DE19837230A1

DE19837230A1 - Neurotrophin-4 zur Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs

Info

Publication number: DE19837230A1
Application number: DE19837230A
Authority: DE
Inventors: Jean Krutmann; Markus Grewe
Original assignee: Jean Krutmann; Markus Grewe
Current assignee: KRUTMANN, JEAN, PROF. DR.MED., 41844 WEGBERG, DE G
Priority date: 1998-08-17
Filing date: 1998-08-17
Publication date: 2000-03-09

Abstract

Erfindungsgemäß wird Neurotrophin-4 als therapeutischer Wirkstoff zur Verfügung gestellt, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs, wie des malignen Melanoms.

Description

Die Erfindung betrifft Neurotrophin-4 als therapeutischer Wirkstoff, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung des malignen Melanoms. Das Neurotrophin-4 kann als solches verabreicht werden, insbesondere als subcutane Formulierung, besonders bevorzugt wird das Neurotrophin-4 jedoch im Rahmen einer Gentherapie eingesetzt.

Neurotrophine stellen eine Familie von Wachstumsfaktoren dar, zu denen fünf strukturell ähnliche Proteine gezählt werden, nämlich der Nerve Growth Factor (NGF), der Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), das Neurotrophin-3 (NT-3), das Neurotrophin-4 (NT-4) und das Neurotrophin-6 (NT-6). In Abhängigkeit der Nomenklatur wird Neurotrophin-4 auch als Neurotrophin-5 (NT-5) bezeichnet, es handelt sich jedoch in beiden Fällen um das gleiche Protein (Neuron, 6, 1991, 845-858, Neuron, 7, 1991, 857-866 und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, 3060-3064).

Die wesentliche bislang beschriebene Funktion der Neurotrophine besteht darin, das Überleben bestimmter, zum Teil überlappender Nervenpopulationen zu stimulieren. Bezüglich der Wirkung von Neurotrophin auf Melanomzellen liegt nur wenig Information vor. Die Arbeit von Yaar et al. (Yaar M. et al., J. Clin. Invest. 1994, 94: 1550-1562) zeigt, daß Neurotrophin-3 einen förderlichen Effekt auf das Wachstum von Melanozyten hat. Für Neurotrophin-4 und die übrigen Neurotrophine wurde ein derartiger Effekt noch nicht offenbart.

Die Struktur des Neurotrophin-4 ist vollständig aufgeklärt (Neuron, 6, 1991, 845-858, Neuron, 7, 1991, 857-866, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, 3060-3064, European Journal of Neuroscience, 5, 1993, 605-613 and J. Clin. Invest., 94, 1994, 1550-1562). Bei Neurotrophin-4 handelt es sich danach um ein 14 kDa Protein, das aus einem 27 kDa großen Precursor Protein hervorgeht. Das für Neurotrophin-4 kodierende Gen ist auf dem Chromosom 19 Band q13.3 lokalisiert. Neurotrophin-4 bindet an den trk Rezeptor und ist hierdurch in der Lage, das Überleben von und das Auswachsen von Neuriten aus sensorischen Neuronen zu stimulieren.

Es ist bekannt, daß Neurotrophin-4 in der menschlichen Haut exprimiert wird (Journal of Investigative Dermatology, 109, 1997, 412). Es zeigte sich, daß kultivierte normale humane Keratinozyten, nicht aber dermale Fibroblasten, Neurotrophin-4 spezifische mRNS exprimieren. Das Neurotrophin-4 Protein konnte mittels Immunpräzipitation in Lysaten und im Überstand von humanen Keratinozyten nachgewiesen werden. In vivo Untersuchungen unter Verwendung eines anti-Neurotrophin-4 Antikörpers zeigten eine spezifische Reaktivität der menschlichen Epidermis, nicht aber der Dermis.

Bei Hautkrebs bzw. Tumoren neuroektodermalen Ursprungs, insbesondere bei malignen Melanomen, handelt es sich um eine schwer behandelbare Krankheit, die häufig zum Tode des Patienten führt, insbesondere wenn mit einer Behandlung zu spät begonnen wird. Es gibt zwar eine Reihe von Möglichkeiten, maligne Melanome zu behandeln, doch alle Behandlungen sind mit ernst zu nehmenden Nebenwirkungen behaftet. Es besteht daher ein Bedürfnis nach neuen Arzneimitteln und neuen Ansätzen zur Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs, insbesondere von malignen Melanomen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Arzneimittel und Verfahren zur gentechnischen Veränderung von Zellen zur Verfügung zu stellen, mit dem Tumore neuroektodermalen Ursprungs und insbesondere maligne Melanome behandelt werden können.

Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.

Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Neurotrophin-4 das Wachstum von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs und insbesondere von malignen Melanomen hemmt und damit zur Behandlung dieser Erkrankungen bei Säugern, insbesondere beim Menschen, eingesetzt werden kann. Bevorzugt wird humanes, rekombinantes Neurotrophin-4 eingesetzt.

Neurotrophin-4 ist gentechnologisch herstellbar und wird kommerziell angeboten, beispielsweise von der Sigma Chemical Company. Die gentechnologische Herstellung erfolgt auf übliche Art und Weise und bedarf keiner ausführlichen Beschreibung. Kommerziell erhältlich ist beispielsweise ein in Sf 21 Insektenzellen exprimiertes humanes rekombinantes Neurotrophin-4 in einer Reinheit von mehr als 95% (bestimmt durch SDS-PAGE).

Das Neurotrophin-4 kann als solches in üblichen Arzneimitteln eingesetzt werden, insbesondere in topischen Formulierungen für die epicutane Verabreichung. Die Herstellung solcher Formulierungen ist dem Fachmann bekannt. In solchen Formulierungen, z. B. als Creme, wird Neurotrophin-4 im allgemeinen in einer Menge von 50 bis 1000 µg/g Creme, bevorzugt von 100 bis 500 µg/g Creme vorhanden sein. Außer in Arzneimitteln für die topische (d. h. epicutane) Applikation kann das Neurotrophin-4 selbstverständlich auch in Arzneimitteln für die systemische Applikation (z. B. die intracutane, subcutane oder intravenöse Applikation) formuliert werden. Die tägliche Dosis an Neurotrophin-4 ist von verschiedenen Faktoren abhängig, wie der Art des Patienten, dem Allgemeinzustand des Patienten, der Schwere der Erkrankung, der Art der Verabreichung, etc. Ein Fachmann kann unter Berücksichtigung dieser Faktoren die entsprechende Tagesdosis aufgrund seines Fachwissens bestimmen. Eine typische Dosierung für die topische Anwendung liegt bei etwa 10 bis 200 µg/cm² Haut pro Tag, bevorzugt sind Dosierungen von 20 bis 100 µg/cm² Haut pro Tag.

Auch andere übliche Verabreichungsformen des Neurotrophin-4 sind erfindungsgemäß möglich.

Bevorzugt ist es jedoch, wenn die Behandlung der Tumore neuroektodermalen Ursprungs im Rahmen einer Gentherapie erfolgt. Die medikamentöse Zuführung von außerhalb des Körpers hergestellten, biologisch aktiven Molekülen hat oft den Nachteil, daß derartige Wirkstoffe häufig, manchmal sogar mehrmals täglich appliziert werden müssen. Häufig reicht eine einfache subcutane Applikation nicht aus, sondern es sind mehrmals täglich intravenöse Gaben erforderlich.

Durch die Gentherapie ist es dagegen möglich, biologisch aktive Moleküle durch in den menschlichen oder tierischen Körper eingebrachte Zellen im Körper selbst produzieren zu lassen. Der Wirkstoff Neurotrophin-4 wird daher fortlaufend in nicht zu hohen Konzentrationen produziert, was die Wirksamkeit erhöht und die Nebenwirkungen beträchtlich vermindert.

Die Behandlung von Patienten im Rahmen einer Gentherapie ist bekannt, und es kann beispielsweise auf die DE-A 44 06 073 und die DE-A 44 06 072 verwiesen werden. Insbesondere die DE-A 44 06 072 offenbart Verfahren zur Herstellung von gentransfizierten Fibroblasten. Eine Gentherapie über die in diesen Druckschriften offenbarten gentransfizierten Fibroblasten ist erfindungsgemäß bevorzugt. Hierzu wird einem Spender Gewebe entnommen und wie in der DE-A 44 06 072 bzw. der DE-A 44 06 073 beschrieben behandelt. In die so erhaltenen Zellen wird dann durch Standardverfahren, beispielsweise solchen, die ebenfalls in diesen Druckschriften beschrieben sind, ein Gen eingeschleust, das für Neurotrophin-4 kodiert. Anschließend werden die transfizierten Zellen dem zu behandelnden Patienten auf bekannte Art und Weise verabreicht.

Während die Verwendung der in der DE-A 44 06 072 und DE-A 44 06 073 beschriebenen Verfahren bevorzugt ist, kann eine Gentherapie selbstverständlich auch über andere Zellen erfolgen. Die entsprechende Probenahme, Behandlung der Zellen und Rückführung der Zellen in den menschlichen Körper sind dem Fachmann bekannt.

Das Prinzip der Gentherapie beruht darauf, daß das Neurotrophin-4 kodierende Gen in einen geeigneten Vektor eingebaut wird. Bei den Vektoren kann es sich um Plasmidvektoren handeln oder um Vektoren auf viraler Basis. Die Vektoren beinhalten diejenigen genetischen Elemente, die zur Vermehrung des Vektors in der Zielzelle erforderlich sind. Wenn sich der Vektor in der Zielzelle vermehrt, wird auch das Gen, das mit Hilfe des Vektors in die Zielzelle eingeführt wird, dort vermehrt und zur Expression gebracht. Die Zielzelle produziert dann NT-4.

Wenn die Sekretion von NT-4 in die Umgebung der gentransfizierten Zellen gewünscht ist, beinhaltet der Sektor auch Sequenzen, die die Sekretion von NT-4 aus den Zielzellen heraus in das umgebende Medium ermöglichen. Derartige Sekretions- oder Leadersequenzen sind im Stand der Technik bekannt.

In einer alternativen Ausführungsform kann das für NT-4 kodierende Gen auch dadurch in die Zellen eingebracht werden, daß die nackte DNA in die Zellen des zu behandelnden Patienten eingebracht wird. Hierbei kann sich die nackte DNA, das heißt der Vektor, auf submikroskopisch kleinen Goldpartikeln befinden, die mit einer geeigneten Vorrichtung (Gengun) auf die Zellen geschossen werden. Die Goldpartikelchen können dann in die Zielzellen eindringen, und der Vektor bewirkt eine Expression des transfizierten Gens (NT-4). Als geeignete Zielzellen können auch mononukleäre Blutzellen verwendet werden, die nach an sich bekannten Methoden aus dem Blut des Patienten isoliert werden. Wenn die auf diese Art und Weise gentransfizierten mononukleären Blutzellen dann wieder dem Patienten verabreicht werden, werden diese Zellen NT-4 exprimieren, und aufgrund der vorhandenen Leadersequenz wird das NT-4 in die Umgebung der gentransfizierten Zellen abgegeben.

Dem Fachmann ist auch bekannt, daß anstelle des NT-4 kodierenden Gens auch ein Gen verwendet werden kann, das zu dem NT-4 kodierenden Gen weitgehend, z. B. zu wenigstens 80%, bevorzugt zu wenigstens 90%, homolog ist, sofern das entstehende Protein noch die im wesentlichen gleichen Eigenschaften aufweist, wie NT-4. Entsprechend kann ein solches zu NT-4 ähnliches Protein auch in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln verwendet werden.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Das in diesem Beispiel verwendete Neurotrophin-4 wurde von der Firma Sigma Chemical Company gentechnisch hergestellt. Es handelte sich um ein weißes Pulver, das aus einer 0,2 µm gefilterten Lösung von 30% Acetonitril und 0,1% Trifluoressigsäure mit 50 µg Rinderalbumin pro 1 µg Neurotrophin-4 gefriergetrocknet worden war. Ein Vial enthielt 5 bis 5,25 µg an Neurotrophin-4. Die Bioaktivität (bestimmt über "Neurite Outgrowth, Chick Dorsal Root Ganglia") betrug EC₅₀ = 10 bis 30 ng/ml, insbesondere 11,1 ng/ml und die Reinheit (bestimmt über das SDS-PAGE Verfahren) war größer als 97%. Der Endotoxingehalt war 0,1 ng/µg Neurotrophin-4. Das Neurotrophin-4 wurde in Sf 21 Insektenzellen exprimiert.

Melanomzellen, die von humanen metastasierenden Melanomen gewonnen wurden, wurden in Kultur gehalten. Bei dem Kulturmedium handelt es sich um RPMI 1640, 1% foetales Kälberserum, 1% Antibiotika, Zellkonzentration: 10.000-80.000/ml, 37°C, pH 7,4, 5% CO₂, Wassersättigung der Atmosphäre. In dieser Zellkultur wurde die Zellproliferation gemessen, indem ein dem Fachmann bekannter, sogenannter BrdU- Assay durchgeführt wurde (siehe Gebrauchsinformation Boehringer-Mannheim). BrdU stellt ein Analogon für einen Desoxyribonukleinsäurebaustein dar und der Einbau dieser Substanz korreliert mit der Zellteilungsrate.

Es wurde nun verglichen, inwieweit der Zusatz von Neurotrophin-4 in das Kulturmedium auf den Einbau von BrdU in die DNS von Melanomzellen einen Einfluß hat. Der BrdU-Assay ist ein Routine-Assay zur Messung von Zellproliferation. Der BrdU-Einbau wird hierbei kolorimetrisch mit Hilfe eines ELISA- Readers bestimmt. Da das Proliferationsverhalten der Melanomzellen zudem abhängig ist von der Ausgangszellzahl in Kultur, war es erforderlich, diesen Einfluß von Neurotrophin-4 auf Kulturen mit unterschiedlicher Ausgangszahl zu untersuchen. Die Ergebnisse der Messungen sind in den Fig. 1 bis 9 gezeigt. Die Ausgangszellzahl, die jeder Figur zugrundelag, kann folgender tabellarischer Aufstellung entnommen werden (Tabelle 1):

Tabelle 1

Fig. 1	12.800
Fig. 2	16.000
Fig. 3	32.000
Fig. 4	10.000 SK-MEL 3
Fig. 5	20.000 SR-MEL 3
Fig. 6	30.000 SK-MEL 3
Fig. 7	40.000 SK-MEL 3
Fig. 8	50.000 SK-MEL 3
Fig. 9	60.000 SK-MEL 3

SK-MEL 3 ist die Bezeichnung für die in den Versuchen verwendete Melanomzellinie.

Die Y-Achse gibt jeweils die Einbaurate in arbiträren Einheiten wieder, die X-Achse zeigt die Konzentration an Neurotrophin-4 an. Aus den Abb. 1 bis 9 zeigt sich deutlich, daß Neurotrophin-4 das Proliferationsverhalten von Melanomzellen günstig beeinflußt und daher zur Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs, insbesondere von malignen Melanomen, eingesetzt werden kann.

Claims

1. Neurotrophin-4 zur Verwendung als therapeutischer Wirkstoff.

2. Neurotrophin-4 zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs.

3. Neurotrophin-4 nach Anspruch 2 zur Verwendung bei der Behandlung des malignen Melanoms.

4. Arzneimittel enthaltend Neurotrophin-4 und einen pharmakologisch verträglichen Exipienten.

5. Arzneimittel nach Anspruch 4 zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5 zur Verwendung bei der Behandlung des malignen Melanoms.

7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei es sich bei dem Arzneimittel um ein Arzneimittel zur topischen (epicutanen), intracutanen, subcutanen oder intravenösen Verabreichung handelt.

8. Verwendung von Neurotrophin-4 zur Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs.

9. Verwendung von Neurotrophin-4 nach Anspruch 8 zur Behandlung des malignen Melanoms.

10. Verfahren zur Transfektion von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Transfektion wenigstens ein Gen in die Zellen eingeschleust wird, das für Neurotrophin-4 kodiert.

11. Gentransfizierte Zellen, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 10.

12. Gentransfizierte Zellen nach Anspruch 11 zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs.

13. Gentransfizierte Zellen nach Anspruch 12 zur Verwendung bei der Behandlung des malignen Melanoms.

14. Verwendung von gentransfizierten Zellen nach Anspruch 11 zur Behandlung von Tumoren neuroektodermalen Ursprungs.

15. Verwendung von gentransfizierten Zellen nach Anspruch 14 zur Behandlung des malignen Melanoms.