróficos, proteínas osteoindutoras, fatores de crescimento, e vacinas, são apresentados no documento U.S. n° de série 11/159.533 (publicações U.S. 20060084602). Em algumas modalidades, os compostos biologicamente ativos que podem ser incorporados nas composições da presente invenção incluem fatores osteoindutores como fatores de crescimento semelhantes à insulina, fatores de crescimento de fibroblasto, ou outros PDGFs. De acordo com outras modalidades, os compostos biologicamente ativos que podem ser incorporados nas composições da presente invenção incluem, de preferência, fatores osteoindutores e osteoestimulantes, como proteínas morfogênicas ósseas (BMPs), miméticos de BMP, calcitonina, miméticos de calcitonina, estatinas, derivados de estatina, fatores de crescimento de fibroblasto, fatores de crescimento semelhantes à insulina, fatores de diferenciação de crescimento, e/ou hormônio da paratireoide. Em algumas modalidades, fatores adicionais para incorporação nas composições da presente invenção incluem inibidores de protease, assim como tratamentos para osteoporose que reduzem a reabsorção óssea, incluindo bisfosfonatos, e anticorpos para o ligante de NF-kB (RANK).

[00128] Protocolos padrão e regimes para liberação de agentes biologicamente ativos adicionais são conhecidos na técnica. Agentes biologicamente ativos adicionais podem ser introduzidos nas composições da presente invenção em quantidades que permitem a liberação de uma dosagem adequada do agente ao tendão danificado e/ou ao local de fixação do tendão. Na maioria dos casos, as dosagens são determinadas com o uso de diretrizes conhecidas dos versados na técnica e aplicáveis ao agente específico em questão. A quantidade de um agente biologicamente ativo adicional a ser incluído em uma composição da presente invenção pode depender de variáveis como o tipo e a extensão da condição, do estado de saúde geral do paciente particular, da formulação do agente biologicamente ativo, da cinética de liberação, e da capacidade de biorreabsorção da matriz biocompatível. Testes clínicos padrão podem ser usados para otimizar a dose e a frequência de dosagem para qualquer agente biologicamente ativo adicional particular.

[00129] De acordo com algumas modalidades, uma composição para fixação de tendão ou ligamento a ou dentro do osso compreende, adicionalmente, um ou mais materiais para enxertia no osso incluindo, por exemplo, medula óssea autóloga, extratos de plaqueta autóloga, aloenxertos, materiais de matriz óssea sintéticos, xenoenxertos, e derivados dos mesmos. Tendões, ligamentos, e ossos tratados

[00130] Os tendões que podem ser tratados pelos métodos da invenção incluem qualquer tendão. Exemplos não-limitadores de tendões incluem tendão patelar, tendão tibial anterior, tendão de Aquiles, tendão flexor do joelho, tendão semitendinoso, tendão do gracilis, tendão abdutor, tendão adutor, tendão supraespinhal, tendão infraespinhal, tendão subescapular, tendão do músculo redondo menor (complexo do manguito rotador), tendão flexor, tendão do reto femoral, tendão tibial posterior, e tendão do quadríceps femoral. Em algumas modalidades, o tendão é selecionado do grupo que consiste em tendão patelar, tendão tibial anterior, tendão de Aquiles, tendão flexor do joelho, tendão semitendinoso, tendão do gracilis, tendão abdutor, e tendão adutor. Em algumas modalidades, o tendão é selecionado do grupo que consiste em: tendão supraespinhal, tendão infraespinhal, tendão subescapular, tendão do músculo redondo menor (complexo do manguito rotador), tendão flexor, tendão do reto femoral, tendão tibial posterior, e tendão do quadríceps femoral. Em algumas modalidades, o tendão não é selecionado do grupo que consiste em: tendão supraespinhal, tendão infraespinhal, tendão subescapular, tendão do músculo redondo menor (complexo do manguito rotador), tendão flexor, tendão do reto femoral, tendão tibial posterior, e tendão do quadríceps femoral.

[00131] Os ligamentos que podem ser tratados pelos métodos da invenção incluem qualquer ligamento. Exemplos não-limitadores de ligamentos incluem ligamento cruzado anterior, ligamento colateral lateral, ligamento cruzado posterior, ligamento colateral medial, ligamento cruzado cranial, ligamento cruzado caudal, ligamento cricotireoideo, ligamento periodontal, ligamento suspensor da lente, ligamento sacroilíaco anterior, ligamento sacroilíaco posterior, ligamento sacrotuberoso, ligamento sacro-espinhoso, ligamento púbico inferior, ligamento púbico superior, ligamento suspensor (por exemplo, pênis ou mama), ligamento radiocarpal palmar, ligamento radiocarpal dorsal, ligamento colateral ulnar, ou ligamento colateral radial.

[00132] Os ossos que podem ser tratados pelas composições e métodos da presente invenção incluem qualquer osso que esteja em locais de fixação para tendões ou ligamentos, e incluem, mas não se limitam a tíbia, fêmur, e úmero. Métodos para o tratamento de lesões de tendão ou ligamento que não envolvem um osso

[00133] A presente invenção apresenta composições e métodos de tratamento de lesões de tendão ou ligamento. Os métodos para tratamento pode compreender tratamento de tendões ou ligamentos lesionados que não envolvem um osso, como tendões/ligamentos cortados, tendões/ligamentos rompidos, tendões/ligamentos que possuem laceração, delaminação, ou qualquer outro estiramento ou deformação.

[00134] Em algumas modalidades, um método para o tratamento de lesões de tendão ou ligamento é direcionado à administração de uma composição da presente invenção a um tendão ou ligamento lesionado. Em algumas modalidades, o tendão ou ligamento lesionado pode ser estabilizado fisicamente para o tratamento. Por exemplo, o tendão ou ligamento lesionado pode ser suturado por uma sutura do tipo Mason Allen modificada, ou qualquer outra sutura adequada. Estes métodos de estabilização podem ser preferenciais em algumas modalidades, uma vez que as extremidades danificadas do tendão ou ligamento podem não permitir o reparo cirúrgico direto ou reconexão das extremidades. Como um resultado, a sutura estabilizante pode ser posicionada distal a uma ou mais das extremidades lesionadas.

[00135] Como um resultado desta sutura estabilizante, o tendão ou ligamento lesionado é posicionado de modo que as extremidades lesionadas do tendão ou ligamento são substancialmente reaproximadas. Em algumas modalidades, um vão de tamanho adequado pode permanecer entre extremidades reaproximadas permitindo, assim, a introdução de uma composição fluxível no volume do vão que então fecha ou preenche o vão. Em algumas modalidades, a composição administrada pode ser substancialmente imóvel no vão. Em algumas modalidades, esta imobilidade substancial pode ser auxiliada ou fornecida por um envoltório, ou outro dispositivo adequado para circundar ou ligar as extremidades reaproximadas com a composição fechando, desta forma, a lesão e a composição ali dentro.

[00136] A composição da presente invenção pode ser fluxível. Desta forma, a composição fluxível pode ser aplicada com mais precisão ao local do tendão ou ligamento lesionado. Uma seringa, ou outro dispositivo adequado, pode ser usada para administrar a composição da presente invenção. A seringa pode incluir, também uma agulha ou outra cânula adequada que permita aplicação mais precisa da composição. A configuração da seringa e/ou da cânula, tal como seu orifício, tamanho, comprimento, etc. pode ser configurada dependendo do volume desejado da composição a ser aplicada, ou das características de fluidez da composição. Outra característica vantajosa da composição da presente invenção é que a composição, uma vez aplicada, pode permanecer substancialmente imóvel no seu local de aplicação. Em algumas modalidades, a composição fluxível é aplicada através de uma agulha de 21 G, 25 G, ou 27 G. Em algumas modalidades, a aplicação por seringa e/ou agulha permite aplicação da composição fluxível através de injeção percutânea. Em algumas modalidades, a composição fluxível pode ser aplicada por um dispositivo não-canular, tal como uma colher, espátula, escova, ou outro dispositivo similar que permita que a composição seja aplicada ao local desejado.

[00137] Mais uma outra característica vantajosa da composição, em uma modalidade da presente invenção, é que suas características fluxíveis permitem que a composição tenha acesso e preencha regiões da lesão que podem ser normalmente difíceis de acessar. Por exemplo, um tendão ou ligamento rompido pode estar significativamente desgastado nas extremidades lesionadas tornado, assim, difícil o reparo cirúrgico direto. Além disso, estas extremidades danificadas podem conter muitas regiões pequenas relativamente inacessíveis, como fendas e outras regiões intersticiais. A composição fluxível da presente invenção pode ser administrada de modo a fluir para o interior destas regiões e, assim, preenchê-las substancialmente, permitindo e promovendo um reparo mais eficaz e revascularização da lesão.

[00138] Em algumas modalidades da presente invenção, o método pode ser realizado com o uso de técnicas artroscópicos, técnicas endoscópicas, técnicas laparoscópicas, ou quaisquer outras técnicas minimamente invasivas adequadas.

[00139] Em algumas modalidades, o método para tratamento de uma lesão de tendão ou ligamento que não envolve um osso em um indivíduo compreende administrar a um local afetado da lesão do indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende: uma matriz biocompatível e PDGF, em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, o método para tratamento de uma lesão de tendão ou ligamento que não envolve um osso em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende: uma matriz biocompatível e PDGF, em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas e em que o PDGF está presente como uma solução que compreende PDGF, em que a concentração de PDGF na solução é de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de PDGF na solução é de cerca de 1,0 mg/ml. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende um colágeno reticulado e uma matriz de glicosaminoglicano. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 60% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 70% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 80% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 85%. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 92%. Em algumas modalidades, a composição é fluxível. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é a matriz fluxível para ferimentos Integra. Em algumas modalidades, o tratamento é de um tendão. Em algumas modalidades, o tratamento é de um ligamento.

[00140] A presente invenção também fornece métodos de tratar lesões do tendão de Aquiles. Em uma modalidade, um método para tratar lesões do tendão de Aquiles compreende fornecer uma matriz biocompatível e PDGF, em que a matriz biocompatível é fluxível.

[00141] A presente invenção fornece, adicionalmente, composições e métodos para tratar qualquer outra lesão de tendão adequada, inclusive, mas não se limitando aos tendões do subescapular, supraespinhal, infraespinhal, músculo redondo menor, reto femoral, tibial posterior, quadríceps femoral, bíceps braquial, assim como o tendão de Aquiles, tendão patelar, tendões abdutor e adutor, ou outros tendões do quadril, o tendão extensor comum, tendão flexor comum, tendões superficiais flexores dos dedos, tendões extensor dos dedos e extensor do dedo mínimo, ou outros tendões do braço e mão.

[00142] A presente invenção fornece, adicionalmente composições e métodos para tratar qualquer outra lesão de ligamento adequada, inclusive, mas não se limitando ao ligamento cruzado anterior, ligamento colateral lateral, ligamento cruzado posterior, ligamento colateral medial, ligamento cruzado cranial, ligamento cruzado caudal, ligamento cricotireoideo, ligamento periodontal, ligamento suspensor da lente , ligamento sacroilíaco anterior, ligamento sacroilíaco posterior, ligamento sacrotuberoso, ligamento sacro-espinhoso, ligamento púbico inferior, ligamento púbico superior, ligamento suspensor (por exemplo, pênis ou mama), ligamento radiocarpal palmar, ligamento radiocarpal dorsal, ligamento colateral ulnar, ou ligamento colateral radial. Métodos para fixação do tendão ao osso ou ligamento ao osso

[00143] A presente invenção apresenta métodos para fixar ou refixar um tendão ou um ligamento dentro/a um osso e para o fortalecimento da fixação do tendão ou ligamento ao osso. Os métodos para fixação podem compreender a integração ou reintegração do tendão ou ligamento com o osso em uma interface entre um tendão e um osso e um ligamento e um osso. Em algumas modalidades, os métodos para fixar um tendão ou um ligamento a ou dentro de um osso compreendem fornecer uma composição que compreende uma solução de PDGF disposta em uma matriz biocompatível e aplicar a composição a uma interface entre um tendão/ligamento e um osso.

[00144] Em algumas modalidades, um método para fixação compreende fornecer uma composição que compreende uma solução de PDGF disposta em uma matriz biocompatível, envolver em torno de um tendão desprendido, inserir a composição e o tendão em um túnel que é perfurado no osso, e fixar o tendão ao osso com suturas.

[00145] Em algumas modalidades, um método para fixação compreende fornecer uma composição que compreende uma solução de PDGF disposta em uma matriz biocompatível, envolver em torno de um ligamento desprendido, inserir a composição e o ligamento em um túnel que é perfurado no osso, e fixar o ligamento ao osso com suturas.

[00146] Em algumas modalidades, um método para fixação compreende fornecer uma composição que compreende uma matriz biocompatível, envolver em torno de um tendão desprendido, inserir a composição e o tendão no osso, injetar uma solução de PDGF em um túnel que é perfurado no osso, e fixar o tendão ao osso com suturas.

[00147] Em algumas modalidades, um método para fixação compreende fornecer uma composição que compreende uma matriz biocompatível, envolver em torno de um ligamento desprendido, inserir a composição e o ligamento no osso, injetar uma solução de PDGF em um túnel que é perfurado no osso, e fixar o ligamento ao osso com suturas.

[00148] Em algumas modalidades, a solução de PDGF pode ser injetada no túnel adjacente ao local do implante do tendão envolvido com a matriz de colágeno. Em algumas modalidades, a solução de PDGF pode ser injetada no lado medial do túnel do osso. Em algumas modalidades, a solução de PDGF pode ser injetada no lado lateral do túnel do osso. Em algumas modalidades, a solução de PDGF pode ser injetada em um único ponto do perímetro do túnel do osso. Em outras modalidades, a solução de PDGF pode ser injetada em múltiplos pontos do perímetro do túnel do osso. Por exemplo, a injeção pode ser feita em %, ^, % da circunferência e na circunferência completa da abertura do túnel.

[00149] Em algumas modalidades, a concentração da solução de PDGF é de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração da solução de PDGF é de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0,5 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração da solução de PDGF é de cerca de 0,15 mg/ml. Em outras modalidades, a concentração da solução de PDGF é de cerca de 0,3 mg/ml.

[00150] A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para fixar um tendão dentro de um osso em um indivíduo para reconstrução do ligamento cruzado anterior, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma matriz biocompatível e PDGF na interface entre o tendão e o osso. Em algumas modalidades, um método para reconstrução do ligamento cruzado anterior compreende fornecer uma composição que compreende uma solução de PDGF disposta em uma matriz biocompatível, envolver em torno de um tendão flexor longo desprendido da sua inserção femoral no lado lateral, inserir a composição e o tendão em um túnel que é perfurado obliquamente através da metáfise da tíbia, e fixar o tendão flexor longo ao córtex medial da tíbia com suturas.

[00151] Em algumas modalidades, um método para reconstrução do ligamento cruzado anterior compreende fornecer uma composição que compreende uma matriz biocompatível, envolver em torno de um tendão flexor longo desprendido da sua inserção femoral no lado lateral, inserir a composição e o tendão em um túnel que é perfurado obliquamente através da metáfise da tíbia, injetar uma solução de PDGF no túnel do osso e fixar o tendão flexor longo ao córtex medial da tíbia com suturas.

[00152] Em algumas modalidades, a presente invenção também fornece métodos para a fixação ou refixação de um tendão a um osso em lesões do manguito rotador. Lesões do manguito rotador e o tratamento de lesões do manguito rotador com um método de reparo aberto, um método de reparo semiaberto e um método de reparo completamente artroscópico são discutidos em WO2008/005427 e no documento U.S. n° de série 11/772.646 (publicação U .S. 2008/0027470). Estas referências estão aqui incorporadas, por referência em suas totalidades. Em algumas modalidades, um método para tratar lesões do manguito rotador compreende fornecer uma composição que compreende uma solução de PDGF disposta em uma matriz biocompatível e aplicar a composição a pelo menos um local de refixação do tendão na cabeça do úmero. Em algumas modalidades, a aplicação da composição a pelo menos um local de refixação do tendão pode compreender moldar a composição de acordo com os contornos do local de refixação na cabeça do úmero. Uma composição pode, por exemplo, ser moldada em um canal formado sobre uma superfície da cabeça do úmero para receber o tendão desprendido. A composição pode ser aplicada às adjacências do local de inserção do tendão no osso para fortalecer ainda mais a fixação.

[00153] Em algumas modalidades, um método para tratar lacerações do manguito rotador compreende, adicionalmente, colocar pelo menos um meio de ancoramento, tal como uma âncora óssea na cabeça do úmero, sendo que a âncora óssea compreende, adicionalmente, uma composição de PDGF, e acoplar pelo menos um tendão desprendido à âncora óssea. Em modalidades da presente invenção, os tendões podem ser presos às âncoras ósseas através de suturas.

[00154] Em algumas modalidades da presente invenção, o método pode ser realizado com o uso de técnicas artroscópicos, técnicas endoscópicas, técnicas laparoscópicas, ou quaisquer outras técnicas minimamente invasivas adequadas.

[00155] As soluções de PDGF e matrizes biocompatíveis adequadas para uso nas composições de acordo com modalidades dos métodos da presente invenção são compatíveis com as fornecidas anteriormente neste documento.

[00156] Em algumas modalidades, o método para fixação de um tendão ou ligamento a ou dentro de um osso em um indivíduo compreende administrar a um local afetado do indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende: uma matriz biocompatível e PDGF, em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, o PDGF está presente como uma solução que compreende PDGF, sendo que a concentração de PDGF na solução é de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de PDGF na solução é de cerca de 0,1 a cerca de 0,4 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de PDGF na solução é de cerca de 0,15 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de PDGF na solução é de cerca de 0,3 mg/ml. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende uma matriz de colágeno reticulado. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende um colágeno reticulado e uma matriz de glicosaminoglicano. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 60% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 70% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 80% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 85%. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 92%. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é COLLATAPE®. Em algumas modalidades, o tratamento é de uma fixação de um tendão ao osso. Em algumas modalidades, o tratamento é de uma fixação de um ligamento ao osso. Suturas

[00157] As suturas usadas nos métodos da invenção, ou incluídas nos kits da presente invenção, podem compreender PDGF. O PDGF pode ser embebido nas suturas ou revestido sobre elas por uma solução que compreende PDGF. Em algumas modalidades, o PDGF está presente na solução a qualquer concentração de cerca de 5,0 a cerca de 20,0 mg/ml, por exemplo, cerca de 7,5 a cerca de 15 mg/ml, por exemplo, cerca de 10 mg/ml.

[00158] As suturas usadas nos métodos da invenção, ou incluídas nos kits da presente invenção, podem ser reabsorvíveis ou não- reabsorvíveis in vivo. O processo de reabsorção envolve a degradação e eliminação do material original através da ação dos fluidos corporais, enzimas ou células. As suturas reabsorvidas podem ser usadas pelo hospedeiro na formação de novo tecido, ou elas podem ser reutilizadas de outro modo pelo hospedeiro, ou elas podem ser excretadas. As suturas podem ser produzidas a partir de fibras sintéticas ou naturais, ou uma combinação de ambas.

Kits da invenção

[00159] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um kit que compreende um primeiro recipiente que compreende uma solução de PDGF e um segundo recipiente que compreende uma matriz biocompatível.

[00160] Em algumas modalidades, é fornecido um kit para o tratamento de uma lesão de tendão ou ligamento que não envolve um osso em um indivíduo, que compreende administrar um primeiro recipiente que compreende uma matriz biocompatível e um segundo recipiente que compreende uma solução PDGF, em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas.

[00161] Em outras modalidades, é fornecido um kit para fixar um tendão ou um ligamento a um osso em um indivíduo, que compreende administrar um primeiro recipiente que compreende uma matriz biocompatível e um segundo recipiente que compreende uma solução de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível tem uma porosidade de pelo menos cerca de 80%, e em que pelo menos cerca de 50% do PDGF é liberado dentro de cerca de 24 horas.

[00162] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível é desidratada. Em algumas modalidades, a solução compreende uma concentração predeterminada de PDGF. Em algumas modalidades, a concentração de PDGF pode ser predeterminada de acordo com a natureza da lesão de tendão ou ligamento sendo tratada. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende uma quantidade predeterminada de acordo com a natureza da lesão de tendão ou ligamento sendo tratada. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende uma quantidade predeterminada de acordo com a natureza do tendão/ligamento e do osso sendo tratados.

[00163] Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende um colágeno reticulado. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende um colágeno solúvel. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende um colágeno reticulado e um glicosaminoglicano. Em algumas modalidades, a matriz biocompatível compreende um colágeno reticulado e sulfato de condroitina.

[00164] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um kit que compreende um primeiro recipiente que compreende uma solução de PDGF, um segundo recipiente que compreende uma matriz biocompatível, e uma seringa. Uma seringa, em algumas modalidades, pode facilitar a dispersão da solução de PDGF na matriz biocompatível para aplicações em um sítio cirúrgico, tal como um local de fixação do tendão ou ligamento ao osso. O kit pode conter, também, instruções para uso.

[00165] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas com propósitos ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção de qualquer maneira.

EXEMPLOS

[00166] Exemplo 1: Caracterização estrutural de várias matrizes de colágeno

[00167] Quatro matrizes de colágeno foram estudadas para determinar as diferenças na estrutura fina e na porosidade. As matrizes de colágeno foram obtidas junto à Kensey Nash Corporation. As matrizes foram feitas a partir de extrato de colágeno purificados de derme bovina, que é uma fonte principalmente de colágeno tipo I. As matrizes são produzidas a partir de pastas fluidas de colágeno com diferentes concentrações de colágeno, 4,5%, 5%, 6% e 7% (p/v). As matrizes de colágeno secas (4,5%, 5%, 6%, e 7%) foram perfuradas em discos de 5 mm após serem submetidas a fluxo com nitrogênio líquido. Os discos foram montados no suporte porta-amostras do microscópio (stub) em três orientações diferentes (face superior para cima, face inferior para cima e face lateral para cima), revestidos com ouro-paládio, e examinados por microscopia eletrônica de varredura (MEV).

[00168] As imagens obtidas por MEV revelaram que havia poros abertos sobre a superfície da matriz de colágeno (4,5%) e da matriz de colágeno (5%). As imagens obtidas por MEV revelaram uma lâmina densa com poros menores sobre a superfície da matriz de colágeno (6%) e da matriz de colágeno (7%). Embora cada uma das matrizes de colágeno parecesse ser porosa, com base nas imagens obtidas por MEV de cortes longitudinais em seção transversal, a matriz de colágeno (5%) pareceu ter a maior porosidade global, conforme avaliado por MEV. Os poros nas matrizes de colágeno não pareceram estar distribuídos de maneira homogênea e em algumas áreas não havia poros.

[00169] As imagens obtidas por MEV foram analisadas com o uso do programa ImageJ para a determinação do tamanho da área do poro e do tamanho do perímetro. O ImageJ é um programa para análise de imagens criado por Wayne Rasband no National Institutes of Health (página da internet em rsb.info.nih.gov/ij). Para usar o programa para análise de imagens, os parâmetros adequados precisaram ser escolhidos e estabelecidos. A partir do menu "analyze", a escala de cada imagem obtida por MEV foi inserida no programa para estabelecer o parâmetro "scale" . A seguir, "area" e "perimeter" foram escolhidos para os parâmetros de medição. Dez poros de cada imagem foram selecionados aleatoriamente, as medições foram feitas e a média foi calculada para o tamanho da área e para o tamanho do perímetro. Os resultados para cada imagem foram registrados. A Tabela 1 mostra os resultados de uma análise. Tabela 1

[00170] A matriz de colágeno (5%) pareceu ter a estrutura mais porosa e o tamanho da área do poro foi a maior tanto nas visualizações do Lado A quanto do Lado B, conforme analisado pelo programa ImageJ.

[00171] Exemplo 2: Análise da liberação cumulativa de PDGF de várias matrizes de colágeno

[00172] A liberação cumulativa de PDGF a partir das diferentes matrizes de colágeno foi analisada. As matrizes de colágeno foram obtidas junto à Kensey Nash Corporation e são iguais as descritas acima no Exemplo 1. As matrizes de colágeno (discos de 8 mm) de cada tipo, 5%, 6%, e 7%, foram imobilizadas em uma agulha de 271ZG, hidratadas com 80 μl de rhPDGF-BB a 0,3 mg/ml e as amostras foram incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente. Os discos de colágeno foram, então, colocados em um microtubo de 2 ml e 2 ml de tampão de eluição (MEM contendo 2% de soro fetal bovino) foram adicionados para liberar o rhPDGF-BB. Amostras em triplicata foram usadas para cada medição. As amostras de controle consistiram na adição de 80 μl de rhPDGF-BB a 2 ml de tampão de eluição. Os microtubos foram agitados em um agitador orbital em uma incubadora a 37°C. Nos tempos de 10 min, 1hr, 8hr, e 24hr, o eluente foi removido de cada tubo e armazenado a 2 a 8°C. Um volume igual de tampão de eluição fresco foi adicionado a cada tubo. Os eluentes armazenados de cada matriz de colágeno foram avaliados quanto ao rhPDGF-BB com o uso do kit de ELISA DuoSet (R & D System) de acordo com as instruções do fabricante.

[00173] A matriz de colágeno (5%) liberou rhPDGF-BB com cinética similar em comparação a matriz de colágeno (6%) e a matriz de colágeno (7%) (figura 1). As cinéticas de liberação foram caracterizadas por uma liberação rápida inicial de bolo de rhPDGF-BB nos primeiros 10 minutos seguido de uma liberação mais lenta e constante ao longo das 23 horas remanescentes do período de estudo. Embora as cinéticas de liberação tenham sido similares, o bolo inicial e a quantidade total de PDGF liberado da matriz de colágeno (5%) foram maiores que os da matriz de colágeno (6%) ou da matriz de colágeno (7%).

[00174] O percentual de liberação de rhPDGF-BB das matrizes de colágeno foi comparado ao controle (rhPDGF-BB somente em tampão de eluição). Os resultados mostraram que, assim como acima, a matriz de colágeno (5%) tinha uma liberação mais rápida e maior de PDGF do que a matriz de colágeno (6%) ou a matriz de colágeno (7%). (Figura 2). Os resultados deste estudo também são mostrados na Tabela 2. Tabela 2

[00175] Exemplo 3: Estudo da biopotência da liberação de PDGF a partir de várias matrizes de colágeno

[00176] A biopotência do PDGF liberado a partir das diferentes matrizes de colágeno foi avaliada em testes de proliferação celular. As amostras foram preparadas de acordo com uma modificação do protocolo descrito acima no exemplo 2. O tampão de eluição foi trocado para D-MEM contendo 2% de soro de bovino. Foram usadas amostras em duplicata para cada material retirado no ponto de tempo de uma hora. A concentração de rhPDGF-BB foi determinada pelo ensaio ELISA DuoSet, e os resultados foram usados como uma referência para diluir as amostras até uma concentração de 1 μg/ml. O rhPDGF-BB a 0,3 mg/ml foi usado como um padrão de referência e aplicado a todas as placas. Cada amostra foi aplicada em uma placa de microtitulação de 96 poços (parede preta e fundo claro) com o uso de uma concentração inicial de 1 μg/ml e, então, foram diluídas seriadamente 1,667 vezes ao longo a mesma coluna. Aproximadamente 104 células NIH 3T3 foram adicionadas a cada poço, com exceção da última coluna em cada placa, que foi usada como um controle em branco. Após 48 horas de cultura, o marcador bromodeoxiuridina (BrdU) foi adicionado a cada placa. Após mais 24 horas de cultura, um teste de proliferação celular com BrdU foi conduzido de acordo com as instruções do fabricante.

[00177] O rhPDGF-BB liberado de cada matriz medida em um teste de proliferação de célula NIH 3T3 demonstrou que a atividade biológica do PDGF liberado foi conservada para as três matrizes analisadas. (Figura 3).

[00178] Exemplo 4: Estudo da estabilidade do PDGF liberado das matrizes de colágeno

[00179] A estabilidade do rhPDGF liberado das matrizes de colágeno foi estudada. As matrizes de colágeno (discos de 8 mm) de cada tipo, (5%, 6%, e 7%) foram imobilizadas em uma agulha de 271ZG e hidratadas com 50 μl de rhPDGF-BB a 1,0 mg/ml. Cada amostra foi incubada em um microtubo cheio com 0,4 ml de tampão de eluição (acetato de sódio 20 mM + cloreto de sódio 0,25 N) durante 1 h. O PDGF liberado foi, então, analisado por HPLC de exclusão de tamanho. Foram feitas medições em triplicata. Nenhuma alteração significativa no perfil foi observada para o rhPDGF-BB liberado a partir das matrizes de colágeno, demonstrando a estabilidade do PDGF liberado das matrizes de colágeno.

[00180] Exemplo 5: Estudo da infiltração de tenócitos de várias matrizes de colágeno

[00181] A capacidade dos tenócitos infiltrarem em diferentes matrizes de colágeno foi avaliada. As matrizes de colágeno foram obtidas junto à Kensey Nash Corporation e foram feitas a partir de pastas fluidas de colágeno com concentrações de colágeno de 5%, 6% e 7% (p/v), conforme descrito na presente invenção. As lâminas de colágeno (1,5 a 2,0 mm de espessura) foram cortadas em discos de 8 mm de diâmetro para os estudos de migração celular in vitro.

[00182] Tenócitos ovinos primários (<4 passagens das células) foram isolados do tendão flexor ovino. As células foram cultivadas em meio de crescimento (D-MEM/F-12 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB)) e trocadas para meio básico (D-MEM/F-12 contendo 2% de SFB) 12 horas antes do início do estudo.

[00183] 50 μl (50.000 células) da suspensão de células de tenócitos em meio básico foram adicionados a cada amostra de disco de colágeno. Após uma incubação de 1 h a 37°C e atmosf era com 5% de CO2 sem imersão do meio, os discos semeados com as células foram transferidos para uma placa de 24 poços preenchida anteriormente com 2 ml de meio básico sozinho ou em combinação com rhPDGF-BB (30 ng/ml). Após 12 h de cultura estática, as placas com os discos semeados com as células foram colocadas em um agitador orbital (60 rpm) na incubadora. As trocas de meio foram feitas a cada 48 h. No dia 6, amostras em quadruplicata a partir de cada matriz de colágeno e tratamento foram retiradas para avaliação histológica.

[00184] Em geral, a avaliação histológica foi semelhante à descrição a seguir. Após uma cultura de seis dias, o meio de cultura celular foi removido de cada poço e substituído por formalina com tamponada com fosfato a 4% (PBF). As amostras foram fixadas em PBF durante aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente (RT). As amostras foram colocadas sob vácuo à temperatura ambiente durante um período de não menos que 1 hora para completar a fixação celular. Com o uso de uma plataforma agitadora e uma câmara de vácuo, os espécimes foram então desidratados ao longo de um período de aproximadamente 5,5 horas ao longo de uma série crescente de concentrações de etanol (70% - 80% - 95% - 100%) à temperatura ambiente, purificados em xileno 100% ao longo de um período de 2 horas à temperatura ambiente, e infiltrados em cera de parafina durante um período de não menos que 2 horas. Amostras de cada grupo de tratamento e matriz foram incluídas em parafina. Os espécimes incluídos foram removidos dos seus moldes de inclusão em parafina, foram "aparados" e "facetados" com um micrótomo giratório para expor a superfície mais externa de todos os espécimes, e, então, colocados no congelador de um dia para o outro. Com o uso de um micrótomo giratório, um banho-maria aquecido, e lâminas para microscópio em vidro pré-rotuladas, seções (2 seções por lâmina) foram retiradas a 4 a 6 mícrons em 3 a 4 níveis de aproximadamente 100 a 150 mícrons de distância. As lâminas foram secas de um dia para o outro em um forno a 60°C. Por fim, as lâmina s foram coradas com coloração de fluorescência Hoescht e visualizadas.

[00185] Os resultados mostraram que os tenócitos infiltraram a matriz de colágeno (5%) com PDGF, enquanto que os tenócitos não pareceram infiltrar a matriz de colágeno (6%) e a matriz de colágeno (7%). Para as amostras de matriz de colágeno (6%) e de matriz de colágeno (7%) a maioria dos tenócitos se acumulou na borda dos discos. Portanto, pareceu que a maior porosidade da matriz de colágeno (5%) permitiu um maior número de células infiltrantes na matriz de colágeno.

[00186] Exemplo 6: Tratamento de lesão de tendão de Aquiles com composições de colágeno/PDGF

[00187] Um estudo exemplificador, conforme descrito abaixo, foi usado para avaliar a eficácia de uma composição e dos métodos de acordo com a presente invenção. A presente invenção inclui composições, e métodos de uso das mesmas, que compreendem uma solução de rhPDGF-BB misturada com uma matriz de colágeno. Por exemplo, a matriz de colágeno é uma matriz de colágeno fluxível e compreende um colágeno de tendão bovino reticulado e uma matriz de glicosaminoglicano (GAG). As composições fluxíveis são facilmente fornecidas ao local da lesão por uma seringa ou outros meios adequados.

[00188] Ovelhas, ou outros objetos de teste adequados foram usados neste estudo exemplificador como um modelo para o reparo de tendão de Aquiles humano. As ovelhas são particularmente adequadas por causa da similaridade de tamanho entre o tendão de Aquiles de ovelha e o tendão de Aquiles humano. Além disso, as ovelhas têm tamanho suficiente para permitir técnicas ortopédicas padrão e colocação da composição. As ovelhas usadas neste estudo eram esqueleticamente maduras (como determinado pela idade [3,5 anos e mais velhas] e desgaste dos dentes) com deambulação normal, e pesavam pelo menos 120 libras e foram aclimatadas no momento da cirurgia. O fornecimento de alimento e água para as ovelhas foi feito de acordo com uma dieta padrão para ruminantes pequenos. O fornecimento de alimento e água foi interrompido para eventos adequados relacionados ao estudo, como anestesia.

[00189] O estudo usou três grupos de tratamento (n=8/grupo) nos quais as seguintes composições de teste foram fornecidas e aplicadas ao local da lesão de transecção aguda de tendão de Aquiles: (1) matriz de colágeno fluxível em tampão, (2) matriz de colágeno fluxível em tampão com 0,3 mg/mL (150 μg) de rhPDGF-BB, e (3) matriz de colágeno fluxível em tampão com 1,0 mg/mL (500 μg) de rhPDGF-BB. Outros grupos de tratamento adequados são usados, como, por exemplo, os que usam composições com outras concentrações adequadas de rhPDGF-BB.

[00190] Uma matriz de colágeno fluxível exemplificadora é a matriz fluxível para ferimentos Integra® Flowable Wound Matrix (IFWM) da Integra LifeSciences Corporation, Plainsboro, NJ. Outras matrizes adequadas conhecidas na técnica também podem ser usadas.

Visão geral do experimento

[00191] Os tendões de Aquiles das ovelhas incluídas neste estudo foram transeccionados, seguido de reparo imediato. As ovelhas foram divididas em três grupos de teste exemplificadores (n=8/grupo) nos quais as seguintes composições foram usadas: 1) matriz de colágeno fluxível em tampão de acetato de sódio 20mM (pH 6,0 +/- 0,5), colocada nas extremidades reaproximadas do tendão (estabilizadas com uma sutura do tipo Mason Allen modificada) (controle), 2) matriz de colágeno fluxível, em tampão de acetato de sódio 20mM contendo 0,3mg/ml de rhPDGF-BB, colocada nas extremidades reaproximadas do tendão (estabilizadas com uma sutura do tipo Mason Allen modificada) e 3) matriz de colágeno fluxível em tampão de acetato de sódio 20mM contendo 1,0mg/ml de rhPDGF-BB, colocada nas extremidades reaproximadas do tendão (estabilizadas com uma sutura do tipo Mason Allen modificada). Material para realização de suturas foi usado, tal como sutura de náilon Ethilon n° 1 ( Ethicon EndoSurgery, Inc, Cincinnati, OH). O desempenho biomecânico e a resposta histológica da simulação de ruptura e refixação de tendão de Aquiles foram determinados. As distribuições do tratamento e o número de animais para ambos os testes de desempenho biomecânico e resposta histológica são descritos na Tabela 3. Tabela 3: Distribuições do tratamento

[00192] Após a colocação dos materiais de teste, a incisão foi fechada com o uso de técnicas cirúrgicas padrão e uma tala foi colocada na parte inferior do pé para evitar articulação durante a deambulação. Durante a semana após a cirurgia, o sítio cirúrgico foi monitorado para cura anormal ou deiscência do ferimento. O animal foi deixado deambular normalmente durante 8 semanas e avaliações de ultrassom foram feitas 2, 4 e 8 semana após a cirurgia. Oito semanas após a cirurgia, todos os animais foram eutanizados e o tendão de Aquiles foi coletado, incluindo as junções musculotendinosas proximal e distal, para avaliação histológica e biomecânica. Tendões normais não operados e suas junções musculotendinosas foram coletados da pata traseira contralateral dos animais de controle (isto é, apenas matriz de colágeno fluxível para ferimentos) para que os testes histológicos e biomecânicos possam ser realizados para os tendões normais não-tratados. A pele do sítio cirúrgico inicial e dos controles contralaterais também foi retirada para avaliação histológica.

Protocolo cirúrgico

[00193] No dia da cirurgia, uma injeção IV consistindo em diazepam (0,22 mg/kg) e cetamina (10 mg/kg) foi dada para indução de anestesia geral. Um tubo endotraqueal com cuff foi colocado e anestesia geral foi mantida com isofluorano (1,5% a 3,0%) em 100% de oxigênio (2L/min) através um sistema de reinalação. O animal foi colocado em um ventilador para auxiliar a respiração. Um tubo estomacal pode ser colocado.

[00194] Com o animal em decúbito lateral esquerdo, a lã foi removida da pata direita para prover acesso adequado para preparar o local para a cirurgia. A pele sobre a articulação do tornozelo direito foi preparada para cirurgia asséptica com o uso de fricções alternadas de iodo-povidona (Betadine) e álcool. O sítio cirúrgico foi, então, coberto com campo cirúrgico para cirurgia asséptica. Uma incisão foi feita sobre o aspecto lateral da perna e, então, aprofundada através dos tecidos subcutâneos para expor o tendão no seu local de inserção no calcâneo. A ramificação maior do tendão gastrocnêmio foi, então, isolada. A inserção do tendão de Aquiles ao calcâneo foi palpada e marcas foram colocadas a 2, 4, e 6 cm do local da inserção com um marcador estéril.

[00195] Antes da cirurgia, a matriz e a solução tampão adequada (tampão de acetato de sódio 20mM, pH 6,0 +/- 0,5) +/- rhPDGF-BB, foram combinadas pela adição de 6,0cc do tampão +/- rhPDGF-BB, a 3,0cc do material de colágeno fluxível (IFWM) (2:1 v/v), com o uso das seringas estéreis marcadas fornecidas contendo o colágeno seco e o tampão +/- rhPDGF-BB. Os materiais foram combinados pela remoção da tampa da ponta da seringa contendo o rhPDGF-BB e substituição da mesma com o conector de três vias (luer lock) estéril ao qual a seringa contendo o colágeno seco foi, então, conectada. A hidratação da matriz de colágeno foi feita pela dispensação de todo o tampão +/- rhPDGF-BB dentro da seringa de colágeno e mistura através da pressão dos êmbolos para frente e para trás pelo menos 15 vezes até que a mistura parecesse homogênea e todo o material pudesse ser movimentado para frente e para trás facilmente entre as seringas. A matriz de colágeno fluxível hidratada foi aliquotada em volumes de 0,5 cc em recipientes estéreis e armazenada a 4°C até o uso.

[00196] Após a exposição do tendão, uma sutura estabilizante (Ethilon n° 1) foi colocada com o uso de uma sutura do tipo Mason Allen modificada com uma extremidade na marca de 2 cm e uma extremidade na marca de 6 cm. A sutura do tipo Mason Allen foi mantida firme para manter o comprimento do tendão, mas uma extremidade foi deixada desamarrada para a manipulação das extremidades do tendão. O tendão foi, então, cortado na marca de 4 cm ou próximo dela, e após isto as extremidades do tendão foram reaproximadas e a extremidade livre da sutura Mason Allen foi amarrada na extremidade distal do tendão. Uma fotografia do tendão cortado com uma régua foi tirada para documentar a distância da inserção do calcâneo. Vide, por exemplo, o tendão cortado suturado exemplificador mostrado na figura 4. Uma pequena cauda na sutura foi deixada na extremidade distal e uma pequena sutura de identificação (3-0) foi colocada na extremidade proximal para identificação após a necropsia. O tecido mole sobrejacente foi fechado, deixando um espaço em volta da transecção do tendão para inserção da matriz fluxível. O material da matriz de colágeno fluxível hidratada foi, então, colocado nas extremidades do tendão da seguinte forma: a alíquota estéril de 0,5cc foi retirada da seringa através de uma agulha de 20 gauge, com o lado chanfrado voltado em direção às extremidades transeccionadas do tendão. Metade (0,25cc) da alíquota estéril foi espremida ao longo da superfície de cada uma das extremidades do tendão transeccionado. Tomou-se cuidado para garantir que o material fosse distribuído de maneira uniforme no espaço do vão. Vide, por exemplo, uma composição fluxível exemplificadora da presente invenção sendo aplicada ao tendão transeccionado suturado exemplificador, conforme mostrado na figura 5.

[00197] O tecido subcutâneo e a pele sobrejacente foram fechados de acordo com procedimentos cirúrgicos padrão. Uma tala produzida a partir de OrthoGlass foi colocada na porção inferior da pata para evitar articulação durante a deambulação. Imediatamente após a cirurgia, as ovelhas foram transferidas da mesa de operação e observadas até que o reflexo de deglutição voltasse, e neste ponto elas foram extubadas. Ao término na cirurgia, as ovelhas foram postas em decúbito esternal, e, então, abrigadas durante a duração do estudo. Talas e/ou moldes de imobilização foram usados nas ovelhas para reduzir a articulação e/ou alongamento excessivo do tendão reparado. Analgesia pós-operatória foi fornecida, e os animais foram mantidos de acordo com procedimentos padrão de cuidado pós-operatório.

Observações clínicas

[00198] Os animais foram observados duas vezes ao dia até serem sacrificados. Durante a primeira semana, o sítio cirúrgico foi observado, e fotos foram obtidas, com relação a anormal ou deiscência do ferimento. Durante todo o período de estudo pós- cirúrgico, os animais foram observados com relação à atitude geral, apetite, uso do membro operado (por exemplo, claudicação), e aparência do sítio cirúrgico. Antibióticos foram administrados a um animal quando uma infecção se desenvolveu no sítio cirúrgico, e este fato foi anotado nas observações. Imagens de ultrassom para o tendão de Aquiles operado e para o tendão de Aquiles contralateral não operado foram obtidas para todos os locais de tratamento 2, 4, e 8 semanas após a cirurgia com o uso de métodos conhecidos na técnica. Oito (8) semanas após a cirurgia, todos os animais foram sacrificados para coleta de tecido.

Teste biomecânico

[00199] O desempenho mecânico de uma ruptura e refixação de tendão de Aquiles estimulado foi determinado com o uso de três diferentes grupos de tratamento, conforme discutido acima na seção de visão geral do experimento.

Materiais e Métodos

[00200] Após a coleta, os espécimes foram envoltos em gaze embebida em solução salina e armazenados a -20°C até o teste. O metatarso foi implantado em um tubo de PVC de 2" com o uso de polimetilmetacrilato (PMMA) de alta resistência. Os espécimes foram mantidos úmidos durante a preparação do implante e o teste biomecânico com uma aspersão de solução salina em intervalos de 15 minutes. O metatarso implantado foi montado em um acessório de teste com desenho customizado que foi fixado de forma rígida à estrutura de carregamento do sistema de teste dos materiais (MTS MiniBionix II, Edan Prairie, MN). Uma braçadeira de criogenia (cryoclamp) com desenho personalizado foi implementada para preservar a seção transversal natural do tendão de Aquiles e reduzir o deslizamento do tecido mole e uma força de tração uniaxial foi aplicada à construção em um ângulo de aproximadamente 135° ao metatarso implantado. Isto foi feito para imitar o vetor da força fisiológica do tendão. O teste começou quando um termopar fixado à braçadeira de criogenia registrou - 22°C, uma tempe ratura relatada anteriormente como sendo suficiente para garantir acoplamento seguro entre o tendão e as braçadeiras. Nenhum material da sutura incluído no tecido foi cortado antes do teste. Desta forma, os resultados biomecânicos representam a contribuição mecânica combinada da sutura incluída no tecido e do tecido de reparação.

[00201] Quatro marcadores retrorrefletores foram suturados ou colados sobre a construção implantada: um no calcâneo imediatamente adjacente ao local de reparo, dois no tendão - um proximal e um distal à interface entre o tecido de reparo e o tendão de Aquiles. O quarto foi colado na braçadeira de criogenia. Três câmeras (Motion Analysis, Santa Rosa, CA) registraram o movimento espacial dos marcadores em 60 Hz. As medições de deslocamento do marcador com o uso do sistema de câmera permitiu um monitoramento em tempo real do deslocamento/estiramento do tecido local dentro do tecido de reparação.

[00202] Fase 1: 30 ciclos de pré-condicionamento dinâmico

[00203] Um teste de carregamento cíclico foi empregado inicialmente para pré-condicionar o tendão reparado. Com o uso de um protocolo de controle de força, uma pré-carga de 10 Newton (N) foi aplicada à construção durante dois minutos. Esta foi escolhida como a configuração inicial para todas as construções. As construções reparadas foram então pré-condicionadas de forma cíclica em um protocolo de controle de força de 10 a 50 N a 0,25 Hz durante 60 ciclos para atingir um estado estacionário. O número de sessenta (n=60) ciclos foi escolhido com base em experimentos anteriores em nosso laboratório que demonstraram que a inclinação da curva de deslocamento versus tempo converge entre 50 e 60 ciclos. Os parâmetros de interesse incluíram o alongamento no condicionamento, definido como a diferença no deslocamento pico a pico entre o primeiro e o sexagésimo ciclos, e o alongamento de pico a pico, definido como a média da diferença entre o mínimo e o máximo local do 58°, 59°, e 60° ciclos.

Carregamento na ruptura quasi-estático

[00204] Após o pré-condicionamento, as construções reparadas foram submetidas a uma carga para ruptura sob controle de deslocamento a uma taxa de 1 mm/s. Os parâmetros biomecânicos de interesse incluíram a carga para ruptura final, rigidez global quasi- estática da construção (definida como o coeficiente angular da curva carga-deslocamento), a rigidez local do tecido de reparo, alongamento na ruptura e energia absorvida na ruptura. Por fim, o mecanismo de ruptura foi documentado para cada espécime. Imagens digitais e/ou vídeo foram feitos antes do teste, durante o procedimento de resistência à ruptura e após a ruptura da construção.

Análise estatística

[00205] Um teste ANOVA unidirecional seguido de um teste post hoc de comparações múltiplas de Tukey foi usado para identificar diferenças significativas nos parâmetros biomecânicos contínuos entre o controle de IFWM e os grupos de tratamento com 0,3 mg/mL de PDGF e 1,0 mg/mL de PDGF. A significância foi estabelecida em p<0,05 e todas as análises foram fitas com o programa SigmaStat 3.1 (Systat Software, Inc., San Jose, CA).

Resultados

[00206] Nenhuma diferença macroscópica visual foi identificada entre os três grupos de tratamento. Duas das seis (33%) construções no grupo de IFWM + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB apresentaram um hematoma evidente no aspecto lateral do tecido de reparo. A presença deste hematoma afetou as propriedades biomecânicas do reparo, como evidenciado pela ruptura começando no local exato do hematoma em cargas extraordinariamente baixas. A análise dos dados foi feita com (n=6) e sem (n=4) estes dois espécimes afetados pelo hematoma. Os dados brutos do componente do pré-condicionamento cíclico do teste, incluindo os dois espécimes afetados pelo hematoma no grupo de 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB, são apresentados na Tabela 4. Nenhuma diferença significativa no alongamento no condicionamento (p=0,636) ou no alongamento de pico a pico (p=0,813) foi identificada entre os grupos de tratamento IFWM, IFWM+0,3 mg/ml de rhPDGF- BB, ou IFWM+1,0 mg/ml de rhPDGF-BB (figura 6A). Tabela 4A: Dados resumidos da análise de pré-condicionamento cíclico. Dados relatados como média ± S.E.M.

[00207] De modo similar, nenhuma diferença significativa no alongamento no condicionamento (p=0,709) ou no alongamento de pico a pico (p=0,947) foi identificada entre os grupos de tratamento IFWM, IFWM+0,3 mg/ml de rhPDGF-BB, ou IFWM+1,0 mg/ml de rhPDGF-BB. Figura 6B. Os dados brutos do componente do pré- condicionamento cíclico do teste com os espécimes afetados pelo hematoma excluídos da análise são apresentados na Tabela 4B. Tabela 4B: Dados resumidos da análise de pré-condicionamento cíclico. Dados relatados como média ± S.E.M.

[00208] ** - dois dos seis espécimes neste grupo apresentaram um hematoma evidente no aspecto lateral do tecido de reparo no qual a ruptura do tecido começou claramente durante o teste de resistência (RTF). Eles foram removidos da comparação estatística.

[00209] Os dados brutos do componente de resistência à ruptura do teste biomecânico com os dois espécimes afetados pelo hematoma incluídos da análise são apresentados na Tabela 5A. Nenhuma diferença significativa foi identificada nos tendões de Aquiles reparados cirurgicamente para qualquer parâmetro quasi-estático entre os grupos de tratamento IFWM, IFWM+0,3 mg/ml de rhPDGF- BB, ou IFWM+1,0 mg/ml de rhPDGF-BB (p>0,05, Tabela 5, figura 7A). Embora não seja significativo, a dose de 1,0 mg/mL de rhPDGF-BB resultou, em média, em um aumento de 57,4% e 55,0% na força final para ruptura em relação aos grupos de controle de IFWM e 0,3 mg/mL de rhPDGF-BB, respectivamente. Nenhuma diferença significativa na energia absorvida na ruptura foi identificada entre os três grupos de tratamento (p=0,209: IFWM, 6423,33 ± 1811,26 N*mm; 0,3 mg/mL de rhPDGF-BB, 7346,00 ± 2989,94 N*mm; 1,0 mg/mL de PDGF, 12173,33 ± 2049,62 N*mm), embora a energia absorvida na ruptura no grupo de tratamento de 1,0 mg/mL de rhPDGF-BB tenha sido, em média, 89,5% e 65,7% maior que os grupos de tratamento de controle de IFWM e 0,3 mg/mL de rhPDGF-BB, respectivamente. Tabela 5A: Dados resumidos da análise de resistência à ruptura. Dados relatados como média ± S.E.M.

[00210] Os dados brutos do componente de resistência à ruptura do teste biomecânico com os dois espécimes afetados pelo hematoma excluídos da análise são apresentados na Tabela 5B. Nenhuma diferença significativa foi identificada nos tendões de Aquiles reparados cirurgicamente para qualquer parâmetro quasi-estático global entre os grupos IFWM, IFWM+0,3 mg/ml de rhPDGF-BB, ou IFWM+1,0 mg/ml de rhPDGF-BB (p>0,05, Tabela 5B, figura 7B). Embora não seja significativo, a dose de 1,0 mg/ml de PDGF resultou, em média, em um aumento de 57,4% e 22,2% na força final para ruptura em relação aos grupos de controle de IFWM e 0,3 mg/ml de PDGF, respectivamente. Nenhuma diferença significativa na energia absorvida na ruptura foi identificada entre os três grupos (p=0,247: IFWM, 6423,33 ± 1811,26 N*mm; 0,3 mg/ml PDGF, 9850,75 ± 4006,36 N*mm; 1,0 mg/ml PDGF, 12173,33 ± 2049,62 N*mm), embora a energia absorvida na ruptura no grupo de tratamento de 1,0 mg/ml PDGF tenha sido, em média, 89,5% e 23,6% maior que os grupos de tratamento de controle de IFWM e 0,3 mg/ml de PDGF, respectivamente. Tabela 5B: Dados resumidos da análise de resistência à ruptura. Dados relatados como média ± S.E.M.

[00211] Com a inclusão dos dois espécimes afetados pelo hematoma na análise (tabela 6, figura 8 (esquerda)), a rigidez local do tecido de reparo no grupo de tratamento com 1,0 mg/mL de rhPDGF- BB (n=6, 312,56 ± 20,86 N/mm) foi, em média, 77,3% maior que a rigidez local quantificada no grupo de tratamento com 0,3 mg/mL (n=6, 176,30 ± 31,17 N/mm). Esta diferença foi estatisticamente significativa (p=0,012). Nenhuma diferença significativa na rigidez local do tecido de reparo foi identificada entre o grupo de tratamento com 1,0 mg/mL de PDGF e do controle de IFWM (n=6, 215,23 ± 33,23 N/mm, p=0,075). Com os dois espécimes afetados pelo hematoma excluídos da análise (figura 8 (direita)), a rigidez local do tecido de reparo no grupo de tratamento com 1,0 mg/mL de rhPDGF-BB foi, em média, 39,7% maior que a rigidez local quantificada no grupo de tratamento com 0,3 mg/ml (n=4, 223,72 ± 11,46 N/mm). Esta diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,096). Entretanto, a rigidez local do tecido de reparo no grupo de 1,0 mg/ml foi significativamente maior (45,2%, p=0,039) que aquela do controle de IFWM (215,23 ± 33,23 N/mm). Tabela 6: Dados resumidos da análise de resistência à ruptura. Dados relatados como média ± S.E.M.

[00212] Dos dezoito (n=8) construtos de tratamento testados, n=16 (88,9%) romperam na interface proximal entre o tecido de reparo e o tendão de Aquiles intacto. Digno de nota, dois dos seis construtos no grupo de tratamento com IFWM + 0,3 mg/mL de rhPDGF-BB apresentaram um hematoma no aspecto lateral do tecido de reparo que era visível macroscopicamente durante a dissecção e subsequente teste biomecânico. Em ambas as construções, a ruptura começou nestas regiões. Os construtos de tratamento remanescentes n=2 (11,1%) romperam na interface distal entre o tecido de reparo e o tendão de Aquiles intacto. O modo de ruptura para os n=6 construtos de tendão de Aquiles contralateral intactos variou. Dois construtos (n=2, 33.3%) intactos romperam através de fratura metatarsal dentro do material de implantação de PMMA. Três construtos (n=3, 50%) intactos romperam através de laceração da substância intermediária do tendão de Aquiles, e uma (n=1, 16,7%) rompeu através de avulsão calcânea.

IV-CONCLUSÃO

[00213] Após oito semanas in vivo, os dados biomecânicos observados para o grupo tratado com IFWM+1,0 mg/mL de rhPDGF- BB foram aumentados de forma consistente e exibiram, em média, uma maior resposta de cura em comparação aos grupos de tratamento de controle de IFWM e IFWM+0,3 mg/mL de rhPDGF-BB. Este efeito da dosagem se manifestou como um aumento de 55%/22,2% (n=6/n=4) e 57,4% na carga para ruptura final em relação aos grupos de tratamento com 0,3 mg/mL e IFWM sozinho, respectivamente. Rigidez do tecido de reparo (isto é, local) foi aumentada em média em 77,3%/39,7% (n=6/n=4) e 45,2% em relação aos grupos de tratamento com 0,3 mg/mL de rhPDGF-BB e IFWM sozinho, respectivamente. Adicionalmente, a força final observada neste estudo para o grupo de IFWM+1,0 mg/mL de rhPDGF-BB foi aumentada em comparação aos outros estudos que utilizaram uma matriz (34,9 vezes maior do que um reparo de 24 semanas com o uso de um emplastro de colágeno combinado com uma matriz de fibrina de plasma rico em plaquetas (Sarrafian et al., Trans ORS, 33:322 (2008)) ou uma proteína (1,9 vezes maior do que um reparo de 3 semanas tratado com CDMP-2 (Virchenko, Arch Orthop Trauma Surg, 128:1001-1006 (2008)).

Teste histológico Coleta de tecido e aparamento

[00214] Após a eutanásia, os tendões de Aquiles operados foram coletados, imobilizados para evitar curvamento do tecido, e colocados em formalina tamponada neutra a 10% para processamento histológico. Além dos tendões de Aquiles operados, dois tendões de Aquiles contralaterais não operados foram coletados para análise histológica. Após fixação durante 24 horas, cada tendão de Aquiles foi bisseccionado nas metades medial e lateral com o uso de um bisturi. A extremidade proximal do tendão de Aquiles foi entalhada para preservar a orientação durante todo o processamento histológico. Um animal no grupo de 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB foi eutanizado após 40 dias (5,8 semanas) da cura devido a razões não relacionadas com o estudo (pneumonia). Processamento histológico

[00215] Todos os espécimes (n=8) foram adicionalmente fixados, desidratados, purificados, infiltrados e incluídos em parafina com o uso de técnicas e equipamentos padronizados de histologia (processador Shandon Citadel 2000 e Shandon Histocentre 2, Thermo Shandon, Inc, Pittsburgh, PA). Os blocos de parafina foram facetados e seções de aproximadamente 10 micra foram cortadas no micrótomo giratório Shandon Finesse (Thermo Shandon, Inc, Pittsburgh, PA). Cinco seções foram cortadas por espécime para um total de 40 seções. Cada seção histológica foi corada com hematoxilina e eosina (H&E). Imagens digitais em alta resolução foram adquiridas campo por campo por toda a lâmina corada incluindo as regiões de interesse com o uso de um sistema de formação de imagens Image Pro (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) e um microscópio Nikon E800 (AG Heinze, Lake Forest, CA).

Histopatologia qualitativa

[00216] Todas as seções de tecido foram avaliadas para determinar a qualidade do tecido de reparo/cura, a interface do tecido tendão nativo/de reparo, a vascularização, inflamação, e densidade de colágeno /orientação das fibras. As seções foram avaliadas de forma cega ao tratamento. A retração do tendão também foi medida através de imagens digitais macroscópicas calibradas com o uso do sistema de formação de imagens Image Pro Plus.

Retração do Tendão

[00217] Todos os espécimes operados apresentaram algum grau de retração do tendão depois de 8 semanas de recuperação. Em média, o tendão de Aquiles se retraiu 55,7 ± 16,1 mm para o Grupo Sem tratamento, 39,8 ± 4,5 mm para o grupo com dose de 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB, e 44,4 ± 1,5 mm para o grupo com dose de 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB.

Histopatologia

[00218] Depois de 8 semanas de recuperação, o colágeno fluxível era visível em todos os espécimes, não importando a dose de rhPDGF-BB. O colágeno fluxível estava localizado, geralmente, mais na direção da extremidade distal do sítio de reparo. Em alguns casos, o colágeno fluxível tinha migrado para fora do centro do sítio de reparo, em direção à superfície dorsal do tecido reparador. Em um espécime, o colágeno fluxível foi observado disperso sobre toda a extensão do sítio de reparo. Foi observada apenas uma discreta inflamação dentro e em torno do colágeno fluxível. A inflamação foi considerada estar levemente aumentada nos grupos de colágeno fluxível + rhPDGF-BB (doses de 0,3 mg/ml e 1,0 mg/ml) comparados com os espécimes Sem Tratamento. A inflamação consistia, comumente, de células gigantes multinucleadas de corpo estranho e/ou inflamação por mononucleares (linfócitos, monócitos e células plasmáticas). Os neutrófilos não foram comumente observados. A fibroplasia com nova produção de colágeno pelos fibroblastos ativados foi observada dentro do colágeno fluxível não importando a dose de rhPDGF-BB. Apesar de algumas fibroplasias terem sido observadas dentro do colágeno fluxível, houve uma descontinuidade dentro das fibras de colágeno reparador. As extremidades proximal e distal do tendão de Aquiles nativo estavam geralmente bem integradas com as novas fibras de colágeno do tecido reparador. Em poucos casos, a interface distal demonstrou uma integração discretamente melhor quando comparada com a interface proximal. A interface proximal continha vários fibroblastos jovens produzindo colágeno imaturo com uma extremidade distorcida do tendão de Aquiles nativo combinada com inflamação leve.

[00219] Houve uma fibroplasia relativamente alta e produção de colágeno pelos fibroblastos ativados com alta densidade de fibras de colágeno, independentemente do tratamento ou da dose de rhPDGF- BB. O alinhamento da fibra de colágeno primária foi coincidente com a direção da fibra de colágeno do tendão de Aquiles nativo, como observado usando luz polarizada. A densidade de fibroblasto foi similar entre os tratamentos. Em um espécime, a densidade de fibroblastos era relativamente menor e as fibras de colágeno eram mais imaturas, menos densas e menos orientadas. As fibras de colágeno estavam alinhadas, geralmente, em paralelo com a direção da fibra de Aquiles nativo, embora nenhuma diferença tenha sido observada entre os grupos quanto à densidade de colágeno ou fibroblasto.

[00220] A inflamação foi observada dentro dos sítios de reparo em todos os tratamentos e era, geralmente, leve. A inflamação consistia em células gigantes multinucleadas de corpo estranho com inflamação mononuclear (linfócitos, monócitos e células plasmáticas). Não foram observados, geralmente, neutrófilos. A inflamação estava associada com a presença de material de sutura e colágeno fluxível e, muito provavelmente, devida ao dano localizado do tecido do hospedeiro. A vascularização abundante também foi observada dentro dos sítios de reparo para todos os tratamentos. A inflamação aumentada estava associada com vascularização mais abundante. A hipertrofia vascular, vasos reativos com células endoteliais arredondadas e espessamento das paredes do vaso foram observados em todas as doses de rhPDGF-BB.

[00221] Houve mais vasos hipertróficos observados nos espécimes tratados com doses de 0,3 mg/ml e 1,0 mg/ml, quando comparados com os espécimes Sem Tratamento. Esses vasos estavam geralmente localizados dentro do tecido reparador em regiões superficiais da superfície dorsal. Em um espécime (40 dias depois da operação), havia vascularização abundante, mas esses vasos eram menores e os vasos hipertróficos não foram observados. A hemorragia, encontrada em conjunto com um espaço hematomatoso e fibrina, foi observada em dois espécimes. Conclusão

[00222] Em resumo, com base no número limitado de amostras testadas, não houve diferenças qualitativas no reparo do tendão de Aquiles entre os grupos com a dose de 0,3 mg/ml, dose de 1,0 mg/ml e de controle (Sem Tratamento). A presença de rhPDGF-BB não evitou a cura nem desencadeou uma resposta histologicamente negativa. Houve uma cura similar entre os grupos de tratamento com a dose de 0,3 mg/ml e a dose de 1,0 mg/ml. Todos os espécimes operados apresentaram algum grau de retração do tendão. O colágeno fluxível estava visível em todos os espécimes, independentemente do tratamento ou da dose de rhPDGF-BB e estava geralmente localizado em direção à extremidade distal do sítio de reparo. A inflamação foi, geralmente, leve e considerada de células gigantes multinucleadas de corpo estranho com inflamação por mononucleares (linfócitos, monócitos e células plasmáticas). A inflamação foi considerada estar levemente aumentada dentro do colágeno fluxível tratado com rhPDGF-BB (dose de 0,3 mg/ml e 1,0 mg/ml) quando comparado com o grupo Sem Tratamento. No tecido reparador houve fibroplasias substanciais, permanentes com uma alta densidade de fibras de colágeno que eram independentes do tratamento ou da dose de rhPDGF-BB. O alinhamento da fibra de colágeno reparador era geralmente em paralelo com a direção da fibra de colágeno do tendão de Aquiles nativo. A densidade do colágeno e de fibroblasto foi similar entre os tratamentos. Vascularização abundante foi observada em todos os espécimes. Foram considerados ser mais hipertróficos os vasos observados nos espécimes com as doses de 0,3 mg/ml e 1,0 mg/ml quando comparados com o grupo Sem Tratamento. Em alguns casos, a interface distal apresentou uma integração discretamente melhor quando comparada com a interface proximal, onde havia menos colágeno maduro e uma extremidade distorcida do tendão de Aquiles nativo combinada com inflamação leve. Isso pode ser o resultado da retração continua do tendão e do dano tecidual local concomitante causado pelo deslizamento da sutura.

[00223] Exemplo 7: Tenócitos Primários Humanos Normais e Doentes Proliferam em Resposta a rhPDGF-BB

[00224] Esse estudo determinou se rhPDGF-BB ativou diretamente a proliferação e/ou a quimiotaxia de tenócitos primários derivados de pacientes com tendinopatias. Tais achados podem apoiar a noção do potencial terapêutico de rhPDGF-BB em tendinopatias.

Pacientes e Métodos Pacientes

[00225] Dez pacientes com tendinopatias foram envolvidos nesse estudo, incluindo cinco pacientes com tendinopatia do tendão de Aquiles e cinco pacientes com tendinopatia do tendão tibial posterior (PTT). Cinco pacientes adicionais que foram envolvidos submeteram- se a substituição completa da articulação do joelho.

Cultura Primária de Tenócitos

[00226] O tecido do tendão, que poderia ser descartado de outra maneira, foi obtido de tendões normais e lesionados durante procedimentos de cirurgia reconstrutora realizados por indicações clínicas. Esses tecidos incluíam a porção tendinopática dos tendões de Aquiles e PTT, assim como a porção saudável (não tendinopática) do tecido do tendão flexor digital longo (FDL), tecido do tendão de Aquiles e tecido do tendão Patelar.

[00227] Culturas de explante de tenócito primário foram obtidas a partir desses tecidos e testadas nas passagens 3 a 5. A identidade do tenócito foi confirmada pela avaliação da expressão de um escleraxis de gene específico para tenócito e de genes de colágeno α1(I), α2(I), e α1(III) em ensaios de PCR em tempo real com iniciadores específicos. Proliferação Celular

[00228] Monocamadas de tenócitos foram tripsinizadas, re- suspensas em meio DMEM/F12 contendo soro fetal bovino 0,5% dialisado, deixadas acoplar por uma noite e depois incubadas com concentrações tituladas de rhPDGF-BB por 24 h. As alterações nas taxas de proliferação das células incubadas foram avaliadas com base na incorporação de BrdU durante a síntese do DNA nas células, usando um ensaio comercialmente disponível (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Cada cultura foi testada em triplicata para cada dose de rhPDGF-BB.

Migração Celular

[00229] Monocamadas de tenócitos foram tripsinizadas, ressuspensas em meio DMEM/F12 contendo soro fetal bovino 0,5% dialisado e colocadas na câmara superior do sistema de migração celular descartável de 96 poços ChemoTx® (Neuro Probe, Gaithersburg, MD). As câmaras inferiores continham concentrações tituladas de rhPDGF-BB. Os tenócitos foram deixados migrara através da membrana que separa as câmaras por 48 h. As placas de 96 poços foram centrifugadas e congeladas e descongeladas três vezes para lisar as células migradas. A quantidade de células migradas viáveis foi medida com base na lactato desidrogenase (LDH) citoplasmática usando um kit comercialmente disponível da Promega (Madison, WI). Análise Estatística

[00230] Um teste ANOVA unidirecional foi usado para determinar se a estimulação com rh-PDGF-BB afeta a proliferação de tenócitos de uma maneira dependente da dose.

Resultados

[00231] Apenas as culturas de tenócitos, mas não as culturas de fibroblastos pulmonares de controle ou culturas de linfócitos T primários de controle, expressaram escleraxis de mRNA, enquanto que os tenócitos e os fibroblastos, mas não os linfócitos expressaram os mRNAs de gene de colágeno.

[00232] Em todos os casos, os tenócitos dos tecidos de tendão envolvidos ou não envolvidos no processo da doença responderam a estimulação com rhPDGF-BB acelerando a incorporação de BrdU (p < 0,05, ANOVA unidirecional). As respostas eram dependentes da dose e foram observadas com 10, 50 e 150 ng/mL de rhPDGF-BB. Embora todas as culturas respondessem a estimulação com rhPDGF-BB, houve variabilidade significativa entre os pacientes na magnitude da incorporação de BrdU depois da estimulação com rhPDGF-BB. A incorporação de BrdU aumentou de um mínimo de 2,1 ± 0,2 vezes até um máximo de 10,7 ± 0,5 vezes comparada com culturas não estimuladas. Tenócitos de cinco pacientes responderam paradoxalmente, com um aumento maior na incorporação de BrdU em concentrações menores (10 ng/mL) do que maiores (50 e 150 ng/mL) de rhPDGF-BB. Tal resposta paradoxal foi observada em tenócitos derivados de ambos os tecidos, tenopático e normal, desses pacientes. Os tenócitos derivados de tendões saudáveis de quarto pacientes incorporaram duas vezes mais BrdU em resposta à estimulação com rhPDGF-BB do que os tenócitos derivados de tecidos doentes. Em um paciente os tenócitos do tecido doente incorporou quatro vezes mais BrdU em resposta a estimulação com rhPDGF-BB do que os tenócitos derivados de tecidos não envolvidos.

[00233] Em todos os casos, os tenócitos foram quimiotaxicamente responsivos a rhPDGF-BB com 50 ng/mL e 150 ng/mL. Os tenócitos não foram expostos a 10 ng/mL de rhPDGF-BB para experimentos em quimiotaxia devido a baixa resposta em experimentos-piloto. Novamente, as respostas foram dependentes da dose, com maior quimiotaxia com 150 ng/mL do que para 50 ng/mL de rhPDGF-BB. Entretanto, os tenócitos de 5 pacientes responderam com maior quimiotaxia para 50 ng/mL do que para 150 ng/mL de rhPDGF-BB, com declínio significativo no número de células migradas (p < 0,05, teste-t de Student bilateral). Houve variabilidade entre pacientes na resposta quimiotáxica máxima a rhPDGF-BB, de 1,4 ± 0,1 a 4,0 ± 0,5 vezes de aumento comparada com o controle não estimulado. Não houve diferença estatisticamente significativa (p > 0,05) na quimiotaxia de tenócitos para rhPDGF-BB dentro de culturas de tenócitos correspondentes derivados de tecidos de tendão tendinopático ou saudável.

Conclusão

[00234] Os resultados desses experimentos sugerem que os tenócitos derivados de tecidos saudáveis e tendinopáticos respondem a rhPDGF-BB pelo aumento das taxas de proliferação e quimiotaxia. De forma importante, os tenócitos de alguns pacientes mostraram resposta paradoxal a PDGF, nos quais doses maiores induziram menos efeito do que doses menores. Igualmente importante, tenócitos de tendões doentes foram, em alguns casos, diferencialmente responsivos a PDGF versus tenócitos de tendões saudáveis implicando em que a própria dosagem pode ser de suma importância no ajuste clínico.

[00235] Exemplo 8: Avaliação de quatro matrizes de colágeno em combinação com o fator de crescimento derivado de plaqueta humano recombinante-bb (rhPDGF-BB) para aplicação no tratamento de refixação de tendão ao osso

[00236] Esse estudo avaliou as características físicas, biocompatibilidade (in vitro e in vivo) e estabilidade (biodegradação) de quatro matrizes de colágeno que podem ser usadas em conjunto com rhPDGF-BB na interface tendão-osso para aplicação no tratamento de tendão ao osso, tal como a reconstrução do ligamento cruzado anterior.

Métodos Materiais e Preparações

[00237] Quatro matrizes de colágeno Tipo I (blocos) foram avaliadas nesse estudo. Três matrizes de colágeno fibroso (A, B e C) eram derivadas da derme bovina com densidades de colágeno diferentes (A= 4,5% de colágeno; B= 5% de colágeno, C= de colágeno; colágeno BIOBLANKET™ feito a partir de percentagens diferentes de pasta de colágeno fornecida pela Kensey Nash Corporation) e a quarta matriz fibrosa (D) era derivada de tendão bovino caracterizada como "altamente porosa" (porosidade de 90%) (COLLATAPE®, Integra LifeSciences). Todas as folhas de colágeno (1,5-2,0mm de espessura) foram perfuradas em discos de 8 mm de diâmetro para caracterização física e avaliação in vitro (citocompatibilidade). As avaliações in vivo (biocompatibilidade e biodegradação) foram realizadas utilizando blocos de 1 x 1 cm2. rhPDGF-BB: fator de crescimento derivado de plaqueta humana recombinante (rhPDGF-BB) a 0,3 mg/ml também foi preparado.

[00238] A fonte de célula é de tenócitos ovinos primários (< 4 passagens) isolados do tendão flexor de ovino que foram cultivados em meio de crescimento (DMEM/F-12 contendo soro fetal bovino 10% (SFB)) e regulados negativamente com meio básico (DMEM/F-12 contendo SFB 2%) 12 horas antes do uso.

Estudo de Citocompatibilidade In vitro

[00239] 50 μl (50.000 células) da suspensão celular de tenócito em meio básico foram adicionados a cada disco de colágeno. Depois de 1 h de incubação a 37°C e atmosfera de CO 2 5% sem meio de imersão, os discos semeados com células foram transferidos para uma placa de 24 poços pré-preenchidas com 2 ml de meio básico sozinho ou em combinação com rhPDGF-BB (30 ng/ml). Depois de 12 h de cultura estática, as placas com os discos semeados com as células foram colocadas em um agitador orbital (60 rpm) na incubadora. O meio foi trocado a cada 48 h. Nos dias 2, 4 e 6, amostras em triplicata de cada material e tratamento foram utilizadas para um ensaio ATP, para determinar o número de células vivas na/dentro das matrizes de colágeno. No dia 4, uma amostra de cada material e tratamento foi usada para a avaliação pelo rastreamento com microscópio eletrônico (SEM). No dia 6, amostras em quadruplicata de cada material e tratamento foram utilizadas para avaliação histológica.

Estudo de Biocompatibilidade e Biodegradação In Vivo

[00240] Um total de 12 coelhos brancos New Zealand foi usado para esse estudo. Através de uma incisão antero-medial, o fêmur foi exposto. Depois da remoção do periósteo, o ponto médio da superfície ventral do fêmur foi localizado e duas áreas (1cm x 1cm), aproximadamente a 0,5-0,8 cm proximal e distal do ponto médio, foram decorticadas usando uma broca arredondada e irrigação copiosa para evitar o superaquecimento do osso. Dois orifícios (0,9mm) foram perfurados no ponto médio do sítio decorticado sobre as superfícies medial e lateral. Finalmente, uma sutura de seda 5.0 foi passada através dos dois orifícios e o bloco de colágeno (pré-saturado com 100μl de 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB) foi então amarrado para segurar o bloco à superfície do fêmur. A cirurgia foi realizada bilateralmente, tal que cada fêmur recebeu dois blocos e cada animal recebeu um de cada um dos quatro blocos de colágeno diferentes. A ordem dos blocos sobre o fêmur foi aleatória. Nas semanas 1, 2 e 3 depois da cirurgia, 4 animais foram sacrificados e os fêmures, junto com os blocos e o tecido circundante, foram fixados em formalina tamponada neutra 10% (NBF), embebidos em metacrilato de metila (MMA) e corados com um procedimento tricrômico de Goldner.

Resultados Estudo de Citocompatibilidade In Vitro

[00241] O ensaio ATP revelou que o crescimento celular nos/dentro dos discos de colágeno aumentou significativamente na presença de rhPDGF-BB e aumentou com o tempo em cultura, sem diferenças significativas observadas através das diferentes matrizes sob as mesmas condições de tratamento. As imagens de SEM das matrizes sozinhas revelou diferenças qualitativas na porosidade, com a matriz D demonstrando a maior porosidade e as matrizes A, B e C mostrando graus decrescentes de porosidade. Os resultados de SEM para cada uma das matrizes depois da semeadura celular mostraram que havia mais células observadas sobre a superfície das três matrizes fibrosas de diferentes densidades, com o menor número observado sobre a superfície da matriz "altamente porosa" (D). As imagens histológicas de seções transversais de cada uma das matrizes semeadas com células apoiaram, adicionalmente, as observações da SEM, demonstrando uma distribuição celular ao longo da superfície externa dos blocos das matrizes com densidade aumentada, com a matriz D demonstrando a maior distribuição de células através da matriz.

Estudo de Biocompatibilidade e Biodegradação In Vivo

[00242] A avaliação histológica revelou que todos os quatro blocos de colágeno permaneceram intactos 1 semana depois do implante. No tecido ao redor das quatro matrizes diferentes, houve infiltração celular aumentada de granulócitos e células mononucleares. Duas (2) semanas depois do implante, foi observada a degradação parcial das matrizes A, B e B com infiltração celular óbvia associada com a matriz D. Três (3) semanas depois do implante, a matriz D estava altamente degradada com apenas pequenos fragmentos de colágeno observados entre células fibroblásticas normais (Figura 9D). Os sítios que receberam derivados de origem dérmica (A, B e C) exibiram degradação que foi inversamente proporcional à densidade do colágeno. Foi observada infiltração celular inflamatória intensa nessas matrizes que se tornaram mais localizadas ao longo do período de observação de três semanas (Figuras 9A-9C).

[00243] Os resultados mostraram que a matriz de colágeno D era a mais porosa, com uma rede de fibra de colágeno fina homogênea, fornecendo uma área superficial mais acessível para o acoplamento e migração celular. A avaliação in vivo das matrizes individuais mostrou que o colágeno D exibiu o período de permanência mais curto e pareceu ser o material mais biocompatível, demonstrando infiltração celular inflamatória mínima 3 semanas depois do implante, enquanto que as matrizes de colágeno com densidades diferentes demonstraram infiltração célula inflamatória crescente que se localizou em focos 3 semanas depois do implante.

[00244] Exemplo 9: Uso de rhPDGF-BB e um Envoltório de Colágeno para Aumentar o Túnel de Fixação do Tendão em um Modelo Caprino de Refixação de Tendão-Osso ou Ligamento-Osso

[00245] Esse estudo avaliou os benefícios histológicos e biomecânicos de envolver uma esponja de colágeno embebida em uma dose de rhPDGF-BB antes da inserção e fixação do tendão flexor longo em um túnel tibial através da metáfise. O método de fixação de enxertos para a reconstrução do ligamento cruzado anterior é como descrito por Rodeo et al., J. Bone Joint Surg. Am., 75(12):1795-1803 (1993). Um bloco de colágeno em combinação com rhPDGF-BB é usado para promover uma integração mais rápida, completa do tendão ou ligamento dentro do sítio de inserção tibial.

Materiais e Métodos Espécie

[00246] A cabra é um modelo adequado por que, como os humanos, seus ossos sofrem remodelagem, que é uma combinação equilibrada de formação e reabsorção óssea levando a uma estrutura óssea normal. Os ossos de modelos de animais menores, tais como ratos ou camundongos, não sofrem remodelagem e, portanto, não representam os processos biológicos que podem ocorrer quando o tendão se reintegra com o osso. Adicionalmente, os tendões de animais maiores, tais como a cabra, podem ser mais facilmente manipulados e reinseridos usando técnicas de instrumentação usadas na cirurgia humana.

[00247] Um total de 24 cabras esqueleticamente maduras (fêmeas, antecedentes geneticamente misturados) é usado nesse estudo. Esses animais são divididos em 3 grupos de tratamento (Tabela 7). O grupo 1 submeteu-se descolamento cortante do tendão flexor longo de sua inserção femoral sobre a face lateral, seguido pela passagem através de um túnel ósseo perfurado obliquamente através da metáfise tibial. Uma vez do outro lado, o tendão é fixado ao córtex medial da tíbia com suturas de aço inoxidável (veja as Figuras 10 e 11). O membro contralateral dos animais do Grupo 1 compreende aqueles no Grupo 2. O grupo 2 submeteu-se ao mesmo procedimento cirúrgico, mas antes de passar através do túnel, o tendão é envolvido com uma esponja de colágeno de 25 x 15 mm (COLLATAPE®, Integra LifeScience Corporation, Plainsboro, NJ). Uma vez fixada ao córtex medial da tíbia, a matriz de colágeno é hidratada com 1,0 mL de tampão acetato de sódio (20 mM, pH 6.0). Dentro de cada animal, os membros que receberam esses tratamentos são randomizados (Tabela 8). Um total de 10 animais foi usado nos Grupos 1 e 2, resultando em n = 5 para cada período de tempo (2 e 4 semanas). Cada período de vida (a coorte de animais usados para cada período de tempo e cada tratamento) produz 3 espécimes para o teste biomecânico e 2 espécimes para histologia.

[00248] Os animais do Grupo 3 submeteram-se ao mesmo procedimento cirúrgico como aqueles do Grupo 2, mas a esponja de colágeno foi hidratada com 1,0 mL de 1,0 mg/mL do fator BB de crescimento derivado de plaqueta humana recombinante (PDGF-BB). Nesse grupo, ambos os membros receberam o tratamento com PDGF- BB. O grupo 3 constitui-se de 10 animais; isso resultou em n = 10 amostras (dois membros operados/animal) para cada período de tempo (2 e 4 semanas). Cada período de vida produz 5 espécimes para o teste biomecânico e 5 espécimes para histologia. Dois animais a mais são usados para um estudo cirúrgico piloto para confirmar a viabilidade da implantação cirúrgica do material (um recebeu o tratamento como descrito para os grupos 1 e 2 acima e o outro recebeu o tratamento como o grupo 3 acima). Esses animais foram observados por 2 semanas depois da cirurgia para confirmar o retorno a deambulação normal e a ausência de complicações. Depois desse período, os animais do estudo piloto foram sacrificados e os tecidos coletados. Se as cirurgias e o período de avaliação pós-operatória ocorressem sem incidentes, o restante do estudo (20 animais) seria realizado como planejado.

Teste e Artigos de Controle

[00249] O Artigo de Teste 1 é 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB em tampão acetato de sódio 20 mM, pH 6.0 +/-0.5, em forma líquida e armazenado a 2°C - 8°C. O Artigo de Teste 2 é colág eno da COLLATAPE®, Integra LifeSciences, em forma sólida e armazenado em temperatura ambiente.

Preparação da Dose Mistura de Colágeno com rhPDGF-BB

[00250] Os artigos de teste e de controle são misturados. É usada a preparação asséptica para os artigos. Toda a mistura é realizada em temperatura ambiente, Os artigos de teste e de controle formulados são usados até 1 hora depois da preparação.

[00251] Os blocos de colágeno são cortados com 25 x 15 mm, envolvidos sobre o tendão e passados através do túnel ósseo. Com uma agulha 27G, 1,0mL de rhPDGF-BB 1,0mg/mL é injetado no túnel adjacente ao sítio final do implante da matriz de colágeno. As aberturas medial e lateral do túnel receberam aproximadamente 0,5 mL do total de 1,0 mg/mL de rhPDGF-BB. As injeções feitas em cada face medial e lateral do túnel foram feitas por injeção em múltiplos pontos do perímetro do túnel, grosseiramente a %, 1A %, e em toda a circunferência da abertura do túnel. (iv) Sistema de Teste (Animal e Cuidados com o Animal)

[00252] Foram usadas cabras fêmeas domésticas esqueleticamente maduras (sem raça definida, n =24), 13-18 kg, testada contra a febre Q com certificado de saúde. Nenhum animal tinha sido usado antes da experimentação. Os animais foram colocados em pastos com um espaço mínimo de 10 pés quadrados por cabra. As gaiolas foram construídas com aço inoxidável e limpas rotineiramente. A temperatura ambiente é mantida entre 15-26°C e a umidade é mant ida entre 3070%.

[00253] A água foi fornecida às cabras à vontade em um balde assim como através de um sistema irrigação automático (LIX-IT). A forragem foi fornecida continuamente e uma vez por dia as cabras eram supridas com ração para cabra adquirida comercialmente. Os animais do estudo foram aclimatados aos seus alojamentos designados por pelo menos 14 dias antes do primeiro dia de tratamento. Esse período de aclimatação permitiu que os animais se tornassem acostumados com o ambiente da sala de estudo. Todos os animais foram fisicamente examinados, incluindo a frequência cardíaca, respiração e flutuação fecal. Apenas aqueles animais considerados estar em excelente estado de saúde pelo veterinário foram admitidos na instalação e aceitos para o estudo. Os animais foram tratados profilaticamente com Ivomec (1 cc/75 lbs) e Penicilina G e Benzocaína (1 cc/10 lbs).

(B) Projeto Experimental Descrição Geral e Método Cirúrgico

[00254] A anestesia foi induzida 30 minutos antes da pré- medicação usando um coquetel para cabra [cetamina 10 cc (100 mg/ml) + xilazina 1 cc (20 mg/ml) a 1ml/10 kg IM. Depois da indução um cateter IV cefálico é colocado no lugar. Um unguento oftalmológico foi colocado delicadamente sobre a córnea para minimizar o ressecamento do olho. As cabras foram entubadas usando um tubo endotraqueal (5-8 ETT) assim como um tubo para o rumem. A anestesia foi mantida com o uso de isofluorano 1,5-2%, liberado em oxigênio 100% usando um circuito com reinalação. Se necessário, a cabra era colocada em um respirador de acordo com o volume corrente (15 mL/kg de peso corporal). Cada cabra recebeu uma solução de Ringer lactato aquecida a 10 ml/kg/h durante a anestesia.

[00255] A penicilina G e a benzocaína (1 cc/ 4 kg de peso corporal) foram administradas uma hora antes da cirurgia e no EOD (final do dia) depois da cirurgia em um total de 3 doses. A buprenorfina (Buprenex) foi administrada a 0,005 mg/kg de peso corporal IM BID x 48 horas de pós-operatório.

[00256] Os sítios cirúrgicos foram preparados para cirurgia asséptica (limpeza com 3-clorexidina [4%] alternando com solução salina estéril) e cobertos. Assepticamente, cada articulação do joelho foi exposta por uma incisão para-patelar lateral e o tendão extensor digital longo foi descolado de sua inserção sobre o côndilo lateral do fêmur (Figura 10). A metáfise tibial proximal foi exposta pela incisão da fáscia do músculo anterior da tíbia e retração do músculo lateralmente.

[00257] Um orifício com 5,6 mm de diâmetro foi feito na metáfise tibial proximal em um ângulo entre 30 e 45° ao long o do eixo da tíbia (Figura 11). Toda a perfuração foi realizada com irrigação abundante e começou proximalmente no côndilo medial da tíbia (1 cm abaixo da linha articular palpada) e terminou distalmente na face lateral da tíbia (2 cm abaixo da linha articular palpada). A profundidade do orifício perfurado foi medida com um medidor de profundidade de metal fino e registrada. Uma esponja de colágeno de 25 x 15 mm foi envolvida em torno do tendão sem superposição, amarrada com uma sutura Vicryl 4.0 e depois passada através do túnel ósseo com um fio de aço inoxidável. Uma vez do outro lado do osso, o tendão foi fixado a córtex medial pelo uso de dois pequenos orifícios e suturas interrompidas de aço inoxidável 4.0. Depois de amarrar o tendão envolvido em colágeno no osso, 1 mL de tampão acetato de sódio pH 6.0 em doses divididas foi injetado em ambos os lados do túnel usando uma agulha de seringa 27G para hidratar a esponja de colágeno. Os tendões dos animais de controle, que não receberam o envoltório de colágeno, foram passados simplesmente através do túnel ósseo e fixado a córtex medial. Os tendões tratados com fator de crescimento foram envolvidos com a esponja de colágeno como acima, passados através do túnel, fixados sobre a córtex medial e depois hidratados com 1 mL de tampão acetato de sódio (pH 6) contendo 1 mg/mL de PDGF-BB.

[00258] Os tecidos moles foram fechados em camadas com suturas reabsorvíveis (por exemplo, Vicryl 4.0). Depois do fechamento da incisão e da pele , uma radiografia de cada membro foi realizada para documentar a localização e o ângulo do túnel. De modo ideal, a radiografia é orientada de maneira a captar o comprimento total do túnel tibial.

[00259] Quando as cabras foram capazes de deambular, elas foram devolvidas para seus cercados. Cada cabra foi deixada comer e beber a vontade.

[00260] A adição de uma dose de rhPDGF-BB à porção do tendão flexor longo inserido no túnel da metáfise óssea é esperada exibir, ao longo do tempo, um aumento de 25% na carga para a ruptura biomecânica e a integração e mineralização aperfeiçoadas pela histologia e micro-CT.

[00261] O procedimento cirúrgico foi realizado primeiro em 2 animais na presença do veterinário para rever os aspectos da cirurgia e do cuidado com o animal. Depois de 14 dias, se todos os animais se recuperassem sem incidentes, o protocolo experimental seria implementado. Na eventualidade do surgimento de dificuldades, os investigadores trabalhariam com diligência com a equipe de veterinários para resolver quaisquer questões necessárias para fornecer um cuidado ótimo aos animais e garantir o sucesso do estudo. Durante a cirurgia, os animais foram anestesiados e os animais foram sedados para procedimentos de amostragem sanguínea. Designações dos Grupos e Níveis de Dose Tabela 7: Grupos de Tratamento

Tabela 8: Designação dos Tratamentos

[00262] N: T Pendão Nu

[00263] SP: Tendão envolvido em esponja de colágeno (COLLATAPE®)

[00264] PDGF: Tendão envolvido em esponja de colágeno contendo rhPDGF-BB

(C) Observações e Medidas em Vida

[00265] Os animais foram observados pelo menos diariamente durante o estudo. O registro das observações começou uma vez que os critérios de pré-seleção estavam completos e continuou até o fim do estudo. Cada animal foi observado quanto a alterações no aspecto geral e comportamento, incluindo alterações na capacidade de andar. Os pesos corporais foram medidos antes da cirurgia e no sacrifício. Os pesos corporais foram registrados em períodos de tempo adicionais conforme necessário para monitorar a saúde dos animais.

[00266] No final da semana 1 do pós-operatório, os animais sacrificados com 2 semanas foram inoculados com 10 mg/kg de calceína (fornecedor TDB) IP (intraperitoneal). Similarmente, em 3 semanas, os animais sacrificados com 4 semanas foram inoculados com 10 mg/kg de calceína (fornecedor TDB) IP. Essas injeções forneceram o esboço da nova formação e do crescimento ósseo no túnel de espécimes histológicos.

(D) Avaliação Clínico-Patológica Coleta de Soro para Análise

[00267] Aproximadamente 5 ml de sangue são coletados em tubos sem aditivos (isto é, "coagulo") de todos os animais uma vez antes da cirurgia e antes do sacrifício. O sangue foi centrifugado para obter o soro e dividido em duas alíquotas. O soro foi armazenado a -70°C ou mais frio para análise posterior.

(E) Anatomia Patológica

[00268] Todos os animais foram sacrificados nos limites apropriados do estudo. Uma necropsia macroscópica foi realizada em cada animal encontrado morto ou sacrificado em uma condição terminal para determinar a causa da morte. Necropsia

[00269] As cabras foram sacrificadas de acordo com o USDA Animal Welfare Act e The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, National Academy Press). As cabras foram sedadas primeiro usando um coquetel para cabra [10cc de cetamina (100 mg/ml) + 1 cc de xilazina (20 mg/ml)] em 1 ml/10kg IM. Depois, foi dado Euthasol (360 mg/ml de pentobarbital sódico) em 1 cm3/ 4,54 kg (1 cc/10 lb) de peso corporal IV. A morte foi confirmada pela ausculta e ausência de reflexos (piscar, afastamento, etc). Coleta e Preservação do Tecido Observações macroscópicas e Fotografia dos Sítios de Implante

[00270] No momento da eutanásia, o sítio do implante foi examinado macroscopicamente e uma descrição do sítio foi registrada. A fotografia digital foi usada para documentar essas observações. Patologia

[00271] A articulação do joelho foi desarticulada e uma serra de Stryker foi usada para cortar a tíbia no eixo médio. Os músculos circundantes e a pele foram desbastados tanto quanto o possível sem expor mais do que o necessário do osso lesionado para realizar a avaliação clínica. Cada espécime foi marcado com o número da cabra, assim como com uma indicação se era o membro direito ou esquerdo. Os tecidos foram colocados em formalina neutra tamponada (10 vol do fixador:1 vol do tecido) e enviados para o responsável. (F) Parâmetros Histologia e Histopatologia

[00272] O processamento histológico foi realizado. Em resumo, os tecidos foram embebidos em metacrilato de metila (MMA), seccionados e corados usando hematoxilina/eosina, Safranina O/Fast Green, Von Kossa/ MacNeal’s e/ou Van Gieson para avaliação microscópica. O plano da seção para a avaliação foi transversal e longitudinal ao túnel tibial. Um sistema de classificação foi planejado para avaliar a quantidade de material remanescente em cada sítio de implante, extensão da mineralização do tendão e quantidade de osso novo crescido ao longo das paredes do túnel. A visualização da calceína foi realizada em seções não coradas adjacentes a seções coradas com hematoxilina/eosina. Biomecânica

[00273] Os espécimes reservados para o teste biomecânico são congelados a -20°C até a utilização. Complexos de t íbia/tendão são acoplados a uma bancada multiaxial a fim de alinhar o eixo longitudinal do túnel com a direção do tendão estirado. Essa orientação minimiza qualquer efeito de fricção e permite testar diretamente a integração/mineralização do tendão com o osso circundante. A medida do pico de carga até a ruptura é normalizada para o comprimento do túnel medido manualmente e pelas radiografias pós-operatórias. Projeto do Estudo

[00274] O estudo determinou o desempenho mecânico da refixação simulada do tendão extensor digital em um túnel no osso tibial. 12 cabras Boer foram utilizadas nesse estudo. (b) Teste Biomecânico

[00275] Os espécimes são envolvidos em gaze embebida em salina e armazenados a -20°C até o teste. A porção distal da tíbia é colocada um tubo de PVC de 2" usando polimetilmetacrilato. Os espécimes são mantidos úmidos durante a preparação do implante e o teste biomecânico com um spray de salina em intervalos de 15 minutos. As tíbias implantadas são montadas em um fixador planejado para o teste que é acoplado rigidamente a estrutura de carregamento do sistema de teste de materiais (MTS MiniBionix, Edan Prairie, MN; Figura 12). Uma braçadeira de criogenia projetada para agarrar a seção transversa natural do tendão é usado nesse estudo para aplicar forças de tração uniaxial a construção. Quaisquer suturas laterais remanescentes são seccionadas.

[00276] A análise das leituras biomecânica e histológica é realizada através da análise de técnicas de covariância. Os efeitos de rhPDGF- BB e COLLATAPE® são investigados usando a massa corporal do animal e o diâmetro do tendão como covariáveis.

[00277] As leituras podem ser transformadas antes da análise através de métodos apropriados. Fase I: 30 Ciclos de Pré-Condicionamento Dinâmico

[00278] Um teste de carregamento cíclico é empregado inicialmente para pré-condicionar o reparo do tendão. Uma pré-carga de 10 Newton (N) é aplicada e a força da construção é deixada relaxar em aproximadamente 40%. Isso é planejado para a configuração inicial de todas as construções. A construção reparada é pré-condicionada ciclicamente em um protocolo de força-controle entre 10 a 30 N a 0,25 Hz por 30 ciclos para alcançar o estado de equilíbrio. Trinta (n = 30) ciclos são escolhidos por que experimentos anteriores em nosso laboratório demonstraram que a inclinação do deslocamento versus a curva de tempo parece se tornar estável entre 20 e 30 ciclos. Fase 2: Carregamento para ruptura quasi-estático

[00279] Depois do pré-condicionamento, as construções reparadas são carregadas até a ruptura sob controle de deslocamento em uma taxa de 1 mm/s. Os parâmetros biomecânicos de interesse incluem a carga até a ruptura final e a rigidez quase estática (definida como a inclinação da curva carga-deslocamento). Finalmente, o mecanismo de ruptura é documentado para cada espécime. São tiradas fotografias digitais de cada espécime no dispositivo de teste e depois da ruptura para documentar o modo e a condição da ruptura. Microtomografia (CT)

[00280] Cada espécime foi rastreado em uma resolução ótima determinada pelo tamanho do espécime. Veja a figura 13. Os cortes foram adquiridos na seção transversal próxima do defeito cilíndrico. Um método de contorno semiautomatizado foi usado para selecionar um volume de interesse (VOI) limitado ao perímetro das bordas originais do defeito. Um limiar de densidade otimizado e um filtro de ruído foram selecionados e aplicados uniformemente a todos os espécimes para segmentar o osso do tecido mole. A densidade média total, a densidade média do osso e o volume do osso/volume total dentro do túnel foram calculados.

[00281] Exemplo 10: Avaliação das características de liberação de rhPDGF-BB (fator de crescimento derivado de plaqueta humano recombinante-BB) a partir das matrizes BIOBLANKET® e COLLATAPE® pelo modelo do tipo BenchTop

[00282] O objetivo deste estudo é medir a liberação de rhPDGF-BB a partir de matrizes BIOBLANKET® com diferentes densidades e da matriz COLLATAPE® com o uso de um modelo do tipo BenchTop à temperatura ambiente. Materiais de teste Tabela 9: Matrizes BIOBLANKET® e COLLATAPE®

[00283] O delineamento do estudo está listado na Tabela 10, mostrando o tempo de fluxo inicial de 5 minutos para todos os grupos de amostras (matrizes BIOBLANKET®, matriz COLLATAPE®, e grupo de controle sem a matriz de colágeno. Tabela 10: Delineamento do estudo

[00284] Com o uso de uma técnica asséptica, discos de 8 mm são cortados de cada folha de BIOBLANKET® e COLLATAPE® com um perfurador de biópsia. Uma agulha de seringa é usada para imobilizar suavemente um disco de BIOBLANKET® e COLLATAPE® sobre uma agulha de 27G11/4 e conectar a agulha com uma cabeça de seringa de 1 mL que é instalada em uma câmara especialmente projetada. 50 μl de PDGF-BB (1,0 mg/mL em tampão de acetato de sódio 20 mM) são aplicados a cada disco. Os discos são, então, incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. Uma extremidade da tubulação de silicone do dispositivo canular artroscópico e a outra extremidade da tubulação da seringa de 20 ml são conectadas conforme mostrado na figura 14. 20 ml de tampão de eluição (EME + 2% de SFB) são colocados na seringa, e a tubulação de silicone da bomba Varistaltic é montada. O bloco de colágeno saturado com rhPDGF-BB é aplicado no topo do dispositivo canular artroscópico. A taxa de fluxo é estabelecida a 200 ml/min (pré-calibrada). A bomba é ligada e funciona durante 5 minutos. Para o controle, 50 μl de rhPDGF- BB são adicionados a 1,0 mg/ml ao sistema a partir do topo do dispositivo canular artroscópico. Após 5 minutos de fluxo, colete o tampão de eluição em um tubo cônico de 50 ml por desconectar a tubulação de silicone da seringa de 20 ml enquanto a bomba ainda está ligada. As amostras são armazenadas a 2 a 4°C para análise. A quantidade de rhPDGF-BB eluído em cada amostra é medida com o uso do kit ELISA DuoSet da R & D Systems, conforme descrito em um procedimento para o ensaio ELISA abaixo.

Procedimento para o ensaio ELISA

[00285] O reagente de captura é diluído até a concentração de trabalho (0,4 μg/ml) em DPBS pela adição de 56 μl de solução de estoque de reagente de captura a 10 ml de DPBS, 100 μl de reagente de captura diluído são então adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços. A placa é selada com uma seladora de placas, e incubada à temperatura ambiente de um dia para o outro em um agitador. As bolhas provenientes das diversas aspirações e dispensações são drenadas e as placas são lavadas três vezes com tampão de lavagem. 200 μl de tampão de eluição são adicionados a cada poço e as placas são bloqueadas por pelo menos 2 horas (máximo de 4 horas) à temperatura ambiente com agitação. As placas são lavadas três vezes com tampão de lavagem.

[00286] Estreptavidina-HRP é diluída até a concentração de trabalho (diluição de 200x) em tampão diluente de reagente pela adição de 50μl de solução de estoque de estreptavidina-HRP a 10 ml de tampão diluente de reagente. A Estreptavidina-HRP é então adicionada em 100 μl a cada poço e a placa é coberta com papel alumínio, e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital. Imediatamente após a adição de estreptavidina- HRP à placa, o volume necessário de SureBlue TMB é então aliquotado em um tubo cônico de 15 ml envolto em folha metálica e colocado em uma bancada para permitir o equilíbrio até temperatura ambiente. É preparado um tubo separado para cada placa. As placas são, então, lavadas três vezes com tampão de lavagem.

[00287] Sure Blue é adicionado em 100 μl a cada poço, a placa é coberta com papel alumínio e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente. 50 μl de HCl 1N são, então, adicionados a cada poço para parar a reação. A densidade óptica a 450 nm é lida com uma correção ajustada a 540 nm dentro de 30 minutos após a reação ter sido paralisada.

Cálculo dos dados

[00288] Padrões usando o gráfico de 4 parâmetros são plotados, e a concentração de rhPDGF-BB para cada conjunto de amostras em cada diluição é calculada com o uso da curva padrão em cada placa. Os valores médios e os desvios padrão (SD) para cada uma das amostras em triplicata das duas diluições em cada ponto de tempo também são calculados.

[00289] O rhPDGF-BB total presente em cada amostra é determinado mutiplicando-se a concentração de rhPDGF-BB pelo volume total de cada amostra. A quantidade cumulativa de rhPDGF- BB em cada amostra em cada ponto de tempo é calculada somandose a quantidade de rhPDGF-BB naquele ponto de tempo ao ponto de tempo anterior.

[00290] A média +/- SD para a quantidade cumulativa de rhPDGF- BB liberado em cada um dos quatro pontos de tempo é plotada. A porcentagem de liberação de rhPDGF-BB em cada amostra é calculada pela divisão da liberação cumulativa de rhPDGF-BB em cada ponto de tempo pelo valor médio do controle no mesmo ponto de tempo. Os valores médios da porcentagem de rhPDGF-BB para cada uma das amostras em triplicata em cada ponto de tempo também são calculados. A média +/- SD para a porcentagem de liberação de rhPDGF-BB em cada um dos quatro pontos de tempo é plotada.

Análise estatística

[00291] As comparações estatísticas dos dados em cada ponto de tempo são feitas por um método adequado de acordo com a distribuição dos dados.

[00292] Exemplo 11: Caracterização da liberação, estabilidade, e biopotência do fator de crescimento derivado de plaqueta humano recombinante-BB (rhPDGF-BB) combinado com matrizes de colágeno com o uso de um modelo do tipo BenchTop de irrigação artroscópica

[00293] Este estudo foi conduzido para desenvolver um novo modelo artroscópico do tipo Bench Top para reproduzir o ambiente artroscópico com alto fluxo de fluidos e para caracterizar a liberação, estabilidade, e biopotência do rhPDGF-BB eluído a partir de quatro diferentes matrizes de colágeno consideradas para aplicação em procedimentos de fixação de tendão ao osso, tal como o procedimento de reconstrução do ligamento cruzado anterior ou o procedimento de tratamento de lesões do manguito rotador.

Métodos

[00294] Quatro matrizes de colágeno tipo I bovino foram avaliadas: três derivadas da derme, matrizes de colágeno com diferentes concentrações de colágeno (A= 4,5% de colágeno; B= 5% de colágeno, C= 6% de colágeno da Kensey Nash Corporation) e uma matriz derivada de tendão de Aquiles (colágeno D, COLLATAPE® da Integra LifeSciences). Todas as matrizes foram cortadas em discos de 8 mm. Para avaliar a liberação de rhPDGF-BB (Novartis), das matrizes de colágeno, cada disco foi hidratado com 50 μl de rhPDGF-BB a 1 mg/ml (50 μg), incubado durante 10 minutos à temperatura ambiente, colocado no sistema artroscópico do tipo Bench Top (vide figura 14) preenchido com 20 ml de tampão de eluição (MEM contendo 2% de SFB), e submetidos a fluxo durante 5 minutos a uma taxa de fluxo 200 ml/min. A mesma quantidade de rhPDGF-BB foi adicionada ao sistema como um controle. As amostras de tampão de eluição usadas para lavar as matrizes foram analisadas com o uso de um ensaio ELISA DuoSet (R & D Systems). Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa e exclusão de tamanho foi usada para gerar os perfis do rhPDGF-BB liberado das matrizes de colágeno para avaliação de alterações/modificação na estrutura nativa /desnaturada de rhPDGF-BB. A biopotência do rhPDGF-BB liberado das matrizes de colágeno foi testado com o uso de um teste de proliferação celular com bromodeoxiuridina (BrdU) (Promega). Fibroblastos NIH3T3 foram cultivados em gel de plaquetas (releasate) contendo rhPDGF-BB (0 a 0,24 μg/ml), BrdU foi, então, adicionado, e as células foram incubadas durante 48 horas.

[00295] O percentual médio de liberação de rhPDGF-BB em relação ao controle para cada uma das quatro matrizes de colágeno foi como segue: colágeno A, 79%; colágeno B, 64,6%; colágeno C, 74,3%; e colágeno D, 89,0%. O colágeno mostrou a maior liberação de rhPDGF-BB, que foi significativamente maior que aquela observada para a matriz B ou C, conforme demonstrado com o uso de uma análise unidirecional de variância pelo método de Fisher LSD. Nenhuma alteração aparente do rhPDGF-BB foi encontrada após a combinação com a matriz D, conforme demonstrado pelo HPLC de fase reversa, mas uma leve oxidação de rhPDGF-BB ocorreu com as matrizes de colágeno A, B, e C, entretanto estas alterações não pareceram afetar a biopotência (avaliada por BrdU).

[00296] Este estudo mostra que o modelo artroscópico Bench Top é um sistema eficaz para avaliar matrizes quanto a liberação de agentes terapêuticos de proteína recombinante propostos para uso em procedimentos de reparo/regeneração artroscópica em medicina desportiva. Os colágenos A e D liberaram mais rhPDGF-BB do que os colágenos B e C, e o colágeno D não resultou em nenhuma alteração do rhPDGF-BB, exibindo grande potencial para uso em procedimentos regenerativos de medicina desportiva. Além disso, este modelo artroscópico representa uma excelente ferramenta in vitro que permite que se adapte dispositivos terapêuticos de proteína recombinante para fornecer a dose de liberação ótima para máxima eficácia.

[00297] Exemplo 12: Migração celular em matrizes BIOBLANKET® de diferentes densidades e COLLATAPE® em resposta a rhPDGF-BB através de uma avaliação por microscopia eletrônica de varredura (MEV)

[00298] Este estudo avaliou a extensão da migração celular nas matrizes BIOBLANKET® e COLLATAPE® pelo cultivo de tenócitos primários ovinos que são tratados com ou sem rhPDGF-BB e subsequentemente avaliados através da técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Materiais e Métodos

[00299] A migração de tenócitos ovinos nas matrizes BIOBLANKET® e COLLATAPE® foi avaliada por semear as matrizes com uma quantidade conhecida de células e, então, cultivar as matrizes durante 4 dias. As matrizes foram então processadas por secagem ao ponto crítico e a distribuição e a densidade das células nas matrizes foram avaliadas sob um microscópio eletrônico de varredura.

[00300] Os materiais de teste incluem 1) BIOBLANKET® 5%, 6%, ou 7% (n° de lote R436-1, R436-2, R436-3); 2) COLLA TAPE® (n° de lote 1072549); 3) rhPDGF-BB (0,3 mg/ml; n° de lote: BMTI204), e 4) pata fresca de ovino, amputada na articulação do tornozelo. O delineamento do estudo é listado na Tabela 11. Tabela 11: Planejamento das amostras

[00301] a Suspensão (P+): a suspensão de semeadura de células contém 1,2 mg/ml de rhPDGF-BB

[00302] b Suspensão (P-): a suspensão de semeadura de células não contém rhPDGF-BB

[00303] c Meio (P+): o meio de cultura celular contém 30 ng/ml de rhPDGF-BB

[00304] d Meio (P-): o meio de cultura celular não contém rhPDGF-BB

Isolamento e cultura de tenócitos ovinos primários

[00305] A pata ovina fresca foi limpa, pulverizada e lavada com o uso de sabão, água, e álcool 70%. Uma porção de cerca de 7,62 cm (3 polegadas) de pele da superfície do tendão flexor foi cortada. A incisão foi pulverizada com álcool 70% e coberta com pensos cirúrgicos. Uma incisão foi feita sobre a bainha do tendão para expor o tendão. O tendão foi, então, cortado a partir do lado distal. O tendão foi puxado o máximo de tempo possível e o lado proximal foi cortado. O tendão foi, então, colocado em um tubo cônico de 50 ml cheio com DPBS gelado. O tecido da pata e o tecido residual foram descartados.

[00306] O tecido do tendão foi picado em pedaços pequenos em uma placa para cultura celular estéril de 120 mm em uma área de trabalho em capela de fluxo laminar. O tecido picado foi, então, transferido para um novo tubo cônico de 50 ml. O tecido do tendão picado foi lavado duas vezes com DPBS e uma vez com meio DMEM/F-12. O tecido do tendão foi, então, digerido com 500 unidades/ml de protease pronase em meio DMEM/F-12 durante uma hora. A protease pronase foi aspirada e lavou-se duas vezes com DPBS e uma vez com meio DMEM/F-12 isento de soro.

[00307] Os tenócitos foram, então, liberados com 0,2% de colagenase P mais 150 unidades/ml de DNAse-II em meio DMEM/F-12 isento de soro durante uma hora. O digesto foi filtrado através de uma peneira de células de 75 μm. O tecido que sobrou foi devolvido da peneira para um tubo cônico de 50 ml, e os tenócitos foram liberados com 0,2% de colagenase P mais 150 unidades/ml de DNAse-II em meio DMEM/F-12 isento de soro durante uma hora. As células foram peletizadas por centrifugação a 1200 a 1500 RPM durante 5 minutos a 4°C. As células foram ressuspensas em 10 ml de meio de crescimento DMEM/F12 e a contagem de células foi feita com o uso de azul de tripan e um hemacitômetro. As células foram plaqueadas em frascos T75 ou T150 com meio de crescimento DMEM/F-12 a uma densidade entre 5000 a 7500 células/cm2. Todo o processo descrito neste parágrafo foi repetido a cada uma hora até a digestão de todos os tecidos do tendão. O meio de crescimento foi trocado a cada dois dias e trocado para meio básico 24 horas antes da semeadura das células nas matrizes BIOBLANKET® e COLLATAPE®. Semeadura das células e adição de rhPDGF-BB

[00308] Com o uso de uma técnica asséptica, foram cortados discos de 8 mm das matrizes BIOBLANKET® e COLLATAPE® com o uso de um perfurador de biópsia. Um disco de BIOBLANKET® ou COLLATAPE® em cada agulha de 27 G1/2 foi suavemente imobilizado e a agulha foi inclinada a um ângulo de 90 graus duas vezes para abrir um formato retangular para evitar o deslizamento do disco. A agulha imobilizada com o disco das matrizes BIOBLANKET® e COLLATAPE® foi conectada uma cabeça de seringa de 1 ml em uma câmara especialmente projetada. Os tenócitos foram tripsinizados e suspensos (menos de 4 passagens) em 1 ml de meio básico DMEM contendo 2% de SFB e antibióticos a uma concentração de 106 células/ml. Uma quantidade total de 60 ng (30 ng/ml em 2 ml de meio) de rhPDGF-BB foi aplicada a cada disco. Os discos das matrizes BIOBLANKET® e COLLATAPE® foram, então, semeados com as células e incubados na câmara na incubadora sem imersão em meio durante 1 hora. Meio DMEM contendo 2% de SFB foi preparado e 2 ml foram adicionados a 8 poços de cada placa de 24 poços de aderência ultra baixa para um total 8 de poços como o grupo tratado com rhPDGF-BB. Após 1 hora de incubação, os discos semeados com as células das caixas de aplicação foram removidos. Com o uso de um hemostato, a ponta da agulha foi quebrada da base plástica. Os discos semeados com as células foram transferidos junto com a ponta da agulha para poços preenchidos com meio contendo diferentes composições. A ponta da agulha fixada aos discos manteve o disco flutuando no meio, para que as células em ambos os lados fossem nutridas uniformemente. Um total de quatro tratamentos foi conduzido para cada material e amostras em triplicata foram preparadas para cada material e para cada tratamento. Após uma cultura estática de 12 horas na incubadora a 37°C e atmosfera de 5% de CO 2, as placas foram colocadas com as matrizes de colágeno semeadas com células em um agitador orbital na incubadora. O meio contendo as mesmas composições que a primeira incubação foi trocado a cada 48 horas. Processo de microscopia eletrônica de varredura

[00309] Após quatro dias da cultura, cada disco semeado com células da placa de 24 poços foi transferido para um criofrasco com emersão de meio. O meio do criofrasco foi, então, removido e as amostras foram lavadas em DPBS duas vezes. As amostras foram fixadas em 2,5% de glutaraldeído durante 2 horas. As amostras foram, então, lavadas em DPBS cinco vezes e pós-fixadas em 2% de tetróxido de ósmio durante duas horas. As amostras foram imersas em água deionizada durante 10 minutos e lavadas cinco vezes com água deionizada para remover o excesso de tetróxido de ósmio. As amostras foram desidratadas em uma série crescente de etanol e, então, secas em uma secadora de ponto crítico Polaron. As amostras foram revestidas com ouro-paládio e visualizadas com um microscópio eletrônico de varredura Hitachi.

Resultados e conclusões

[00310] Os tenócitos foram cultivados sobre a superfície de todas as matrizes BIOBLANKET® com diferentes concentrações de pasta fluida de colágeno, mas cultivados dentro da matriz COLLATAPE®. A maioria dos tenócitos tinha formato redondo quanto cultivados sobre todas as matrizes BIOBLANKET®com diferentes concentrações da pasta fluida de colágeno, mas tinham formato de carretel na matriz COLLATAPE®. Vide figura 15.

[00311] Exemplo 12: Reparo do manguito rotador com o uso de rhPDGF-BB e matriz de colágeno tipo I bovino em um modelo de ovino

[00312] O propósito deste estudo foi determinar a eficácia de uma matriz carregada com rhPDGF-BB destinada a promover refixação mais forte do tendão infraespinhal ao úmero para reparo do manguito rotador com o uso de um modelo de ovino. O delineamento experimental é fornecido a seguir: 1) apenas sutura (n=9); 2) sutura + matriz de colágeno + tampão (n=9); 3) sutura + matriz de colágeno + 0,15 mg/ml (ou 75 μg) de rhPDGF-BB (n=9); 4) sutura + matriz de colágeno + 0,30 mg/ml (ou 150 μg) de rhPDGF-BB (n=9); 5) sutura + matriz de colágeno + 1,0 mg/ml (ou 500 μg) de rhPDGF-BB (n=9); e 6) iCTL (n=9) controle contralateral intacto. 9 animais dos grupos apenas com sutura, sutura + matriz de colágeno + tampão, e dos três grupos de dosagem foram utilizados para o teste biomecânico, e 3, cada, para teste de histologia. O grupo de iCTL foi menor, com 6 animais para teste biomecânico e 3 para teste de histologia.

Procedimento cirúrgico

[00313] O tendão infraespinhal de ovelhas esqueleticamente maduras (3,5+ anos) foi exposto cirurgicamente e desprendido da cabeça do úmero. A área ocupada pelo tendão foi decorticada e três perfurações foram feitas no osso para induzir sangramento. Os artigos de teste foram colocados como um enxerto interposicional entre o tendão e o osso. Duas suturas foram passadas através do tendão com o uso da técnica de Mason-Allen e o tendão foi preso à cabeça do úmero através de um reparo em fileira única que consiste em 3 túneis ósseos. O sítio cirúrgico foi fechado com o uso de procedimento padrão e as ovelhas foram deixadas deambular normalmente. Os animais foram sacrificados 12 semanas após a cirurgia.

Materiais e Métodos Teste biomecânico

[00314] Os ombros dos animais alocados para teste biomecânico foram coletados e toda a musculatura foi removida, mas a construção do úmero-tendão infraespinhal foi deixada intacta. Um total de 51 ombros foi avaliado biomecanicamente. Após a limpeza, os espécimes foram envoltos em gaze embebida em solução salina e armazenados a -20°C até o teste biomecânico. Os úmeros foram im plantados em um tubo de PVC de 2" com o uso de resina de polimetilmetacrilato (PMMA) de alta resistência. Os espécimes foram hidratados durante a preparação do implante e o teste biomecânico com uma aspersão de solução salina em intervalos de 15 minutes. Os úmeros implantados foram montado em um acessório de teste com desenho customizado que foi fixado de forma rígida à estrutura de carregamento do sistema de teste dos materiais (MTS MiniBionix, Edan Prairie, MN). Uma braçadeira de criogenia com desenho personalizado foi projetada para preservar a seção transversal natural do tendão infraespinhal e reduzir o deslizamento do tecido mole e uma força de tração uniaxial foi aplicada à construção em um ângulo de aproximadamente 135° ao úmero implantado. Isto foi feito para imitar o vetor da força fisiológica do tendão. O teste começou quando um termopar fixado à braçadeira de criogenia registrou -22°C, uma temperatura relatada anteriormente como sendo suficiente para garantir acoplamento seguro entre o tendão e a braçadeira.

[00315] Três marcadores retrorrefletores foram suturados ou colados sobre a construção implantada: um no úmero imediatamente adjacente ao local de reparo, dois no tendão proximal à interface do reparo e o terceiro na braçadeira. Três câmeras (Motion Analysis, Santa Rosa, CA) registraram o movimento espacial dos marcadores em 60 Hz. As medições de deslocamento do marcador com o uso do sistema de câmera permitiu um monitoramento em tempo real da deformação local do tecido em todo o sítio de reparo do manguito rotador.

[00316] Fase 1: 30 ciclos de pré-condicionamento dinâmico

[00317] Um teste de carregamento cíclico foi empregado inicialmente para pré-condicionar o manguito rotador reparado. Uma pré-carga de 10 Newton (N) foi aplicada em controle de força durante dois minutos, e após isto as construções reparadas foram pré- condicionadas ciclicamente em um protocolo de controle de força de 10 a 50 N a 0,25 Hz durante 60 ciclos para atingir uma condição de estado estacionário. O número de sessenta (n=60) ciclos foi escolhido com base em experimentos piloto em nosso laboratório que demonstraram que a inclinação da curva de deslocamento versus tempo atinge um comportamento de estado estacionário passível de repetição entre 50 e 60 ciclos. O alongamento no condicionamento e o alongamento de pico a pico foram determinados durante o teste de pré-condicionamento cíclico. O alongamento no condicionamento foi definido como a distância no deslocamento y entre o 1° pico cíclico e 60° pico cíclico. O alongamento de pico a pico foi definido como a média entre o mínimo e o máximo local dos 58°, 59° e 60° ciclos.

[00318] Fase 2: Carregamento na ruptura quasi-estático

[00319] Após o pré-condicionamento, as construções reparadas foram submetidas a uma carga para ruptura sob controle de deslocamento a uma taxa de 1 mm/s. Os parâmetros biomecânicos de interesse incluíram a carga para ruptura final, rigidez quasi-estática (definida como o coeficiente angular da curva carga-deslocamento). Por fim, o mecanismo de ruptura foi documentado para cada espécime. Imagens digitais foram tiradas, conforme adequado.

Análise estatística

[00320] Um teste ANOVA unidirecional e testes post-hoc LSD de Fisher e Tukey foram usados para identificar diferenças significativas nos parâmetros biomecânicos contínuos entre os grupos de tratamento excluindo os controles intactos. A significância foi estabelecida em p < 0,05 e todas as análises foram realizadas com o programa SigmaStat 3.1 (Systat Software, Inc., San Jose, CA). Resultados

[00321] Os dados brutos do componente de pré-condicionamento cíclico do teste são apresentados na Tabela 12. Os grupos com 0,15 mg/ml de PDGF e 0,30 mg/ml de rhPDGF-BB foram submetidos a um alongamento de condicionamento significativamente maior que os grupos apenas com sutura e sutura + matriz de colágeno (Tukey: p < 0,024; LSD de Fisher: p <_0,003). Figura 16A. Não houve diferenças significativas no alongamento de pico a pico entre os grupos (p=0,111, Figura 16B). Tabela 12: Dados resumidos da análise de pré-condicionamento cíclico. Dados relatados como média ± S.E.M.

[00322] Os dados brutos do componente de resistência à ruptura do teste biomecânico são apresentados na Tabela 13. O aumento do reparo com 0,15 mg/ml e 0,30 mg/ml de rhPDGF-BB resultou em um aumento de 63,7% e 63,3% na carga para ruptura em relação ao grupo apenas com sutura, respectivamente (Tukey: p=0,176; LSD de Fischer: p=0,029 e Tukey: p=0,181; LSD de Fisher: p=0,030, figura 17A). Adicionalmente, os dados de carga na ruptura indicaram que as menores doses de rhPDGF-BB de 0,15 mg/ml e 0,30 mg/ml tiveram melhor desempenho que a dose mais elevada de 1,0 mg/ml de PDGF, o que se manifestou como um aumento de 120% e 119,3%, respectivamente, na carga na ruptura (p=0,023 e p=0,023 (Fisher: p=0,003)). Não foram identificadas diferenças estatísticas na rigidez da construção entre os grupos (p=0,254, figura 17B). As construções nos grupos de 0,15 mg/ml e 0,30 mg/ml de rhPDGF-BB exibiram alongamento significativamente maior na ruptura em relação ao grupo apenas com sutura (p<0,018 e p<0,024, respectivamente). O LSD de Fisher indicou que os grupos com 0,15 mg/ml e 0,30 mg/ml de PDGF alongaram significativamente mais do que o grupo com sutura + matriz de colágeno tampão (p=0,015 e p=0,011, respectivamente). Não foram identificadas diferenças no alongamento na ruptura entre os grupos com 0,15 mg/ml, 0,30 mg/ml ou 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB (p>0,054). Tabela 13: Dados resumidos do teste de resistência à ruptura. Dados relatados como média ± S.E.M

[00323] Para o grupos de tratamento apenas com sutura, sutura + matriz de colágeno + tampão, e sutura + matriz de colágeno + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB, a ruptura da construção em todos os espécimes se manifestou como uma ruptura do tecido na substância intermediária no local de inserção no úmero. Não foram observadas rupturas da avulsão do úmero em nenhum dos tendões (n=27) nestes três grupos. Em contrapartida, os modos de ruptura nos grupos de tratamento com 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB e 0,30 mg/ml de rhPDGF- BB foram variados, se manifestando como ruptura do tecido na substância intermediária no local da inserção no úmero ou como ruptura do tecido na substância intermediária combinada com alguma avulsão óssea. Especificamente, 6 de 9 (66,7%) ombros no grupo com 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB exibiram algum grau de avulsão óssea enquanto que 5 de 9 (55,6%) ombros no grupo com 0,30 mg/ml de rhPDGF-BB exibiram algum grau de avulsão óssea. A ruptura das construções contralaterais intactas se manifestou como fratura da diáfise média umeral (n=5) ou avulsão óssea no local de inserção do tendão infra-espinhal no úmero (n=1).

IV-CONCLUSÃO

[00324] O aumento da refixação do tendão infra-espinhal do úmero com 0,15 mg/ml e 0,30 mg/ml de rhPDGF melhorou a função mecânica após três meses em um modelo ovino em relação aos grupos apenas com sutura, sutura + matriz de colágeno + tampão e sutura + matriz de colágeno + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB. A integridade biomecânica intensificada das doses menores de rhPDGF-BB se manifestou como um aumento de 63% na carga para ruptura em relação ao grupo apenas com sutura e um aumento de 120% na carga na ruptura em relação ao grupo com 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB. Os dados relatados aqui fornecem suporte para um efeito dependente da dose sobre o aumento do manguito rotador, com doses menores de rhPDGF-BB gerando uma resposta de cura maior em relação à dose mais elevada de 1,0 mg/ml do fator de crescimento. Adicionalmente, os modos de ruptura nos grupos de tratamento com 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB e 0,30 mg/ml de rhPDGF-BB foram similares ao modo de ruptura visto de forma consistente nos ombros não operados intactos, uma vez que 6 dos 9 (66,7%) ombros no grupo com 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB exibiram algum grau de avulsão óssea enquanto que 5 dos 9 (55,6%) ombros no grupo com 0,30 mg/ml de rhPDGF-BB exibiram algum grau de avulsão óssea. Este achado mostra que as menores doses de PDGF (por exemplo, rhPDGF-BB) promoveu maior integração tendinosa com a tuberosidade do úmero ao longo de um período de cura de 12 semanas e que as doses menores de PDGF são mais adequadas para aumentar os reparos de manguito rotador.

[00325] Exemplo 13: Reparo do manguito rotador com o uso de rhPDGF-BB e uma matriz de colágeno tipo I bovino em um modelo de ovino: resultados histológicos

[00326] Este estudo foi projetado para avaliar a eficácia do fator de crescimento derivado de plaqueta humano recombinante-BB (rhPDGF- BB) em combinação com uma matriz de colágeno tipo I bovino para promover cura e regeneração da inserção do manguito rotador de ovelhas. A cura ótima das lesões do manguito rotador envolve a reinserção no osso no local original da fixação ("footprint" do tendão). Sem reinserção das fibras do tendão no osso, o local curado é considerado "mais fraco" do que a fixação original, limitando potencialmente a função e levando a maiores chances de lesão repetida. Estudos anteriores relataram uma taxa relativamente mais elevada de ruptura após reparo do manguito rotador (Vide, por exemplo, Boileau P., et al., J Bone Joint Surg Am, 87:1229-1240 (2005); Galatz L. M., et al., J. Bone Joint Surg Am., 86:219-224 (2004)); Gazielly D. F., Clin. Orthop Relat Res, 304:43-53 (1994)); Gerber C. J. et al., Bone Joint Surg Am, 82:505-515 (2000); e Harryman D. T., et al., J. Bone Joint Surg Am, 73:982-989 (1991)), o que foi postulado como sendo o resultado de uma variedade de diferentes fatores (vide, por exemplo, Goutalier D., et al., Clin Orthop, 304:78-83 (1994); Gerber C. et al., J Bone Joint Surg Br, 76:371-380 (1994); Warner J. P., et al., J Bone Joint Surg Am, 74:36-45 (1992)). A qualidade do tecido do tendão e a cura do tendão ao osso foram propostas como dois dos fatores mais importantes que contribuem para reparos mal sucedidos do manguito rotador, e a liberação de fatores de crescimento ou células para aumentar a cura do tendão ao osso foi sugerida como um método para otimizar a cura destas lesões (vide, por exemplo, Gamradt S. C., et al., Tech in Orthop, 22:26-33 (2007) e Dovacevic D., et al., Clin. Orthop Relat Res, 466:622-633 (2008)). O PDGF-BB é uma proteína de cura de ferimentos bem caracterizada que é conhecida por ser quimiotática (migração celular) e mitogênica (proliferação celular) para células de origem mesenquimal, incluindo células de osso (osteoblasto) e tendão (tenócitos). Adicionalmente, foi mostrado que o PDGF-BB regula positivamente o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), levando a angiogênese aumentada (revascularização), que é essencial para processos regenerativos bem-sucedidos. O propósito deste estudo foi determinar a eficácia de rhPDGF-BB, combinado com uma matriz de colágeno tipo I bovino , no local do reparo do tendão para aumentar e otimizar a refixação do tendão com o uso de medidas de resultados biomecânicos e histológicos.

Delineamento do estudo

[00327] Um total de 17 ovinos maduros do esqueleticamente foi incluído como parte do estudo. Os animais foram submetidos a desprendimento cirúrgico seguido de refixação imediata do tendão infraespinhal direito à tuberosidade maior do úmero com o uso de suturas através de túneis no osso. No primeiro conjunto de experimentos, os animais experimentais (n=3) receberam um veículo de colágeno tipo I combinado com rhPDGF-BB com concentrações de 0,15 (n=3) ou 0,3 (n=3) mg/ml em tampão de acetato de sódio 20 mM (acetato) na interface tendão-osso. O tempo de sobrevida para todos os animais foi de 12 semanas. As distribuições do tratamento são apresentadas na Tabela 14. Tabela 14: Espécimes alocados para histologia

[00328] No segundo conjunto de experimentos, os animais experimentais (n=3/grupo) receberam um veículo de colágeno tipo I (matriz de colágeno) combinado com rhPDGF-BB com uma concentração de 1,0 mg/mL ou apenas matriz de colágeno em tampão de acetato de sódio 20mM (acetato) na interface tendão-osso. Tabela 15. Tabela 15: Espécimes alocados para avaliação histológica

[00329] Os animais foram eutanizados humanamente após 12 semanas da cura e os ombros (direitos) operados foram coletados e colocados em formalina tamponada neutra a 10% para processamento histológico. Cada ombro foi bisseccionado através do tendão infraespinhal e seu local de fixação ao úmero dentro das metades cranial e caudal com o uso de um bisturi para o tendão e uma serra de lâmina de diamante para o úmero (Exakt Technologies, Oklahoma City, OK). Imagens digitais de cada espécime foram tiradas durante o aparamento. Uma metade (ou do aspecto cranial ou do caudal) foi processada para histologia descalcificada; a outra metade foi processada para análise histológica não-descalcificada.

Processamento histológico descalcificado

[00330] O aspecto cranial ou o caudal foi processado para histologia descalcificada e incluído em parafina. Os espécimes foram fixados, descalcificados, desidratados, purificados, infiltrados e incluídos em parafina com o uso de técnicas e equipamentos padronizados de histologia (processador Sakura Tissue TEK V.I.P., Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA e Shandon Histocentre 2, Thermo Shandon, Inc, Pittsburgh, PA). Os blocos de parafina foram facetados e seções de aproximadamente 8 μm foram cortadas no micrótomo giratório Shandon Finesse (Thermo Shandon, Inc, Pittsburgh, PA). Cinco seções histológicas foram obtidas a partir de cada ombro em incrementos de espessura espacial de aproximadamente 250 micra. Imagens digitais em alta resolução foram adquiridas campo por campo por toda a lâmina corada e as regiões de interesse com o uso de um sistema de formação de imagens Image Pro (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) e um microscópio Nikon E800 (AG Heinze, Lake Forest, CA) e uma câmera digital Spot (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI), e um computador Pentium IBM com capacidades de memória expansíveis (Dell Computer Corp., Round Rock, TX). Histopatologia semiquantitativa

[00331] Todas as seções de tecido foram classificadas de acordo com uma escala de classificação para determinar o grau de retração do tendão (caso exista), para a avaliação do tecido de reparo/cura, da interface do tendão ao osso, da resposta do tecido aos tratamentos, vascularização, inflamação, orientação do colágeno /alinhamento das fibras, e interdigitação e presença de fibras de Sharpey no local da inserção. As seções foram primeiramente avaliadas de forma cega ao tratamento e avaliadas quanto à cura global em comparação umas com as outras e designadas com uma pontuação de cura. Uma descrição dos critérios para cada pontuação é apresentada na Tabela 16. O grau de retração do tendão (caso existente) também foi medido através de imagens digitais macroscópicas calibradas com o uso do sistema de formação de imagens Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Tabela 16: Descrição das pontuações de cura

Resultados (I)

[00332] No primeiro conjunto de experimentos (matriz de colágeno + 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB ou 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB), todos os espécimes operados, independentemente do tratamento, apresentaram algum grau de retração do tendão após 12 semanas da cura. Em média, o tendão infra-espinhal retraiu 41,8 ± 3,5 mm (média ± desvio padrão) a partir do osso no grupo de dosagem com 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB, e 45,2 ± 8,9 mm no grupo de dosagem com 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB.

[00333] As pontuações histopatológicas medidas por tratamento no primeiro conjunto de experimentos são apresentadas na Tabela 17; a representação gráfica destes resultados é apresentada na figura 18. Foi observado que as suturas estavam intactas dentro do túnel osso em 4 dos 6 espécimes após 12 semanas da cura, o que indica que a ruptura que leva à retração do tendão ocorreu na interface sutura-tendão e não na interface osso-sutura.

[00334] Como um todo, independentemente do tratamento, o tecido de reparo entre o úmero e a extremidade nativa do tendão consistiu em um tecido fibrovascular (tecido fibroso altamente vascularizado) com fibroplasia ativa e fibras de colágeno polarizáveis moderadamente densas presentes. Não foram observadas diferenças na densidade do fibroblasto entre os tratamentos. Todos os espécimes apresentaram alinhamento das fibras de colágeno primário paralelo às fibras do tendão original com áreas com fibras menos organizadas. A orientação média das fibras de colágeno e a densidade das fibras foram similares entre os tratamentos. Tabela 17: Pontuações histopatológicas agrupadas por tratamento e médias calculadas

[00335] Nos locais de inserção em regeneração, foram observadas fibras colagenosas de Sharpey do tecido de reparo do tendão inserindo e interdigitando diretamente com colágeno do osso ou através de uma camada de fibrocartilagem em todos os espécimes. Em média, observou-se interdigitação em aproximadamente 30 a 40% da superfície óssea decorticada total e esta observação foi consistente em todos os grupos de tratamento. As fibras de Sharpey observadas nos espécimes operados eram mais imaturas do que o controle intacto; entretanto, houve inserção e continuidade destas fibras regenerativas com o colágeno do osso subjacente. Em alguns poucos casos observou-se uma porção do local de fixação do tendão nativo original nos ombros operados.

[00336] A reabsorção osteoclástica anterior da superfície do osso foi observada na maioria dos espécimes na região decorticada do local de fixação original. Isto foi reconhecido pela superfície recortada do osso (lacunas de Howship) onde os osteoclastos não mais estavam presentes ou por uma linha reversa basofílica recortada onde a superfície havia sido coberta por novo tecido ósseo. Tipicamente, as regiões de reabsorção anterior estavam cobertas com uma camada de osso reativo trançado com osteoblastos presentes. O osso reativo tinha, frequentemente, inserção de fibra de Sharpey. A extensão da reabsorção foi variável. Isto foi observado em aproximadamente 10 a 50% da superfície total do osso independentemente do tratamento, e estava tipicamente coberta por novo osso trançado. Ilhas de osso trançado reativo e/ou fibrocartilagem foram observadas ocasionalmente dentro do tecido de reparo.

[00337] Em todos os espécimes foi observada inflamação leve por corpo estranho no interior do tecido em cura e ela estava concentrada principalmente próxima ao material de sutura. Em alguns poucos casos foram observadas pequenas áreas de inflamação mononuclear dentro do tecido do reparo, possivelmente associadas com vascularização ou tecido focalmente danificado. A inflamação era principalmente mononuclear com células gigantes multinucleadas. Tipicamente, não foram observados neutrófilos. Observou-se vascularização abundante no tecido de cura em todos os espécimes independentemente do tratamento. Proliferação angioblástica, que indica produção de novos vasos, também foi observada em alguns espécimes e não estava correlacionada com um tratamento específico. Esta proliferação foi causada, mais provavelmente, pelas alterações adaptacionais em andamento associadas com o processo de cura.

[00338] Sabe-se que a infiltração gordurosa é uma consequência de lacerações do tendão do manguito rotador e ela foi mostrada estando correlacionada com o grau de retração do tendão (Nakagaki et al, J. Clin Orth Rel Res (2008) e Bjorkenheim J. M., et al, Acta Orthop Scand. 60(4): 461-3(1989). Observou-se infiltração gordurosa em alguns espécimes no tecido periférico adjacente ao músculo. Ela só foi observada no centro do tecido de reparo em um espécime (dose de 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB). (II)

[00339] No segundo conjunto de experimentos (sutura, sutura + matriz de colágeno + tampão de acetato, sutura + matriz de colágeno + rhPDGF-BB, ou controle intacto), o tendão infraespinhal retraiu 28,1 ± 2,8 mm a partir do osso para o grupo somente com sutura, 39,0 ± 4,6 mm para o grupo com sutura + matriz de colágeno + tampão de acetato, e 40,9 ± 8,3 mm para o grupo com sutura + matriz de colágeno + rhPDGF-BB.

[00340] As suturas estavam intactas dentro do túnel osso em todos os espécimes após 12 semanas da cura, o que indica que a ruptura que leva à retração do tendão ocorreu na interface sutura-tendão e não na interface osso-sutura. A cura dentro e entre os tratamentos foi variável. A cura para o grupo apenas com sutura foi a mais variável, com espécimes variando da melhor cura até a pior cura dos grupos. Os espécimes do grupo com sutura + matriz de colágeno + tampão de acetato variaram entre as classificações de cura média/alta até média /baixa, e os espécimes do grupo com sutura + matriz de colágeno + rhPDGF-BB variaram de cura média /baixa até baixa. O tratamento em si não foi visível em nenhuma das lâminas histológicas coradas. As pontuações de cura ordenadas de melhor cura até pior cura para todos os espécimes dos grupos são mostradas na Tabela 18. Tabela 18: Pontuações de cura para os espécimes individuais

[00341] As pontuações histopatológicas medidas por tratamento são apresentadas na Tabela 19 e na figura 19. Como um todo, independentemente do tratamento, o tecido de reparo entre o úmero e a extremidade nativa do tendão consistiu em um tecido fibrovascular (tecido fibroso altamente vascularizado) com fibroplasia ativa e fibras de colágeno polarizáveis presentes. Não foram observadas diferenças na densidade do fibroblasto entre os tratamentos. Alguns espécimes apresentaram regiões de alinhamento das fibras de colágeno primário (com o alinhamento do colágeno paralelo ao do tendão original) e outros não; a maioria dos espécimes apresentaram regiões com alinhamento organizado e desorganizado das fibras de colágeno. Em geral, o alinhamento do colágeno foi melhor próximo à superfície do osso ao invés de próximo à extremidade retraída do tendão.

[00342] Em geral, foram observadas fibras colagenosas de Sharpey do tendão, na sua inserção e sua interdigitação, com colágeno do osso através de uma camada de fibrocartilagem, mas em regiões muito pequenas; a interdigitação foi observada geralmente ao longo de menos de 10% da superfície total de fixação ao osso. Foram observadas pequenas regiões de inserção de fibra de Sharpey em todos os três espécimes do grupo apenas com sutura (isolada), e, dois dos espécimes do grupo com sutura + matriz de colágeno + tampão de acetato, e em todos os espécimes do grupo com sutura + matriz de colágeno + rhPDGF-BB. Em alguns poucos casos observou-se uma porção do local de fixação do tendão nativo original nos ombros operados.

[00343] A reabsorção osteoclástica da superfície do osso foi observada na maioria dos espécimes na região decorticada do local de fixação original. Isto foi reconhecido pela superfície recortada do osso (lacunas de Howship) onde os osteoclastos não mais estavam presentes ou pela superfície que havia sido coberta por outro tecido. A reabsorção ocorreu em aproximadamente 10 a 20% da superfície total do osso independentemente do tratamento. Osso trançado reativo e/ou fibrocartilagem foi observado dentro do tecido de reparo e na superfície do osso em todos os três espécimes apenas com sutura e em um espécime com sutura + matriz de colágeno + tampão de acetato.

[00344] Em todos os espécimes foi observada inflamação leve por corpo estranho no interior do tecido em cura, concentrada principalmente próximo ao material de sutura. Em alguns poucos casos foram observadas pequenas áreas de inflamação mononuclear dentro do tecido do reparo, possivelmente associadas com tecido focalmente danificado. A inflamação era principalmente mononuclear com células gigantes multinucleadas. Em geral, não foram observados neutrófilos. Observou-se vascularização abundante no tecido de cura em todos os espécimes independentemente do tratamento. Proliferação de angioblastos, que indica produção de novos vasos, também foi observada em alguns espécimes de forma independente do tratamento e provavelmente representou alterações adaptacionais em andamento no processo de cura.

IV-CONCLUSÃO

[00345] O aumento de uma refixação do tendão infraespinhal do úmero com uma matriz de colágeno embebida em rhPDGF-BB não evitou ruptura na interface sutura-tecido. O tendão foi retraído a partir do úmero e substituído por tecido fibrovascular de reparo em todos os espécimes após 12 semanas da cura, o que sugere que a retração ocorreu dentro das primeiras várias semanas após a cirurgia.

[00346] Os espécimes exibiram graus variados de formação de osso novo, inflamação, vascularização, e fibra de Sharpey inserindo o tendão ao osso no local de inserção. Não foram observadas diferenças nos grupos apenas com sutura, sutura + colágeno, e sutura + colágeno + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB na avaliação da retração do tendão, células inflamatórias, vascularização, ou fibras de Sharpey. As seções histológicas dos grupos com sutura + matriz de colágeno + 0,15 mg/ml de rhPDGF-BB e sutura + matriz de colágeno + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB apresentaram reparo aumentado do tendão e interdigitação do colágeno do tendão com o colágeno do osso na interface de fibrocartilagem. Figuras 20A e 20B.

[00347] A menos que definido de outro modo, os significados de todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção são os comumente compreendidos pelo versado na técnica a qual pertence a presente invenção. Deve ser compreendido que esta invenção não é limitada à metodologia, aos protocolos, e reagentes particulares descritos, uma vez que estes podem variar. Um versado na técnica também entenderá que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos também podem ser usados para praticar ou testar a invenção.

[00348] Os cabeçalhos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tidos por referência ao relatório descritivo como um todo.

Claims

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma matriz biocompatível e um fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que: (i) o PDGF está presente como uma solução e a concentração de PDGF na solução é de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 2,0 mg/mL, (ii) a matriz biocompatível é homogênea e compreende: (a) colágeno, ou (b) colágeno e um glicosaminoglicano, (iii) a matriz biocompatível compreende poros, (iv) a matriz biocompatível apresenta uma porosidade de pelo menos 80%, e (v) pelo menos 50% de PDGF é liberado em 24 horas; em que é uso na ligação de um tendão em uma lesão que não envolve um osso.

2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma matriz biocompatível e um fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), em que: (i) o PDGF está presente como uma solução e a concentração de PDGF na solução é de 0,1 mg/mL a 2,0 mg/mL, (ii) a matriz biocompatível é homogênea e compreende: (a) colágeno ou (b) colágeno e um glicosaminoglicano, (iii) a matriz biocompatível compreende poros, (iv) a matriz biocompatível apresenta uma porosidade de pelo menos 80%, e (v) pelo menos 50% de PDGF é liberado em 24 horas; em que é para uso na ligação de um tendão a um osso.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a matriz biocompatível apresenta uma porosidade de pelo menos 85%.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que: (i) os poros apresentam uma área média que varia de 2500 μm2 a 20.000 μm2, e/ou (ii) os poros apresentam um perímetro médio que varia de 200 μm a 600 μm, e/ou (iii) os poros apresentam diâmetros que variam de 1 μm a 1 mm.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que os poros compreendem poros interconectados.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que pelo menos 60% de PDGF é liberado em 24 horas.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a matriz biocompatível é reabsorvida dentro de 21 dias da administração in vivo.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o glicosaminoglicano é sulfato de condroitina.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição é um gel, partícula, pó, lâmina, bloco, pasta, emplastro ou esponja.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição é fluxível.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a matriz biocompatível é COLLATAPE®.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o tendão é selecionado do grupo que consiste em tendão patelar, tendão tibial anterior, tendão de Aquiles, tendão isquiotibial, tendão semitendíneo, tendão grácil, tendão abdutor, tendão adutor, tendão supraespinal, tendão infraespinhal, tendão subescapular, tendão do músculo redondo menor, tendão flexor, tendão reto femoral, tendão tibial posterior e tendão quadríceps femoral.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 12, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso na ligação de um tendão em uma lesão de tendão que não envolve um osso, em que a lesão de tendão ou ligamento é uma ruptura, corte, laceração, delaminação, estiramento, ou deformação de tendão ou ligamento.

14. Kit para (i) ligar um tendão em uma lesão que não envolve um osso em um indivíduo, ou (ii) anexar um tendão a um osso em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro recipiente compreendendo uma matriz biocompatível, em que a matriz biocompatível é homogênea e compreende (a) colágeno ou (b) colágeno e um glicosaminoglicano, e um segundo recipiente que compreende uma solução de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), tendo uma concentração de PDGF de 0,1 mg/mL a 2,0 mg/mL, em que a matriz biocompatível compreende poros, em que a matriz biocompatível apresenta uma porosidade de pelo menos 80%, e em que pelo menos 50% de PDGF é liberado em 24 horas.