DE69717293T2

DE69717293T2 - Pharmazeutische formulierungen aus corticotropin freisetzenden faktor mit verbesserter stabilitaet in fluessiger form

Info

Publication number: DE69717293T2
Application number: DE69717293T
Authority: DE
Inventors: G. Hirtzer; Bert Ho; Behzad Khosrovi
Original assignee: Neurobiological Technologies Inc
Current assignee: Neutron Row Ltd Hamilton Bm
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1997-09-17
Publication date: 2003-09-04
Anticipated expiration: 2017-09-18
Also published as: JP2001500876A; CA2266666C; ES2187820T3; ATE228005T1; JP4147329B2; US5780431A; CA2266666A1; WO1998011912A1; DE69717293D1; EP0929314A1; EP0929314B1; AU4419497A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Formulierungen des Corticitropin-Releasing-Faktors (CRF) mit verbesserter Lagerbeständigkeit über längere Zeit in flüssiger Form, die während ihrer Lagerung einen hohen Grad an pharmazeutischer Aktivität beibehalten und/oder pharmazeutisch verträglich sind. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung derartiger pharmazeutischer Formulierungen.

Hintergrund der Erfindung

Der Corticotropin-Releasing-Faktor (CRF) ist ein endogenes 41 Aminosäurereste-Peptid, das zum ersten Mal 1981 als Haupt-Hypothalamus-Hormon identifiziert wurde, das für die Stimulierung der Hypophysen-Nebennieren-Achse verantwortlich ist (Vale, W., et al., Science 213: 1394-1397 (1981)). Später konnte gezeigt werden, daß CRF eine periphere, durch nicht-endokrine Funktion vermittelte Aktivität als wirksamer Inhibitor von Ödemen und Entzündungen aufweist (Wei, E. T., et al., Ciba Foundation Symposium 172: 258-276 (1993)). Dies konnte in einer Reihe von Experimenten nachgewiesen werden, bei denen die systemische Verabreichung von CRF das Austreten von Plasmakomponenten aus Gefäßen und die damit verbundene Gewebeschwellung als Reaktion auf Verletzungs- oder Entzündungsmediatoren inhibieren (Wei, E. T., et al., European J. of Pharm. 140: 63-67 (1987), Serda, S. M., et al., Pharm. Res. 26: 85-91 (1992) und Wei, E. T., et al., Regulatory Peptides 33: 93-104 (1991)). CRF ist außerdem bekannt als Corticotrop(h)-Reheasing-Hormon (CRH), Corticoliberin, Corticorelin und CRF-41).
Das CRF-Neuropeptid wurde zum ersten Mal aus Extrakten von Schaf-Hypothalami isoliert (oCRF; Vale, W., et al., Science 213: 1394-1397 (1981)) und wurde nachfolgend aus dem Hypothalamus zahlreicher anderer Säuger, einschließlich der Ratte (rCRF; Rivier, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4851- 4855 (1983), des Schweins (pCRF; Schally, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 5197-5201 (1981) und des Menschen (hCRF; Shibahara, S., et al., EMBO J. 2: 775-779 (1983)) identifiziert und isoliert. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen der CRF-Peptide aus dem Schaf, der Ratte und des Menschen hat ergeben, daß die Rattenpeptide und die menschlichen Peptide identisch sind, wobei beide an 7 Aminosäurepositionen sich vom Schaf-Peptid unterscheiden und diese Differenzen größtenteils im C-Terminus-Bereich der Peptide auftreten (Hermus, A., et al., J. Clin. Endocrin. und Metabolism 58: 187-191 (1984) und Saphier, P., et al., J. Endocrin. 133: 487-495 (1993)).
Es konnte gezeigt werden, daß CRF ein sicheres und geeignetes Mittel für eine große Zahl unterschiedlicher Verwendungszwecke beim Menschen in Frage kommt. Insbesondere hat die in großem Umfange durchgeführte in vivo-Verabreichung vor CRF die Ursache von hyper- und hypo-cortisolemischen Bedingungen bei Menschen erhellen helfen und stellt ein äußerst wertvolles diagnostisches Mittel und Untersuchungswerkzeug für eine ganze Reihe anderer Krankheiten dar, welche die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse befällt, einschließlich endogener Depressionen und der Cushing-Syndrom (Chrousos, G., et al., N. Eng. J. Med. 310: 622 (1984) und Lytras, N., et al., Clin. Endocrinol. 20: 71 (1984)). Die in vivo-Verabreichung von CRF ist nämlich geeignet, um die corticotrope Funktion des Hypophysenvorderlappens in all jenen Fällen zu überprüfen, in denen der Verdacht einer Beeinträchtigung der Funktion der vorderen Hypophyse besteht. Dies gilt für Patienten mit Hypophysentumoren oder Craniopharyngiomen, Patienten mit Verdacht auf Hypophyseninsuffizienz, Panhypopituitarismus oder Empty-sella-Syndrom sowie für Patienten mit traumatischer oder postoperativer Verletzung des Hypophysenbereichs und Patienten, die einer Radiotherapie des Hypophysenbereichs unterzogen wurden. CRF ist somit besonders geeignet für die diagnostische Analyse der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA)-Achse.
Für wichtige periphere Verwendungszwecke besitzt CRF außerdem eine in vivo-antiinflammatorische Aktivität. Was die antiinflammatorische Aktivität des CRF-Peptids betrifft, so verhindert das CRF das Durchlässigwerden der Gefäße, das durch eine Reihe von inflammatorischen Mediatoren induziert wird, die auf die postkapillaren kleinen Hautvenen einzuwirken scheinen. CRF inhibiert außerdem das durch Verletzungs- und inflammatorische Mediatoren induzierte Austreten aus Muskelkapillaren, cerebralen Mikrogefäßen und Lungenalveolarkapillaren. Diese Beobachtungen legen nahe, daß CRF im gesamten Mikrokreislauf so wirkt, daß es die Integrität der Endothelzellen aufrechterhält oder wiederherstellt, wodurch der Flüssigkeitsaustritt und das Austreten der weißen Blutzellen aus dem intravaskulären Raum und ihre Akkumulierung an den Verletzungsstellen inhibiert.
Für die neue inflammatorische Aktivität des CRF-Peptids sprechen zahlreiche klinische Indikationen. Klinische Indikationen, für die das CRF-Peptid in Frage kommt, sind z. B. rheumatoide Arthritis, sekundäre Ödeme infolge von Gehirntumoren oder Bestrahlung bei Karzinomen, Ödeme infolge von Schlaganfällen, Schädeltraumata oder Rückgratverletzungen, postchirurgische Ödeme, Asthma und andere respiratorische Erkrankungen und cystoides Makulaödem des Auges.
Für die oben beschriebenen in vivo-Verwendungszwecke kann CRF dem Patienten auf verschiedenem Wege verabreicht werden wie z. B. subkutan, intravenös, intramuskulär oder nasal als Aerosol. Diese unterschiedlichen Verabreichungsmöglichkeiten erfordern gewöhnlich die Herstellung zahlreicher unterschiedlicher CRF- Formulierungen. CRF-Peptid-Formulierungen, die gewöhnlich für die in vivo-Verabreichung in Frage kommen, werden als festes, lyophilisiertes Pulver synthetisiert und gelagert, das dann unmittelbar vor Gebrauch in eine pharmazeutisch verträgliche Flüssigkeit überführt wird. Derartige Formulierungen werden gewöhnlich bevorzugt, da die Fachleute erkannt haben, daß lyophilisierte Präparate im allgemeinen ihre pharmazeutische Aktivität über längere Zeit aufrechterhalten als flüssige Formulierungen. Lyophilisierte Formulierungen sind jedoch insofern von Nachteil, als sie unmittelbar vor Gebrauch eine Wiederherstellung erforderlich machen und daher für die klinische oder ambulante Behandlung ungünstiger sind.
Außerdem sind lyophilisierte Formulierungen im allgemeinen schwerer herzustellen und teurer, da sie die zusätzliche Stufe der Lyophilisierung während ihrer Herstellung erforderlich machen.
Zahlreiche experimentelle Präparate von CRF-Peptid, wurden sie nun aus vorgängig lyophilisiertem Material wiederhergestellt oder nicht, wurden sowohl Menschen als auch Tieren verabreicht. Beispielhafte CRF-Präparate enthalten 0.0001 N HCl- 154 mM NaCl, 0,1% Lactose, 0,25% menschliches Serumalbumin (HSA), 0,5 mM Ascorbinsäure und 0,9% Benzylalkohol (DeCherney, G., et al. J. Clin. Endocrin. und Metabolism 61: 273-279 (1985) und DeCherney, G., et al., J. Clin. Endocrin. und Metabolism 64: 1211-1217 (1987)), physiologische Kochsalzlösung, pH 2.0 (Hermus, A., et al., Clin. Endocrin. 21: 589-595 (1984) und Hermus, A., et al., Eur. J. Clin, Pharmacol. 31: 531-534 (1987)), 0,02% HCl und 10% Albumin in 0,9%-iger physiologischer Kochsalzlösung (Holsboer, F., et al., Neuroendocrinology 48: 32-38 (1988)), 0,05 mM Essigsäure und 5% Mannit (Koide, Y., et al., J. Clin. Endocrin. und Metabolism 63: 329-335 (1986)), 0,04 M Phosphatpuffer (pH 7,3), enthaltend 0,1% BSA und 0,01% Ascorbinsäure (Lee, S., et al., Alcohol. Clin. Exp. Res. 17: 1009-1013 (1993)), 0,001 N HCl-154 mM NaCl, 0,9% Benzylalkohol, 10% Mannit und 0,25% HSA (Orth, D., et al., J. Clin. Endocrin. und Metabolism 55: 1017-1019 (1982)) und steriles Wasser + 5% Mannit (Schulte, H., et al., J. Clin. Endocrin. und Metabolism 58: 192-196 (1984) and Schurmeyer, T., et al., J. Clin. Endocrin. und Metabolism 59: 1103-1108 (1984)).
Die oben beschriebenen CRF-Formulierungen sind jedoch für den großtechnischen, kommerziellen pharmazeutischen Gebrauch aus einer Reihe von Gründen ungeeignet. So z. B. führen viele der oben beschriebenen Formulierungen zu einer erheblichen Irritation, wenn sie subkutan oder nasal aufgebracht werden, und zwar aufgrund ihrer chemischen Formulierungen, des pH usw. Außerdem versagen viele der oben beschriebenen Formulierungen, wenn sie nicht lyophilisiert und nicht unmittelbar vor Gebrauch wiederhergestellt werden, da das CRF-Peptid gegenüber Abbau und begleitendem Verlust an pharmazeutischer Aktivität hochempfindlich ist, wenn es über längere Zeit in Anwesenheit bestimmter Zusätze und bei bestimmtem pH gelagert wird. Außerdem ist CRF in einem bestimmten pH-Bereich relativ unlöslich, insbesondere in einem Bereich von ca. 5 bis 6. Wie oben beschrieben wurden bei den Versuchen zur Vermeidung eines erheblichen Abbaus während der Lagerung viele der oben beschriebenen Formulierungen tatsächlich als lyophilisiertes Material hergestellt, das unmittelbar vor Gebrauch als physiologisch verträgliche Flüssigkeit wiederhergestellt wird.
Es besteht daher ein erhebliches Interesse an der Bereitstellung verbesserter pharmazeutischer CRF-Formulierungen mit entsprechender Löslichkeit, die über längere Zeit lagerbeständig sind. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Herstellung pharmazeutischer CRF-Formulierungen, die in flüssiger Form über längere Zeit ohne erheblichen Abbau des Peptids bzw. ohne erheblichen Verlust an pharmazeutischer Wirksamkeit in flüssiger Form gelagert werden können. Derartige flüssige Formulierungen benötigen keine Lyophilisierung und nachfolgende Wiederherstellung des Peptids vor dem Gebrauch, wodurch die Verabreichung vereinfacht wird. Bei der Entwicklung derartiger flüssiger Formulierungen muß man die Art der Verabreichung der Formulierung, die Löslichkeit des CRF-Peptids in dieser flüssigen Formulierung, die Beständigkeit des Peptids über längere Zeit der Lagerung als Flüssigkeit bei unterschiedlichem pH, die Temperatur usw. berücksichtigen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von CRF-Formulierungen, die pharmazeutisch verträglich sind, d. h. die bei Patienten nach ihrer Verabreichung, insbesondere auf subkutanem oder nasalem Wege, nichtzu erheblichen Irritationen führen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen und der Verwendung derartiger Formulierungen für die Herstellung eines Medikaments zur Verringerung von Entzündungen und Ödemen bei Säugern.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Kenndaten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und den anschließenden Patentansprüchen.
Die Veröffentlichungen und andere hier zitierte Druckschriften dienen der Erhellung des Hintergrunds der Erfindung und der Bereitstellung zusätzlicher detaillierter Angaben im Hinblick auf ihre Ausführung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von CRF- Formulierungen mit verträglicher Löslichkeit, die in flüssiger Form über längere Zeit lagerbeständig sind, während dieser Lagerung keinen erheblichen Verlust an pharmazeutischer Aktivität erleiden und/oder insofern pharmazeutisch verträglich sind, als sie im Hinblick auf Irritation bei ihrer Verabreichung gut toleriert werden. Die vorliegende betrifft somit pharmazeutisch verträgliche Formulierungen des CRF, die
(a) eine pharmazeutisch wirksame Menge an CRF,
(b) einen Puffer bei einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 50 mM, welcher der Aufrechterhaltung des pH der Formulierung in einem Bereich von ca. 2.0 bis ca. 5.0 bzw. von ca. 6.0 bis ca. 9.0 dient, wenn die Formulierung in flüssiger Form vorliegt, wobei das Anion des Puffers ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Acetat, Phosphat, Carbonat, Succinat, Citrat, Borat, Tartrat, Fumarat und Lactat, und
(c) einen Alkohol in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 10%, wobei dieser ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Mannit, Sorbit, Ribot, Arabit, Xylit, Inosit, Galactit, Methanol, Ethanol und Glycerin, umfassen.
Erfindungsgemäß können gegebenenfalls in die oben beschriebene Formulierung auch noch unterschiedliche Komponenten aufgenommen werden und den Puffer ersetzen. Derartige Zusätze sind Aminosäuren wie Methionin, Arginin, Lysin, Glutaminsäure, Cystein, Glutathion usw. Die Aminosäuren liegen im allgemeinen in Konzentrationen in einem Bereich von ca. 1 mM bis ca. 100 mM vor.
Erfindungsgemäß können die CRF-Formulierungen gegebenenfalls auch noch verschiedene Zucker enthalten. Diese umfassen z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Trehalose, Mannose u. a. Die zugesetzten Zucker liegen im allgemeinen in Konzentrationen von ca. 1 - ca. 10% vor.
Den oben beschriebenen Formulierungen können erfindungsgemäß auch starke stabilisierende Verbindungen wie Fe(III)-, Cu(II)-, Mg- und Zn-Salze u. a. Salze zugesetzt werden. Diese starken Stabilisatoren können vor Abbau des CRF-Peptids schützen und liegen im allgemeinen in Konzentrationen von ca. 0,05 mM bis ca. 1 mM vor.
Den oben beschriebenen Formulierungen können erfindungsgemäß auch Antioxidantien wie butyliertes Hydroxytoluol (BHT) u. a. oder chemisch verträgliche Konservierungsstoffe wie Benzylalkohol, Chlorbutanol, Phenol, Cresol, Methylparaben, Propylparaben u. a. zugesetzt werden. Diese Verbindungen können ebenfalls vor Abbau des CRF-Peptids in Lösung schützen bzw. das Wachstum kontaminierender Substanzen inhibieren.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen und Verfahren zu Verbesserung der Beständigkeit des CRF in einer Formulierung durch Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen an Aminosäuren, wodurch die Geschwindigkeit des Abbaus des CRF-Peptids vermindert wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen CRF-Formulierungen für die Herstellung eines Medikaments zur Abschwächung von Entzündungen und Ödemen bei Säugern.
Weitere Aspekte der Erfindung sind für einen Durchschnittsfachmann leicht einzusehen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenzen des menschlichen CFR-Peptids und des Ratten-CRF-Peptids im Vergleich zum CRF-Peptid des Schafs. Die Aminosäuren sind in ihren üblichen Einbuchstaben-Bezeichnungen dargestellt. Die Aminosäuren in der Schaf- Sequenz, die fett gezeichnet und unterstrichen sind, sind jene, die sich von der menschlichen CRF-Sequenz bzw. der Ratten- CRF-Sequenz unterscheiden.
Fig. 2 zeigt die relativen Abbaugeschwindigkeiten für CRF während der Lagerung bei 30ºC in flüssigen Formulierungen, wobei die getesteten flüssigen Formulierungen 1 mg/ml CRF, einen pH von 4.0, 20 mM Acetat ("pH 4.0"), 1 mg/ml CRF, pH 4.0, 20 mM Acetat, 5% Mannit ("pH 4/Mannit") und 1 mg/ml CRF, pH 4.0, 20 mM Acetat und 5% Sorbit ("pH 4/Sorbit") aufweisen.
Fig. 3 zeigt die relativen Abbaugeschwindigkeiten für CRF während der Lagerung bei 4ºC in flüssigen Formulierungen, wobei die getesteten flüssigen Formulierungen 1 mg/ml CR, pH 4.0, 20 mM Acetat (" "), 1 mg/ml CRF, pH 4.0, 20 mM Acetat, 5% Mannit (" ") und 1 mg/ml CRF, pH 4.0, 20 mM Acetat und 5% Sorbit (" ") aufwiesen.
Fig. 4 zeigt die relative Abbaugeschwindigkeit für das CRF- Peptid in der Charge Nr. 194004 bei Langzeitlagerung bei 2- 8ºC.
Fig. 5 zeigt die relative Abbaugeschwindigkeit für das CRF- Peptid in der Charge Nr. 195004 bei Langzeitlagerung bei 2- 8ºC.
Fig. 6 zeigt die relative Abbaugeschwindigkeit für das CRF- Peptid bei 40ºC in den folgenden Flüssigformulierungen über längere Zeit: 1 mg/ml CRF in 20 mM Acetat und 5% Mannit (Kontrolle) ( ), Kontrolle + 10 mM Methionin ( ) und Kontrolle + 50 mM Methionin ( ).
Fig. 7 zeigt die relative Abbaugeschwindigkeit für das CRF- Peptid bei 40ºC in den folgenden Flüssigformulierungen über längere Zeit: 1 mg/ml CRF in 20 mM Acetat und 5% Mannit (Kontrolle) ( ), 1 mg/ml CRF in 10 mM Acetat und 5% Mannit ( ), 1 mg/ml CRF in 5 mM Acetat und 5% Mannit ( ) und 20 mM Methionin mit 5% Mannit ( ).
Fig. 8 zeigt die relative Abbaugeschwindigkeit für das CRF- Peptid bei 40ºC in den folgenden Flüssigformulierungen über längere Zeit: 1 mg/ml CRF, pH 4.0 in 20 mM Acetat mit 5% Mannit (Kontrolle) ( ), 20 mM mit 5% Mannit ( ) und 50 mM Methionin mit 5% Mannit ( ).

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Identifizierung und Herstellung von CRF-Formulierungen, die bei Lagerung als Flüssigkeit über lange Zeit beständig sind, während der Lagerung keinen erheblichen Verlust an pharmazeutischer Aktivität erleiden und/oder insofern pharmazeutisch verträglich sind, als sie im Hinblick auf Irritation nach Verabreichung gut toleriert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung derartiger Formulierungen, Verfahren zur Erhöhung der Beständigkeit des CRF-Peptids in solchen Formulierungen und die Verwendung derartiger Formulierungen für die Herstellung eines Medikaments zur Abschwächung von Entzündungen und Ödemen bei Säugern.
Die Ausdrücke "Corticotropin-Releasing-Faktor", "CRF", Corticotrop(h)in-Releasing-Hormon", "CRH", "Corticoliberin", "Corticorelin", "CRF-41", wie sie hier verwendet werden, oder entsprechende Synonyme sind funktionell definiert und betreffen Peptide, die eine oder mehrere biologische Aktivitäten des nativen, intakten CRF-Peptids gemeinsam haben. Derartige biologische Aktivitäten sind z. B. die Fähigkeit, die Freisetzung von ACTH zu stimulieren, die Fähigkeit, Ödeme in vivo zu inhibieren, und die Fähigkeit, an CRF-Inhibitoren zu binden. Jeder der oben genannten Ausdrücke bezieht sich auf 41-Aminosäuren umfassende Corticotropin-Releasing-Faktor-Peptide von Mensch, Ratte, Schaf, Ziege, Schwein und die Corticotropin-Releasing- Faktor-Peptide von Fischen und CRF-Peptide aus anderen Säugern, seien sie nun durch Extraktion und Reinigung aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanten Zellkultursystemen isoliert oder unter Einsatz der Peptidsynthesetechnologie synthetisiert worden. Die genannten Ausdrücke gelten auch für die Bezeichnung anderer mit CRF verwandter Peptide, die eine oder mehrere biologische Aktivitäten der nativen CRF-Peptide wie Urocortin gemeinsam haben (Vaughan, J., et al., Nature 378: 287-292 (1995), Donaldson, C. J., et al., Endocrinology 137 (5): 2167-2170 (1996) und Turnbull, A. V., et al., Eur. J. Pharm. 303: 213-216 (1996)), Urotensin I (Lederis, K., et al., Science 218: 162-164 (1982)) und Sauvagine (Montecucchi, P. C., et al., Int. J. Pep. Prot. Res. 16: 191-199 (1980)). Die in den erfindungsgemäßen Formulierungen verwendeten CRF-Peptide werden vorzugsweise unter Verwendung von Techniken der Peptidsynthese in der Fest- oder Lösungs-Phase synthetisiert, wobei jedoch auch andere Quellen für das CRF-Peptid für eine Durchschnittsfachmann leicht zugänglich sind. Die Aminosäuresequenzen von CRF-Peptiden des Menschen, der Ratte und des Schafs sind in Fig. 1 dargestellt. Die Ausdrücke "Corticotropin-Releasing-Faktor" und "CRF" decken in gleicher Weise auch biologisch aktive CRF-Äquivalente ab wie z. B. Peptide, die sich in einer oder mehreren Aminosäuren in der gesamten Aminosäuresequenz unterscheiden sowie im Hinblick auf Substitution, Deletion oder Insertion unterscheiden, sowie modifizierte Aminosäurevarianten des CRF, welche die biologische Aktivität, die gewöhnlich mit dem intakten CRF-Gebiet zusammenhängt, im wesentlichen beibehalten.
Der Ausdruck "pharmazeutisch verträglich" bedeutet im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Formulierungen eine Formulierung, die nicht zu einer inakzeptablen Irritation am Patienten führt, dem die Formulierung nach einem bekannten Verabreichungsschema verabreicht wird. Was in diesem Fall eine inakzeptable Irritation bedeutet, läßt sich von einem Durchschnittsfachmann leicht feststellen und umfaßt Erytheme und Verätzungen sowie die mit der Verabreichung verbundene Ödemstärke.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen umfassen einerseits eine therapeutisch wirksame Menge des CRF-Peptids. Unter der "therapeutisch wirksamen Menge" versteht man, daß die Formulierung eine CRF-Konzentration aufweist, die bei Verabreichung an ein Individuum, das einer solchen bedarf, und zwar unter den üblichen Verabreichungsbedingungen, eine erwünschte pharmakologische oder therapeutische Wirkung erzielen läßt. Im allgemeinen liegt eine therapeutisch wirksame Menge an CRF in einer Formulierung in einem Bereich von ca. 0,1 mg/ml bis ca. 10 mg/ml. Eine therapeutisch wirksame Menge an CRF liegt vorzugsweise in einem Bereich von ca. 0,5 mg/ml bis ca. 5 mg/ml und insbesondere in einem Bereich von ca. 0,5 mg/ml bis ca. 3 mg/ml.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen umfassen außerdem einen Puffer. Die Puffer, die hier in Frage kommen, sind solche, die als anionischen Teil Acetat, Phosphat, Carbonat, Succinat, Citrat, Borat, Tartrat, Fumarat, Lactat u. a. enthalten. Zur Aufrechterhaltung der annähernden elektrischen Neutralität können die negativ geladenen anionischen Anteile durch die Anwesenheit einer annähernd gleichen Menge an positiv geladenen Gegenionen ausgeglichen werden. Die hier Verwendung findenden Gegenionen sind physiologisch verträglich und umfassen Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium (NH&sub4;) u. a. Derartige anionische Puffer können jedoch zur Gänze durch Aminosäuren wie Methionin, Arginin, Lysin, Glutaminsäure, Cystein, Glutathion u. a. ersetzt werden. Obwohl diese Aminosäuren nur schwache Puffer darstellen, sorgen sie für die entsprechende Abpufferung der erfindungsgemäßen Formulierungen.
Die in den erfindungsgemäßen Formulierungen verwendeten Puffer sind physiologisch verträglich und liegen im allgemeinen in einem Konzentrationsbereich von ca. 1 mM bis ca. 50 mM. Vorzugsweise liegt jedoch der Puffer in einem Konzentrationsbereich von ca. 5 mM bis ca. 30 mM und insbesondere von ca. 5 mM bis ca. 20 mM. Außerdem sollte der verwendete Puffer vorzugsweise eine relativ niedrige Ionenstärke aufweisen, wobei jedoch auch Puffer mit hoher Ionenstärke verwendet werden können.
Bekannt ist außerdem, daß verschiedene Puffer bei der Lyophilisierung sich bis zu einem gewissen Grade verflüchtigen können. Bei der Lyophilisierung der CRF enthaltenden Formulierung sind daher nichtflüchtige Puffer vorzuziehen. Beispiele für nichtflüchtige Puffer sind solche mit anionischen Anteilen wie Succinat, Tartrat, Phosphat u. a.
Die Funktion des Puffers in den erfindungsgemäßen Formulierungen besteht einerseits in der Aufrechterhaltung eines annähernd konstanten pH der Formulierung, wenn diese in flüssiger Form vorliegt. Im allgemeinen können pH-Werte im Bereich von ca. 2,0 bis ca. 5,0 oder ca. 6,0 bis ca. 9,0 verwendet werden. Vorzugsweise liegt der pH der flüssigen Formulierung jedoch in einem Bereich von ca. 3,0 bis ca. 4,5 oder ca. 6,5 bis ca. 8,0. Insbesondere liegt der pH der erfindungsgemäßen Formulierungen in einem Bereich von ca. 3,8 bis ca. 4,2 oder ca. 7,0 bis ca. 7,5. Ganz besonders bevorzugt werden saure pH's. Praktisch kommt jede organische oder anorganische Säure in Frage, um den pH einer erfindungsgemäßen flüssigen Formulierung herabzusetzen mit der Maßgabe, daß die Säure keine deutlich negative Wirkung auf die Beständigkeit bzw. Löslichkeit des in Lösung sich befindenden CRF-Peptids ausübt. Illustrierende Beispiele für Säuren, die hier Verwendung finden können, sind HCl, H&sub3;PO&sub4;, H&sub2;SO&sub4;, Essigsäure u. a.
Es wurde außerdem festgestellt, daß die Zugabe eines Alkohols oder Zuckeralkohols zu einer pharmazeutischen Formulierung des CRF-Peptids auf die Langzeitlagerung des Peptids und eine mögliche Irritation bei Verabreichung der Formulierung an ein Individuum eine günstige Wirkung ausübt. Die erfindungsgemäßen Formulierungen können daher außerdem einen Alkohol umfassen. Alkohole, die für die erfindungsgemäßen Formulierungen in Frage kommen, sind Mannit, Sorbit, Ribot, Arabit, Xylit, Inosit, Galactit, Methanol, Ethanol, Glycerin u. a. Im allgemeinen liegt die Alkoholkonzentration in den erfindungsgemäßen Formulierungen in einem Bereich von ca. 1% bis ca. 10%, vorzugsweise von ca. 3% bis ca. 7,5% und insbesondere in einem Bereich von ca. 4% bis ca. 6%.
Die CRF enthaltenden erfindungsgemäßen Formulierungen besitzen eine Osmolarität, die annähernd physiologisch ist, wobei jedoch auch nichtphysiologische Osmolaritäten in Frage kommen. Unter der "physiologischen Osmolarität" der Formulierung versteht man eine solche, die gewöhnlich an der physiologischen Verabreichungsstelle angetroffen wird. Außerdem ist bekannt, daß Menge und Art des Alkohols bzw. Zuckeralkohols, die der Formulierung zugesetzt werden, die Osmolarität der Formulierung beeinflussen, weshalb Menge und Art des zugesetzten Alkohols so gewählt werden, daß die Osmolarität der Formulierung in den entsprechenden physiologischen Bereich gebracht wird. Die Osmolarität kann auch durch die Zugabe physiologisch verträglicher Salze zur Formulierung beeinflußt werden, weshalb die Zugabe praktisch jedes physiologisch verträglichen Salzes in Frage kommt, um die Osmolarität der CRF enthaltenden Formulierung abzuändern. Die Salze, die hier in Frage kommen, sind physiologisch verträglich und vermindern praktisch nicht die Beständigkeit bzw. Löslichkeit des CRF.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können außerdem gegebenenfalls andere Komponenten in Mengen enthalten, die vorzugsweise die Herstellung der aktiven, beständigen CRF-Peptid-Formulierungen nicht negativ beeinflussen, sowie in Mengen, die für eine wirksame und sichere pharmazeutische Verabreichung geeignet sind.
Gewöhnlich verläuft der primäre Weg des Abbaus des CRF-Peptids in Lösung über die Oxidation der Methioninreste im Peptid. Andere Quellen für den Abbau sind die Hydrolyse und Deamidierung der Peptidbindung. Es wurde festgestellt, daß die Zugabe freier Aminosäuren zu den erfindungsgemäßen Formulierungen die Beständigkeit des CRF-Peptids erhöht. Die Zugabe von freiem Methionin verbessert die Beständigkeit des CRF durch Bereitstellung zusätzlicher zugänglicher Zentren für die Oxidationsvorgänge im System. Die Anwesenheit dieser zusätzlichen zugänglichen Oxidationsvorgänge vermindert daher vermutlich wirksam die Zahl der Oxidationsvorgänge am CRF-Peptid selbst und verbessert damit die Beständigkeit des Peptids in Lösung.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden freie Aminosäuren den hier beschriebenen Formulierungen zugesetzt, und zwar entweder als solche oder im Gemisch untereinander, um die Beständigkeit des CRF-Peptids in diesen Formulierungen zu erhöhen. Aminosäuren, die hier in Frage kommen, sind Methionin, Arginin, Lysin, Glutaminsäure, Cystein, Glutathion u. a. Im allgemeinen werden freie Aminosäuren in einer Konzentration in einem Bereich von ca. 1 mM bis ca. 100 mM, vorzugsweise von ca. 5 mM bis ca. 80 mM und insbesondere von ca. 20 mM bis ca 50 mM zugesetzt. Diese Aminosäuren können zusätzlich zum anionischen Puffer in den erfindungsgemäßen Formulierungen zugegeben werden oder diesen ersetzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden reduzierende oder nichtreduzierende Zucker den erfindungsgemäßen Flüssigformulierungen zugesetzt. Der Ausdruck "Zucker" bedeutet hier sowohl reduzierende als auch nichtreduzierende Zucker wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Trehalose, Mannose u. a. Im allgemeinen liegen die Zucker in den erfindungsgemäßen Formulierungen in einer Konzentration von ca. 1% bis ca. 10%-, vorzugsweise von ca. 3% bis ca. 7,5% und insbesondere von ca. 4% bis ca. 6% vor.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden den erfindungsgemäßen Formulierungen stark stabilisierende Verbindungen zugesetzt, um auf das CRF-Peptid zusätzlich stabilisierend einzuwirken. Verbindungen, die hier in Frage kommen, sind Fe(II)-, Mg-, Cu(II)- und Zn-Salze sowie andere Salze. Vorzugsweise werden Verbindungen wie Fe(II)-, Mg-, Cu(II)- und Zn-Salze den erfindungsgemäßen Formulierungen in einer Konzentration von ca. 0,05 bis ca. 5,0 mM und vorzugsweise von ca. 0,1 bis ca. 1,0 mM zugesetzt.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Formulierungen gegebenenfalls auch noch Antioxidantien wie butyliertes Hydroxytoluol (BHT) u. a. enthalten. Gewöhnlich werden die Antioxidantien in Konzentrationen von ca. 0,01 mM bis ca. 5,0 mM und vorzugsweise von 0,05 mM bis ca. 2,0 mM verwendet.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können außerdem noch aus dem Stand der Technik bekannte chemisch verträgliche Konservierungsmittel in wirksamen Konzentrationen enthalten. Unter "chemisch verträglich" versteht man, daß das Konservierungsmittel die Geschwindigkeit des Abbaus des CRF-Peptids in einer flüssigen oder lyophilisierten Formulierung nicht erheblich ansteigen läßt. Illustrierende Beispiele für chemisch verträgliche Konservierungsmittel, wie sie in den oben beschriebenen Flüssigformulierungen verwendet werden, sind Benzylalkohol, Chlorbutanol, Phenol, Cresol, Methylparaben, Propylparaben u. a.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Formulierungen noch gegebenenfalls ein oder mehrere nichtionische Detergentien wie Polysorbat 20, Polysorbat 18 u. a. in Mengen von ca. 0.001 bis ca. 1% enthalten, um die Aktivitätsbeständigkeit des CRF-Peptids zu steigern. Zusätzlich können Teil der erfindungsgemäßen Formulierungen auch noch andere pharmazeutisch verträgliche, dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannte Träger sein. Diese sind z. B. Chelatbildner wie Dinatriumedetat (EDTA) u. a. Kolösungsmittelkomponenten wie Polyethylenglycol (PEG).
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können in flüssiger oder fester Form vorliegen. Vorzugsweise liegt die Formulierung in flüssiger Form vor, um die Verabreichung unter klinischen Bedingungen zu erleichtern. Liegt sie jedoch in fester Form vor, ist es vorzuziehen, die Formulierung zu lyophilisieren.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen werden im allgemeinen durch Mischen der Komponenten der Formulierung unter Einsatz der allgemein üblichen pharmazeutischen Mischtechniken hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind beständig, wenn sie bei ca. 2-8ºC über längere Zeit gelagert werden. Unter "beständig" versteht man, daß das CRF-Peptid bei Lagerung bei 2- 8ºC während 24 Monaten zu weniger als 20% und bei Lagerung bei 2-8ºC während 12 Monaten zu weniger als 10% abgebaut ist. Der Prozentanteil an Abbau des CRF-Peptids ermittelt man durch HPLC-Analyse und Division der Fläche unter dem Peak, der dem CRF-Peptid entspricht, durch die Gesamtfläche unter allen nachweisbaren Peaks. Vorzugsweise wird das CRF-Peptid der Formulierung zu weniger als 10% bei Lagerung bei 2-8ºC während 24 Monaten und zu weniger als 5% bei Lagerung bei 2-8ºC während 12 Monaten und vorzugsweise zu weniger als 5% bei Lagerung bei 2-8ºC während 24 Monaten abgebaut.
Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration der einzelnen Ausführungsformen der Erfindung und schränken deren Gegenstand nicht ein.

Versuchsteil

Beispiel 1: Synthese der CRF-Peptide

CRF-Peptide können unter Einsatz der bekannten Peptidsynthesetechnologie in der Festphase nach Merrifield synthetisiert werden. Im einzelnen wird die erste, einen Carboxylterminus aufweisende Aminosäure der CRF-Peptid-Sequenz durch eine Aminbindung an ein unlösliches Polystyrolharz (Benzhydrylaminderivat) gebunden, wonach die restlichen Aminosäuren des Peptids nacheinander in Sequenz verknüpft werden. Die Aminosäurereste werden chemisch geschützt, um sie vor unerwünschten Kupplungsreaktionen zwischen den reaktionsfähigen Seitenketten der Aminosäureuntereinheiten zu schützen. Nach Abschluß der Peptidsynthese wird flüssiger Fluorwasserstoff verwendet, um das Peptid vom Harz abzuspalten und die Schutzgruppen von den vorgängig geschützten reaktionsfähigen Zentren an den Aminosäureuntereinheiten abzuspalten.
Nach Abschluß der Synthese wird dann das rohe CRF-Peptid durch Umkehrphasenchromatographie unter Einsatz eines C&sub1;&sub8;-Harzes und eines Puffersystems aus Essigsäure/Acetonitril gereinigt. Die reineren Fraktionen werden dann gesammelt, um sie unter Verwendung einer halbpräparativen C&sub1;&sub8;-Chromatographie weiter zu reinigen. Für die Eluierung aus dieser Säule verwendet man ein Puffersystem auf der Basis von Essigsäure/Acetonitril und/oder auf der Basis von Ammoniumbicarbonat/Acetonitril. Die reinsten Fraktionen werden dann gesammelt und lyophilisiert. Das gereinigte Peptid wird dann in Glasbehältern bei -25ºC bis -15ºC gelagert, bis die Herstellung einer Flüssigformulierung erfolgt.

Beispiel 2: Herstellung von Flüssigformulierungen von CRF aus svnthetisiertem Peptid

Aus dem in Beispiel 1 synthetisierten CRF-Peptid wurde eine Flüssigformulierung (pH 4.0) aus 1 mg/ml CRF in 20 mM Acetat- Puffer und 5% Mannit wie folgt hergestellt:
Das feste CRF-Peptid wird nach seiner Lagerung aus dem Kühlschrank entnommen und bei Raumtemperatur während wenigstens 30 Minuten äquilibrieren gelassen. Während der Äquilibrierung des CRF-Peptids werden in einem sterilen 2 l-Kolben 1100 ml steriles Wasser und 1.36 ml Eisessig vorgelegt, wonach die Lösung während wenigstens 5 Minuten gerührt wird. Danach wird die Lösung mit sterilem Wasser auf ein Volumen von 1200 ml gebracht und während wenigstens weiterer 5 Min. gerührt. Dadurch entsteht die "Essigsäure"-Lösung.
Unter Rühren der Essigsäurelösung werden 1088 g Natriumacetatdehydrat in 300 ml sterilem Wasser gelöst, wonach die Lösung mit sterilem Wasser auf ein Volumen von 400 ml gebracht und während wenigstens 5 Min. gemischt wird. Auf diese Weise entsteht die "Na-Acetat"-Lösung. Danach werden in einem sterilen 2 l-Kolben 1100 ml der Essigsäurelösung mit 240 ml der Na-Acetat-Lösung vereinigt und während mindestens 5 Min. gemischt, wonach der pH mit Hilfe der restlichen Essigsäurelösung zur Herabsetzung des pH auf einen Wert von 4.0 bzw. mit Hilfe der restlichen Na-Acetat-Lösung zur Anhebung des pH eingestellt. Diese Lösung wird dann mit filtriertem Stickstoff während wenigstens 30 Min. zerstäubt. Auf diese Weise erhält man die "Puffer"-Lösung.
Nach der Zerstäubung mit Stickstoff während wenigstens 30 Min. werden 800 ml Pufferlösung in einen 2 l-Meßzylinder gegeben, wonach 55 g Mannit zugesetzt werden. Diese Lösung wird dann während wenigstens 10 Min. gerührt, bis sich der Mannit vollständig aufgelöst hat, wobei man die Lösung weiterhin mit Stickstoff zerstäubt. Der pH dieser Lösung wird dann auf 4.0 eingestellt, indem man entweder die Essigsäurelösung zur Verminderung des pH zusetzt oder Na-Acetat-Lösung, um diesen anzuheben. Auf diese Weise erhält man die "Puffer-Mannit"-Lösung.
Nach Einstellung der Puffer-Mannit-Lösung auf einen pH von 4.0 werden 1.1 g (Nettogewicht des Peptids) festes CRF zugesetzt, wonach die Lösung bis zur vollständigen Auflösung des CRF gerührt wird. Während dieser Zeit wird die Lösung unter einem Stickstoffstrom gehalten. Nach vollständiger Auflösung des zugesetzten CRF wird das Volumen der Lösung mit Puffer-Mannit- Lösung auf 1100 ml gebracht und es wird, indem man die Lösung unter einem Stickstoffstrom hält, gemischt. Auf diese Weise erhält man die "CRF-Puffer-Mannit"-Lösung.
Die CRF-Puffer-Mannit-Lösung wird dann durch einen sterilen Filter aus einer Durapore-Membran mit einer Porengröße von 0,22 um unter Halten der filtrierten Lösung unter einem Stickstoffstrom filtriert. Sterile Lagerungsampullen werden dann mit filtriertem Stickstoff gespült, wonach 0,5-2,0 ml der CRF-Puffer-Mannit-Lösung in aliquoten Anteilen in die Ampullen abgefüllt, luftdicht verschlossen und bei 2-8ºC gelagert werden. Die erhaltene Flüssigformulierung enthält 1.0 mg/ml CRF in 20 mM Acetatpuffer, pH 4.0, und 5% Mannit.

Beispiel 3: Löslichkeit des CRF in verschiedenen Pufferlösungen

Zur Entwicklung von Flüssigformulierungen des CRF für großtechnische pharmazeutische Zwecke wurden Versuche konzipiert, um die Löslichkeit des CRF in einer großen Zahl unterschiedlicher Pufferlösungen zu messen. Konkret wurde CRF in zunehmenden Mengen zu einer großen Zahl unterschiedlicher Pufferlösungen bei sehr unterschiedlichen Konzentrationen und unterschiedlichen pH-Werten entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit anderer Trägerzusätze zugegeben, wonach die Löslichkeit des CRF-Produktes ermittelt wurde. Tabelle 1 faßt die Ergebnisse dieser Versuche zur Messung der Löslichkeit von CRF in unterschiedlichen Phosphat-, Citrat- und Acetatpuffern in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Träger wie NaCl und Mannit zusammen. Die CRF-Löslichkeit ist als Bruttogewicht CRF in mg/ml ausgedrückt. Tabelle 1: Löslichkeit des CRF in unterschiedlichen Pufferlösungen
Die in Tabelle 1 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß CRF in einem Phosphatpuffer zwischen einem pH von 2 und 3,6 sehr gut löslich ist und zwischen einem pH von 5 und 6 weniger löslich wird. Die Löslichkeit des CRF scheint dann anzusteigen, wenn der pH auf 7,0 oder darüber angehoben wird.
Die in Tabelle 1 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen ferner, daß CRF in Citratpuffer zwischen einem pH von 4 und 6 weitgehend unlöslich ist (≤0,2 mg/ml).
Schließlich ist CRF in Acetatpuffer zwischen einem pH von 4 und 5 ohne zugesetztes NaCl starklöslich, wohingegen die Zugabe von 150 mM NaCl zu einer erheblichen Reduzierung der CRF- Löslichkeit im Acetat-Puffer führt. Die Zugabe von 5% Mannit scheint keine schädliche Wirkung auf die Löslichkeit des CRF bei jedem geprüften pH zu haben.
Um festzustellen, warum bestimmte Puffer bei der Lyophilisierung sich verflüchtigen, wurden, wie oben beschrieben, weitere Versuche durchgeführt, um die Löslichkeit von CRF in verschiedenen anderen nichtflüchtigen Pufferlösungen zu überprüfen.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2: Löslichkeit des CRF in unterschiedlichen nichtflüchtige Pufferlösung
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß CRF in den geprüften Puffern Ascorbin-, Milch-, Bernsteinsäure und Phosphat sehr stark löslich ist. Bei Verwendung von Weinsäurepuffer war die Löslichkeit stark eingeschränkt.

Beispiel 4: Untersuchungen zur CRF-Beständigkeit in Ascorbin- Bernsteinsäure- und Phosphatpuffer

Ausgehend von den Ergebnissen in Tabelle 2, die zeigen, daß CRF in Ascorbin-, Bernsteinsäure- und Phosphatpuffer weitgehend löslich ist, wurden Formulierungen mit unterschiedlichen CRF-Konzentrationen mit allen drei Puffern hergestellt und die Abbaugeschwindigkeit für CRF-Peptid in diesen Formulierungen nach einer Lagerung während 5 Tagen bei 4 bzw. 30ºC ermittelt. Bei jeder Formulierung betrug die Konzentration der Puffersalze 20 mM und Mannit war in einer Konzentration von 5% anwesend. Die Abbaugeschwindigkeit wurde durch Messen der CRF-Konzentration in jeder Formulierung vor der Lagerung und dann nach 5 Tagen Lagerung bei jeder Temperatur geprüft. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3: Beständigkeit von CRF in Ascorbin-, Bernsteinsäure und Phosphat-Puffer
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, daß einerseits die Formulierung auf Ascorbinsäurebasis die Beständigkeit des CRF sowohl bei 4ºC als auch bei 30ºC beeinträchtigt, während die Formulierungen auf Bernsteinsäure- und Phosphatbasis zu keinem erheblichen Abbau des solubilisierten CRF-Peptids führen.

Beispiel 5: Analyse der Wirkung von Mannit und Sorbit auf die CRF-Beständigkeit in Flüssigformulierungen

Es wurden Versuche durchgeführt, um die Wirkung von 5% Mannit bzw. 5% Sorbit auf die Beständigkeit von Flüssigformulierungen von CRF bei Langzeitlagerung bei 4 bzw. 30% zu ermitteln. Es wurden die folgenden Flüssigformulierungen hergestellt und auf Lagerbeständigkeit bei 4 bzw. 30ºC analysiert:
Die Beständigkeit des Peptids in jeder geprüften Formulierung wurde durch Analyse jeder Probe durch HPLC zu unterschiedlichen Zeitpunkten und durch Messen der Menge des Peptidabbaus zu jedem Zeitpunkt durch Berechnung der Fläche unter dem Peak, der dem CRF entsprach, im Vergleich zur Gesamtfläche unter allen nachgewiesenen Peaks ermittelt.
Die aufgrund der Versuche erzielten Ergebnisse zeigten, daß nach zweiwöchiger Lagerung bei 4 bzw. 30ºC die pH 4,0-Formulierungen gleich beständig waren wie die pH 4,5-Formulierungen, weshalb die letzteren aus den Untersuchungen ausgeschieden wurden.
Die Ergebnisse der Untersuchungen im Hinblick auf die pH 4,0- Formulierungen erfolgten bei 30ºC, wie aus Fig. 2 hervorgeht. Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß nach zweiwöchiger Lagerung bei 30ºC die Mannit enthaltende pH 4,0-Formulierung eine leichte Tendenz zu einer höheren Beständigkeit als die Sorbit enthaltende Formulierung zeigte. Sowohl die Mannit enthaltende als auch die Sorbit enthaltende Formulierung waren erheblich beständiger als die Formulierung ohne den Alkoholzusatz. Dasselbe Muster zeigte sich auch noch nach zwölfwöchiger Lagerung bei 30ºC. Die Ergebnisse belegen, daß der Zusatz eines Alkohols wie Mannit oder Sorbit vor Abbau des CRF bei Lagerung in flüssiger Form bei 30ºC schützt.
Die Ergebnisse der bei 4ºC durchgeführten Untersuchungen sind in Fig. 3 dargestellt. Die Ergebnisse in Fig. 3 zeigen, daß sowohl die Mannit enthaltende als auch die Sorbit enthaltende Formulierung erheblich beständiger als die Formulierung ohne den Alkoholzusatz war, und zwar nach 2, 3 und 5 Monaten. Diese Ergebnisse belegen somit, daß der Zusatz eines Alkohols wie Mannit oder Sorbit zu Flüssigformulierungen vor Abbau des CRF bei Lagerung in flüssiger Form bei 4ºC schützt.

Beispiel 6: Untersuchungen zur Lagerbeständigkeit von CRF

Unabhängige Chargen von flüssigen pH 4,0-Formulierungen mit 1 mg/ml CRF in 20 mM Acetatpuffer und 5% Mannit (Chargen Nr. NTI 94004 und NTI 95004), einer pH 7,4-Flüssigformulierung mit 1 mg/ml CRF in 10 mM Phosphatpuffer und 5% Mannit (Charge Nr. 17210394) und einer pH 7,4-Flüssigformulierung mit 0,5 mg/ml CRF in 10 mM Phosphatpuffer und 5% Mannit (Charge Nr. 29210694) wurden hergestellt und auf ihre Lagerbeständigkeit zu verschiedenen Zeitpunkten bei 2-8ºC geprüft. Der Prozentanteil an Beständigkeit der Flüssigformulierungen wurde dadurch gemessen, daß man die Proben nach Lagerung während der gewünschten Zeitdauer der HPLC-Analyse unterzog und die relative Fläche unter dem dem CRF entsprechenden Peak verglichen mit der Gesamtfläche unter allen nachgewiesenen Peaks ermittelte. Die in Tabelle 4 und in den Fig. 4 und 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Flüssigformulierung von CRF sowohl in Acetatpuffer als auch in Phosphatpuffer über lange Zeit bei 2-8ºC beständig sind. Tabelle 4: Beständigkeit von CRF in Acetat- und Phosphat-Puf fer
Zwei unabhängige Chargen CRF-enthaltender Formulierungen (Nr. NTI 1-02-03191 und NTI-07-05122) wurden hergestellt, lyophilisiert, während unterschiedlicher Zeiten bei -20ºC bis -15ºC gelagert, in physiologischer Kochsalzlösung wiederhergestellt und auf ihren Prozentanteil an Beständigkeit nach der Lagerung getestet. Vor der Lyophilisierung enthielten die Flüssigformulierungen 0,2 mg/ml CRF, 0,1% HCl und 10 mg/ml Mannit. Nach 3 Jahren Lagerung in lyophilisierter Form bei -20ºC bis -15ºC ergab die HPLC-Analyse der Charge NTI-02-03191, wie oben beschrieben, eine Beständigkeit von über 97%. Nach 3 Jahren Lagerung bei -20ºC bis -15ºC ergab die HPLC-Analyse der Charge NTI-07-05122, wie oben beschrieben, eine Beständigkeit von über 95%.

Beispiel 7: Untersuchungen an pharmazeutischen Formulierungen

Zur Bewertung der Wirkung unterschiedlicher Stoffe auf die Langzeitbeständigkeit des CRF-Peptids in unterschiedlichen Flüssigformulierungen wurde eine Reihe von Untersuchungen durchgeführt. Dabei wurde eine große Zahl unabhängiger Reihen von CRF-Flüssigformulierungen getrennt voneinander analysiert. Bei jeder Reihe von Flüssigformulierungen ging man von einer anfänglichen pH 4.0-Flüssigformulierung, bestehend aus 1 mg/ml CRF in 20 mM Acetatpuffer und 5% Mannit ("Kontrollformulierung") aus, wobei entweder verschiedene Komponenten zugesetzt wurden ("zuges." in Tab. 5) oder eine bestimmte Komponente oder bestimmte Komponenten in der Ausgangsformulierung dadurch ersetzt wurden ("anst. v." in Tab. 5). Jede Formulierung aus jeder Reihe von Formulierungen wurde dann bei 40ºC gelagert, worauf der Abbaugrad für das CRF-Peptid durch HPLC-Analyse zu unterschiedlichen Zeitpunkten ermittelt wurde. Jede einzelne Formulierungsreihe wurde zusammen mit einer parallelen Kontrollflüssigformulierung durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Die quantitativen Ergebnisse in Tabelle 5 sind die Ergebnisse des letzten Zeitabschnitts für jeden Versuch, wobei die Endzeitpunkte für die Reihen A-H in einem Bereich von Tagen bis mehr als 8 Wochen variierten. Die Ergebnisse sowohl für Gehalt als auch für Reinheit sind in Prozenten angegeben, bezogen auf die parallele Kontrolle. Der Gehalt wird gemessen als CRF-Konzentration gegenüber dem Bezugsstandard und die Reinheit wird gemessen als Reinheit des CRF-HPLC-Peaks gegenüber dem der übrigen nachweisbaren, mit CRF zusammenhängenden Peaks der Probe. Tabelle 5: Beständigkeit von CRF in unterschiedlichen Flüssig-Formulierungen bei 40ºC
nv = nicht verfügbar
Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, daß die Zugabe von Aminosäuren wie Methionin, Arginin, Lysin und Glutaminsäure vor Abbau des CRF-Peptids in einer Flüssigformulierung schützt. Es wird angenommen, daß die freien Aminosäuren Mechanismus und Geschwindigkeit des Peptidabbaus verändert. Im Falle des Zusatzes Methionin wirkt die Aminosäure als Substitutionsstelle für die Oxidation, wodurch die Oxidation des CRF vermindert wird. Der Zusatz Methionin übt somit eine Schutzwirkung auf das CRF-Peptid aus. Außerdem kann auch der Zusatz der starken Stabilisatoren wie Mg-, Cu(II)- oder Zn-Salze eine stabilisierende Wirkung gegenüber dem Abbau von CRF in einer Flüssigformulierung ausüben, wohingegen der Zusatz von Cu(I)-Chlorid eher eine negative Wirkung auf die CRF-Beständigkeit ausübt.
Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen ferner, daß verschiedene Alkohole wie Methanol oder Glycerin Mannit in der Flüssigformulierung wirksam ersetzen können, ohne daß es zu einer starken negativen Wirkung auf die Beständigkeit des CRF kommt. Außerdem können die Mannit-Konzentrationen der Flüssigformulierung sich innerhalb eines Bereichs von 1-10% bewegen, ohne daß es zu einer erheblichen negativen Wirkung kommt. Außerdem zeigen die Ergebnisse in Tabelle 5, daß die Verwendung von Methionin oder eines Puffers auf Succinatbasis anstelle des Puffers auf Acetatbasis der Kontrolle keine erhebliche negative Wirkung auf die CRF-Beständigkeit einer Flüssigformulierung ausübt.
Schließlich zeigen die Ergebnisse in Tabelle 5, daß der Zusatz eines Antioxidans wie z. B. von butyliertem Hydroxytoluol (BHT) keine erhebliche negative Wirkung auf die Beständigkeit des CRF in einer Flüssigformulierung ausübt.

Beispiel 8: Untersuchungen zur Ermittlung der Wirkung von zugesetztem Methionin auf die CRF-Beständigkeit

Es wurden Folgeversuche durchgeführt, um die Schutzwirkung aufgrund der Zugabe von Methionin zu den erfindungsgemäßen CRF-Formulierungen festzustellen. Fig. 6 zeigt die relative Geschwindigkeit des Abbaus des CRF-Peptids während der Lagerung bei 40ºC in einer Kontroll-Flüssigformulierung (20 mM Acetat und 5% Mannit) gegenüber einer Formulierung mit 10 bzw. 50 mM Methionin, das der Kontrollformulierung zugegeben wird. Der "Prozentanteil an Fläche" der Flüssigformulierungen wurde dadurch gemessen, daß man die Proben nach Lagerung während der gewünschten Zeitdauer der HPLC-Analyse unterzog und die relative Fläche unter dem dem CRF entsprechenden Peak verglichen mit der Gesamtfläche unter allen nachgewiesenen Peaks ermittelte.
Die Ergebnisse in Fig. 6 zeigen, daß einerseits die Zugabe von 10 mM Methionin zu den CRF-Formulierungen eine geringe Schutzwirkung gegenüber dem Abbau des Peptids bei 40ºC ausübt, während die Zugabe von 50 mM Methionin zu den Kontrollformulierungen eine stark erhöhte Schutzwirkung ausübt.
Fig. 7 zeigt die Beständigkeit von CRF bei 40ºC in Anwesenheit unterschiedlicher Acetat- und/oder Methioninkonzentrationen. Die Ergebnisse in Fig. 7 zeigen, daß die Verwendung von 20 mM Methionin anstelle von Acetat eine erhebliche Schutzwirkung verglichen mit der Kontrollformulierung ausübt.
Schließlich zeigt Fig. 8 außerdem, daß die Verwendung von 20 mM bzw. 50 mM Methionin anstelle von Acetat in den Formulierungen des CRF-Peptids bei 40ºC zu einer erheblichen Verminderung der Geschwindigkeit führt, bei der das CRF-Peptid abgebaut wird.

Beispiel 9: Untersuchungen zur Ermittlung der Beständigkeit von CRF als lyophilisiertes Pulver verglichen mit der wiederhergestellten Flüssigkeit

Es wurden Versuche durchgeführt, um den Unterschied in der CRF-Beständigkeit bei Lagerung als lyophilisiertes Pulver ("Pulverform") verglichen mit der Lagerung in einer Flüssigformulierung, die aus dem lyophilisiertem Pulver wiederhergestellt wurde ("Flüssigform") festzustellen. Für diese Versuche wurden 2 unterschiedliche CRF-Formulierungen als lyophilisierte Pulver hergestellt, wobei ein Teil dieser Formulierungen als Flüssigkeit wiederhergestellt wurde. Sowohl die Pulverform als auch die Flüssigform des Peptids wurden dann während 6 Wochen bei 30 bzw. 40ºC gelagert, um das Ausmaß an CRF-Abbau während der Lagerungsdauer zu ermitteln. Die geprüften Formulierungen waren (1) 0,2 mg/ml CRF in 10 mM Succinat, pH 4.0, und 5% Mannit ("Succinatformulierung") und (2) 0,2 mg/ml CRF in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, und 5% Mannit ("Phosphatformulierung"). Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Die Werte in Tabelle 6 zeigen den Prozentanteil an CRF-Ausgangskonzentration zu jedem analysierten Zeitpunkt. Die Abkürzung "NE" bedeutet, daß zu den angegebenen Zeitpunkten keine Konzentrationsmessungen erfolgt sind. Tabelle 6: Beständigkeit unterschiedlicher Flüssig- und Pulverformulierungen von CRF
NE = nicht ermittelt
Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen, daß die Flüssiglösungen von CRF über längere Zeit genauso beständig sind wie die lyophilisierten CRF-Pulver. Diese Ergebnisse waren überraschend, wen man vom Stand der Technik ausgeht, wonach allgemein gilt, daß lyophilisierte Formulierungen über längere Zeit beständiger sind als entsprechende Flüssigformulierungen.

Beispiel 10: Screening auf subkutane und intrakutane Irritation

Es wurden Versuche durchgeführt, um das Irritationspotential der einzelnen Formulierungen mit oder ohne CRF-Peptid zu ermitteln. Zuerst wurden zwei CRF enthaltende Formulierungen hergestellt und subkutan als Einzeldosis appliziert, wonach der Irritationsgrad an der Applikationsstelle zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Applikation beobachtet wurde. Es wurde das Irritationspotential der nachfolgenden Formulierungen analysiert.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten, daß keine der beiden analysierten Formulierungen bei den Testtieren bei subkutaner Applikation einer Einzeldosis Irritationen auslösen. Bei täglicher subkutaner Applikation im Verlaufe von 7 Tagen wurde bei Ratten zwar keine Irritation visuell festgestellt, jedoch zeigten die Formulierungen bei mikroskopischer Prüfung der Injektionsstelle ein Irritationspotential.
Danach wurde das Irritationspotential unterschiedlicher flüssiger Vehikel ohne CRF-Zusatz an einem intrakutanen Irritationsmodell an Kaninchen geprüft. Bei diesem Modell wurde der Rücken der Versuchskaninchen rasiert, wonach intrakutan an 5 unterschiedlichen Stellen des Rückens 0,2 ml jedes Testformulierungsvehikels injiziert wurden, wonach die Injektionsstellen auf Erytheme bzw. Verätzungen und Ödeme 24, 48 bzw. 72 Stunden nach der Injektion geprüft wurden. Zu jedem Beobachtungszeitpunkt wurden die Entstehung von Erythemen bzw. Verätzungen anhand einer Skala von 0 bis 4 entsprechend Tabelle 7 bewertet.

Tabelle 7: Bewertung der Erythemen bzw. Verätzungen

Bewertungsstufe
Kein Erythem 0
Sehr schwaches Erythem (kaum bemerkbar) 1
Deutlich ausgebildetes Erythem 2
Mäßig ausgebildetes bis starkes Erythem 3
Starkes dunkelrotes Erythem bis schwache Verätzung 4
Außerdem wurde zu jedem Beobachtungszeitpunkt die Ödembildung unter Ausschluß der nicht-inflammatorischen (mechanischen) Ödembildung durch die Extraktionsflüssigkeit anhand einer Skala von 0 bis 4, wie in Tabelle 8 dargestellt, bewertet.

Tabelle 8: Bewertung der Ödembildung

Bewertungsstufe
Kein Ödem 0
Sehr schwaches Ödem (kaum bemerkbar) 1
Leichtes Ödem (Ränder der Flächen gut ausgebildet 2
aufgrund von deutlicher Vorwölbung)
Mäßiges Ödem (Vorwölbung ca. 1 mm) 3
Starkes Ödem (Vorwölbung über 1 mm und sich über die Einwirkfläche hinaus ausdehnend) 4
Nach Abschluß der Untersuchungen wurde für jede getestete Formulierung ein "durchschnittlicher Irritationswert" ermittelt, indem der Wert für die Erythembildung bzw. Verätzung mit dem Ödemwert an jedem der 5 Injektionsstellen und an jedem der 3 verschiedenen Beobachtungszeitpunkte addiert und dann der Gesamtwert durch die Zahl der an jeder Stelle ermittelten Werte und zu jedem Beobachtungszeitpunkt (2) dividiert, multipliziert mit der Zahl der Injektionsstellen zu jedem Zeitpunkt (5) und multipliziert mit der Zahl der Beobachtungszeitpunkte (3), ermittelt wurde. Die durchschnittlichen Irritationswerte der einzelnen CRF-Formulierungsvehikel sind in Tabelle 9 zusammengefaßt. Tabelle 9: Durchschnittliche Irritationswerte für unterschiedliche CRF-Vehikel-Lösungen
Die Ergebnisse zeigen, daß während das pH 4,0, 20 mM Acetatpuffer-Vehikel einen relativ hohen durchschnittlichen Irritationswert zeigt, die Zugabe eines Alkohols wie Mannit zum Vehikel zu einer erheblichen Verringerung der irritativen Wirkung der Flüssigformulierung führt. Dieselbe Schutzwirkung läßt sich auch beobachten, wenn Mannit in Verbindung mit einem Phosphatpuffer bei pH 7,4 verwendet wird.
Ähnliche Versuche wurden auch durchgeführt, um die Wirkung des Zusatzes Methionin auf das Irritationspotential einer CRF-Formulierung zu ermitteln. Die Ergebnisse der Versuche mit verschiedenen unterschiedlichen Formulierungsvehikeln sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Tabelle 10: Durchschnittliche Irritationswerte für unterschiedliche CRF-Vehikel-Lösungen
Die Ergebnisse in Tabelle 10 zeigen, daß Methionin enthaltende Formulierungen im allgemeinen weniger irritierend sind als ähnliche Formulierungen ohne Methionin. Außerdem führt der Ersatz von Acetat durch Methionin zu einer weniger irritierenden Formulierung.
Die obige Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dient lediglich der Illustration und Beschreibung. Sie haben keinen erschöpfenden Charakter und schränken die Erfindung auch nicht auf die konkrete beschriebene Form ein. Im Lichte der obigen Lehre sind zahlreiche Modifikationen und Variationen möglich. Diese sind für einen Fachmann ersichtlich und bewegen sich innerhalb des Erfindungsumfangs.

Claims

1. Pharmazeutisch verträgliche Formulierung des Corticotropin- Releasing-Faktors (CRF), die

(a) eine pharmazeutisch wirksame Menge an CRF,

(b) einen Puffer bei einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 50 mM, welcher der Aufrechterhaltung des pH der Formulierung in einem Bereich von ca. 2.0 bis ca. 5.0 bzw. von ca. 6.0 bis ca. 9.0 dient, wenn die Formulierung in flüssiger Form vorliegt, wobei das Anion des Puffers ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Acetat, Phosphat, Carbonat, Succinat, Citrat, Borat, Tartrat, Fumarat und Lactat, und

(c) einen Alkohol in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 10%, wobei dieser ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Mannit, Sorbit, Ribot, Arabit, Xylit, Inosit, Galactit, Methanol, Ethanol und Glycerin, umfaßt.

2. Formulierung nach Anspruch 1, die außerdem eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Methionin, Arginin, Lysin, Cystein, Glutathion und Glutaminsäure, in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 100 mM umfaßt.

3. Formulierung nach Anspruch 2, bei der die Aminosäure Methionin ist.

4. Formulierung nach Anspruch 3, bei der das Methionin in einer Konzentration von ca. 10 bis ca. 50 mM vorliegt.

5. Formulierung nach Anspruch 1, die außerdem einen Zucker in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 10% umfaßt.

6. Formulierung nach Anspruch 5, bei der der Zucker ausgewählt wird aus der Gruppe Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Trehalose und Mannose.

7. Formulierung nach Anspruch 1, die außerdem ein Fe(III)- oder Cu(II)-Salz in einer Konzentration von ca. 0.05 bis ca. 1 mM umfaßt.

8. Formulierung nach Anspruch 7, bei der das Fe(III)- oder Cu(II)-Salz Fe(III)- oder Cu(II)-Chlorid ist.

9. Formulierung nach Anspruch 1, die außerdem butyliertes Hydroxytoluol in einer Konzentration von ca. 0.05 bis ca. 0.5 mM umfaßt.

10. Formulierung nach Anspruch 1, die außerdem Magnesium- oder Zinkchlorid in einer Konzentration von ca. 0.5 bis ca. 2.0 mM umfaßt.

11. Formulierung nach Anspruch 1, die außerdem ein beliebiges chemisch verträgliches Konservierungsmittel umfaßt.

12. Formulierung nach Anspruch 11, bei der das chemisch verträgliche Konservierungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe Benzylalkohol, Chlorbutanol, Phenol, Cresol, Methyl- und Propylparaben.

13. Formulierung nach Anspruch 1, die 0.5-3 mg/ml CRF in 20 mM Acetatpuffer und 5% Mannit bei pH 4.0 umfaßt.

14. Formulierung nach Anspruch 1, die 0.5-3 mg/ml CRF in 20 mM Acetatpuffer, 5% Mannit und 50 mM Methionin bei pH 4.0 umfaßt.

15. Pharmazeutisch verträgliche Formulierung des Corticotropin- Releasing-Faktors (CRF), die

(a) eine pharmazeutisch wirksame Menge an CRF,

(b) eine Aminosäure bei einer Konzentration von ca. 1 bis 100 mM, wobei diese Aminosäure ausgewählt wird aus der Gruppe Methionin, Arginin, Lysin, Cystein, Glutathion und Glutaminsäure, und

c) einen Alkohol in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 10%, wobei dieser ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Mannit, Sorbit, Ribot, Arabit, Xylit, Inosit, Galactit, Methanol, Ethanol und Glycerin, umfaßt.

16. Formulierung nach Anspruch 15, bei der die Aminosäure Methionin ist.

17. Formulierung nach Anspruch 16, bei der das Methionin in einer Konzentration von ca. 10 bis ca. 50 mM vorliegt.

18. Formulierung nach Anspruch 17, bei der das Methionin in einer Konzentration von ca. 20 mM vorliegt.

19. Formulierung nach Anspruch 15, die 0.5-3 mg/ml CRF in 20 mM Methionin und 5% Mannit bei pH 4.0 umfaßt.

20. Formulierung nach Anspruch 15, die außerdem ein chemisch verträgliches Konservierungsmittel umfaßt.

21. Formulierung nach Anspruch 20, bei der das chemisch verträgliche Konservierungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe Benzylalkohol, Chlorbutanol, Phenol, Cresol, Methyl- und Propylparaben.

22. Formulierung nach den Ansprüchen 1 oder 15 in flüssiger Form.

23. Formulierung nach den Ansprüchen 1 oder 15 in lyophilisierter Form.

24. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutisch verträglichen Formulierung des CRF-Peptids, das dessen Lösen in einer Lösung umfaßt, die

(a) entweder (i) einen Puffer bei einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 50 mM, welcher der Aufrechterhaltung des pH der Formulierung in einem Bereich von ca. 2.0 bis ca. 5.0 bzw. von ca. 6.0 bis ca. 9.0 dient, wenn die Formulierung in flüssiger Form vorliegt, wobei das Anion des Puffers ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Acetat, Phosphat, Carbonat, Succinat, Citrat, Borat, Tartrat, Fumarat und Lactat, oder (ii) eine Aminosäure in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 100 mM, wobei diese ausgewählt wird aus der Gruppe Methionin, Arginin, Lysin, Cystein, Glutathion und Glutaminsäure, und

(b) einen Alkohol in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 10%, wobei dieser ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Mannit, Sorbit, Ribot, Arabit, Xylit, Inosit, Galactit, Methanol, Ethanol und Glycerin, umfaßt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die Lösung den Puffer und die weitere Stufe der Zugabe einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Methionin, Arginin, Lysin, Cystein, Glutathion und Glutaminsäure, in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 100 mM zur Formulierung umfaßt.

26. Verfahren nach Anspruch 24, das außerdem die Stufe der Zugabe eines Zuckers in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 10% zur Formulierung umfaßt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem der Zucker ausgewählt wird aus der Gruppe Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Trehalose und Mannose.

28. Verfahren nach Anspruch 24, das außerdem die Stufe der Zugabe eines Fe(III)- oder Cu(II)-Salzes in einer Konzentration von ca. 0.05 bis ca. 1 mM umfaßt.

29. Verfahren nach Anspruch 28, bei dem das Fe(III)- oder Cu(II)-Salz Fe(III)- oder Cu(II)-Clorid ist.

30. Verfahren nach Anspruch 24, das außerdem die Stufe der Zugabe von butyliertem Hydroxytoluol zur Formulierung in einer Konzentration von ca. 0.05 bis ca. 0.5 mM umfaßt.

31. Verfahren nach Anspruch 24, das außerdem die Stufe der Zugabe von Magnesium- oder Zinkchlorid zur Formulierung in einer Konzentration von ca. 0.5 bis ca. 2.0 mM umfaßt.

32. Verfahren nach Anspruch 24, das außerdem die Zugabe eines chemisch verträglichen Konservierungsmittels umfaßt.

33. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem das chemisch verträgliche Konservierungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe Benzylalkohol, Chlorbutanol, Phenol, Cresol, Methyl- und Propylparaben.

34. Verfahren nach Anspruch 24, das außerdem die Stufe der Zufuhr der Formulierung zu einem Vorratsbehälter unter Inertgas umfaßt.

35. Verfahren nach Anspruch 24, das außerdem die Stufe der Lyophilisierung der Formulierung umfaßt.

36. Formulierung nach einem der Ansprüche 1-23 zur Verwendung in der Medizin.

37. Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1- 23 zur Herstellung eines Medikaments zur Abschwächung einer Entzündung oder eines Ödems bei einem Säuger.