CN108697824A - 用于肌腱/韧带骨整合的内源性干细胞激活的方法 - Google Patents

Abstract

肌腱和韧带损伤在整形外科临床实践中是常见的并且在运动和日常每日活动中导致相当大的发病率。虽然手术重建是有效的，但是大部分的患者经受长时间的恢复，这是因为肌腱‑骨界面的再生能力有限。在此，本申请的发明人已经建立了一种用于促进肌腱/韧带整合的方法。通过首先将内源性干细胞募集到损伤部位，然后体内递送骨形态发生蛋白(BMP)以促进修复。经由上述方法和组合物显著加速愈合引起快速恢复和恢复正常活动，从而提供了用于治疗累及肌腱‑骨界面的损伤的新的治疗途径。

Description

用于肌腱/韧带骨整合的内源性干细胞激活的方法

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在政府支持下根据美国国家卫生研究院(The National Institutes ofHealth)的基金号TR000124作出的。政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本文描述了与通过使用超声波进行增强基因递送来进行骨、肌腱以及韧带修复的治疗相关的方法和组合物。

背景

肌腱和韧带损伤在整形外科临床实践中是常见的并且在运动和日常每日活动中导致相当大的发病率。膝关节的前十字韧带(ACL)和肩关节的肩袖被包括在最常受损的软组织结构中。手术重建已经是用于肌腱和韧带损伤的金标准治疗选择方案，其中将肌腱自体移植物或同种异体移植物植入并且附接到骨。尽管外科医生已经能够以可预测的成功率重建韧带，如ACL，但是这些重建的完整性仍取决于韧带与骨之间的界面的充分生物愈合。该界面的愈合是一个漫长的过程，该过程常常引起桥接这两个组织类型之间的间隙的纤维化修复组织的形成。

令人遗憾的是，当通过手术重建这些韧带时，大部分的患者经受长时间的恢复(长达1年)。实现在功能上和生物学上类似于天然解剖结构的肌腱/韧带-至-骨的愈合可能是具有挑战性的，这是因为肌腱-骨界面的再生能力有限。已经提出了几种生物学方法来增强韧带-骨整合。这些策略包括递送骨诱导性生长因子、富含血小板的血浆、编码生长因子的基因的病毒转导、以及基于细胞的治疗。尽管有一些有希望的结果，但是所有这些策略都具有缺点：生长因子由于短暂的半衰期而需要重复注射，病毒载体对于在人类中使用来说可能是危险的，并且可植入的细胞治疗需要复杂的离体操作。此外，生长因子可能是非常昂贵的并且基于细胞的治疗将可能需要USFDA的延长监管程序。鉴于这些障碍，本领域迫切需要一种增强骨-同种异体移植物整合的新的和改进的生物治疗。

先前，本申请的发明人开发了一种程序，所述程序首先涉及可生物降解的支架的手术植入以将内源性干细胞募集到损伤部位，并且使用超声波脉冲来促进成骨基因经皮递送到募集的细胞。这种方法被证明是非常成功的并且在猪模型中的临界尺寸骨缺损中引起完全骨再生。利用这种程序以增强用于ACL重建的同种异体移植物骨整合的这些成功的结果为促进愈合提供了坚实的基础。

本文描述了以下发现，向驻留干细胞进行靶向骨形态发生蛋白(BMP)基因递送在大型动物模型中将增强肌腱同种异体移植物整合到骨中。将所提出的治疗施用于猪膝关节ACL重建模型中的骨-同种异体移植物附着点部位上。在猪ACL重建模型中使用基于超声波的基因递送，利用向内源性干细胞进行的靶向BMP基因递送改善了猪模型中的肌腱同种异体移植物骨整合。由于可以使用胶原支架将内源性间充质干细胞(MSC)募集到骨损伤部位，因此基于超声波的BMP基因递送被证实能够进一步促进骨再生。BMP转基因的瞬时表达足以进行有效的局部骨再生并且向ACL重建骨隧道进行的基于超声波的基因递送在整形外科治疗中提供了显著的新进展。

附图说明

图1：引起加速的肌腱/韧带与骨的整合的两步程序。在第一个步骤中，将内源性干细胞募集到肌腱/韧带-骨界面的部位，并且在第二个步骤中，借助于超声波向募集的干细胞递送成骨基因。

图2：内源性MSC募集到小型猪胫骨骨缺损部位。在小型猪的胫骨中产生1-cm节段性缺损并且植入胶原支架。14天后，使用微泡(MB)将GFP质粒注射到缺损部位，继而施加超声波能量脉冲。5天后，从缺损部位中分离细胞并且进行流式细胞术。本申请的发明人的结果显示约50％的细胞表达MSC标志物。选择第14天作为基因递送的目标日，这是因为在第21天，标志物表达百分比降低(每个时间点n＝3；p＝0.0031)。

图3：在超声波介导的基因递送之后小型猪的胫骨骨缺损中的报告基因表达。图3A：40％-50％的细胞表达GFP(n＝3-4，p<0.05)(US＝超声波)。图3B：转染有GFP的细胞的70％-90％是内源性MSC。使用流式细胞术分析从骨缺损中分离的细胞中GFP和MSC标志物(CD90、CD29以及CD44)的共表达(n＝3-4，**＝p<0.01，***＝p<0.001)。

图4：向猪胫骨骨缺损进行超声波介导的BMP-6基因递送诱导了完全缺损修复。在小型猪胫骨中产生1cm骨缺损并且植入胶原支架(图4A：荧光透视图像显示缺损和固定板；箭头指示骨缺损)。在手术后第14天，向缺损部位注射BMP-6质粒，继而施加超声波脉冲。在基因递送后6周，将动物处死。显微CT定量分析显示，与接受BMP-2或对照处理的缺损相比，在接受BMP-6处理的胫骨缺损中骨体积(图4B)和骨密度(图4C)显著更大。使用正常完整胫骨作为对照。显微CT图像显示BMP-6处理的骨缺损完全愈合(图4D)。(**-p<0.01；***-p<0.001；****-p<0.0001)。[MB＝微泡，US＝超声波]。

图5：BMP-6处理的猪胫骨显示出优越的生物力学特性。在手术之后8周进行扭转测试以研究经过处理的胫骨缺损的机械特性。与接受BMP-2和超声波(“BMP-2+US”组)或单独的BMP-6质粒(“仅质粒”组)处理的胫骨缺损相比，接受BMP-6和超声波处理的胫骨缺损显示出显著更高的刚度、强度、以及韧性。使用正常完整胫骨作为对照。(*-p<0.05；**-p<0.01；***-p<0.001；****-p<0.0001)

图6：展示了如本申请中所述的韧带、骨结构、以及重建的小型猪ACL重建模型。

图7：向ACL重建骨隧道中的内源性MSC进行的超声波介导的转基因递送。使用猪肌腱同种异体移植物重建猪的ACL。在14天后，在荧光透视引导下将GFP质粒注射到骨隧道中，继而向股骨隧道施加超声波(图7A、图7B)。在基因递送后5天进行的FACS分析显示股骨隧道中50％的细胞表达GFP(图7C)。此外，隧道中12％-22％的细胞表达MSC标志物(图7D)(n＝3，*＝p<0.05)。[US＝超声波]

图8：向ACL重建骨隧道中的内源性MSC进行超声波介导的BMP-2基因递送。图8A、图8B：胫骨隧道和股骨隧道中的骨体积和表观密度的定量，显示股骨隧道中的值显著更高(n＝3；*p<0.05，t检验)。图8C、图8D：骨隧道的代表性显微Ct图像。图8E、图8F：显示股骨隧道(图8E)和胫骨隧道(图8F)的小型猪的膝关节的MRI扫描。

图9：向ACL重建骨隧道中的内源性MSC进行超声波介导的BMP-6基因递送。A：隧道中骨体积的定量，显示BMP-6处理的动物中的值显著更高(n＝6；*p<0.05，t检验)。B、C：BMP-6处理的股骨隧道和未处理的股骨隧道的代表性显微CT图像。D：代表性的经过处理的动物的荧光透视三维重建，显示在经过处理的骨隧道周围没有异位骨形成。

图10：BMP-6处理的ACL重建猪显示出优越的生物力学特性。图8A：BMP-6+US处理的猪在±20N下的AP松弛度低于未处理的猪。线性刚度(图8B)和最大破坏载荷(图8C)这两者都显著高于未处理的猪，这表示经过处理的动物的移植物-骨整合更强。(n＝3；*p<0.05，t检验)。

图11：在超声波介导的基因递送之后小型猪的胫骨骨折中的报告基因表达。(图11A)在处理之后五天，暴露的GFP处理的骨折的离体荧光成像。骨折边缘由虚线方框表示。(图11B)在存在或不存在超声波处理的情况下，在处理之后五天，从骨折部位中分离的GFP阳性细胞的百分比的流式细胞术分析。(图11C)在存在或不存在超声波处理的情况下，在处理后五天，每个从骨折中分离的细胞的平均荧光强度。(图11D)在存在或不存在超声波的情况下，在处理之后五天，从骨折部位中分离的细胞中的荧光素酶的酶活性。在存在或不存在超声波处理的情况下，在处理之后五天，从骨折中分离的GFP阳性细胞中的(图11E)CD29阳性细胞、(图11F)CD90阳性细胞以及(图11G)CD44阳性细胞。(“无US”组：n＝3；“US”组：n＝4；*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001；US＝超声波，GFP＝绿色荧光蛋白，RLU＝相对光单位)。

图12：在向骨折部位进行超声波介导的基因递送之后BMP-6的表达。在超声波介导的BMP-6基因递送之后2天、5天以及10天，胫骨骨折部位中的(图12A)基因(相对定量(RQ))和(图12B)蛋白质表达。(每个实验组n＝3；US＝超声波；*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001)

图13：向小型猪的胫骨骨折进行超声波介导的BMP-6基因递送。胫骨骨折中骨形成的定量分析，包括(图13A)骨体积密度和(图13B)表观密度。(图13C)在手术之后8周，骨折的代表性μCT切片。星号表示骨折内新的骨形成。箭头指向皮质不连续性，这表明骨折内的骨折不愈合。自体移植物边缘由虚线方框表示。(图13D)在黄色方框的低放大倍数(上部子图)和高放大倍数(下部子图)下，在手术后八周胫骨骨折的马松三色染色(Masson'strichrome staining)。箭头指向骨折中原生骨与新形成的骨之间的边界。比例尺：1mm。(US＝超声波；自体移植物：n＝7；BMP-6+US：n＝8；仅BMP-6：n＝6；仅US：n＝3；仅支架：n＝4；**p<0.01，***p<0.001)。

图14：经过处理的胫骨的生物力学特性。对收获的胫骨进行扭转测试。(图14A)安装的胫骨达到它的破坏点。进行载荷和旋转分析以确定经过处理的骨的(图14B)强度、(图14C)刚度以及(图14D)韧性(US＝超声波，N.m＝牛顿米；每个实验组n＝5；*p<0.05，**p<0.01)。

图15：所提出的治疗。超声波介导的微泡增强的骨形态发生蛋白基因递送诱导了临界尺寸的骨折的快速和有效的再生。

图16：尤卡坦小型猪的胫骨中的临界尺寸骨折模型。(图16A)在手术期间，在前内侧暴露胫骨并且通过从骨干去除1cm的骨(示于右下方插图中)来产生骨折(由白色箭头表示)。使用定制的6孔限制接触动态压缩板使骨折的骨稳定。(图16B)稳定化的胫骨(箭头)的手术后荧光透视图像。(图16C)在手术后14天，在施加超声波之后立即对骨折进行的显微计算机断层扫描(骨折部位由虚线方框表示)。

图17：内源性间充质祖细胞募集到小型猪胫骨骨折部位。在手术后7天、14天以及21天，来自胫骨骨折部位的(图17A)CD29阳性细胞和(图17B)CD90阳性细胞的流式细胞术分析(每个时间点n＝3；**p<0.01)

图18：超声波处理设置。(图18A)骨折部位的荧光透视成像。在骨折部位的中心看到针。(图18B)将DNA和微泡混合物注射到骨折部位中。将超声波探头放置在针的附近以将注射的混合物最佳可视化。(图18C)骨折部位(由黄色虚线方框标记)的B型超声波可视化。胫骨的皮质由红色虚线标记。(图18D)在DNA和微泡注射期间骨折部位(黄色虚线方框)的超声波造影剂成像。胫骨的皮质由红色虚线标记。

图19：在超声波介导的基因递送之后BMP-6表达的生物分布。与未处理的动物相比，在超声波介导的BMP-6处理之后2天和10天，各种器官中的BMP-6基因表达。(BM＝骨髓；每个时间点n＝3)。

发明内容

本文描述了一种促进骨整合的方法，所述方法包括在包括以下各项的界面的组织部位处施用药剂：(i)骨和(ii)肌腱或韧带，以及在所述组织部位处递送编码一种或多种蛋白质的一种或多种载体，其中所述组织部位处的细胞表达所述一种或多种蛋白质，从而促进骨整合。在其他实施方案中，所述药剂能够将干细胞募集到所述组织部位。在其他实施方案中，所述药剂是支架。在其他实施方案中，所述支架包括胶原。在其他实施方案中，所述组织部位包括一个或多个骨隧道。在其他实施方案中，递送一种或多种载体包括注射。在其他实施方案中，递送一种或多种载体包括超声波。在其他实施方案中，所述一种或多种蛋白质包含骨形态发生蛋白(BMP)。在其他实施方案中，所述BMP包含骨形态发生蛋白-6(BMP-6)。在其他实施方案中，所述BMP包含骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。在其他实施方案中，其中使用计算机断层(CT)扫描测量骨整合。在其他实施方案中，使用磁共振(MR)成像测量骨整合。在其他实施方案中，所述组织部位包括受损组织。在其他实施方案中，受损组织包括前十字韧带、后十字韧带、膝关节和肘关节的内侧副韧带、膝关节和肘关节的外侧副韧带、以及肩袖肌腱撕裂。在其他实施方案中，受损组织已经被重建。在其他实施方案中，所述重建包括自体移植和/或同种异体移植。

本文还描述了一种试剂盒，所述试剂盒包括可生物降解的药剂、编码一种或多种蛋白质的一种或多种载体、微泡溶液、以及使用说明书。在其他实施方案中，所述药剂能够将干细胞募集到组织部位。在其他实施方案中，所述药剂是支架。在其他实施方案中，所述支架包括胶原。在其他实施方案中，所述一种或多种蛋白质包含骨形态发生蛋白(BMP)。在其他实施方案中，所述BMP包含骨形态发生蛋白-6(BMP-6)。在其他实施方案中，所述BMP包含骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。

具体实施方式

本文引用的所有参考文献以引用的方式整体并入本文，就如同被完全阐述一般。除非另外定义，否则本文所用的技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。Allen等人,Remington:The Science and Practice ofPharmacy第22版,Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等人,Introductionto Nanoscience and Nanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版,修订版,J.Wiley&Sons(纽约州的纽约(New York,NY)2006)；Smith,March's Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure第7版,J.Wiley&Sons(纽约州的纽约2013)；Singleton,Dictionary of DNA and Genome Technology第3版,Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4版,ColdSpring Harbor Laboratory Press(纽约州的冷泉港(Cold Spring Harbor,NY)2012)为本领域技术人员提供了本申请中所用的许多术语的一般指导。关于如何制备抗体的参考文献，参见Greenfield,Antibodies A Laboratory Manual第2版,Cold Spring HarborPress(纽约州的冷泉港,2013)；和Milstein,Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976年7月,6(7):511-9；Queen和Selick,Humanized immunoglobulins,美国专利号5,585,089(1996年12月)；以及Riechmann等人,Reshaping human antibodies for therapy,Nature1988年3月24日,332(6162):323-7。

本领域技术人员将认识到与本文所述的那些相似或等同的可以用于实施本发明的许多方法和材料。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义于下文中。

除非上下文另外明确规定，否则如在本文的说明中以及在随后的整个权利要求书中所用的“一个(种)(a/an)”和“所述”的含义包括复数指代对象。此外，除非上下文另外明确规定，否则如本文的说明中所用的“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。

肌腱和韧带损伤在整形外科临床实践中是常见的并且在运动和日常每日活动中导致相当大的发病率。ACL和肩袖被包括在最常受损的软组织结构中。肩袖断裂是最常见的退行性肌腱损伤并且作为多因素病症主要发生在年龄较大的患者中，所述多因素病症表现疼痛和活动范围受限的主要症状。尽管有症状的肩袖损伤的精确患病率是未知的，但是它可能在5％至30％的范围内。在老年供体的尸体研究中，全厚度撕裂的患病率已经被估计为高达30％。肩袖修复是最常见的整形外科程序之一并且或许是所有肩关节手术中最常见的。每年通过手术修复200,000例至300,000例肩袖，具有15％-20％的失败率。ACL是生理性膝关节活动的最重要的稳定器。ACL损伤仅在美国就有超过200,000例的每年发病率，每年重建这些膝关节中的约100,000例。ACL损伤在15岁-45岁的患者中最为普遍(1,750个人中有1例)。在这个年龄组中更常见的部分原因是他们更积极的生活方式以及更高的运动参与度。参与如英式足球、足球、以及篮球的高需求运动的运动员更可能损伤他们的ACL。ACL损伤可能是毁灭性的，特别是对于年轻的运动员来说，其中在没有手术重建ACL的情况下往往不可能在剧烈运动中高水平参与。此外，膝关节骨关节炎(OA)的长期发展是常见的。最近的具有12年随访的研究显示，在ACL重建手术之后约50％的患者患有OA。在随访时患者的平均年龄是31岁。在这个年龄段，对于有症状的骨关节炎性膝关节没有良好的治疗选择方案。因此，重要的是，开发用于肌腱与骨愈合的新的方法，旨在维持长期健康和生活质量这两者。

手术重建已经是用于肌腱和韧带损伤的金标准治疗选择方案。在该程序期间，植入自体肌腱或同种异体肌腱以置换受损的韧带。成功的肌腱与骨的愈合对于恢复关节的功能和稳定性是关键的。然而，该愈合过程缓慢发生并且在一些情况下，不完全发生，从而导致不佳的移植物-骨整合，这会导致结构不稳定性和发病。在过去的十年中，已经使用生长因子和基于细胞的治疗来研究以生物学方法加速和改善肌腱与骨的愈合的策略。这些策略包括递送骨诱导性生长因子、富含血小板的血浆、编码生长因子的基因的病毒转导、以及基于细胞的治疗。特别是，研究了骨形态发生蛋白(BMP)以增强肌腱在骨隧道中的整合。然而，BMP是非常高成本的，并且最近因副作用的高发生率而受到严格审查，这可能是因为它们以大剂量使用。

肌腱与骨的连接处愈合缓慢，这是因为纤维软骨区域的相对无血管性和损伤部位处的骨质流失。为了克服这种具有挑战性的环境，可以使用骨祖细胞(主要是间充质干细胞(MSC))与生长因子(主要是BMP)的组合作为强效的骨诱导剂以实现更好的附着点和改善的肌腱与骨的愈合。在一系列出版物中，本申请的发明人证实被工程化以过表达不同的BMP基因的MSC可以分化并且有助于体内骨形成过程，从而引起节段性缺损的完全再生。然而，这种方法需要几个步骤，即细胞分离、扩增、以及工程化，这使临床使用变得复杂并且延长了临床使用的监管途径。替代的靶向基因治疗方法将是在驻留在附着点部位处的MSC中过表达成骨基因，如BMP。这是一种有吸引力的方法，这是因为它引起生理水平的BMP蛋白的瞬时分泌并且它不需要收获细胞或移植物或产生高成本的试剂，如重组蛋白。然而，基因表达的效率与将基因运送到目标部位的载体强相关。多年来已经开发了和测试了一系列广泛的基因递送方法用于骨再生。毫无疑问的是，病毒载体是最有效的基因递送工具，但是它们的效率被致瘤性和免疫原性响应的潜在风险所抵消。非病毒载体被认为对人类使用更安全，尽管对于基因表达的效率低得多。为了提高体内非病毒基因递送的效率，开发了依靠短脉冲能量的方法。这些方法诱导细胞膜中瞬时纳米级孔隙的形成，这使得能够摄取DNA，从而引起细胞转染。细胞穿孔可以通过电脉冲、超声波、或激光能量来诱导。

超声波在临床中广泛用于各种不同的目的，如成像、碎石术、以及肿瘤消融。已经进行临床前研究来研究超声波介导的基因治疗的可能性。这种递送方法被称作声致穿孔，是一种有吸引力的方法，这是因为它引起瞬时的基因表达并且不需要潜在致瘤性和免疫原性病毒载体或侵入性电穿孔。由于超声波应用可以局限于所关注的区域，因此可以特异性地对深部组织进行声致穿孔而有最小的全身作用。大部分的声致穿孔研究已经将质粒DNA与微泡(MB)组合以经由微泡体积波动和/或塌缩的效应来提高膜渗透性。实际上，先前的尝试已经证实了使用体内细胞穿孔和编码BMP基因的质粒的直接递送来诱导骨形成的可行性。然而，这些研究都没有在骨损伤部位中进行。

在本领域中迫切需要一种新的和改进的生物治疗，其目的在于解决当前在治疗韧带和肌腱损伤方面未满足的临床需求。膝关节的前十字韧带(ACL)损伤将可以用作优良的实验模型。据报道，每年在美国进行至少100,000例-200,000例ACL重建。ACL重建与所有膝关节韧带重建一样，需要将自体或同种异体组织植入到在胫骨和股骨处钻出的骨隧道中。令人遗憾的是，当通过手术重建这些韧带时，并不罕见的是，这些患者中有许多经历长时间的康复(长达约1年)。一个关键因素，特别是在软组织移植物重建的环境下，是移植物在肌腱-骨界面处充分和及时的整合。ACL移植物整合到宿主骨中的生物学是指导早期康复锻炼限制的主要原则。此外，已知的是，与自体移植物重建相比，同种异体移植物ACL重建的结合被延迟。美国运动医学整形外科学会(American Orthopaedic Society for SportsMedicine，AOSSM)已经估计，仅在2005年就有约60,000个同种异体移植物被用于膝关节重建程序中。鉴于此，开发具有能够加速移植物整合的能力的新的治疗干预将具有巨大的临床影响，并且进而，这些干预可以转化为患者经历更快速恢复至不受限制的活动。

已经提出了几种生物学方法来增强韧带-骨整合。这些策略包括递送骨诱导性生长因子、富含血小板的血浆、编码生长因子的基因的病毒转导、以及基于细胞的治疗。举例来说，一些研究已经报道了向韧带/肌腱-骨界面递送病毒载体，从而编码骨形态发生蛋白(BMP)或环加氧酶2。在一些情况下，其中将重组人类BMP注射到肌腱自体移植物中诱导异位骨形成的两步程序用作ACL重建模型中的实验性附着点。尽管有一些有希望的结果，但是所有这些策略都具有多个缺点，包括：生长因子由于它们的短暂的半衰期而需要重复注射，病毒载体对于在人类中使用来说可能是危险的，并且可植入的细胞治疗需要复杂的离体操作。此外，重组蛋白可能是非常昂贵的并且基于细胞的治疗将可能需要USFDA的延长监管和批准程序。

一种有吸引力的替代方案将是向韧带-骨连接的部位非病毒递送成骨基因。令人遗憾的是，病毒载体比大部分非病毒方法有效得多。为了提高体内非病毒基因递送的效率，已经开发了依靠短脉冲能量来优化基因递送的方法。这些方法诱导细胞膜中瞬时纳米级孔隙的形成，这使得能够摄取DNA，从而引起细胞转染。该细胞穿孔可以通过电脉冲、超声波、或激光能量来诱导。

本申请的发明人的小组已经研究了向内源性干细胞进行靶向超声波介导的基因递送的潜能。使用两步程序，其中本申请的发明人首先将可生物降解的支架植入到骨缺损中以将内源性干细胞募集到损伤部位。在这之后是施用短脉冲能量(电或超声波)以将本申请的发明人所关注的基因递送到募集的细胞中。这种方法在啮齿类动物模型中引起靶向骨再生。本申请的发明人已经证实，宿主祖细胞迁移到支架植入部位，然后变成在指定位置处转基因递送的靶标。随后，本申请的发明人能够证实，类似的方法已经在小型猪胫骨模型中引起完全骨缺损再生。

这些结果代表了使用超声波介导的基因递送靶向损伤部位处的骨形成的第一次成功验证。这种方法具有几个优点：1.它引起特定位置处加速的骨形成并且因此可以增强韧带-骨整合；2.它不需要重复递送高成本的生长因子，如重组BMP；3.它不需要离体干细胞操作；4.它容易转化为临床环境，这是因为它需要在临床上已经广泛使用的超声波系统；5.所述技术是安全的并且仅需要转基因的瞬时表达以诱导骨形成(不需要病毒载体或持续的DNA整合)。

所提出的治疗方法对于增强韧带/肌腱整合到骨中具有巨大的潜能。所提出的治疗背后的生物学已经被证实，特别侧重于内源性祖细胞的作用而无需离体操作。因此，该技术的下一个合理应用是在用作人类临床试验的前体的大型动物模型中。鉴于超声波技术被广泛整合到常规患者护理中，本申请的发明人认为该项目将容易转化为临床实践。应当指出的是，在此描述的局部内源性引导的分化适用于所有韧带/肌腱重建，包括多韧带膝关节损伤和肩袖肌腱修复，尽管存在现代修复技术，但是这些仍然与高复发性撕裂率有关。

可以通过使用体内细胞穿孔将BMP直接转染到内源性MSC中来促进节段性骨缺损的完全修复。内源性干细胞可以使用胶原支架的植入被募集到缺损部位并且可以作为基因递送的靶标。此外，可以相同的方式使用超声波以将所关注的基因递送到骨空隙和骨折部位中。最终，这种超声波方法可以用于在大型动物模型中使节段性骨折完全愈合。组合这些特征，两步程序可以引起加速的肌腱/韧带与骨的整合。在第一个步骤中，将内源性干细胞募集到肌腱/韧带-骨界面的部位，并且在第二个步骤中，借助于超声波向募集的干细胞递送成骨基因。组合在一起的这些特征可以建立用于在肌腱重建手术后增强移植物-骨整合、恢复的功能以及控制的方法。干细胞、超声波、以及基因递送的组合使用可以为患有肌肉骨骼系统中的软组织结构损伤的各种患者提供大量益处。

本文描述了一种促进骨整合的方法，所述方法包括在包括以下各项的界面的组织部位处施用药剂：(i)骨和(ii)肌腱或韧带，以及在所述组织部位处递送编码一种或多种蛋白质的一种或多种载体，其中所述组织部位处的细胞表达所述一种或多种蛋白质，从而促进骨整合。在其他实施方案中，所述药剂能够将干细胞募集到组织部位。在其他实施方案中，所述药剂是支架。在其他实施方案中，所述支架包括胶原。举例来说，将在骨隧道处植入所述胶原支架。在其他实施方案中，所述组织部位包括一个或多个骨隧道。在其他实施方案中，递送一种或多种载体包括注射。在其他实施方案中，递送一种或多种载体包括超声波。在各种实施方案中，将所述一种或多种载体(包括DNA载体，如质粒)与微泡混合。举例来说，在一些实施方案中，递送载体可以包括一次注射最多1mg悬浮在10⁷个微泡中的编码骨形态发生蛋白(BMP)的质粒。在其他实施方案中，质粒的量包括约0.1mg-0.25mg、约0.25mg-0.50mg、约0.5mg-1.0mg、约1.0mg-1.5mg、约1.5mg-2.0mg或2mg或更多。在其他实施方案中，所述量的质粒悬浮在10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个或更多个微泡中。在其他实施方案中，BMP质粒应当在两周的时间内每天产生数纳克蛋白质的分泌。在各种实施方案中，递送一种或多种载体可以包括多次施用。举例来说，在基于成像和功能改善证实部分响应之后3个月至6个月内任选的重复治疗过程。在其他实施方案中，将以经皮方式施加超声波脉冲。在其他实施方案中，所述一种或多种蛋白质包含骨形态发生蛋白(BMP)。在其他实施方案中，所述BMP包含骨形态发生蛋白-6(BMP-6)。在其他实施方案中，所述BMP包含骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。在其他实施方案中，使用计算机断层(CT)扫描测量骨整合。在其他实施方案中，使用磁共振(MR)成像测量骨整合。举例来说，与标准护理相比，骨整合和骨整合的改善可以通过观测到以下来测量：骨隧道部位处新骨形成速率增加，如通过CT扫描所示；以及骨隧道部位处骨体积和密度增加，如通过MR成像所示；或移植物与骨的整合速率增加，而没有异常或过度骨形成。在其他实施方案中，所述组织部位包括受损组织。在其他实施方案中，受损组织包括前十字韧带、后十字韧带、膝关节和肘关节的内侧副韧带、膝关节和肘关节的外侧副韧带、肩袖肌腱撕裂。在其他实施方案中，受损组织已经被重建。在其他实施方案中，所述重建包括自体移植和/或同种异体移植。多个终点可以证实与重建手术相关的改善的骨整合。举例来说，在膝关节韧带重建中：能够比对照更早地恢复到进行涉及变向和旋转活动的运动的患者比例。本申请的发明人还将评估患者报告的结果分数的改善(根据滕纳尔活动水平量表(Tegner Activity Level Scale)和马克思活动量表(Marx Activity Scale))。这将包括根据用于重建的移植物来源(解剖供体部位)以及移植物是否是同种异体的来将结果分层。遭受复发性膝关节韧带损伤的患者的比例。具有能够使用患肢进行单肢敏捷性运动达到对于使用对侧未受损伤的肢体进行相同任务所测量的值的80％或更大的水平的能力的患者比例(例如单腿跳跃测试、Y平衡测试、功能性运动筛查)。或者，在肩袖肌腱修复中：本申请的发明人将评估患者报告的结果分数(美国肩肘学会肩评估分数(AmericanShoulder and Elbow Society Shoulder Assessment score))、客观手运动强度测试以及有效运动范围测试的改善。在这些情况下，用于证实功效的标准可以包括能够比对照更早地恢复到涉及变向和旋转的活动的患者比例的测量。或者，可以测量能够恢复日常生活活动而没有显著的疼痛、虚弱或活动范围限制的患者比例。

本文描述了一种骨折修复方法，所述方法包括在骨折部位处递送编码一种或多种蛋白质的一种或多种载体，其中所述骨折部位处的细胞表达所述一种或多种蛋白质，从而促进骨折的修复。在其他实施方案中，在递送所述一种或多种载体之前在骨折部位处施用药剂。在其他实施方案中，所述药剂能够将干细胞募集到组织部位。在其他实施方案中，所述药剂是支架。在其他实施方案中，所述支架包括胶原。

在其他实施方案中，递送一种或多种载体包括注射。在其他实施方案中，递送一种或多种载体包括超声波。在各种实施方案中，将所述一种或多种载体(包括DNA载体，如质粒)与微泡混合。举例来说，在一些实施方案中，递送载体可以包括一次注射最多1mg悬浮在10⁷个微泡中的编码骨形态发生蛋白(BMP)的质粒。在其他实施方案中，质粒的量包括约0.1mg-0.25mg、约0.25mg-0.50mg、约0.5mg-1.0mg、约1.0mg-1.5mg、约1.5mg-2.0mg或2mg或更多。在其他实施方案中，所述量的质粒悬浮在10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个或更多个微泡中。在其他实施方案中，BMP质粒应当在两周的时间内每天产生数纳克蛋白质的分泌。在各种实施方案中，递送一种或多种载体可以包括多次施用。举例来说，在基于成像和功能改善证实部分响应之后3个月至6个月内任选的重复治疗过程。在其他实施方案中，将以经皮方式施加超声波脉冲。在其他实施方案中，所述一种或多种蛋白质包含骨形态发生蛋白(BMP)。在其他实施方案中，所述BMP包含骨形态发生蛋白-6(BMP-6)。在其他实施方案中，所述BMP包含骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。

在其他实施方案中，所述骨折修复是适于用移植物治疗的骨折。这包括例如包括大于1cm的间隙的骨移植物。这还包括长骨，如胫骨、腓骨、股骨，而且还包括其他骨骼，如下颌骨、颅面骨、以及脊柱。

本文描述了一种增强组织部位处的基因递送的方法。在各种实施方案中，所述方法包括在组织部位处递送编码一种或多种蛋白质的一种或多种载体，其中递送包括超声波和微泡成像以及持续施加超声波直到相当大部分的微泡已经消散为止，从而增强组织部位处的基因递送。在其他实施方案中，在递送所述一种或多种载体之前在骨折部位处施用药剂。在其他实施方案中，所述药剂能够将干细胞募集到组织部位。在其他实施方案中，所述药剂是支架。在其他实施方案中，所述支架包括胶原。

在其他实施方案中，递送一种或多种载体包括注射。在各种实施方案中，所述一种或多种载体可以在与微泡的混合物中，包括DNA载体，如质粒。举例来说，注射DNA和微泡的混合物，同时使用超声波单元成像。在各种实施方案中，施加超声波脉冲以使相当大部分的微泡消散，其中相当大部分包括大于50％、60％、70％、80％、90％或更多的微泡。在各种实施方案中，超声波包括具有约1.0MHz、1.1MHz、1.2MHz、1.3MHz、1.4MHz、1.5MHz的传输频率的超声波脉冲。在各种实施方案中，超声波包括约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的机械指数。在各种实施方案中，超声波包括约1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm或8cm的深度。在各种实施方案中，超声波包括施加约30秒-60秒、约1分钟至2分钟、2分钟-3分钟、3分钟-4分钟、以及4分钟-5分钟。在各种实施方案中，超声波包括具有1.3MHz的传输频率、0.6的机械指数、以及4cm的深度的超声波脉冲，持续约2分钟直到所有可视化的微泡破裂为止。在另一个实例中，应用相同的参数，其中机械指数是1.2并且深度是3cm。在各种实施方案中，增强基因递送包括与不包括微泡成像和持续施加超声波的技术相比，表达提高了10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％或更多。

实施例1

总论

早期的研究已经证实了使用体内细胞穿孔和编码BMP基因的质粒的直接递送进行骨诱导的可行性。然而，这些研究都没有在骨损伤部位处进行。本申请的发明人先前的研究已经确定了节段性骨缺损可以通过使用细胞穿孔进行直接BMP转染来完全修复。

不受任何具体理论所束缚，在此提出，为了实现有效的、靶向的骨再生非病毒基因递送，这应当与缺损部位处内源性间充质干细胞(MSC)的存在相配合。出于这个目的，在骨缺损部位处植入胶原支架。随后，本申请的发明人在支架植入之后不同的时间点分析侵入并且填充支架的细胞。在支架植入之后10天(在大鼠模型中)和14天(在猪模型中)之后，海绵状物基本上被宿主祖细胞侵入(还参见图1-图2)。在第二个步骤，本申请的发明人尝试向迁移到骨缺损部位的祖细胞递送在微泡(MB)中混合以提高转染效率的报告基因。在荧光透视引导下将荧光素酶质粒或GFP质粒注射到在大鼠的椎骨和小型猪的胫骨中产生的骨缺损。本申请的发明人使用体内生物发光成像来监测经过处理的大鼠中的转基因表达。使用流式细胞术来定量猪胫骨骨缺损处转染有GFP的细胞的百分比。本申请的发明人的结果显示，荧光素酶表达直到处理后第35天被检测到，然后完全衰减。转基因表达的这种瞬时性质是有利的，这是因为它降低了靶组织类型的异位生长或过度生长的风险并且因为持续转导将对最终的人类临床试验提出显著的监管挑战。

实施例2

检测表达体内递送的转基因的细胞

在小型猪胫骨缺损模型中，本申请的发明人可以证实，在处理后5天，骨缺损内40％-50％的细胞表达GFP(图3A)。此外，本申请的发明人的流式细胞术结果表明，70％的转染细胞表达已知的MSC标志物(图3B)。

实施例3

骨形态发生蛋白(BMP)促进骨再生

使用上述小型猪骨缺损模型，本申请的发明人尝试递送编码BMP蛋白的基因以诱导骨再生(图4)。基于证实BMP-6在MSC中过表达会引起体内骨形成加速的相关研究，本申请的发明人使用BMP-2或BMP-6以评价它们在骨再生方面的功效。如先前所述，第一个步骤包括将胶原支架植入1cm胫骨节段性缺损中。在十四天后，本申请的发明人注射与MB预混合的1mg编码BMP-6(“BMP-6+US”组)或BMP-2(“BMP-2+US”组)的质粒DNA。随后，本申请的发明人使用临床超声波机器(Sonos 5500，Phillips)向缺损区域经皮施加超声波脉冲。为了正确评价BMP基因和超声波的协同作用，使用以下对照组：仅注射与MB预混合的BMP-6质粒(“仅质粒”组)；注射与MB预混合的空质粒载体并且暴露于超声波(“仅US”组)；以及仅接受手术程序的非处理猪(“仅支架”组)。还将这些组与它们保持完整的对侧胫骨相比较。在缺损形成后八周(处理后六周)，将猪处死并且使用显微CT分析来定量缺损部位处的骨形成。结果显示，在被BMP-6质粒转染的骨缺损中，以更高的表观密度(p<0.01)形成显著更多的骨(p<0.0001)。接受BMP-6处理的所有缺损都完全愈合，而BMP-2处理的缺损或对照中无一者愈合。

实施例4

BMP添加的生物化学研究

根据显微CT分析结果，对经过处理的骨的进一步生物力学分析揭示了接受BMP-6处理的缺损的机械优越性。接受BMP-6和超声波处理的胫骨缺损和完整胫骨比接受BMP-2和超声波处理的胫骨或仅质粒对照显著更硬、更强以及更具韧性(p<0.05)(图5)。在完整胫骨与BMP-6和超声波处理的胫骨之间没有发现刚度的显著差异(p>0.05)，这进一步证实了BMP-6和超声波处理的胫骨的优越的生物力学特性。

实施例5

侧重于骨肌腱界面处的骨整合

关注的是了解这些结果是否可以应用于开发用于加速ACL重建模型中的同种异体移植物-骨整合的类似方法。本申请的发明人认为，BMP蛋白可以用于增强肌腱同种异体移植物的骨整合。当与非病毒基因递送相比时，经由重组蛋白和病毒载体递送这类因子具有它们相关的警告。尽管有这些有希望的方法，但是尚未证实，非病毒方法在参考ACL重建模型时可以诱导相似的结果。

在此，本申请的发明人首先从非存活手术中收获了猪屈肌腱。将猪肌腱送到Veterinary Transplant Services公司以进行细菌学测试并且制备无菌同种异体移植物。随后，使用小型猪模型进行ACL重建。在小型猪中横切ACL之后，将先前制备的同种异体移植物植入具有皮质螺钉固定的股骨隧道和胫骨隧道中(图6)。重要的是，还在胫骨隧道和股骨隧道内同种异体移植物组织的两端处植入胶原支架(DuraGen，Integra LifeSciences)。

在操作后十四天，本申请的发明人在荧光透视引导下将悬浮在MB中的GFP质粒注射到股骨隧道和胫骨隧道这两者中(图7A)。随后，仅对股骨隧道施加经皮超声波(图7B)。在五天后，将小型猪处死并且使用流式细胞术分析来自骨隧道内的细胞。本申请的发明人的结果显示，股骨隧道中约50％的细胞表达GFP(图7C)。本申请的发明人还注意到，骨隧道中12％-22％的细胞表达MSC标志物(图7D)。

实施例6

侧重于骨肌腱界面处的骨整合

不受任何具体理论所束缚，本申请的发明人提出了，在大型动物模型中使用向驻留干细胞进行的靶向BMP基因递送来增强肌腱同种异体移植物整合到骨中(图8)。

在横切原生ACL之后，可以使用屈肌腱同种异体移植物重建小型猪的ACL，然后将所述同种异体移植物插入胫骨和股骨处的骨隧道中，如图6中所示。将移植物的胫骨部分和股骨部分用胶原支架包裹，以将宿主祖细胞募集到骨隧道部位。在手术后两周，在荧光透视引导下将悬浮在MB中的BMP基因注射到ACL重建骨隧道中(图7A)。在这之后，对隧道施加超声波脉冲以促进治疗性基因细胞内递送到填充植入的支架的宿主局部MSC中。这引起增强的ACL移植物整合到宿主骨中(图7B)。

使用向内源性干细胞进行的超声波介导的基因递送以增强肌腱同种异体移植物-骨愈合可以为患有肌肉骨骼系统中的软组织结构损伤的各种患者提供大量益处。

实施例7

研究设计

本申请的发明人的研究的目的是开发一种新型治疗，其由超声波介导的对内源性MSC的基因靶向组成以用于临界尺寸骨折修复。本申请的发明人预先指定的假设是，超声波介导的微泡增强的BMP-6基因的基因递送将在临床相关的大型动物模型中引起有效的骨再生和骨折愈合。在本研究中使用雄性和雌性尤卡坦小型猪(S&S Farms)。动物的平均体重±SD是37.0kg±3.6kg并且它们的平均年龄±SD是7.8±1.2个月大。所用的样本量被估计为使用单因素方差分析实现0.8的功效和α＝0.05。

研究声致穿孔使临界尺寸胫骨骨折再生的能力。猪接受手术并且在它们的胫骨中产生1cm临界尺寸的骨折。将胶原支架植入骨折部位内以募集内源性MSC。在十四天后，将猪随机分配为接受处理或分配到对照组之一中，所述处理由以下组成：将与微泡预混合的BMP-6质粒注射到骨折部位，继而施加超声波(“BMP-6+US”组)。使用以下对照组：1)无处理(“仅支架”组)；2)注射与微泡预混合的BMP-6质粒(“BMP-6”组)；或3)注射与微泡预混合的空质粒载体，继而施加超声波(“仅US”组)。此外，使用接受自体移植物处理的对照组(“自体移植物”组)来与用于大骨折的金标准治疗相比评估本申请的发明人的治疗功效。使用报告基因表达以及对BMP-6基因和蛋白质表达的组织分析来估计声致穿孔效能。使用显微计算机断层扫描、组织学以及生物力学测试来评估骨形成。在随访期间产生损害动物福利的急性手术并发症，如骨固定失败或痛苦迹象的动物被排除在所述研究之外。

实施例8

质粒DNA产生

使用在泛素启动子(pUb-Luc2)控制下编码荧光素酶2以及在巨细胞病毒启动子(pCMV-EGFP-N1)控制下编码增强绿色荧光蛋白的质粒研究转基因表达。使用在巨细胞病毒启动子(pCMV-BMP6)控制下编码BMP6的质粒来诱导骨再生。质粒制备详述于其他地方。将所有质粒使用标准实验室程序扩增并且使用EndoFree试剂盒(加利福尼亚州瓦伦西亚的Qiagen(Qiagen,Valencia,CA))纯化。

实施例9

临界尺寸胫骨骨折模型：手术程序

所有动物程序都由西达-赛奈医疗中心(Cedars-Sinai Medical Center)的动物实验机构审查委员会批准。按照先前描述的方法在尤卡坦小型猪的胫骨中产生1cm长度的临界尺寸周缘骨缺损。人类中的临界尺寸缺损被定义为累及胫骨的皮质直径的50％并且长度>1cm。胫骨的平均长度在尤卡坦小型猪中是10cm，并且在成人中，它是43cm。因此，小型猪中的1-cm缺损可以与普通人中的4.3cm缺损相匹敌。在18小时手术前禁食之后，使用肌内乙酰丙嗪(acepromazine)(0.25mg/kg)、氯胺酮(ketamine)(20mg/kg)以及阿托品(atropine)(0.02mg/kg-0.05mg/kg)使每一只小型猪镇静。然后向动物静脉内施用丙泊酚(propofol)(2mg/kg)并且进行气管插管术。在程序的持续时间内使用1-3.5％的吸入异氟烷(isoflurane)维持麻醉。在胫骨上制作10-cm前内侧皮肤切口。钝性解剖软组织和骨膜以暴露胫骨骨干。使用摆锯(佛罗里达州拉哥的ConMed(ConMed,Largo,FL))去除1cm的骨并且产生节段性骨折。使用定制的6孔限制接触动态压缩板(佛罗里达州圣奥古斯丁的VeterinaryOrthopedic Implants(Veterinary Orthopedic Implants,St.Augustine,FL)；图16)在内部固定骨折，并且将具有100μm的孔径的可生物降解的胶原支架(DuraGen Matrix，IntegraLifeSciences)的平片成形并且植入骨折部位中。对于自体移植物处理的动物，将切除的骨段移植到骨折中并且使用固定板固定。最终，用可吸收的皮下缝合线封闭皮下组织并且使用不可吸收的缝合线封闭皮肤，在手术之后两周将其去除。动物接受围手术期抗微生物预防(头孢噻呋(ceftiofur)，0.05ml/kg)和手术后镇痛(丁丙诺啡(buprenorphine)，0.2mg/kg)。

实施例10

募集到骨折部位的细胞的流式细胞术表征

九只动物接受手术并且被麻醉并且在手术后第7天、第14天以及第21天通过注射兽医用安乐死溶液(爱达荷州博伊西的Vetone(Vetone,Boise,ID))来处死。在死后，将组织从骨折部位中提取，用PBS洗涤，使用0.1％胶原酶(1A型，密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))消化1小时，使用70μm细胞过滤器过滤并且以2000rpm离心7分钟。考虑到抗猪抗体的有限可用性，分析新鲜分离的细胞的MSC表面标志物。将细胞用小鼠抗人类(对猪具有交叉反应性)CD90和小鼠抗猪CD29(加利福尼亚州圣地亚哥的BD Biosciences Pharmingen(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA))染色。通过根据制造商的建议，施用荧光染料缀合的二抗大鼠抗小鼠-PE(BD BiosciencesPharmingen)来检测这两种一抗。使用LSR-II流式细胞仪、BD FACSDiva、以及FCS Express软件(德国海德堡的BD(BD,Heidelberg,Germany))分析细胞并且作图。定量二抗的非特异性结合，并且将荧光信号从实验组的检测值中减去。

实施例11

超声波介导的微泡增强的基因递送

在产生骨折、植入支架以及骨稳定化后十四天，以上述方式使每一只动物镇静。首先，通过使用Vialmix振荡器(马萨诸塞州比尔里卡的Lantheus Medical(LantheusMedical,N.Billerica,MA))振荡45秒来活化微泡悬浮液(Definity，马萨诸塞州比尔里卡的Lantheus Medical Imaging(Lantheus Medical Imaging,N.Billerica,MA))。然后，将10⁷个微泡和1mg质粒DNA混合在一起。为了避免微泡聚集和粘附到注射器壁，在注射之前定期手动旋转容纳混合物的注射器。随后，使用荧光扫描小型C臂(马萨诸塞州贝德福德的Hologic(Hologic,Bedford,MA))将骨折定位并且将18G针插入骨折的中心中(图18A)。注射混合物，同时使用Sonos 5500(马萨诸塞州安杜佛的Philips Ultrasound(PhilipsUltrasound,Andover,MA))单元可视化，所述单元配备有被设定成B型的聚焦S3探头，它的焦点与缺损的位置匹配(图18B、图18C)。然后，使用cadence造影剂成像模式，以1.3MHz的传输频率、0.6的机械指数以及4cm的深度施加治疗性超声波脉冲约2分钟直到所有可视化的微泡破裂为止(图18D)。

实施例12

转染功效评价：GFP表达

六只动物接受手术。在十四天后，向小型猪注射与微泡预混合的GFP质粒。随机分配所述动物以使得只有一半在注射之后立即用超声波处理。在转染后五天，将动物处死。使用荧光成像系统(IVIS；马萨诸塞州沃尔瑟姆的Perkin Elmer(Perkin Elmer,Waltham,MA))对骨折部位进行离体光学成像以定位经过处理的肢体内的信号。然后，如上文所述分离来自骨折部位的细胞。使用流式细胞术研究所述细胞以检测GFP表达。GFP阳性细胞的百分比用作转染率的量度。

实施例13

转染功效评价：荧光素酶表达

六只动物接受手术并且在14天后，注射与微泡预混合的荧光素酶质粒。随机分配所述动物以使得只有一半在注射之后立即用超声波处理。在转染后五天，如上文所述分离来自骨折部位的细胞并且与荧光素酶裂解缓冲液(威斯康辛州麦迪逊的Promega(Promega,Madison,WI))一起孵育。将所得的匀浆物以10,000g离心10分钟，并且将100μl的荧光素酶反应缓冲液(Promega)添加到20μl的澄清上清液中。通过光度计(TD-20/20；加利福尼亚州桑尼维尔的Turner BioSystems(Turner BioSystems,Sunnyvale,CA))以RLU测量光发射。将值相对于蛋白质含量归一化，所述蛋白质含量是使用二辛可宁酸测定(伊利诺伊州罗克福德的Pierce(Pierce,Rockford,IL))测量的。荧光素酶活性被表示为每毫克蛋白质的RLU数。

实施例14

BMP-6基因和蛋白质表达分析

十八只动物接受手术并且在手术后14天注射与微泡预混合的BMP-6质粒。随机分配所述动物以使得只有一半在注射之后立即用超声波处理。然后，在超声波转染之后2天、5天或10天将动物随机处死。在死后收集组织以表征BMP-6基因和蛋白质表达。

进行定量RT-PCR以估计在超声波转染后各种器官中的BMP-6基因表达。在死后收获来自骨折部位、脑、骨髓、肺、肝脏、心脏、骨骼肌、以及脾脏的组织并且使用RNeasy提取试剂盒(加利福尼亚州瓦伦西亚的Qiagen)分离RNA。然后使用随机引物和逆转录酶(Promega)将RNA逆转录。使用ABI7500Prism系统(加利福尼亚州福斯特城的Applied Biosystems(Applied Biosystems,Foster City,CA))分析BMP-6基因的表达。使用18s作为看家基因对照。

使用ELISA来估计随时间推移在骨折中的BMP-6蛋白质表达。将来自骨折部位的组织使用组织匀浆器(宾夕法尼亚州拉德诺的VWR(VWR,Radnor,PA))匀浆并且与蛋白酶抑制剂(瑞士巴塞尔的Roche(Roche,Basel,Switzerland))在4℃下孵育2小时。将所得的匀浆物以12,000rpm离心10分钟，并且收集上清液以用于BMP-6ELISA测定(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D Systems(R&D Systems,Minneapolis,MN))。将值相对于蛋白质含量归一化，所述蛋白质含量是使用二辛可宁酸测定(Pierce)测量的。

实施例15

使用显微计算机断层扫描进行骨形成分析

二十八只小型猪接受手术并且在14天后被随机分配成接受以下：1)无处理(“仅支架”组)；2)与微泡预混合的BMP-6质粒(“BMP-6”组)；3)与微泡预混合的空质粒载体和超声波(“仅US”组)；4)与微泡预混合的BMP-6质粒和超声波(“BMP-6+US”组)；或5)自体移植物植入。在手术后八周，将动物安乐死，并且收获它们的胫骨以用于离体高分辨率显微计算机断层扫描(vivaCT 40；瑞士布吕蒂瑟伦的Scanco Medical AG(Scanco Medical AG,Brüttisellen,Switzerland))，如先前所述。使用具有55kVp电位的X射线管获取显微断层扫描切片并且以35μm的体素尺寸重建。使用组织形态测量学三维评价来评价骨折。使用约束三维高斯滤波器(σ＝0.8，支持＝1)部分抑制所关注的体积中的噪声。使用全局阈值法程序从骨髓和软组织分割骨组织。使用直接三维形态测定法产生基于显微断层扫描数据集的骨体积密度和表观密度的定量评估。

实施例16

组织学评价

使用来自每一个处理组的一个标本来进行组织学评价。清洁标本并且在4％福尔马林中固定3天。使用一系列分级乙醇和三级二甲苯完成脱水。使用一系列分级二甲苯和Osteo-Bed(宾夕法尼亚州沃灵顿的Polysciences(Polysciences,Warrington,PA))树脂，继而使用每100ml含有1.40g过氧化苯甲酰的Osteo-Bed树脂的催化混合物来进行渗透。使用每100ml含有2.5g过氧化苯甲酰的Osteo-Bed树脂溶液的最终催化树脂混合物进行包埋。在Leica RM2155旋转切片机(德国韦茨拉尔的Leica(Leica,Wetzlar,Germany))上通过使用碳化钨D型刀以5.0μm的切片厚度切割组织切片。使用基质特异性马松三色染色对切片进行染色。简单地说，在室温下将组织切片在布安溶液(Bouin's solution)中处理过夜。将载片在流水下冲洗10分钟并且用维格特氏苏木精(Weigert's hematoxylin)染色5分钟。然后冲洗载片并且用猩红-酸性品红染色5分钟并且再次冲洗，之后将载片再次用磷钼酸-磷钨酸、苯胺蓝、以及2％乙酸染色，各自染色5分钟。最终，冲洗载片，干燥，并且封固。使用四通道激光扫描显微镜780(加利福尼亚州普莱森顿的Zeiss(Zeiss,Pleasanton,CA))以×20放大倍数、z-堆栈、以及5×5平铺扫描对载片进行成像。对于放大图像，生成单个z-堆栈图像。使用相同的增益和曝光设置扫描所有样品。

实施例17

生物力学分析

使用来自“自体移植物”组、“BMP-6+US”组以及“仅BMP-6”组(每组n＝5)的十五个样品进行生物力学分析。在收获后，将样品包裹在盐水浸泡的纱布中，密封并且冷冻直到分析为止。在分析之前，将样品解冻约1小时，然后将其在PBS中再水化2小时。使用定制的对准夹具将胫骨的近端和远端通过将每一端的1英寸浸没在Bosworth Fastray粘固剂(印第安纳州莱克维尔的Midway Dental Supply(Midway Dental Supply,Lakeville,IN))中而固定在两个铝制方盆中。在测试之前使用卡尺测量两个固定端之间暴露的胫骨的标距长度。使用定制设计的夹具在Instron ElectroPuls 10000(马萨诸塞州诺伍德的Instron(Instron,Norwood,MA))上进行扭转测试。以1度/秒的速率将旋转致动器旋转直到破坏为止。在测试期间连续记录载荷和旋转数据。使用自定义MATLAB代码分析收集的数据以确定扭转刚度、屈服扭矩、极限扭矩、达到屈服扭矩的旋转度、达到极限扭矩的旋转度、达到屈服扭矩的功、以及达到极限扭矩的功。

实施例18

统计分析

使用GraphPad Prism 5.0f软件(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad Prism(GraphPad Prism,San Diego,CA))分析数据。结果示为平均值±SE。使用单因素方差分析或双因素方差分析和图凯氏多重比较事后检验(Tukey's multiple comparison post hoctest)来进行数据分析。为了评估显著性，p<0.05被认为具有统计显著性。

实施例19

声致穿孔引起被募集到骨折部位的内源性MSC中的报告基因表达

小型猪接受手术，期间产生1-cm临界尺寸的胫骨骨折并且植入可生物降解的胶原支架(图16)。在手术之后14天，当注意到间充质谱系的最大细胞募集时，用微泡增强的超声波介导的基因递送处理骨折部位(图17)。将在微泡中混合的编码报告基因(绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶)的质粒DNA经皮注射到骨折部位中，并且用超声波随机处理一半的动物(图18)。骨折部位的离体光学成像揭示了GFP处理的动物的骨折部位处良好定位的荧光信号(图11A)。流式细胞术揭示，从接受超声波处理的动物(“US”组)的胫骨骨折内收集的40％的细胞表达GFP，这是在未处理的动物(“无US”组，p<0.05；图11B)中所观测到的六倍。来自超声波处理的动物中的骨折的表达GFP的细胞的荧光也是来自没有经受超声波的动物中的骨折部位的细胞的三倍(p<0.01，图11C)，并且所显示的荧光素酶活性是其80倍(p<0.05，图11D)。有趣的是，检查转染的细胞显示，超声波处理组中有显著更多的表达MSC标志物CD29和CD90的细胞。超声波处理组中90％的GFP阳性细胞是CD29阳性的并且80％的GFP阳性细胞是CD90阳性的，而未处理组中只有30％的GFP阳性细胞是CD29阳性的并且40％是CD90阳性的(p<0.01；图11E、图11F)。在CD44阳性细胞中没有观测到显著差异(p＝0.07；图11G)。总体而言，超声波处理的骨折部位表现出显著更高的祖细胞转染率以及更强的转基因表达水平。

实施例20

声致穿孔诱导骨折部位处瞬时的BMP-6表达

如上所述对十八只猪进行手术并且用超声波介导的BMP-6和微泡基因递送(“BMP-6+US”组)或在不施加超声波的情况下进行的BMP-6和微泡的注射(对照“BMP-6”组)处理。随时间推移评价在对胫骨骨折进行声致穿孔之后BMP-6基因的局部表达。

注射混合物(DNA和微泡)，同时使用Sonos 5500(马萨诸塞州安杜佛的PhilipsUltrasound)单元可视化，所述单元配备有被设定成B型的聚焦S3探头，它的焦点与缺损的位置匹配(图18B、图18C)。然后，使用cadence造影剂成像模式，以1.3MHz的传输频率、0.6的机械指数、以及4cm的深度施加治疗性超声波脉冲约2分钟直到所有可视化的微泡破裂为止(图18D)。对于ACL研究，应用相同的参数，其中机械指数是1.2并且深度是3cm。

来自骨折部位的分离细胞的定量PCR分析显示，超声波处理的动物中的BMP-6表达在处理后第2天和第5天时分别是对照动物的850倍和400倍(p<0.05，图12A)。在第10天，BMP-6基因表达水平是不可检测的。类似地，骨折部位中的BMP-6蛋白分泌水平在处理后第2天和第5天时分别是没有接受超声波处理的动物的70倍和120倍(p<0.01，图12B)。在第10天检测到可忽略水平的BMP-6蛋白。此外，在脱靶组织中没有发现BMP-6的过表达(图19)。

实施例21

BMP声致穿孔促进体内骨再生

随后，在相同的猪胫骨非愈合骨折模型中评价局部BMP-6基因递送的治疗作用。如上文所述对二十八只动物进行手术。将BMP-6和超声波(“BMP-6+US”组)处理的动物中的胫骨骨折再生与以下各项相比较：未处理对照组(“仅支架”组)、仅接受与微泡预混合的质粒的注射处理而没有接受超声波处理的动物(“仅BMP-6”组)或接受与微泡预混合的空质粒和超声波处理的动物(“仅US”组)、以及接受自体移植物处理的金标准对照组(“自体移植物”组)。在手术之后八周进行的显微计算机断层扫描(μCT)分析揭示，接受BMP-6和超声波处理的骨折通过新形成的骨再生了它的体积的75％，这等同于自体移植物移植(p>0.05)并且是所有其他处理组的两倍(p<0.001；图13A)。在接受BMP-6和超声波处理的雄性猪与雌性猪之间没有发现愈合的差异(p＝0.119，每组n＝4)。此外，除了“自体移植物”组(p>0.05)之外，“BMP-6+US”组中的新形成的骨比所有其他组(p<0.01；图13B)显著更加钙化。重要的是，只有接受BMP-6和超声波(“BMP-6+US”)或自体移植物处理的骨折显示出愈合，如通过胫骨的完全皮质连续性明显看出(图13C)。组织学分析显示，在BMP-6和超声波处理的猪中，骨折通过成熟的新形成的骨完全再生以及骨细胞的存在(图13D)。然而，在所有其他组中，不足的骨形成与大量肉芽组织沉积和纤维化一起被发现(图13D)。

实施例22

BMP-6基因递送诱导经过处理的骨的功能性愈合

在不知情的情况下对从接受手术的动物切除的胫骨进行扭转测试以检查在手术之后8周经过处理的骨的机械特性。根据μCT和组织学分析结果，来自“BMP-6+US”组的胫骨显示出是来自“仅BMP-6”组的胫骨骨折的至少两倍的机械刚度、强度以及韧性(p<0.05，图14)。在“BMP-6+US”组与自体移植物组之间没有观测到显著差异(p>0.05)。

实施例23

讨论

在本研究中，本申请的发明人提出了在大型动物模型中使用超声波介导的微泡增强的基因递送用于原位骨工程化(图15)。本申请的发明人能够证实，向驻留在骨折部位内的细胞进行超声波介导的基因递送实现了瞬时局部基因表达，主要是靶向内源性MSC。成骨基因递送引起与非病毒基因递送系统一致的空间和时间表达谱。此外，它在手术后八周引起完全骨折愈合，以及自体移植物等同的生物力学特性。在本研究中，本申请的发明人在预期的参数范围内使用临床超声波系统，这包括使用对比成像。基于本领域中的共识，本申请的发明人使用安全范围内的超声波能量。实际上，在超声波暴露之后在临床上和组织学上没有明显的发热或热相关损伤迹象。重要的是，没有观测到异位转基因表达或炎性响应的证据，这表明有利的安全特征。就本申请的发明人所知，这是证实了在临床相关的大型动物模型中成功的声致穿孔诱导的基因递送和骨再生的首次报道。

据报道，非病毒基因递送可以在大型动物模型(犬科动物)中实现完全骨折修复。使用含有编码人类甲状旁腺激素的质粒DNA的基因激活的基质植入物，对于1.6cm和1.0cm尺寸的骨折分别到18周和8周时实现了完全的临界尺寸胫骨骨折修复。从那时起，涉及大型动物的其他工作主要侧重于病毒基因递送。这包括证实了骨质疏松绵羊的胫骨骨折中在BMP-2腺病毒基因递送之后改善的骨折修复的报道。其他报道证实了在将BMP-2病毒转导的骨髓源性间充质干细胞植入山羊胫骨骨折中之后改善的骨折修复。尽管有这些有希望的结果，但是病毒具有许多安全问题，限制了它们在人类中的使用。其他报道已经观测到，向骨折部位进行腺病毒BMP-2基因递送引起针对所述病毒载体的暂时的细胞免疫应答和持续的体液免疫应答。此外，临床试验已经证实，病毒基因递送可能诱发全身炎性响应，从而导致死亡，并且可能因随机基因插入基因组中而导致致癌作用。因此，必须开发有效的非病毒基因递送方法用于临床使用。

直到本研究为止，超声波介导的BMP基因递送尚未成功应用于骨折修复。研究人员已经在大鼠的股骨骨折不愈合模型中使用BMP-2和BMP-7的微泡增强的超声波介导的基因递送。尽管使用重复处理成功诱导基因过表达和异位骨形成，但是他们不能在骨折部位中诱导显著的原位骨形成。这些差异可以归因于BMP-2和BMP-7在骨折部位微环境内的成骨潜能减弱，如在其他动物和临床研究中所报道的那样。对BMP的生物响应取决于BMP递送的部位处存在的细胞类型和微环境。BMP-6具有独特的BMPR-IA受体特异性，这使得它不太受到内源性BMP抑制剂的影响，同时强烈促进成骨细胞的成骨。在本申请的发明人先前发表的报道中，本申请的发明人证实，当在MSC中过表达时，BMP-6在体外和体内比BMP-2具有更好的成骨潜能并且诱导更有效的骨形成。一些研究已经表明，BMP-6信号转导经由骨软骨骨化和膜内骨化的机制起作用，其中后者是主要途径，从而在骨折部位内引起更快速的钙化。因此，BMP-6可以用作更强效的原位骨诱导剂。

在本申请的发明人的研究与由Feichtinger等人进行的研究之间的另一个差异是两步程序，这包括将内源性祖细胞募集到骨折部位。本研究证实，通过将胶原支架植入到骨折部位中，可以在手术之后14天内实现支架中有效的内源性祖细胞迁移和滞留。

有趣的是，据报道，延迟施用编码BMP-2的腺病毒载体在大鼠的临界尺寸的股骨骨折中改善了骨形成。可能的是，延迟处理允许更多的祖细胞填充骨折部位，从而使得载体在靶向响应于BMP分泌并且诱导骨再生的细胞方面更有效。总体而言，似乎是强效成骨蛋白连同向活祖细胞群体的有效递送策略的组合是有效骨折修复的关键。

在此描述的方法的改动可以包括将微泡和质粒预负载到支架中，这将消除对随后注射这些材料的需要。最近的论文使用含有微泡、BMP2/7共表达质粒以及C2C12细胞的纤维蛋白/胶原混合基质，在肌内植入小鼠中之后立即对其施加超声波。尽管该研究将外源性细胞组合在支架内，但是在体内仅产生少量的新骨。在本申请的发明人提出的方法中，内源性祖细胞的募集是一个重要因素，如本申请的发明人先前已经在啮齿类动物中所证实，并且该过程可能需要至少两周。因此，植入含有质粒和微泡的支架将需要对这些组分的长期保护，这是因为裸DNA会被DNA酶降解并且当局部注射时微泡具有约10分钟的短半衰期。就本申请的发明人所知，仍需要克服技术障碍以产生这样的复合支架。

用于骨折不愈合治疗的临床金标准利用自体移植物。作为活组织，它们的骨诱导性和骨引导性特性使得它们远远优于其他类型的移植物。用于骨移植的最常见的供体部位是患者自身的髂嵴。由于在此使用的自体移植物是原生截骨胫骨，因此它们远远优于临床环境中可用的自体移植物。该组代表了假设完美的病例情景，其中将丧失的骨的精确自体复制品植入骨折部位内。用于本研究中的自体移植物的尺寸、形状以及骨含量在结构上与骨折部位是相同的。这允许在八周内有效的骨形成和缺损的完全桥接，如在本申请的发明人的结果中所看到的那样。此外，它们的收获没有引起供体部位发病，从而缩短了手术时间并且改善了恢复。此外，这些自体移植物附接到骨膜血液供应。这些因素被证实改善了骨折愈合。据报道，这种方法相对于其他类型的移植物引起优越的骨折修复。在自体移植物组与接受BMP-6和超声波施加(BMP-6+US)处理的组之间发现的相似性用作概念验证，即本申请的发明人提出的治疗与“最佳”自体移植物同样有效用于治疗临界尺寸骨折，所述自体移植物并非在所有临床病例中都总是可用。

本申请的发明人的研究与其他报道的研究之间的最终差异在于在治疗期间使用超声波成像监测微泡振荡。这是所述方案的一个关键方面，这是因为虽然超声波治疗非常有前途，但是超声波的传播受到它可以施加的介质的限制。骨和固定板这两者都高度反射超声波。这些反射可能显著改变骨折部位中的超声波场，从而降低转染功效。该影响在其他工作中被观测到，从而需要更长的超声波暴露时间以实现有效的基因递送。为了使用本申请的发明人提出的治疗进行有效的基因递送，成像提供了确保足够的声致穿孔的机会，尽管固定板有可能妨碍超声波。可以实现更稳健的超声波系统以在未来的人类治疗中绕过这些障碍。在本研究中没有测试的参数之一是使用重复治疗。由于治疗的相对容易性和低侵入性，因此在各个时间点的重复治疗可能进一步增强成骨作用并且促进更快的和改善的骨修复。因此，多次治疗的实施可以是未来超声波介导的基因递送研究中的另一种方法。然而，必须指出的是，向细胞进行过量的DNA递送可能经由机械机制导致细胞毒性。此外，长时间的超声波暴露可能会引起多种不利影响，包括过度的组织发热和由于组织损伤所致的营养不良性钙化。在更高的超声波强度下，超声波和微泡的组合还可能由于组织内微泡塌缩期间的喷射而引起细胞裂解。

当前研究评价了在短期内基于超声波的BMP基因递送的作用。需要长期研究来充分评估与对照相比所述方法在骨愈合方面的效率。在此，本申请的发明人在所有动物中都植入了胶原支架，本申请的发明人先前已经证实所述胶原支架具有一些骨引导性特性。然而，即使在包括支架的情况下并且在短时间内，本申请的发明人仍能够显示出各组之间在愈合速率、骨形成以及生物力学方面的显著结果。本申请的发明人可以确定，胶原支架、BMP-6质粒、微泡以及超声波的联合治疗优于对照组并且类似于自体移植物处理的动物。

关于低强度脉冲超声波(LIPUS)是否可以加速骨折愈合存在许多争议。最近的研究显示，单独的超声波不会改善人类患者的胫骨骨折的功能恢复或加速影像学愈合。此外，每天施加LIPUS，持续数周(在上述研究中长达52周)，而本申请的发明人提出的治疗仅需要单次暴露，这使得单独的超声波不太可能对骨折修复有影响。此外，本申请的发明人的数据分析显示，在接受超声波和悬浮在微泡中的空质粒处理的组(“仅US”组)与阴性对照组(“仅支架”组)之间骨形成没有差异，这进一步支持了本申请的发明人的假设，即经由局部基因递送实现治疗作用。

这些结果显示未来对组织的超声波介导的基因治疗的巨大前景。由于超声波技术是安全的并且广泛用于临床，因此该方法可以容易地转化为临床实践。微泡的引入允许在治疗部位中定位注射材料并且实时监测声致穿孔程序。这种方法有可能用于许多不同的应用，从而促进原位组织工程化。在骨折的背景下，这种治疗可以应用于多种矫形适应症。它是微创的，不需要离体干细胞操作，并且避免使用高成本的生长因子或患者自身的骨收获用于植入。由于尚未发现在具有严重骨质流失的部位中诱导骨再生的替代有效方法，因此超声波介导的基因治疗是一种有前途的工具，它可能为这一未满足的临床需求提供积极的响应。

上述各种方法和技术提供了实施本发明的许多方式。当然，应当了解的是，未必所述的所有目的或优势都可以根据本文所述的任何具体实施方案来实现。因此，例如，本领域技术人员将认识到，所述方法可以这样的方式执行，所述方式实现或优化如本文所教导的一个优势或一组优势而不一定实现如本文可能教导或提出的其他目的或优势。在本文提到了多种有利的和不利的替代方案。应当了解的是，一些优选的实施方案具体包括一个、另一个、或几个有利的特征，而其他优选的实施方案具体排除了一个、另一个、或几个不利特征，而另外的其他优选的实施方案通过包括一个、另一个、或几个有利特征而具体减轻了目前的不利特征。

此外，本领域技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地，上述各种要素、特征和步骤以及每一个这样的要素、特征或步骤的其他已知的等同方案可以由本领域普通技术人员混合和匹配以进行根据本文所述的原理的方法。在各种要素、特征、以及步骤中，在不同的实施方案中，一些将被具体包括，并且其他将被具体排除。

尽管已经在某些实施方案和实施例的背景下公开了本发明，但是本领域技术人员将了解的是，本发明的实施方案在具体公开的实施方案以外延及其他替代性实施方案和/或用途以及其改动方案和等同方案。

许多变化方案和替代要素已经公开在本发明的实施方案中。再另外的变化方案和替代要素对本领域技术人员将是显而易见的。在这些变化方案中有但不限于用于募集内源性干细胞的药剂、质粒和通过所述质粒编码的蛋白质、递送质粒的方法、以及经由本发明的教导产生的产物的特定用途。本发明的各种实施方案可以具体包括或排除这些变化方案或要素中的任一个。

在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方案的表示成分的量、特性(如浓度)、响应条件等的数字应当被理解为在一些情况下由术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，书面说明和所附权利要求书中所述的数值参数是近似值，它们可以根据试图通过一个具体的实施方案获得的所期望的特性而变化。在一些实施方案中，数值参数应当根据所报告的有效数字位数并且通过应用普通的四舍五入技术来加以解释。尽管阐述本发明的一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中所述的数值是尽可能精确地报告的。本发明的一些实施方案中所示的数值可能含有由它们对应的测试测量中所存在的标准偏差必然产生的某些误差。

在一些实施方案中，描述本发明的一个具体实施方案的上下文中(特别是以下权利要求中的某些的上下文中)所用的术语“一个(种)(a/an)”和“所述”以及类似引用可以被解释为涵盖单数形式和复数形式这两者。本文对值的范围的叙述仅意图用作单独提到落入所述范围内的每一个单独值的简写方法。除非本文另外指明，否则每一个单个值被并入本说明书中，就如同它在本文被单独叙述一般。除非本文另外指明或另外与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以按照任何合适的顺序进行。本文关于某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地阐明本发明而不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言不应当被理解成将任何未要求保护的要素指示为对实施本发明来说是必要的。

本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应当被视为限制。每一个组成员可以单独或以与本文所发现的其他组成员或其他要素的任何组合的形式被提及和要求保护。出于方便性和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以被包括在组中或从组中删除。当任何这样的包括或删除发生时，本说明书在本文被认为含有如所修改的组，从而实现用于所附权利要求书中的所有马库什组的书面说明。

在本文描述了本发明的优选的实施方案，包括本申请的发明人已知用于实施本发明的最佳方式。在阅读上述说明时，那些优选的实施方案的变化方案对于本领域的普通技术人员来说将变得显而易见。据考虑，本领域技术人员在适当时可以使用这样的变化方案，并且本发明可以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明的许多实施方案包括如由适用法律所允许的所附权利要求书中所叙述的主题的所有改动方案和等同方案。此外，除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾，否则其所有可能的变化方案中上述要素的任何组合由本发明所涵盖。

此外，在整个本说明书中已经对专利和印刷出版物进行了许多参考。上文引用的参考文献和印刷出版物中的每一篇在本文单独地以引用的方式整体并入本文。

最后，应当了解的是，本文公开的本发明的实施方案说明了本发明的原理。可以使用的其他改动方案可以落入本发明的范围内。因此，举例来说而非限制，本发明的替代配置可以根据本文的教导来利用。因此，本发明的实施方案不限于如精确所示和所描述的那样。

Claims (23)

1.一种促进骨整合的方法，所述方法包括：

在包括以下各项的界面的组织部位处施用药剂：(i)骨和(ii)肌腱或韧带；以及

在所述组织部位处递送编码一种或多种蛋白质的一种或多种载体，其中所述组织部位处的细胞表达所述一种或多种蛋白质，从而促进骨整合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂能够将干细胞募集到所述组织部位。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述药剂是支架。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述支架包含胶原。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织部位包含一个或多个骨隧道。

6.根据权利要求1所述的方法，其中递送一种或多种载体包括注射。

7.根据权利要求1所述的方法，其中递送一种或多种载体包括超声波。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质包括骨形态发生蛋白(BMP)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述BMP包括骨形态发生蛋白-6(BMP-6)。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述BMP包括骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。

11.根据权利要求1所述的方法，其中使用计算机断层(CT)扫描测量骨整合。

12.根据权利要求1所述的方法，其中使用磁共振(MR)成像测量骨整合。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织部位包括受损组织。

14.根据权利要求13所述的方法，其中受损组织包括前十字韧带、后十字韧带、膝关节和肘关节的内侧副韧带、膝关节和肘关节的外侧副韧带、以及肩袖肌腱撕裂。

15.根据权利要求15所述的方法，其中所述受损组织已经被重建。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述重建包括自体移植和/或同种异体移植。

17.一种试剂盒，所述试剂盒包括：

可生物降解的药剂；

编码一种或多种蛋白质的一种或多种载体；

微泡溶液；以及

使用说明书。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述药剂能够将干细胞募集到所述组织部位。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述药剂是支架。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述支架包含胶原。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质包括骨形态发生蛋白(BMP)。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述BMP包括骨形态发生蛋白-6(BMP-6)。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述BMP包括骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。