JP7097815B2 - 腱／靭帯の骨結合のための内在性幹細胞活性化の方法 - Google Patents

Description

連邦支援の研究開発に関する声明
本発明は米国国立衛生研究所による助成金番号ＴＲ０００１２４のもとで政府の支援によって行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。

発明の分野
本明細書において、超音波を用いて増強した遺伝子送達による骨、腱、及び靭帯の修復のための治療法に関する方法及び組成物が記載されている。

背景
腱及び靭帯の損傷は整形外科の臨床診療では一般的であり、スポーツ及び日常の活動で実質的な病的状態を引き起こす。膝の前十字靭帯（ＡＣＬ）及び肩の腱板は、最も一般的に損傷される軟組織構造に含まれる。再建手術が腱及び靭帯の損傷のための治療選択肢のゴールデンスタンダードであり、その際、腱の自家移植片または同種移植片を骨に移植し、付着させる。外科医らは予測可能な成功率でＡＣＬのような靭帯を再建することができるが、これらの再建の完全性は依然として靭帯と骨の間の境界面の適切な生物学的な癒合に依存している。この境界面の癒合は、これら２つの組織型の間の隙間を橋渡しする線維性の修復組織の形成を生じることが多い時間のかかる過程である。

残念ながら、これらの靭帯を外科的に再建すると、患者の大半は長い回復期間（１年まで）に悩まされる。腱・骨境界面の限られた再生能のために、天然の生体構造に機能的に且つ生物学的に類似する腱／靭帯・骨の癒合を達成することは難題であり得る。靭帯・骨の統合を増強するための幾つかの生物学的アプローチが提案されている。これらの戦略には、骨誘導性増殖因子の送達、血小板濃縮血漿、増殖因子をコードする遺伝子のウイルス性形質導入、細胞ベースの治療法が挙げられる。若干の有望な成績はあったが、これらの戦略はすべて短所を有し：増殖因子は短い半減期のゆえに繰り返し注入する必要があり、ウイルスベクターはヒトでの使用は危険である可能性があり、移植可能な細胞療法は複雑な生体外の操作を要する。さらに、増殖因子は非常に高価な場合があり、細胞ベースの治療法はＵＳＦＤＡによる長期の規制プロセスを必要とする可能性がある。これらの障害を踏まえると、骨・同種移植片の統合を向上させる新しい且つ改善された生物学的治療法に対する大きなニーズが当該技術にはある。

以前、本発明者らは、損傷部位に内在性幹細胞を動員するために生分解性足場の外科的移植が先ず関与する手順を開発したが、動員した細胞への骨形成遺伝子の経皮送達を促すのに超音波パルスを使用する。このアプローチは非常に上手く行くことが判明し、ブタモデルにおける臨界サイズの骨損傷部に完全な骨の再生をもたらした。ＡＣＬ再建のための同種移植片の骨統合を増強するためにこの手順を利用するこれらの好結果は癒合を促すための確かな基礎を提供する。

本明細書に記載されているのは、常在幹細胞への標的化された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）遺伝子の送達が、大型動物モデルにて腱同種移植片の骨への統合を増強するという発見である。ブタの膝ＡＣＬ再建のモデルにおける骨・同種移植片の靭帯付着部に提案された治療法を適用した。ＡＣＬ再建のブタモデルにて超音波を用いた遺伝子送達を用い、内在性幹細胞への標的化ＢＭＰ遺伝子送達を用いてブタモデルにおける腱同種移植片の骨統合が改善された。コラーゲン足場を用いて骨損傷部位に内在性の間葉幹細胞（ＭＳＣ）を動員することができるので、超音波を用いたＢＭＰ遺伝子送達は骨再生をさらに促進することができるとして示される。ＢＭＰ導入遺伝子の一時的な発現は、効率的な局所の骨再生に十分であり、ＡＣＬ再建の骨孔への超音波を用いた遺伝子送達は整形外科の治療において有意な新しい進歩を提供する。

図１：加速された腱／靭帯の骨への統合をもたらす２工程処置。第１の工程では、腱／靭帯・骨の境界面の部位に内在性幹細胞が動員され、第２の工程では、超音波の助けを借りて、動員された幹細胞に骨形成遺伝子が送達される。 図２：ミニブタの脛骨欠損部位への内在性ＭＳＣの動員。ミニブタの脛骨に１ｃｍの部分欠損部を作り出し、コラーゲン足場を埋入した。１４日後、マイクロバブル（ＭＢ）と共に欠損部位にＧＦＰプラスミドを注入し、その後、超音波エネルギーパルスを与えた。５日後、欠損部位から細胞を単離し、フローサイトメトリーに供した。本発明者らの結果は約５０％の細胞がＭＳＣマーカーを発現したことを示す。マーカー発現の割合が２１日目では低下したので遺伝子送達のための標的日として１４日目を選択した（１時点当たりｎ＝３、ｐ＝０．００３１）。 図３：超音波が媒介する遺伝子送達後の、ミニブタの脛骨欠損部におけるレポーター遺伝子の発現。図３Ａ：４０～５０％の細胞がＧＦＰを発現した（ｎ＝３～４、ｐ＜０．０５、（ＵＳ＝超音波）。図３Ｂ：ＧＦＰをトランスフェクションした細胞の７０～９０％が内在性ＭＳＣだった。骨欠損部から単離した細胞をＧＦＰ及びＭＳＣマーカー（ＣＤ９０、２９及び４４）の同時発現についてフローサイトメトリーを用いて解析した（ｎ＝３～４、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１）。 図３Ａの説明を参照。 図４：ブタ脛骨欠損部への超音波が媒介するＢＭＰ－６遺伝子の送達は完全な欠損修復を誘導する。ミニブタの脛骨に１ｃｍの骨欠損部を作り出し、コラーゲン足場を埋入した（図４Ａ：蛍光透視画像は欠損及び固定板を示す；矢印は骨欠損部を示す）。手術後１４日目にＢＭＰ－６プラスミドを欠損部位に注入し、その後超音波パルスを行った。遺伝子送達の６週間後、動物を屠殺した。マイクロＣＴ定量解析は、ＢＭＰ－２または対照で処理した欠損部に比べてＢＭＰ－６で処理した脛骨の欠損部にて有意に多い骨量（図４Ｂ）及び骨密度（図４Ｃ）を明らかにした。正常なインタクトの脛骨を対照として使用した。マイクロＣＴ画像はＢＭＰ－６処理した骨欠損部の完全な癒合を示した（図４Ｄ）。（^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１、^****ｐ＜０．０００１）［ＭＢ＝マイクロバブル、ＵＳ＝超音波］ 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 図５：ＢＭＰ－６処理したブタ脛骨は優れた生体力学的な特性を示す。ねじり試験を行って、処理した脛骨欠損部の術後８週での機械的特性を調べた。ＢＭＰ－６と超音波で処理した脛骨欠損部は、ＢＭＰ－２と超音波（「ＢＭＰ－２＋ＵＳ」群）またはＢＭＰ－６プラスミドのみ（「プラスミドのみ」群）で処理した脛骨欠損部に比べて有意に高い剛性、強度、及び靭性を示した。正常なインタクトの脛骨を対照として使用した（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１、^****ｐ＜０．０００１） 図６：靭帯、骨構造、及び本出願に記載されているような再建を示すミニブタのＡＣＬ再建モデル。 図７：ＡＣＬ再建の骨孔における内在性ＭＳＣへの超音波が媒介する導入遺伝子の送達。ブタ腱の同種移植片を用いてブタのＡＣＬを再建した。１４日後、Ｘ線透視下で骨孔にＧＦＰプラスミドを注入し、その後、大腿骨孔に超音波を適用した（図７Ａ、図７Ｂ）。遺伝子送達の５日後に行ったＦＡＣＳ解析は大腿骨孔における細胞の５０％がＧＦＰを発現することを示した（図７Ｃ）。加えて、骨孔における細胞の１２～２２％がＭＳＣマーカーを発現した（図７Ｄ）（ｎ＝３、^*ｐ＜０．０５）［ＵＳ＝超音波］ 図８：ＡＣＬ再建の骨孔における内在性ＭＳＣへの超音波が媒介するＢＭＰ－２遺伝子の送達。図８Ａ、図８Ｂ：大腿骨孔にて有意に高い値を示す脛骨孔及び大腿骨孔における骨量及び見かけ密度の定量（ｎ＝３、^*ｐ＜０．０５、ｔ検定）。図８Ｃ、図８Ｄ：骨孔の代表的なマイクロＣＴ画像。図８Ｅ、図８Ｆ：大腿骨（図８Ｅ）及び脛骨（８Ｆ）の孔を示すミニブタ膝関節のＭＲＩスキャン。 図８Ａの説明を参照。 図８Ａの説明を参照。 図８Ａの説明を参照。 図８Ａの説明を参照。 図８Ａの説明を参照。 図９：ＡＣＬ再建の骨孔における内在性ＭＳＣへの超音波が媒介するＢＭＰ－６遺伝子の送達。Ａ：ＢＭＰ－６処理した動物で有意に高い値を示す骨孔における骨量の定量（ｎ＝６、^*ｐ＜０．０５、ｔ検定）。Ｂ、Ｃ：ＢＭＰ－６処理した及び未処理の大腿骨孔の代表的なマイクロＣＴ画像。Ｄ：処理した骨孔付近に異所性の骨形成を認めない代表的な処理動物のＸ線透視３Ｄ再建。 図１０：ＢＭＰ－６処理したＡＣＬ再建ブタは優れた生体力学特性を示す。Ａ：ＢＭＰ－６＋ＵＳ処理したブタの±２０ＮでのＡＰ弛緩は未処理のブタより低かった。線形剛性（Ｂ）及び最大破断荷重（Ｃ）が双方とも未処理のブタより高かったということは、処理動物における強い移植片・骨の統合を示している（ｎ＝３、^*ｐ＜０．０５、ｔ検定）。 図１１：超音波が媒介する遺伝子送達後のミニブタの脛骨骨折部におけるレポーター遺伝子の発現。（図１１Ａ）ＧＦＰ処理した骨折部の、処理５日後に撮影した生体外Ｘ線透視画像。骨折部の画像は点線の四角で示す。（図１１Ｂ）処理５日後の、超音波処理有り又は無しにおける骨折部位から単離したＧＦＰ陽性細胞の割合のフローサイトメトリー解析。（図１１Ｃ）処理５日後の、超音波処理有り又は無しにおける骨折部から単離した細胞当たりの平均蛍光強度。（図１１Ｄ）処理５日後の、超音波処理有り又は無しにおける骨折部から単離した細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性。処理５日後の、超音波処理有り又は無しにおける骨折部から単離したＧＦＰ陽性細胞のうちのＣＤ２９（図１１Ｅ）、ＣＤ９０（図１１Ｆ）及びＣＤ４４（図１１Ｇ）の陽性細胞。（「ＵＳなし群」：ｎ＝３、「ＵＳ群」：ｎ＝４、^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^****ｐ＜０．０００１；ＵＳ＝超音波、ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質、ＲＬＵ＝相対光単位）。 図１２：骨折部位への超音波が媒介する遺伝子送達後のＢＭＰ－６発現。超音波が媒介するＢＭＰ－６遺伝子送達の２、５及び１０日後の脛骨骨折部位での遺伝子発現（相対定量（ＲＱ））（図１２Ａ）及びタンパク質（図１２Ｂ）の発現。（実験群当たりｎ＝３、ＵＳ＝超音波、^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^****ｐ＜０．０００１）。 図１３：ミニブタの脛骨骨折部への超音波が媒介するＢＭＰ－６遺伝子送達。骨量密度（１３Ａ）及び見かけ密度（１３Ｂ）を含む脛骨骨折部における骨形成の定量分析。（１３Ｃ）術後８週目の骨折部の代表的なマイクロμＣＴ切片。星印は骨折部内での新しい骨形成を示す。矢印は骨折部内の癒着不能を示す皮質不連続性を示している。同種移植片の縁は点線の四角で示す。（図１３Ｄ）術後８週目の脛骨骨折部のマッソントリクローム染色、低拡大（上の部分図）及び黄色四角の高拡大（下の部分図）。矢印は骨折部における天然な骨と新しい形成された骨の境界を示している。縮尺棒、１ｍｍ。（ＵＳ＝超音波、同種移植片：ｎ＝７；ＢＭＰ－６＋ＵＳ：ｎ＝８；ＢＭＰ－６のみ：ｎ＝６；ＵＳのみ：ｎ＝３；足場のみ：ｎ＝４、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１）。 図１３Ａの説明を参照。 図１３Ａの説明を参照。 図１３Ａの説明を参照。 図１４：処理した脛骨の生体力学的特性。回収した脛骨でねじり試験を行った。（図１４Ａ）破断点に達する標本にした脛骨。荷重及び回転の分析を行って、処理した骨の強度（図１４Ｂ）、剛性（図１４Ｃ）及び靭性（図１４Ｄ）を決定した（ＵＳ＝超音波、Ｎ．ｍ＝ニュートンメートル；実験群当たりｎ＝５；^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１）。 図１４Ａの説明を参照。 図１４Ａの説明を参照。 図１４Ａの説明を参照。 図１５：提案された治療法。超音波が媒介してマイクロバブルが増強する骨形成タンパク質遺伝子の送達は、臨界サイズの骨折部の迅速で効率的な再生を誘導する。 図１６：ユカタンミニブタの脛骨における臨界サイズの骨折モデル。（図１６Ａ）手術の間、脛骨を前内側方向に露出させ、骨幹から１ｃｍの骨を取り除くこと（右下の挿入図で示す）によって、骨折部を作り出した（白い矢印によって示す）。特注の６穴リミテッドコンタクト・ダイナミックコンプレッションプレートを用いて、骨折した骨を固定した。（図１６Ｂ）固定した脛骨（矢印）の術後のＸ線透視画像。（図１６Ｃ）手術の１４日後の超音波適用直後の骨折部（点線の四角によって示した骨折部位）のマイクロコンピュータ断層撮影スキャン。 図１７：ミニブタ脛骨骨折部位への内在性の間葉前駆細胞の動員。手術の７、１４、及び２１日後の脛骨骨折部位に由来するＣＤ２９陽性細胞（図１７Ａ）及びＣＤ９０陽性細胞（図１７Ｂ）のフローサイトメトリー解析（１時点当たりｎ＝３、^**ｐ＜０．０１）。 図１８：超音波処理の設定。（図１８Ａ）骨折部位のＸ線透視画像。骨折部位の中央に針が見える。（図１８Ｂ）ＤＮＡ及びマイクロバブルの混合物の骨折部位への注入。注入した混合物の最適な視覚化のために針に隣接して超音波プローブを置く。（図１８Ｃ）超音波Ｂモードによる骨折部位の視覚化（黄色の点線四角で印を付けている）。赤い点線で脛骨の皮質に印を付けている。（図１８Ｄ）ＤＮＡとマイクロバブルの注入の間の骨折部位（黄色の点線四角）の超音波造影剤画像。赤い点線で脛骨の皮質に印を付けている。 図１９：超音波が媒介する遺伝子送達後のＢＭＰ－６発現の生体分布。未処理の動物と比べた、超音波が媒介するＢＭＰ－６処理の２日後及び１０日後の種々の臓器におけるＢＭＰ－６遺伝子の発現（ＢＭ＝骨髄；１時点当たりｎ＝３）。

本明細書において、骨結合（オッセオインテグレーション）を促進する方法であって、（ｉ）骨と（ｉｉ）腱または靭帯の境界面を含む組織部位で作用物質を投与する工程と、１以上のタンパク質をコードする１以上のベクターを組織部位に送達する工程とを含み、組織部位の細胞が１以上のタンパク質を発現し、それによって骨結合が促進される、方法が記載されている。他の実施形態では、作用物質は組織部位に幹細胞を動員することができる。他の実施形態では、作用物質は足場である。他の実施形態では、足場にはコラーゲンが含まれる。他の実施形態では、組織部位には１以上の骨孔が含まれる。他の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程には注入が含まれる。他の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程には超音波照射が含まれる。他の実施形態では、１以上のタンパク質は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。他の実施形態では、ＢＭＰは骨形成タンパク質－６（ＢＭＰ－６）を含む。他の実施形態では、ＢＭＰは骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）を含む。他の実施形態では、骨結合はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを用いて測定される。他の実施形態では、骨結合は磁気共鳴（ＭＲ）画像解析を用いて測定される。他の実施形態では、組織部位には損傷組織が含まれる。他の実施形態では、損傷組織には、膝及び肘の前十字靭帯、後十字靭帯、内側側副靭帯、膝及び肘の外側側副靭帯、ならびに腱板腱の断裂が挙げられる。他の実施形態では、損傷組織は再建されている。他の実施形態では、再建には自家移植及び／または同種移植が含まれる。

本明細書において、生分解性の作用物質、１以上のタンパク質をコードする１以上のベクター、マイクロバブル溶液、及び使用説明書を含むキットも記載されている。他の実施形態では、作用物質は組織部位に幹細胞を動員することができる。他の実施形態では、作用物質は足場である。他の実施形態では、足場はコラーゲンを含む。他の実施形態では、１以上のタンパク質は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。他の実施形態では、ＢＭＰは骨形成タンパク質－６（ＢＭＰ－６）を含む。他の実施形態では、ＢＭＰは骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）を含む。
[本発明1001]
骨結合を促進する方法であって、
（ｉ）骨と（ｉｉ）腱または靭帯との境界面を含む組織部位に作用物質を投与する工程と、
1以上のタンパク質をコードする1以上のベクターを前記組織部位に送達する工程とを含み、
前記組織部位における細胞が前記1以上のタンパク質を発現し、それによって骨結合が促進される、前記方法。
[本発明1002]
前記作用物質が前記組織部位に幹細胞を動員することができる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記作用物質が足場である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記足場がコラーゲンを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記組織部位が1以上の骨孔を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
1以上のベクターを送達する工程が注入を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
1以上のベクターを送達する工程が超音波照射を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記1以上のタンパク質が骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記ＢＭＰが、骨形成タンパク質－6（ＢＭＰ－6）を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記ＢＭＰが、骨形成タンパク質－2（ＢＭＰ－2）を含む、本発明1008の方法。
[本発明1011]
骨結合がコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを用いて測定される、本発明1001の方法。
[本発明1012]
骨結合が磁気共鳴（ＭＲ）画像解析を用いて測定される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記組織部位が損傷組織を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
損傷組織が、膝及び肘の前十字靭帯、後十字靭帯、内側側副靭帯、膝及び肘の外側側副靭帯、ならびに腱板腱の断裂を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記損傷組織が再建されている、本発明1015の方法。
[本発明1016]
前記再建が自家移植及び／または同種移植を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
生分解性の作用物質；
1以上のタンパク質をコードする1以上のベクター；
マイクロバブル溶液；及び
使用説明書
を含む、キット。
[本発明1018]
前記作用物質が、組織部位に幹細胞を動員することができる、本発明1017のキット。
[本発明1019]
前記作用物質が足場である、本発明1018のキット。
[本発明1020]
前記足場がコラーゲンを含む、本発明1019のキット。
[本発明1021]
前記1以上のタンパク質が骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む、本発明1017のキット。
[本発明1022]
前記ＢＭＰが、骨形成タンパク質－6（ＢＭＰ－6）を含む、本発明1021のキット。
[本発明1023]
前記ＢＭＰが、骨形成タンパク質－2（ＢＭＰ－2）を含む、本発明1021のキット。

詳細な説明
本明細書で引用されている参考文献はすべて、あたかも完全に述べられているかのようにその全体が参照によって組み込まれる。定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２^ｎｄ ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１５，２０１２）；Ｈｏｒｎｙａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，（２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３^ｒｄ ｅｄ．，ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７^ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０１３）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３^ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２８，２０１２）；ならびにＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１２）は本出願で使用されている用語の多くに対する一般的な手引きを当業者に提供する。抗体の調製の仕方を参照するには、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２^ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１３）；Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６，Ｊｕｌ，６（７）：５１１－９；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｓｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，米国特許第５，５８５，０８９号（１９９６，Ｄｅｃ）；ならびにＲｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，Ｍａｒ，２４，３３２（６１６２）：３２３－７を参照のこと。

当業者は、本発明の実施において使用されてもよい、本明細書に記載されているものに類似するまたはそれらと同等である多くの方法及び材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載されている方法及び材料に決して限定されない。本発明の目的では、以下の用語が以下で定義される。

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体にわたる記載で使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は文脈が明瞭に指示しない限り、複数の参照を含む。また、本明細書の記載で使用されるとき、「ｉｎ」の意味は、文脈が明瞭に指示しない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。

腱及び靭帯の損傷は整形外科の臨床診療では一般的であり、スポーツ及び日常の活動で実質的な病的状態を引き起こす。ＡＣＬ及び腱板は、最も一般的に損傷される軟組織構造に含まれる。腱板断裂は、最も一般的な変性腱損傷であり、疼痛及び抑制された可動域の主要症状を示す多因子疾病として主として高齢患者で発生する。症候性の腱板損傷の正確な有病率は分からないが、５％から３０％に及ぶかもしれない。高齢者ドナーの死体研究では、全層断裂の有病率は３０％まで達すると推定されている。腱板の修復は最も一般的な整形外科処置の１つであり、おそらくすべての肩手術のうちで最も一般的である。１５～２０％の失敗率で毎年、２００，０００～３００，０００の間の腱板が外科的に修復される。ＡＣＬは生理的な膝運動の最も重要な安定材である。ＡＣＬ損傷は米国だけで２００，０００症例を超える年間発生を有し、これらの膝のうち約１００，０００が毎年再建されている。ＡＣＬ損傷は１５～４５歳の患者で最も多い（１，７５０人に１人）。１つにはさらに活動的な生活スタイルと同様にスポーツへの参加の多さが理由で、それはこの年齢群でさらに一般的である。サッカー、フットボール及びバスケットボールのような要求の高いスポーツに参加するアスリートはＡＣＬを損傷する可能性がさらに高い。ＡＣＬ損傷は、ＡＣＬの外科的再建を行わなければ激しいスポーツへの高レベルの参加が可能でなくなることが多い、特に若いアスリートにとって衝撃的である。さらに、膝変形性関節症（ＯＡ）の長期発生が一般的である。１２年間の経過観察を伴った最近の研究は、ＡＣＬ再建手術後の患者の約５０％がＯＡを発症することを示した。経過観察での患者の平均年齢は３１歳だった。この年齢では、症候性の変形性関節症の膝に対する良好な治療選択肢がない。従って、長期の健康及び生活の質の双方を維持することを目標にして腱・骨癒合のための新しいアプローチを開発することが重要である。

再建手術は、腱及び靭帯の損傷についての治療選択肢のゴールデンスタンダードである。この処置の間に、自己または同種の腱を移植し、損傷した靭帯を置き換える。上首尾の腱・骨癒合は関節の機能及び安定性を回復するのに決定的である。しかしながら、この癒合過程はゆっくりと発生し、場合によっては不完全に発生し、不十分な移植片・骨統合をもたらし、構造的な不安定性及び病的状態を生じる。過去１０年間の間、腱・骨癒合を生物学的に加速し、改善する戦略は増殖因子及び細胞ベースの治療法を用いて研究されてきた。これらの戦略には、骨誘導性増殖因子の送達、血小板濃縮血漿、増殖因子をコードする遺伝子のウイルスによる形質導入、及び細胞ベースの治療法が挙げられる。特に、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は骨孔における腱の統合を増強するために研究された。しかしながら、ＢＭＰは非常に高価であり、おそらく大量投与での使用のせいでの副作用の高い発生率について最近綿密に精査されている。

腱・骨接合は、線維軟骨帯の相対的な無血管状態と損傷部位での骨喪失のためにゆっくり癒合する。この難題環境を克服するには、良好な腱・靭帯付着部及び改善された腱・骨癒合を達成するために強力な骨誘導因子として、増殖因子（主にＢＭＰ）と組み合わせた骨前駆細胞（主として間葉幹細胞（ＭＳＣ））を使用することができる。一連の出版物にて、本発明者らは、異なるＢＭＰ遺伝子を過剰発現するように操作されたＭＳＣが生体内で分化し、骨形成の過程に寄与し、部分欠損部の完全な再生をもたらすことができることを示した。しかしながら、そのようなアプローチは幾つかの工程―細胞の単離、増殖及び操作を必要とし、それらは複雑であり、臨床使用までの規制経路を長引かせる。代替の標的化遺伝子療法のアプローチは腱・靭帯付着部位に常在するＭＳＣにてＢＭＰのような骨形成遺伝子を過剰発現させる。それは生理的なレベルでのＢＭＰタンパク質の一時的な分泌をもたらし、細胞もしくは移植片の回収、または組換えタンパク質のような高価な試薬の製造を必要としないので、これは魅力的なアプローチである。さらに、遺伝子発現の効率は遺伝子を標的部位に運ぶベクターに強く相関する。多種多様な遺伝子送達の方法が開発されており、骨の再生について長年にわたって調べられてきた。ウイルスベクターが最も効率的な遺伝子送達ツールであることは疑いがないが、その効率は腫瘍形成性及び免疫原性の反応のリスクの可能性によって相殺される。遺伝子発現の効率がずっと低いにもかかわらず、ヒトでの使用については非ウイルスベクターがさらに安全であると見なされる。生体内での非ウイルス性の遺伝子送達の効率を増強するために、短いパルスのエネルギーを頼る方法が開発された。これらの方法は、ＤＮＡの取り込みを可能にする、細胞膜に一時的なナノサイズの孔の形成を誘導し、それが細胞のトランスフェクションをもたらす。細胞穿孔は電気パルス、超音波またはレーザーエネルギーによって誘導することができる。

超音波は、たとえば、画像解析、リソグラフィ及び腫瘍焼灼のような多様な目的で臨床にて広く使用されている。超音波が媒介する遺伝子療法の可能性を検討するために前臨床試験が実施されている。ソノポレーションと呼ばれるこの送達法は、それが一時的な遺伝子発現をもたらし、潜在的に腫瘍形成性及び免疫原性のウイルスベクターまたは侵襲性の電気穿孔法を必要としないので魅力的なアプローチである。超音波の適用は対象とする領域に局在化できるので、最少の全身性の影響で深い組織を特異的にソノポレーションすることができる。マイクロバブル（ＭＢ）の体積変動及び／または崩壊の効果を介して膜の透過性を増強するためにほとんどのソノポレーションの研究はプラスミドＤＮＡとマイクロバブルを組み合わせている。実際、以前の試みは、生体内での細胞穿孔及びＢＭＰ遺伝子をコードするプラスミドの直接送達を用いて骨形成を誘導することの実現可能性を示した。しかしながら、これらの研究は骨損傷部位では実施されていなかった。

靭帯及び腱の損傷の治療における現在の満たされていない臨床的なニーズに対処することを目的とする新しい且つ改善された生物療法について当該技術で大きなニーズがある。膝の前十字靭帯（ＡＣＬ）損傷は優れた実験モデルとして役立つことができる。少なくとも１００，０００～２００，０００のＡＣＬの再建が毎年米国で実施されることが報告されている。膝靭帯の再建すべてと同様にＡＣＬの再建は、脛骨及び大腿骨に穴を開けた骨孔への自己または同種の組織の移植を必要とする。残念ながら、これらの靭帯を外科的に再建する場合、長期間（およそ１年までの）のリハビリを確保することはこれら患者の多くにとって珍しいことではない。軟組織移植片再建の設定で特に決定的な因子の１つは、腱・骨境界面での移植片の適正で且つタイミングのよい統合である。宿主骨へのＡＣＬ移植片統合の生物学は、早期のリハビリ運動制限を導く主要な理念である。さらに、同種移植片のＡＣＬ再建の取り込みが自家移植片の再建に比べて遅延することが知られている。米国整形外科スポーツ医学会議（ＡＯＳＳＭ）は、およそ６０，０００の同種移植片が２００５年の膝再建処置だけに使用されたと推定している。これを踏まえて、移植片統合を加速する能力を伴った新しい治療的介入の開発は素晴らしい臨床的な影響を有し、結果としてこれらの介入は自由な活動へのさらに迅速な回復を経験する患者につながり得る。

靭帯・骨統合を増強させるために幾つかの生物学的アプローチが提案されている。これらの戦略には、骨誘導性増殖因子の送達、血小板濃縮血漿、増殖因子をコードする遺伝子のウイルスによる形質導入、細胞ベースの治療法が挙げられる。たとえば、幾つかの研究は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）またはサイクロオキシゲナーゼ２をコードするウイルスベクターの靭帯／腱・骨境界面への送達を報告している。一部の例では、組換えヒトＢＭＰの腱自家移植片への注入が異所性の骨形成を誘導した２段階処置がＡＣＬ再建モデルにて実験的な腱／靭帯付着部として役立つ。幾つかの有望な成績はあったが、これらの戦略のすべては、その短い半減期のゆえに繰り返して注入されることを必要とする増殖因子、ヒトでの使用で潜在的に危険であるウイルスベクター及び煩雑な生体外操作を要する移植可能な細胞療法を含む種々の短所を有する。さらに、組換えタンパク質は非常に高価であり得、細胞ベースの治療法はＵＳＦＤＡによる長期の規制及び認可のプロセスを必要とする可能性がある。

魅力的な代替法は、靭帯・骨接合部位への骨形成遺伝子の非ウイルス性送達である。残念ながら、ウイルスベクターはほとんどの非ウイルス性の方法よりもはるかに効率的である。生体内での非ウイルス性の遺伝子送達の効率を増強するために、遺伝子送達を最適化する短いパルスのエネルギーを頼る方法が開発されている。これらの方法はＤＮＡの取り込みを可能にする、細胞膜に一時的なナノサイズの孔の形成を誘導し、それが細胞のトランスフェクションをもたらす。この細胞穿孔は電気パルス、超音波またはレーザーエネルギーによって誘導することができる。

本発明者らのグループは内在性幹細胞への標的化された超音波が媒介する遺伝子送達の可能性を検討している。損傷部位に内在性幹細胞を動員するために、本発明者らが先ず、骨欠損部に生分解性の足場を埋入する２工程手順を使用すること。これには次いで、動員された細胞に、対象とする本発明者らの遺伝子を送達するために短いパルスのエネルギー（電気または超音波）を加えることが続く。このアプローチは、齧歯類モデルにおいて標的化された骨再生をもたらす。本発明者らは、宿主前駆細胞が足場埋入部位に移動し、次いで、特定の位置で導入遺伝子送達の標的になることを示している。次に本発明者らは、同様のアプローチがミニブタ脛骨モデルにおいて完全な骨欠損部の再生をもたらすことを示すことができた。

そのような結果は、超音波が媒介する遺伝子送達を用いて損傷部位での骨形成を標的とする最初の上手く行った実証を表す。この方法は幾つかの利点を有する。（１）それは特定の位置で加速された骨形成をもたらすので靭帯・骨統合を増強し得る。（２）それは組換えＢＭＰのような高価な増殖因子の反復送達を必要としない。（３）それは生体外での幹細胞の操作を必要としない。（４）それは、臨床的にすでに広く使用されている超音波システムを必要とするので、容易に臨床設定につながる。（５）技術が安全であり、骨形成を誘導するために導入遺伝子の一時的な発現しか必要としない（ウイルスベクターまたはＤＮＡの持続統合を必要としない）。

提案された治療的アプローチは骨への靭帯／腱の統合の増強について大きな能力を有する。提案された治療の背後にある生物学は、生体外の操作を行うことなく内在性の前駆細胞の役割に特に着目して明らかにされている。従って、この技術の次の合理的に考えられる適用は、ヒトの臨床試験に対する前段階として役立つ大型動物モデルにおけるものである。超音波技術が日常の患者管理に広く統合されていることを考えると、本発明者らは、このプロジェクトが容易に医療現場につながると考えている。ここに記載されている局在化した内在性の誘導される分化は、最新の修復技法にもかかわらず、高率の再発断裂に関連し続ける、多重靭帯膝損傷及び腱板腱の修復を含む、靭帯／腱すべての再建に適用できることが言及されるべきである。

生体内での細胞穿孔を用いて内在性ＭＳＣへのＢＭＰの直接トランスフェクションによって部分骨欠損部の完全な修復を促進することができる。コラーゲン足場埋入を用いて欠損部位に内在性幹細胞を動員することができ、遺伝子送達のために標的とすることができる。さらに、対象とする遺伝子を骨空隙及び骨折部位に送達するために同様の方法で超音波を使用することができる。最終的に、この超音波アプローチを用いて大型動物モデルにて部分骨折部を完全に癒合することができる。これらの特徴を合わせて、２工程処置は骨への腱／靭帯の加速された統合をもたらすことができる。第１の工程では、腱／靭帯・骨境界面の部位に内在性幹細胞が動員され、第２の工程では、超音波の助けを借りて骨形成遺伝子を動員された幹細胞に送達する。一緒に合わせたこれらの特徴は、腱再建手術に続いて移植片・骨の統合、回復された機能及び制御を増強するアプローチを確立することができる。幹細胞、超音波及び遺伝子送達を組み合わせて使用することは、筋骨格系における軟組織構造の損傷を患っている多種多様の患者に有意な多数の利益を提供することができる。

本明細書において、骨結合を促進する方法であって、（ｉ）骨と（ｉｉ）腱または靭帯との境界面を含む組織部位に作用物質を投与する工程と、１以上のタンパク質をコードする１以上のベクターを組織部位に送達する工程とを含み、組織部位の細胞が１以上のタンパク質を発現し、それによって骨結合が促進される、方法が記載されている。他の実施形態では、作用物質は組織部位に幹細胞を動員することができる。他の実施形態では、作用物質は足場である。他の実施形態では、足場にはコラーゲンが含まれる。たとえば、コラーゲン足場は骨孔に埋入されるであろう。他の実施形態では、組織部位は１以上の骨孔を含む。他の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程は注入を含む。他の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程は超音波照射を含む。種々の実施形態では、プラスミドのようなＤＮＡベクターを含む１以上のベクターはマイクロバブルと混合される。たとえば、一部の実施形態では、ベクターを送達する工程は、１０^７個のマイクロバブル中に懸濁させた１ｍｇまでの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードするプラスミドの１回の注入を含む。他の実施形態では、プラスミドの量には、約０．１～０．２５ｍｇ、約０．２５～０．５０ｍｇ、約０．５～１．０ｍｇ、約１．０～１．５ｍｇ、約１．５～２．０ｍｇまたは２ｍｇ以上が挙げられる。他の実施形態では、当該量のプラスミドを、１０^５個、１０^６個、１０^７個、１０^８個、またはより多くのマイクロバブル中に懸濁させる。他の実施形態では、ＢＭＰプラスミドは２週間の期間にわたって１日当たりナノグラムレベルのタンパク質の分泌をもたらすはずである。種々の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程は多重投与を含むことができる。たとえば、画像解析及び機能的改善に基づく部分奏効の証明後の３～６ヵ月以内の任意の反復治療単位の治療法。他の実施形態では、経皮の方法で超音波パルスが適用されるであろう。他の実施形態では、１以上のタンパク質は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。他の実施形態では、ＢＭＰは骨形成タンパク質－６（ＢＭＰ－６）を含む。他の実施形態では、ＢＭＰは骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）を含む。他の実施形態では、骨結合はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを用いて測定される。他の実施形態では、骨結合は磁気共鳴（ＭＲ）画像解析を用いて測定される。たとえば、骨結合または骨結合における改善は、ＣＴスキャンによって実証されるような骨孔部位での新しい骨形成の速度の上昇、及びＭＲ画像解析によって実証されるような骨孔部位での骨量と密度の上昇、または異常にもしくは過剰に骨が形成されることなく標準ケアに比べて骨に対する移植片の統合の速度が上昇することを観察することによって測定することができる。他の実施形態では、組織部位には損傷組織が含まれる。他の実施形態では、損傷組織には、膝及び肘の前十字靭帯、後十字靭帯、内側側副靭帯、膝及び肘の外側側副靭帯、腱板の腱の断裂が挙げられる。他の実施形態では、損傷組織は再建されている。他の実施形態では、再建には自家移植及び／または同種移植が含まれる。種々の評価項目は再建手術に関連するような改善された骨結合を実証することができる。たとえば、膝では靭帯の再建。制御よりも前に切り離しと旋回の動作が関与するスポーツをするまでに回復することができる患者の比率。本発明者らは、再建に使用される患者が報告する転帰スコア（Ｔｅｇｎｅｒ活動レベルスケール及びＭａｒｘ活動スケールに従った。これには、移植片供給源（解剖学のドナー部位）による階層化結果が含まれる）における改善と同様に移植片が同種であるかどうかも評価する。再発膝靭帯損傷を経験する患者の比率。反対側の損傷のない肢によって行われる同じ作業について測定される値の８０％以上であるレベルまで罹患肢を用いて単一肢敏捷性運動を行う能力を持つ患者の比率（たとえば、片足跳び試験、Ｙバランス試験、機能的運動評価）。或いは、腱板の腱の修復において：本発明者らは、患者が報告する転帰スコア（米国肩及び肘協会、肩評価スコア）、客観的な手の運動力試験及び能動的可動域試験における改善を評価するであろう。そのような例では、有効性を実証するための基準には、制御よりも前に切り離しと旋回が関与する活動まで回復することができる患者の比率の測定を挙げることができる。或いは、有意な疼痛、虚弱または可動域の制限なしで日常生活の活動を再開することができる患者の比率を測定することができる。

本明細書において、骨折を修復する方法であって、１以上のタンパク質をコードする１以上のベクターを骨折部位に送達する工程を含み、骨折部位の細胞が１以上のタンパク質を発現し、それによって骨折の修復が促進される、方法が記載されている。他の実施形態では、１以上のベクターを送達する前に骨折部位で作用物質が投与される。他の実施形態では、作用物質は組織部位に幹細胞を動員することができる。他の実施形態では、作用物質は足場である。他の実施形態では、足場はコラーゲンを含む。

他の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程には注入が含まれる。他の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程には超音波照射が含まれる。種々の実施形態では、プラスミドのようなＤＮＡベクターを含む１以上のベクターはマイクロバブルと混合される。たとえば、一部の実施形態では、ベクターの送達には、１０^７個のマイクロバブル中に懸濁させた１ｍｇまでの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードするプラスミドの１回の注入が含まれうる。他の実施形態では、プラスミドの量には、約０．１～０．２５ｍｇ、約０．２５～０．５０ｍｇ、約０．５～１．０ｍｇ、約１．０～１．５ｍｇ、約１．５～２．０ｍｇ、または２ｍｇ以上が挙げられる。他の実施形態では、当該量のプラスミドは、１０^５個、１０^６個、１０^７個、１０^８個、またはより多くのマイクロバブル中に懸濁させる。他の実施形態では、ＢＭＰプラスミドは２週間の期間にわたって１日当たりナノグラムレベルのタンパク質の分泌をもたらすはずである。種々の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程は多重投与を含むことができる。たとえば、画像解析及び機能的改善に基づく部分奏効の証明後の３～６ヵ月以内の任意の反復治療単位の治療法。他の実施形態では、経皮の方法で超音波パルスが適用されるであろう。他の実施形態では、１以上のタンパク質は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。他の実施形態では、ＢＭＰは骨形成タンパク質－６（ＢＭＰ－６）を含む。他の実施形態では、ＢＭＰは骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）を含む。

他の実施形態では、骨折の修復は移植片による治療に好適な骨折である。これには、たとえば、１ｃｍより大きな裂け目を含む骨移植片が含まれる。これにはさらに、脛骨、腓骨、大腿骨のような長骨が含まれるが、下顎骨、頭蓋顔面骨、及び脊椎のような他の骨も含まれる。

本明細書において、組織部位への遺伝子送達を増強する方法が記載されている。種々の実施形態では、当該方法は、１以上のタンパク質をコードする１以上のベクターを組織部位に送達する工程を含み、その際、送達は、超音波照射とマイクロバブルの画像化とマイクロバブルの実質的に大半が消散するまで継続する超音波の適用とを含み、それによって組織部位での遺伝子送達を増強する。他の実施形態では、１以上のベクターを送達する前に作用物質を骨折部位で投与する。他の実施形態では、作用物質は組織部位に幹細胞を動員することができる。他の実施形態では、作用物質は足場である。他の実施形態では、足場はコラーゲンを含む。

他の実施形態では、１以上のベクターを送達する工程には注入が含まれる。種々の実施形態では、プラスミドのようなＤＮＡベクターを含む１以上のベクターはマイクロバブルとの混合物の中にあることができる。たとえば、ＤＮＡとマイクロバブルの混合物が、超音波ユニットを用いて画像化されながら、注入される。種々の実施形態では、超音波パルスを適用して実質的に大半のマイクロバブルを消散させ、その際、実質的な大半は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を超えるまたはそれ以上のマイクロバブルを含む。種々の実施形態では、超音波には約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５ＭＨｚの伝送周波数を持つ超音波パルスが含まれる。種々の実施形態では、超音波には、約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９のメカニカルインデックスが含まれる。種々の実施形態では、超音波には約１、２、３、４、５、６、７または８ｃｍの深さが含まれる。種々の実施形態では、超音波には、約３０～６０秒間、約１分間～２分間、２～３分間、３～４分間、及び４～５分間の適用が含まれる。種々の実施形態では、超音波は、眼に見えるマイクロバブルすべてがはじけるまでおよそ２分間の１．３ＭＨｚの伝送周波数、０．６のメカニカルインデックス、及び４ｃｍの深さを伴う超音波パルスを含む。別の例では、同じパラメータが１．２のメカニカルインデックス及び３ｃｍの深さで適用される。種々の実施形態では、遺伝子送達を増強することは、マイクロバブルの画像化及び超音波の継続した適用を含まない技法に比べて発現において１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％以上の改善を含む。

実施例１
概要
以前の研究は、生体内の細胞穿孔と、ＢＭＰ遺伝子をコードするプラスミドの直接送達とを用いた骨誘導の実現可能性を明らかにしている。しかしながら、これらの研究のいずれも骨損傷部位では実施されていない。本発明者らの以前の研究は、細胞穿孔を用いたＢＭＰの直接トランスフェクションによって部分骨欠損を完全に修復できることを立証している。

特定の理論によって束縛されることなく、ここでは、効率的な標的化された骨再生の非ウイルス性遺伝子送達を達成するために、これが欠損部位における内在性間葉幹細胞（ＭＳＣ）の存在と協調すべきであることが示唆されている。この目的で、骨欠損部位にコラーゲン足場を埋入した。次に、本発明者らは、足場埋入後の様々な時点で足場に浸潤し、そこに集まる細胞を分析した。足場埋入の１０日後（ラットモデルにて）及び１４日後（ブタモデルにて）、スポンジは宿主前駆細胞によって実質的に浸潤された（図１～２も参照のこと）。第２の工程にて本発明者らは、マイクロバブル（ＭＢ）と混合したレポーター遺伝子を骨欠損部位に移動した前駆細胞に送達してトランスフェクション効率を高めようとした。ラット脊椎にて及びミニブタ脛骨にて作り出した骨欠損部にＸ線透視下でルシフェラーゼまたはＧＦＰのプラスミドを注入した。本発明者らは、生体内生物発光画像化を用いて、処理したラットにおける導入遺伝子の発現をモニターした。フローサイトメトリーを用いて、ブタの脛骨の骨欠損部における、ＧＦＰをトランスフェクションされた細胞の割合を定量化した。本発明者らの結果は、ルシフェラーゼの発現は処理後３５日まで検出され、次いで完全に減衰することを示した。導入遺伝子発現のこの一時的な性質は、標的組織型の異所性のまたは過剰な増殖のリスクを低減するので、及び持続した形質導入は実際のヒト臨床試験について有意な規制上の課題を提示するので、有利である。

実施例２
生体内における、送達された導入遺伝子を発現している細胞の検出
本発明者らは、ミニブタ脛骨欠損モデルにおいて、処理の５日後に、骨欠損内の細胞の４０～５０％がＧＦＰを発現することを示すことができた（図３Ａ）。さらに、本発明者らのフローサイトメトリーの結果は、トランスフェクションした細胞の７０％が既知のＭＳＣマーカーを発現することを示した（図３Ｂ）。

実施例３
骨再生を促進するような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）
本発明者らは、上記のミニブタ骨欠損モデルを用いて、骨再生を誘導するためにＢＭＰタンパク質をコードする遺伝子を送達しようと試みた（図４）。本発明者らは、関連する試験に基づいてＢＭＰ－２またはＢＭＰ－６のいずれかを用いて骨再生における有効性を評価し、ＭＳＣにおけるＢＭＰ－６の過剰発現が生体内での加速された骨形成をもたらすことを示した。以前記載されているように、第１の工程には、１ｃｍの脛骨部分欠損部にコラーゲン足場を埋入することが含まれる。１４日後、本発明者らは、ＭＢと予め混合したＢＭＰ－６（「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群）またはＢＭＰ－２（「ＢＭＰ－２＋ＵＳ」群）のいずれかをコードする１ｍｇのプラスミドＤＮＡを注入した。次に、本発明者らは、臨床超音波機械（Ｓｏｎｏｓ ５５００、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）を用いて欠損領域に経皮で超音波パルスを適用した。ＢＭＰ遺伝子と超音波の相乗効果を正しく評価するために、以下の対照群を使用した：ＭＢと予め混合したＢＭＰ－６プラスミドのみの注入（「プラスミドのみ」群）；ＭＢと予め混合した空のプラスミドベクターの注入及び超音波への曝露（「ＵＳのみ」群）；ならびに手術処置のみを受けた未処理のブタ（「足場のみ」群）。これらの群を、インタクトのままである反対側の脛骨とも比較した。欠損形成の８週間後（処理の６週間後）、ブタを屠殺し、マイクロＣＴ解析を用いて欠損部位での骨形成を定量した。結果は、ＢＭＰ－６プラスミドをトランスフェクションした骨欠損部にて高い見かけ密度（ｐ＜０．０１）で有意に多くの骨が形成される（ｐ＜０．０００１）ことを実証した。ＢＭＰ－６で処理した欠損部はすべて完全に癒合した一方で、ＢＭＰ－２で処理した欠損部または対照はどれも癒合しなかった。

実施例４
ＢＭＰ添加の生化学的試験
マイクロＣＴ解析の結果と合致して、処理した骨のさらなる生体力学的解析は、ＢＭＰ－６で処理した欠損部の機械的な優位性を明らかにした。ＢＭＰ－６と超音波とで処理した脛骨欠損部及びインタクトの脛骨は、ＢＭＰ－２と超音波とで処理した脛骨またはプラスミドのみの対照よりも有意に堅く、強く、且つ頑丈だった（ｐ＜０．０５）（図５）。インタクトの脛骨とＢＭＰ－６及び超音波で処理した脛骨との間で剛性に有意な差異は見いだされなかった（ｐ＞０．０５）ということはさらに、ＢＭＰ－６及び超音波で処理した脛骨の優れた生体力学的な特性を実証している。

実施例５
骨腱境界面での骨結合に着目
関心があるのは、これらの結果を適用してＡＣＬ再建モデルにて同種移植片・骨統合の加速についての同様のアプローチを開発できるかどうかを理解することである。本発明者らは、ＢＭＰタンパク質を使用して腱同種移植片の骨結合を増強することができると考えている。非ウイルス性遺伝子送達と比べると、組換えタンパク質とウイルスベクターを介したそのような因子の送達は、それらの関連する警告を有する。これらの有望なアプローチにもかかわらず、非ウイルス性の方法がＡＣＬ再建モデルに関して類似の成績を誘導できたことは実証されていない。

ここで、本発明者らは先ず、非生存手術からブタの屈筋腱を回収した。細菌学的な検査及び無菌同種移植片の調製のために、ブタの腱をＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｉｎｃに送った。次に、ミニブタモデルを用いてＡＣＬの再建を行った。ミニブタにおいてＡＣＬを離断後、予め調製した同種移植片を皮質ねじ固定によって大腿骨孔及び脛骨孔に移植した（図６）。重要なことに、脛骨孔及び大腿骨孔の中の同種移植片組織の両端にコラーゲン足場（ＤｕｒａＧｅｎ， Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）も埋入した。

手術の１４日後、本発明者らは、Ｘ線透視下で大腿骨孔及び脛骨孔双方の中にＭＢ中に懸濁させたＧＦＰプラスミドを注入した（図７Ａ）。次に、大腿骨孔のみに経皮超音波を適用した（図７Ｂ）。５日後、ミニブタを屠殺し、フローサイトメトリーを用いて骨孔内の細胞を解析した。本発明者らの結果は、大腿骨孔における細胞の約５０％がＧＦＰを発現していたことを示した（図７Ｃ）。本発明者らはまた、骨孔内の細胞の１２～２２％がＭＳＣマーカーを発現していたことも確認した（図７Ｄ）。

実施例６
骨腱境界面での骨結合に着目
特定の理論によって束縛されないで、本発明者らは、大型動物モデルにおける骨への腱同種移植片の統合を増強するために常在幹細胞への標的化されたＢＭＰ遺伝子送達の使用を提案している（図８）。

天然ＡＣＬを離断後、図６で示したように、その後脛骨及び大腿骨で骨孔に挿入される屈筋腱同種移植片を用いてミニブタにてＡＣＬを再建することができる。骨孔部位に宿主前駆細胞を動員するために、移植片の脛骨及び大腿骨の部分をコラーゲン足場で包み込む。手術の２週間後、ＭＢ中に懸濁させたＢＭＰ遺伝子をＸ線透視下でＡＣＬ再建骨孔に注入する（図７Ａ）。埋入した足場に集まる宿主の局所ＭＳＣへの治療遺伝子の細胞内送達を促すために、続いて骨孔に超音波パルスを適用する。これが宿主骨への増強されたＡＣＬ移植片の統合をもたらす（図７Ｂ）。

腱同種移植片・骨癒合を増強するための内在性幹細胞への超音波が媒介する遺伝子送達の使用は、筋骨格系での軟組織構造の損傷を患っている多種多様な患者に有意に多くの利益を提供することができる。

実施例７
試験設計
本発明者らの試験の目的は、臨界サイズの骨折修復のための内在性ＭＳＣに対する超音波が媒介する遺伝子の標的指向化から成る新規の治療法を開発することである。本発明者らの以前特定された仮説は、臨床的に関連する大型動物モデルにおける、超音波が媒介してマイクロバブルが増強するＢＭＰ－６遺伝子の遺伝子送達は、効率的な骨再生及び骨折癒合をもたらすということである。オス及びメスのユカタンミニブタ（Ｓ＆Ｓ Ｆａｒｍ）をこの試験に使用した。動物の平均体重±ＳＤは３７．０±３．６ｋｇであり、その平均月齢±ＳＤは７．８±１．２ヵ月だった。使用した試料サイズを評価して一元ＡＮＯＶＡを用いた０．８の検出力及びα＝０．０５を達成した。

臨界サイズの脛骨骨折部を再生する能力についてソノポレーションを検討した。ブタが手術を受け、１ｃｍの臨界サイズの骨折部をその脛骨にて作り出した。コラーゲン足場を骨折部内に埋入し、内在性ＭＳＣを動員した。１４日後、マイクロバブルと予め混合したＢＭＰ－６プラスミドを骨折部位に注入し、続いて超音波を適用することから成る治療（「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群）を受けるように、または対照群の１つに、ブタを無作為に割り当てた。以下の対照群：（１）処理なし（「足場のみ」群）；（２）マイクロバブルと予め混合したＢＭＰ－６プラスミドを注入（「ＢＭＰ－６」群）；または（３）マイクロバブルと予め混合した空のプラスミドベクターを注入後に超音波を適用（「ＵＳのみ」群）を使用した。さらに、自家移植片で処理した対照群（「自家移植片」群）を用いて、大きな骨折に対する処理のゴールデンスタンダードに比べた本発明者らの処理の有効性を評価した。レポーター遺伝子の発現ならびにＢＭＰ－６の遺伝子及びタンパク質の発現についての組織の分析を用いて、ソノポレーションの能力を評価した。マイクロコンピュータ断層撮影、組織学及び生体力学の検査を用いて骨形成を評価した。骨固定不良または動物福祉を脅かす経過観察中での苦痛の兆候のような急性の手技上の合併症を発生させている動物は試験から外した。

実施例８
プラスミドＤＮＡの作出
ユビキチンプロモータの制御下でのルシフェラーゼ２をコードするプラスミド（ｐＵｂ－Ｌｕｃ２）、及びサイトメガロウイルスプロモータの制御下での増強緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ－Ｎ１）を用いて導入遺伝子の発現を検討した。サイトメガロウイルスプロモータの制御下でＢＭＰ６をコードするプラスミド（ｐＣＭＶ－ＢＭＰ－６）を用いて、骨再生を誘導した。プラスミドの調製はどこかに詳述されている。プラスミドはすべて標準的な実験室手順を用いて増殖させ、ＥｎｄｏＦｒｅｅキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。

実施例９
臨界サイズの脛骨骨折モデル：外科手術
動物の処置はすべてＣｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの動物実験に関する施設内倫理委員会によって認可された。以前記載された方法によって長さ１ｃｍの臨界サイズの周囲の骨欠損部をユカタンミニブタの脛骨で作り出した。ヒトにおける臨界サイズの欠損部は脛骨の皮質直径の５０％及び長さ＞１ｃｍを含むと定義された。ユカタンミニブタにおける脛骨の平均長は１０ｃｍであり、成人ではそれは４３ｃｍである。従って、ミニブタにおける１ｃｍの欠損は平均的なヒトでの４．３ｃｍの欠損に匹敵することができる。１８時間の術前絶食に続いて、筋肉内のアセプロマジン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）とケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）とアトロピン（０．０２～０．０５ｍｇ／ｋｇ）とを用いてミニブタを鎮静状態にした。次いで動物にプロポフォール（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、気管内挿管を行った。処置の持続時間の間、１～３．５％の吸入イソフルランを用いて麻酔を維持した。脛骨にて１０ｃｍの前内側皮膚の切開を行った。軟組織及び骨膜をはっきりと切断し、脛骨骨幹を露出させた。振動鋸（ＣｏｎＭｅｄ，Ｌａｒｇｏ，ＦＬ）を用いて１ｃｍの骨を取り除き、部分骨折部を作り出した。特注の６穴リミテッドコンタクト・ダイナミックコンプレッションプレート（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｉｍｐｌａｎｔｓ，Ｓｔ．Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ，ＦＬ；図１６）を用いて骨折部を内部で固定し、孔サイズ１００μｍの生分解性コラーゲン足場の平らなシート（ＤｕｒａＧｅｎ Ｍａｔｒｉｘ，Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を成形し、骨折部位に埋入した。自家移植片処理の動物については、切除した骨断片を骨折部に移植し、固定プレートを用いて固定した。最終的に、吸収性の皮下縫合糸を用いて皮下組織を閉じ、皮膚は非吸収性縫合糸を用いて閉じ、それは手術の２週間後に取り除いた。動物は、手術前後の抗菌予防薬（セフチオフル、０．０５ｍｌ／ｋｇ）及び術後鎮痛剤（ブプレノルフィン、０．２ｍｇ／ｋｇ）を受けた。

実施例１０
骨折部位に動員された細胞のフローサイトメトリーによる特性評価
９匹の動物が手術を受け、術後７、１４及び２１日目に獣医安楽死溶液（Ｖｅｔｏｎｅ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）の注射によって麻酔され、屠殺された。死後、骨折部位から組織を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％コラゲナーゼ（１Ａ型、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて１時間消化し、７０μｍの細胞濾過器を用いて濾過し、２０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。抗ブタ抗体の限定された利用性を考慮してＭＳＣ表面マーカーについて新しく単離した細胞を解析した。細胞をマウス抗ヒト（ブタとの交差反応を伴う）ＣＤ９０及びマウス抗ブタＣＤ２９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。製造元の推奨に従って、蛍光色素を結合した二次抗体ラット抗マウス－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を適用することによって双方の一次抗体を検出した。ＬＳＲ－ＩＩフローサイトメータ，ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ及びＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエア（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を解析し、プロットした。二次抗体の非特異的な結合を定量し、その蛍光シグナルを実験群の検出値から差し引いた。

実施例１１
超音波が媒介してマイクロバブルが増強する遺伝子送達
骨折部の作出、足場の埋入、及び骨の固定の１４日後、各動物を上述の方法で鎮静状態にした。先ず、マイクロバブル懸濁液（Ｄｅｆｉｎｉｔｙ，Ｌａｎｔｈｅｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｎ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、Ｖｉａｌｍｉｘ振盪器（Ｌａｎｔｈｅｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｎ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いた４５秒間の振盪によって活性化した。次いで１０^７個のマイクロバブルと１ｍｇのプラスミドＤＮＡを一緒に混合した。マイクロバブルの注射器壁への凝集及び接着を回避するために、混合物を含有する注射器を注入前に手動で周期的に回転させた。次に、蛍光走査ミニＣアーム（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて骨折部を見つけ、１８Ｇの針を骨折部の中央に挿入した（図１８Ａ）。欠損の位置に一致するその焦点を持つＢモードに設定された焦点Ｓ３プローブを備えたＳｏｎｏｓ ５５００（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）ユニットを用いて視覚化しながら、混合物を注入した（図１８Ｂ、Ｃ）。次いで、可視化されたマイクロバブルがすべてはじけるまで、１．３ＭＨｚの伝送周波数と０．６のメカニカルインデックスと４ｃｍの深さでおよそ２分間のｃａｄｅｎｃｅ造影剤画像化モードを用いて治療用超音波パルスを適用した（図１８Ｄ）。

実施例１２
トランスフェクション効率の評価―ＧＦＰの発現
６匹の動物が手術を受けた。１４日後、マイクロバブルと予め混合したＧＦＰのプラスミドをミニブタに注射した。動物を無作為に割り当てたので、半分だけが注射の直後に超音波で処理された。トランスフェクションの５日後、動物を屠殺した。蛍光画像化システム（ＩＶＩＳ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて骨折部位の生体外光学画像解析を行い、処理した肢の中でのシグナルを見つけ出した。次いで、骨折部位に由来する細胞を上述のように単離した。フローサイトメトリーを用いて細胞を調べＧＦＰの発現を検出した。ＧＦＰ陽性細胞の割合は、トランスフェクション効率の測定として役立った。

実施例１３
トランスフェクション効率の評価―ルシフェラーゼの発現
６匹の動物が手術を受け、１４日後、マイクロバブルと予め混合したルシフェラーゼのプラスミドを注射した。動物を無作為に割り当てたので、半分だけが注射の直後に超音波で処理された。トランスフェクションの５日後、骨折部位に由来する細胞を上述のように単離し、ルシフェラーゼ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共にインキュベートした。得られたホモジネートを１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、１００μｌのルシフェラーゼ反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を２０μｌの透明な上清に加えた。ルミノメータ（ＴＤ－２０／２０；Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によってＲＬＵで発光を測定した。その値を、ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定したタンパク質含量で標準化した。ルシフェラーゼ活性は、タンパク質のｍｇ当たりのＲＬＵとして表された。

実施例１４
ＢＭＰ－６の遺伝子及びタンパク質の発現解析
１８匹の動物が手術を受け、術後１４日目にマイクロバブルと予め混合したＢＭＰ－６のプラスミドを注射した。動物を無作為に割り当てたので、半分だけが注射の直後に超音波で処理された。次いで超音波によるトランスフェクションの２、５、または１０日後に動物を無作為に屠殺した。死後、組織を回収して、ＢＭＰ－６の遺伝子及びタンパク質の発現を特性評価した。

定量的ＲＴ－ＰＣＲを行って超音波によるトランスフェクション後の種々の臓器におけるＢＭＰ－６遺伝子の発現を評価した。骨折部位、脳、骨髄、肺、肝臓、心臓、骨格筋、及び脾臓に由来する組織を死後に回収し、ＲＮｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＲＮＡを単離した。次いでランダムプライマーと逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＲＮＡを逆転写した。ＡＢＩ７５００プリズムシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＢＭＰ－６遺伝子の発現を解析した。ハウスキーピング遺伝子対照として１８ｓを使用した。

ＥＬＩＳＡを用いて骨折部におけるＢＭＰ－６タンパク質の発現を経時的に評価した。骨折部位に由来する組織を組織ホモゲナイザー（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）を用いてホモジネートし、プロテイナーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に４℃で２時間インキュベートした。得られたホモジネートを１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＢＭＰ－６のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のために上清を回収した。その値を、ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定したタンパク質含量で標準化した。

実施例１５
マイクロコンピュータ断層撮影を用いた骨形成の解析
２８匹のミニブタが手術を受け、１４日後、無作為に割り当てられて以下を受け取った：（１）処理なし（「足場のみ」群）、（２）マイクロバブルと予め混合したＢＭＰ－６プラスミド（ＢＭＰ－６」群）、（３）マイクロバブルと予め混合した空のプラスミドベクター及び超音波（「ＵＳのみ」群）、（４）マイクロバブルと予め混合したＢＭＰ－６プラスミド及び超音波（「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群）、または（５）自家移植片の移植。術後８週で動物を安楽死させ、以前記載されたような生体外高分解能マイクロコンピュータ断層撮影（ｖｉｖａＣＴ ４０；Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ，Ｂｒｕｔｔｉｓｅｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のために脛骨を回収した。５５ｋＶｐの電位でのＸ線管を用いてマイクロ断層撮影スライスを取得し、ボクセルサイズ３５μｍで再構成した。組織形態計測３Ｄ評価を用いて骨折部を評価した。制約された３Ｄガウシアンフィルター（σ＝０．８、サポート＝１）を用いて立体的関心領域のノイズを部分的に抑えた。大局的閾値処理法を用いて骨髄及び軟組織から骨組織を分割した。直接３Ｄ形態計測を用いて、マイクロ断層撮影のデータセットに基づいた骨量密度及び見かけ密度の定量的評価を作り出した。

実施例１６
組織学的な評価
各処理群からの検体１つを組織学的な評価に使用した。検体をきれいにして４％ホルマリンで３日間固定した。脱水はエチルアルコールと３段階のキシレンとの段階的な系を用いて達成した。段階的な系のキシレンとＯｓｔｅｏ－Ｂｅｄ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）樹脂、その後の１００ｍｌ当たり１．４０ｇの過酸化ベンゾイルを含有するＯｓｔｅｏ－Ｂｅｄ樹脂の触媒混合物を用いて浸透を行った。包埋は、１００ｍｌ当たり２．５ｇの過酸化ベンゾイルを含有するＯｓｔｅｏ－Ｂｅｄ樹脂溶液の最終的な触媒された樹脂混合物を用いて行った。炭化タングステンＤ－プロファイルナイフを用いたＬｅｉｃａ ＲＭ２１５５回転ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて組織切片を５．０μｍの切片厚に切断した。マトリクス特異的なマッソントリクローム染色を用いて切片を染色した。手短には、組織切片を室温にてブアン溶液で一晩処理した。流水のもとでスライドを１０分間すすぎ、ワイゲルトのヘマトキシリンで５分間染色した。次いでスライドをすすぎ、スカーレット酸フクシンで５分間染色し、再びすすぎ、その後、スライドを再びリンモリブデン酸・リンタングステン酸、アニリンブルー及び２％酢酸でそれぞれ５分間染色した。最終的にスライドをすすぎ、乾燥させ、標本にした。×２０拡大、ｚ－スタッキング及び５×５のタイル走査の４チャンネルレーザー走査顕微鏡７８０（Ｚｅｉｓｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いてスライドを画像化した。ズームイン画像については、単一のｚスタック画像を生成した。試料はすべて同一のゲイン及び露出設定を用いて走査した。

実施例１７
生体力学的解析
「自家移植片」群、「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群、「ＢＭＰ－６のみ」群（群当たりｎ＝５）に由来する１５の試料を生体力学的解析に使用した。回収に続いて、生理食塩水に浸したガーゼで試料を包み、解析まで密封し、凍結した。解析に先立って、試料をおよそ１時間で解凍し、次いでＰＢＳで２時間再水和させた。Ｂｏｓｗｏｒｔｈ Ｆａｓｔｒａｙ Ｃｅｍｅｎｔ（Ｍｉｄｗａｙ Ｄｅｎｔａｌ Ｓｕｐｐｌｙ，Ｌａｋｅｖｉｌｌｅ，ＩＮ）に各端の１”を沈めることによって特注のアライメント治具を用いて２つのアルミニウム製の四角のポットにて脛骨の近位端と遠位端を固定した。試験に先立ってノギスを用いて２つの固定した端の間で露出した脛骨のゲージ長を測定した。Ｉｎｓｔｒｏｎ ＥｌｅｃｔｒｏＰｕｌｓ １００００（Ｉｎｓｔｒｏｎ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）にて特注設計の治具を用いてねじり試験を行った。回転アクチュエータを１度／秒の速度で破断するまで回転させた。試験の間、荷重及び回転のデータを連続して記録した。収集したデータを特注のＭＡＴＬＡＢコードを用いて解析し、ねじり剛性、降伏トルク、最終トルク、降伏トルクまでの回転、最終トルクまでの回転、降伏トルクまでの仕事量及び最終トルクまでの仕事量を決定した。

実施例１８
統計的解析
ソフトウエアのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてデータを解析した。結果は平均値±ＳＥとして提示する。データ解析は、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定と共に一元ＡＮＯＶＡまたは二元ＡＮＯＶＡを用いて行った。有意性を評価するには、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。

実施例１９
ソノポレーションは、骨折部位に動員された内在性ＭＳＣにおいてレポーター遺伝子の発現をもたらす
ミニブタが手術を受け、その間に１ｃｍの臨界サイズの脛骨骨折部を作り出し、生分解性コラーゲンの足場を埋入した（図１６）。手術の１４日後（手術の１４日後に間葉系細胞の動員が最大となることに留意されたい）に、マイクロバブルが増強し、超音波が媒介する遺伝子送達によって骨折部位を処理した（図１７）。マイクロバブルと混合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼのいずれかであるレポーター遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを骨折部位に経皮注入し、動物の半分を無作為に超音波で処理した（図１８）。骨折部位の生体外光学画像解析は、ＧＦＰ処理した動物について骨折部位によく局在化した蛍光シグナルを明らかにした（図１１Ａ）。フローサイトメトリーは、超音波で処理した動物（「ＵＳ」群）の脛骨骨折部内で回収した細胞の４０％が未処理の動物「非ＵＳ」群）で見られるものより６倍多いＧＦＰを発現することを明らかにした（ｐ＜０．０５、図１１Ｂ）。超音波処理した動物の骨折部に由来するＧＦＰ発現細胞は、超音波に供されなかった動物の骨折部位に由来する細胞より３倍多く蛍光があり（ｐ＜０．０１、図１１Ｃ）、８０倍多いルシフェラーゼ活性を示した（ｐ＜０．０５、図１１Ｄ）。興味深いことに、トランスフェクションした細胞の検査は、超音波処理群にてＭＳＣマーカーであるＣＤ２９及びＣＤ９０を発現している細胞が有意に多いことを示した。超音波処理群におけるＧＦＰ陽性細胞の９０％がＣＤ２９陽性であり、ＧＦＰ陽性細胞の８０％がＣＤ９０陽性であったのに対して、未処理群におけるＧＦＰ陽性細胞のたった３０％がＣＤ２９陽性であり、４０％がＣＤ９０陽性だった（ｐ＜０．０１、図１１Ｅ、Ｆ）。ＣＤ４４陽性細胞では有意差は観察されなかった（ｐ＝０．０７；図１１Ｇ）。全体的に見て、超音波処理した骨折部位は、有意に高い前駆細胞のトランスフェクション率、ならびに強い導入遺伝子発現レベルを示した。

実施例２０
ソノポレーションは骨折部位において一時的なＢＭＰ－６の発現を誘導する
１８匹のブタを上述のように手術し、超音波が媒介するＢＭＰ－６及びマイクロバブルの遺伝子送達（「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群）または超音波を適用しないＢＭＰ－６とマイクロバブルの注入（対照「ＢＭＰ－６」群）によって処理した。脛骨骨折部へのソノポレーション後のＢＭＰ－６遺伝子の局所発現を経時的に評価した。

欠損の位置に一致する焦点を持つＢモードに設定された焦点Ｓ３プローブを備えたＳｏｎｏｓ ５５００（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）ユニットを用いて視覚化しながら、混合物（ＤＮＡ及びマイクロバブル）を注入した（図１８Ｂ、Ｃ）。次いで、可視化されたマイクロバブルがすべてはじけるまで、１．３ＭＨｚの伝送周波数と０．６のメカニカルインデックスと４ｃｍの深さでおよそ２分間のｃａｄｅｎｃｅ造影剤画像化モードを用いて治療用超音波パルスを適用した（図１８Ｄ）。ＡＣＬの試験については、１．２のメカニカルインデックス及び３ｃｍの深さで同じパラメータを適用した。

骨折部位から単離した細胞の定量的ＰＣＲ解析は、処理の２日後及び５日後でそれぞれ、超音波処理動物において対照動物と比べて８５０倍及び４００倍高いＢＭＰ－６発現を示した（ｐ＜０．０５、図１２Ａ）。１０日目では、ＢＭＰ－６遺伝子の発現レベルは検出できなかった。同様に、骨折部位におけるＢＭＰ－６タンパク質の分泌レベルは、処理の２日後及び５日後でそれぞれ、超音波処理しなかった動物に比べて７０倍及び１２０倍高かった（ｐ＜０．０１、図１２Ｂ）。無視できるレベルのＢＭＰ－６タンパク質が１０日目に検出された。加えて、的外れの組織ではＢＭＰ－６の過剰発現は見いだされなかった（図１９）。

実施例２１
ＢＭＰソノポレーションは生体内での骨再生を促す
次に、局所ＢＭＰ－６遺伝子送達の治療効果を脛骨の癒合しない骨折部の同じブタモデルで評価した。２８匹の動物を上述のように手術した。ＢＭＰ－６と超音波（「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群）で処理した動物における脛骨骨折部の再生を、未処理の対照群（「足場のみ」群）、超音波なしでマイクロバブルと予め混合したプラスミドの注入のみで処理した動物（「ＢＭＰ－６のみ」群）、またはマイクロバブルと予め混合した空のプラスミドと超音波で処理した動物（「ＵＳのみ」群）、及び自家移植片で処理したゴールデンスタンダード対照群（「自家移植片」群）と比べた。術後８週目のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）の解析は、ＢＭＰ－６と超音波で処理した骨折部は新しく形成された骨でその体積の７５％を再生し、それは自家移植片の移植と同等であり（ｐ＞０．０５）、他の処理群すべての２倍であること（ｐ＜０．００１；図１３Ａ）を明らかにした。ＢＭＰ－６と超音波で処理したオスブタとメスブタの間では癒合での差異は認められなかった（ｐ＝０．１１９、群当たりｎ＝４）。さらに、「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群における新しく形成された骨は、「自家移植片」群（ｐ＞０．０５）を除いて他の群すべてよりも有意に多く骨化した（ｐ＜０．０１；図１３Ｂ）。重要なことに、ＢＭＰ－６と超音波（「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」）または自家移植片で処理した骨折部のみが脛骨の完全な皮質連続性によって証拠付けられる癒合を示した（図１３Ｃ）。組織学的な解析は、ＢＭＰ－６と超音波で処理したブタにて成熟した新しく形成された骨による骨折部の完全な再生及び骨細胞の存在があることを示した（図１３Ｄ）。しかしながら、他の群ではすべて、多量の肉芽組織の沈着及び線維化に沿って不十分な骨形成が見いだされた（図１３Ｄ）。

実施例２２
ＢＭＰ－６遺伝子送達は処理した骨の機能的な癒合を誘導する
手術した動物から摘出した脛骨にて盲検でねじれ試験を行い、術後８週目での処理した骨の機械的特性を調べた。μＣＴ及び組織学的解析の結果と合致して、「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群に由来する脛骨は「ＢＭＰ－６のみ」群に由来する脛骨骨折部に比べて少なくとも２倍高い機械的な剛性、強度、及び靭性を示した（ｐ＜０．０５；図１４）。「ＢＭＰ－６＋ＵＳ」群と自家移植片群との間では有意差は観察されなかった（ｐ＞０．０５）。

実施例２３
考察
この研究において本発明者らは、大型動物モデルにおける原位置での骨再生のための、超音波が媒介してマイクロバブルが増強する遺伝子送達（図１５）の使用を提示している。本発明者らは、骨折部位内に存在する細胞への超音波が媒介する遺伝子送達は、主として内在性ＭＳＣを標的とする一時的な局所遺伝子発現を達成することを示すことができた。骨形成遺伝子の送達は、非ウイルス性の遺伝子送達系に一致する空間的且つ時間的な発現パターンをもたらした。さらに、それは、術後８週で完全な骨折癒合、及び自家移植片と同等の生体力学的な特性をもたらした。この研究において本発明者らは、パラメータの意図された範囲内で臨床用の超音波システムを使用し、それにはコントラスト画像化の使用が含まれる。分野におけるコンセンサスに基づいて、本発明者らは安全な範囲内で超音波エネルギーを使用した。実際、超音波曝露の後に、加熱または熱に関連した損傷の兆候は、臨床的及び組織学的に明らかではなかった。重要なことに、異所性の導入遺伝子の発現または炎症反応の証拠が観察されなかったということは、見込みのある安全なプロファイルを示唆している。本発明者らが知っている限りでは、これは、臨床的に関連する大型動物モデルにおいて成功したソノポレーションが誘導する遺伝子送達及び骨再生を示す最初の報告である。

非ウイルス性の遺伝子送達が大型動物モデル（イヌ）にて完全な骨折修復を達成することができることは報告されている。ヒトの副甲状腺ホルモンをコードするプラスミドＤＮＡを含有する遺伝子を活性化するマトリクスインプラントを用いて、１．６ｃｍ及び１．０ｃｍのサイズの骨折部についてそれぞれ１８週及び８週で完全な臨界サイズの脛骨骨折部の修復が達成された。それ以来、大型動物が関与する他の研究はウイルス性遺伝子送達に主として着目した。これには、骨粗鬆症のヒツジにおける脛骨骨折部にてＢＭＰ－２のアデノウイルス遺伝子送達後の改善された骨折部の修復を示す報告が含まれる。他の報告は、ＢＭＰ－２をウイルスで形質導入した骨髄由来間葉幹細胞をヤギの脛骨骨折部に移植した後の改善された骨折部の修復を明らかにしている。これらの有望な成績にもかかわらず、ウイルスはヒトでの使用を制限する多数の安全性の懸念を有する。他の報告は、アデノウイルスによる骨折部位へのＢＭＰ－２遺伝子送達がウイルスベクターに対する一時的な細胞性の及び持続する液性の免疫応答をもたらしたことを観察している。加えて、臨床試験は、ウイルス性の遺伝子送達が死を招く全身性の炎症反応を惹起する可能性があり、ゲノムへの無作為な遺伝子挿入によって発癌を引き起こし得ることを示している。従って、効率的な非ウイルス性の遺伝子送達の方法が臨床での使用のために開発されなければならない。

この研究まで、超音波が媒介するＢＭＰ遺伝子送達は骨折部の修復には上手く適用されていなかった。研究者らは、ラットの大腿骨癒着不能モデルにてＢＭＰ－２及びＢＭＰ－７のマイクロバブルが増強する超音波が媒介する遺伝子送達を使用していた。反復処理を用いて遺伝子の過剰発現及び異所性の骨形成を上手く誘導したにもかかわらず、彼らは骨折部位にて有意な同所性の骨形成を誘導することができなかった。これらの差異は他の動物及び臨床の研究で報告されたように、骨折部位の微細環境内でのＢＭＰ－２及びＢＭＰ－７の低い骨形成能に起因し得る。ＢＭＰに対する生体応答はＢＭＰ送達の部位に存在する細胞型及び微細環境に左右される。ＢＭＰ－６ははっきり異なるＢＭＰＲ－ＩＡ受容体特異性を有し、骨芽細胞による骨形成を強く促進する一方で、内在性のＢＭＰ阻害因子の影響をあまり受けないようにする。本発明者らの以前出版された報告では、本発明者らは、ＢＭＰ－６はＭＳＣにて過剰発現されると、試験管内及び生体内の双方でＢＭＰ－２よりも良好な骨形成能を有し、効率的な骨形成を誘導することを示した。一部の研究は、ＢＭＰ－６のシグナル伝達は骨軟骨の及び膜内の骨化の双方のメカニズムを介して機能し、後者が主要な経路なので、骨折部位内でさらに迅速な石灰化をもたらすことを示唆している。従って、ＢＭＰ－６はさらに強力な同所性骨誘導因子として役立ち得る。

本発明者らの研究とＦｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒらによって行われた研究の間の別の差異は２工程手順であり、それには内在性前駆細胞の骨折部位への動員が含まれる。本研究は、コラーゲンの足場を骨折部位に埋入することによって手術後１４日以内に足場における効率的な内在性前駆細胞の移動及び保持を達成できることを示した。
興味深いことに、ＢＭＰ－２をコードするアデノウイルスベクターの遅延投与はラットにおける臨界サイズの大腿骨骨折部にて骨形成を改善したことが報告されている。遅延処理はさらに多くの前駆細胞が骨折部位に集まるのを可能にし、ＢＭＰ分泌に反応し、骨再生を誘導する標的化細胞にてベクターをさらに効率的にすることはありそうなことである。全体的に見て、生きている前駆細胞の集団への有効な送達戦略と一緒に強力な骨形成性タンパク質を組み合わせることは効率的な骨折修復に重要であると思われる。

ここに記載されている方法の改変には、マイクロバブルとプラスミドの足場への事前の組込みが含まれてよく、それは後でこれらの物質を注入する必要を除くことになる。最近の論文は、マウスにおける筋肉内移植の直後に超音波が適用されるＣ２Ｃ１２細胞と一緒にマイクロバブル、ＢＭＰ２／７同時発現プラスミドを含有するフィブリン／コラーゲンのハイブリッドマトリクスを使用した。その研究は足場内で外来性の細胞を組み合わせたが、生体内ではほんの少量の新しい骨しか生成されなかった。本発明者らが提案した方法では、本発明者らが以前齧歯類でプロセスは少なくとも２週間かかることを示したように、内在性の前駆細胞の動員が重要な因子である。従って、プラスミドとマイクロバブルとを含有する足場を埋入することは、裸のＤＮＡはＤＮＡ分解酵素によって消化され、マイクロバブルは局所に注入されるとおよそ１０分間の短い半減期を有するので、これらの成分の長期の保護を要することになる。本発明者らが知る限りでは、そのような複合足場を生成するために克服することが必要である技術的な障壁がある。

癒着不能の治療のための臨床上のゴールデンスタンダードは自家移植片を利用する。生きている組織として、その骨誘導性及び骨伝導性の特性は他の種類の移植片を超えてそれらをさらに優れたものにする。骨移植のための最も一般的なドナー部位は患者自身の腸骨稜である。ここで使用される自家移植片は天然の骨切り脛骨なので、それらは臨床設定で利用できる自家移植片よりもはるかに優れていた。この群は仮説上完全な症例シナリオを表し、失った骨の正確な自己複製が骨折部位に移植された。この研究で使用された自家移植片はサイズ、形状、及び骨内容が骨折部位と構造的に同一である。これは、本発明者らの結果に見られるように８週間で効率的な骨形成及び欠損部の完全な橋渡しを可能にした。加えて、その回収は、ドナー部位の病的状態をもたらさず、手術時間を短縮し、且つ回復を改善した。さらに、これらの自家移植片は骨膜の血液供給につなげられた。これらの因子は骨折癒合を改善することが示された。このアプローチは他の種類の移植片に比べて優れた骨折修復をもたらすことが報告されている。自家移植片の群とＢＭＰ－６及び超音波の適用で処理された群（ＢＭＰ－６＋ＵＳ）との間で見いだされた類似性は、本発明者らが提案している治療法が、臨界サイズの骨折部の治療について臨床症例のすべてにおいて常に利用できるわけではない「最適な」自家移植片と同じくらい効率的であるという概念の証明として役立つ。

本発明者らの研究と他の報告のそれとの間の最終的な差異は処理の間にマイクロバブルの振動をモニターするための超音波画像診断の使用である。超音波療法は高度に有望である一方で、超音波の波動伝搬はそれを適用できる培地によって限定されるので、これはプロトコルの重要な態様である。骨及び固定板は双方とも超音波の波動を高度に反射する。これらの反射は骨折部位における超音波場を有意に変化させることができ、トランスフェクション効率を低下させる。この効果は他の研究でも観察され、有効な遺伝子送達のためにさらに長い超音波曝露の時間を要した。本発明者らが提案する治療法を用いた効率的な遺伝子送達については、画像診断が、固定板が超音波の波動を妨げる能力を有するにもかかわらず充分なソノポレーションを確保する機会を提供する。さらに強固な超音波システムは、将来のヒト治療法におけるこれらのハードルを回避するように実施することができる。本研究で調べなかったパラメータの１つは反復処理の使用である。治療法の相対的な容易さと低い侵襲性のゆえに、種々の時点での反復処理は骨形成の効果をさらに高め、より急速且つ改善された骨修復を促進する可能性がある。従って、複数の処理の実施は将来の超音波が媒介する遺伝子送達研究における別のアプローチであってもよい。しかしながら、細胞への過剰なＤＮＡ送達は機械的なメカニズムを介して細胞毒性をもたらし得ることが言及されなければならない。さらに、長い超音波曝露は、過剰な組織癒合及び組織の損傷による異栄養性石灰化を含む種々の有害効果をもたらし得る。さらに高い超音波強度に伴って、超音波とマイクロバブルの組み合わせは、組織内でのマイクロバブルの崩壊の間のジェッティングにより細胞溶解ももたらし得る。

現在の研究は、短期間での超音波を用いたＢＭＰ遺伝子送達の効果を評価した。対照と比べた骨癒合にて方法の効率性を完全に評価するために長期試験の必要がある。ここで、本発明者らは、本発明者らが一部の骨伝導性特性を有することを以前示したコラーゲンの足場を動物すべてに埋入した。さらに、足場を含めても、且つ短期間内に、本発明者らは、群間の癒合率、骨形成及び生体力学における有意な結果を示すことができた。本発明者らは、コラーゲン足場とＢＭＰ－６プラスミドとマイクロバブルと超音波との併用療法が対照群よりも優れ、自家移植片処理動物に類似することを判定することができる。
低強度のパルス状超音波（ＬＩＰＵＳ）が骨折癒合を加速することができるかどうかという多くの論争がある。最近の研究は、ヒト患者では超音波単独は機能的回復を改善せず、脛骨骨折部のＸ線写真の癒合を加速しないことを示した。加えて、ＬＩＰＵＳは何週間も毎日適用される（上述の研究では５２週まで）一方で、本発明者らに提案されている治療法が単回の曝露のみを要したということは、超音波単独が骨折部の修復に効果を有する可能性を低くしている。また、本発明者らのデータ解析は、陰性対照群（「足場のみ」群）と比べた超音波とマイクロバブル中に懸濁させた空のプラスミドで処理した群（「ＵＳのみ」群）との間の骨形成に差異がないということは、治療効果は局在化した遺伝子送達によって達成されるという本発明者らの仮説をさらに支持している。

これらの結果は、組織への将来の超音波が媒介する遺伝子治療について大いに明るい見通しを示している。超音波技術は安全であり、診療所では広く使用されているので、このアプローチは容易に臨床診療につなげることができる。マイクロバブルの導入は注入した物質の局在化及び処理部位におけるソノポレーション法のリアルタイムのモニタリングを可能にする。この方法は多数の異なる適用で使用される能力を有し、原位置での組織再生を促進する。骨折の文脈では、この治療法は種々の整形外科適応に適用することができる。それは、最小限に侵襲性であり、生体外の幹細胞の操作を必要とせず、高価な増殖因子の使用または移植にための患者自身の骨の回収を回避する。重度の骨粗鬆の部位で骨再生を誘導する代わりの効率的な方法は未だに見いだされていないので、超音波が媒介する遺伝子治療法はこの満たされない臨床ニーズに積極的な応答を提供し得る有望なツールである。

上記の種々の方法及び技法は、本発明を実施する多くの方法を提供している。当然、記載されている目的及び利点のすべてが本明細書に記載されている特定の実施形態に従って必ずしも達成されてもよいわけではないことが理解されるべきである。従って、たとえば、当業者は、本明細書で教示され、または示唆されてもよいような他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で教示されるような１つの利点または利点の群を達成するまたは最適化するやり方で方法を実施することができることを認識するであろう。種々の有利な及び不利な代替が本明細書で言及されている。一部の好ましい実施形態は１つの、もう１つのまたは幾つかの有利な特徴を具体的に含む一方で、他は１つの、もう１つのまたは幾つか不利な特徴を具体的に排除し、さらに他は、１つの、もう１つのまたは幾つかの有利な特徴の包含によって存在する不利な特徴を具体的に軽減することが理解されるべきである。

さらに、技量のある熟練者は様々な実施形態に由来する種々の特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上記で議論された種々の要素、特徴及び工程、と同様にそのような要素、特徴または工程のそれぞれについての他の既知の同等物は、本明細書に記載されている原理に従って方法を実施するために当業者によって混合し、マッチさせることができる。種々の要素、特徴及び工程の間では、多様な実施形態にて一部は具体的に包含され、他は具体的に排除されるであろう。

本発明は特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されているが、本発明の実施形態は具体的に開示されている実施形態を超えて、他の代替の実施形態及び／またはその使用及び改変及び同等物まで拡大することが当業者によって理解されるであろう。

多数の変化及び代替要素が本発明の実施形態にて開示されている。その上さらなる変化及び代替要素は当業者に明らかであろう。これらの変化の中で、限定しないで、内在性幹細胞を動員するのに使用される作用物質、プラスミド及び前記プラスミドによってコードされるタンパク質、プラスミドを送達する方法、生成物の特定の使用は本発明の教示を介して作り出される。本発明の種々の実施形態はこれらの変化または要素のいずれかを具体的に包含することができ、または排除することができる。

一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を記載し、請求するのに使用される成分や、たとえば、濃度、反応条件等のような特性の量を表現する数は時には、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。従って、一部の実施形態では、記述された説明及び添付の特許請求の範囲にて述べられている数的パラメータは、特定の実施形態によって得られるように求められる所望の特性に応じて変化することができる近似値である。一部の実施形態では、数的パラメータは報告された有意な数字の数の観点で及び普通の四捨五入法を適用することによって解釈されるべきである。本発明の一部の実施形態の広い範囲を示す数的な範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、具体例で述べられる数値は出来るだけ正確に報告される。本発明の一部の実施形態にて提示される数値はそれぞれの試験測定値にて見いだされる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含有してもよい。

一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を記載する文脈で（特に後に続く特許請求の範囲の特定の文脈で）使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の参照は単数及び複数の双方を対象とするように解釈することができる。本明細書の値の範囲の引用は範囲内に入る各別々の値を個々に参照することの簡単な方法として役立つように単に意図される。本明細書で指示されない限り、各個々の値はそれが本明細書で個々に引用されたかのように本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されている方法はすべて、本明細書で指示されない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、好適な順序で実施することができる。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意の及びすべての例のまたは例となる言語（たとえば、「ｓｕｃｈ ａｓ」）は、本発明の理解をさらに良好に容易にするように単に意図され、さもなければ請求される本発明の範囲で限定を提示するものではない。本明細書における言語は、本発明の実践に必須である任意の請求されない要素を示すと解釈されるべきではない。

本明細書で開示されている本発明の代替の要素または実施形態のグループ分けは限定として解釈されるべきではない。各群のメンバーは個々に、または本明細書で見いだされる群の他のメンバーまたは他の要素との組み合わせで参照することができ、請求することができる。群の１以上のメンバーは都合上及び／または特許性の理由で群に含めることができ、またはそれから削除することができる。そのような包含または削除が生じる場合、本明細書は改変されたような群を含有すると本明細書では見なされるので、添付の特許請求の範囲で使用されるマーカッシュ群すべての記述された説明を満たす。

本発明者らに既知の本発明を実施するための最良の方法を含む本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。それら好ましい実施形態における変化は前述の説明を読む際に当業者に明らかになるであろう。技量のある熟練者は適宜そのような変化を採用することができることが熟考され、本発明は本明細書で具体的に記載されている以外に実践することができる。従って、本発明の多数の実施形態は、適用法令によって許可されるようにそれに添付された特許請求の範囲で引用される主題の改変及び同等物のすべてを含む。さらに、その考えられる変化すべてにおける上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書で指示されない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、本発明によって包含される。

さらに、数的参照は、本明細書全体にわたって特許及び印刷された出版物に対して行われている。上記で引用された参考文献及び印刷された出版物のそれぞれは、その全体が参照によって個々に本明細書に組み入れられる。

最後に、本明細書で開示されている本発明の実施形態は本発明の原理の説明に役立つと理解されるべきである。採用することができる他の改変は本発明の範囲内にあることができる。従って、限定としてではなく、例として、本明細書の教示に従って本発明の代替の構成を利用することができる。従って、本発明の実施形態は示され、記載されたようなものに正確には限定されない。

Claims (9)

1. コラーゲン足場を含む剤であって、前記コラーゲン足場が内在性の間葉幹細胞を組織部位に動員する剤；および
   マイクロバブルおよび骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）または骨形成タンパク質－６（ＢＭＰ－６）をコードする１つ以上のベクターを含む組成物
   を組み合わせて使用することを特徴とする、骨と腱または骨と靭帯との境界面における骨結合を促進するための医薬であって、
   前記組み合わせの使用が、前記剤が（ｉ）骨と（ｉｉ）腱または靭帯との境界面を含む損傷組織部位に投与された後、前記マイクロバブルおよびＢＭＰ－２またはＢＭＰ－６をコードする１つ以上のベクターを含む組成物が前記損傷組織部位に送達され、その後に前記損傷組織部位に超音波照射が適用されることを含み、
   前記損傷組織部位における前記動員された間葉幹細胞がＢＭＰ－２またはＢＭＰ－６をコードする1つ以上のベクターでトランスフェクトされ、前記ＢＭＰ－２またはＢＭＰ－６を発現することによって、骨結合が促進される、前記医薬。
2. 前記組織部位が１つ以上の骨孔を含む、請求項１に記載の医薬。
3. 前記１つ以上のベクターの送達が注入を含む、請求項１に記載の医薬。
4. 前記骨結合がコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを用いて測定される、請求項１に記載の医薬。
5. 前記骨結合が磁気共鳴（ＭＲ）画像解析を用いて測定される、請求項１に記載の医薬。
6. 前記損傷組織が、膝及び肘の前十字靭帯、後十字靭帯、内側側副靭帯、膝及び肘の外側側副靭帯、ならびに腱板腱の断裂を含む、請求項１に記載の医薬。
7. 前記損傷組織が再建されている、請求項１に記載の医薬。
8. 前記再建が自家移植及び／または同種移植を含む、請求項７に記載の医薬。
9. 請求項１に記載の医薬；及び
   使用説明書
   を含む、骨と腱または骨と靭帯との境界面における骨結合を促進するためのキット。

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