FR2565490A1 - Solide sec hydrosoluble renfermant une substance proteinique bioactive - Google Patents
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Abstract
COMPOSITION SECHE, STABLE, HYDROSOLUBLE, RENFERMANT UNE SUBSTANCE PROTEINIQUE BIOACTIVE. ON LA PREPARE PAR SECHAGE D'UNE SOLUTION AQUEUSE RENFERMANT CONJOINTEMENT LA SUBSTANCE PROTEINIQUE ET UN POLYSACCHARIDE, PRINCIPALEMENT CONSTITUE DE MOTIFS REPETES DE MALTOTRIOSE. ON PEUT AINSI OBTENIR DES PREPARATIONS STABLES, NOTAMMENT DE LYMPHOKINES ET D'HORMONES PEPTIDIQUES, FACILEMENT DISSOLVABLES DANS L'EAU, CE QUI FACILITE LEUR UTILISATION POUR LE TRAITEMENT ET LA PREVENTION DES MALADIES HUMAINES, AINSI QUE COMME REACTIFS D'ESSAI.
Description
La présente invention se rapporte à un solide sec, stabilisé, renfermant
une substance protéinique bioactive, conjointement avec un polysaccharide principalement composé
de motifs répétés de maltotriose.
Dans ce qui suit, on utilise les abréviations sui-
vantes: "IFN" pour interféron, "HuIFN" pour interféron hu-
main, "TNF" pour facteur de nécrose tumorale, "LT" pour lymphotoxine, "GH" pour hormone de croissance, "EPO" pour
erythopoiétine, "EGF" pour facteur de croissance épidermi-
que, et "TSH" pour hormone stimulant la thyroïde. La lettre "h", précédant certaines abréviations,signifie qu'il s'agit de substances spécifiquement humaines (par exemple: hGH,
hEGF, hEPO et hTSH).
Des substances protéiniques bioactives, utilisa-
bles comme réactif d'essai et/ou produit pharmaceutique, par exemple lymphokines et hormones peptidiques, ont été largement étudiées et développées, comme en témoignent les
récents progrès remarquables en biochimie et science médi-
cale. Plusieurs de ces substances sont commercialisées, ou sur le point de l'être. Comme les substances protéiniques bioactives sont, en général, relativement instables, on
doit leur ajouter, avant leur commercialisation, un stabi-
lisant. Le stabilisant le plus fréquemment employé est l'al-
bumine de serum humain (HSA). Toutefois, son utilisation
s'avère désavantageuse en raison des faits suivants.
(1) L'effet de stabilisation sur les substances pro-
téiniques bioactives n'est pas satisfaisant.
(2) L'addition de HSA masque l'activité spécifique de la substance. Une activité spécifique est représentée comme
l'activité/mg de protéine, et est utilisée pour la détermi-
nation du degré de purification.
(3) L'utilisation de HSA présente un daMger d'interven-
tion dans les maladies infectieuses de l'homme, puisqu'il s'agit d'une protéine provenant du serum humain; (4) HSA a tendance à former, lors du séchage, un solide
insoluble dans l'eau.
Afin d'éviter ces inconvénients de HSA, on a proposé diffé-
rents autres stabilisants. Pour IFN, la publication de bre-
vet japonais n 92 691/83 propose la cyclodextrine, et celle de brevet japonais n 25 333/84 propose des saccharides
(à l'exclusion des polysaccharides), comme mono- et oligo-
saccharides, et des polyols comme glycérine et éthylène glycol. Pour la stabilisation de TNF, la publication de brevet japonais n 39 829/84 propose des agents tensio-actifs non ioniques, et celle de brevet japonais n 59 625/84 du D-glucose, D-galactose, D-xylose, de l'acide Dglucutonique, du dextrane, de l'hydroxyéthyl amidon, et de préférence du trehalose. Les effets de stabilisation, obtenus avec ces
stabilisants, se sont révélés insuffisants. De plus, le tre-
halose est relativement coûteux. Aussi, ces stabilisants ne
sont-ils pas entrés dans la pratique.
La présente invention permet d'éviter ces incon-
vénients de l'art antérieur et d'obtenir un solide sec,
hydrosoluble, très stable, renfermant une substance protéi-
nique bioactive.
La nouvelle composition selon l'invention, renfer-
mant une substance protéinique bioactive, est caractérisée en ce qu'elle contient en outre un polysaccharide composé
principalement de motifs répétés de maltotriose. Cette com-
position solide sèche est obtenue par séchage d'une solu-
tion aqueuse renfermant conjointement la substance bioactive
et le polysaccharide spécifique,par évaporation.
Le terme "substance protéinique bioactive", tel qu'utilisé ici, comprend les substances protéiniques qui
présentent in vivo une bioactivité, comme de simples protéi-
nes et des protéines conjuguées, en particulier des lympho-
kines comme: IFN, LT, TNF, facteur d'inhibition de migra-
tion macrophage, facteur de transfert, facteur T de crois-
sance cellulaire, et facteur de stimulation de colonie; et des hormones peptidiques comme: insuline, GH, prolactine,
gonadotrophine chorionique, EPO, hormone stimulant le folli-
cule, hormone lutéinante, EGF, hormone adrénocorticotrope, lactogène placentaire, TSH, et hormone parathyroldienne, qui ont un poids moléculaire compris entre environ 10 000 et 200 000 daltons. Les substances protéiniques bioactives, selon l'invention, comprennent des substances qui peuvent être isolées à partir de fluide corporel, cellule, tissu ou organe, dans lesquels elles se trouvent à l'état naturel; des substances qui peuvent être recueillies à partir de
cultures in vivo ou in vitro des précédentes; des substan-
ces qui peuvent être recueillies à partir de cellules hu-
maines ou animales, ou à partir de microorganismes, dans lesquels l'aptitude à produire de telles substances a été agencée par des moyens classiques, comme fusion cellulaire, technique de recombinaison de gènes, etc.; mais elles ne sont pas limitées à celles qui peuvent être préparées par
des modes opératoires particuliers.
Les polysaccharides utilisables conformément à l'invention, sont ceux qui sont principalement composés de
motifs de maltotriose polymérisés de manière ç. Convien-
nent,par exemple, pullulane, elsinane, et leurs hydrolysats partiels, ayant un poids moléculaire compris entre environ 000 et 10 000 000 daltons, de préférence entre 20 000 et 2 000 000 daltons. Le rapport pondéral du polysaccharide à la substance est d'au moins 0,5, de préférence de 1 à
10 000, sur la base des solides secs.
La solution aqueuse, renfermant une substance pro-
téinique bioactive conjointement avec le polysaccharide, est séchée dans des conditions appropriées pour donner un
solide sec hydrosoluble, sans diminution marquée de l'acti-
vité de la substance. Bien que, conformément à l'invention, on puisse opérer au moyen de modes de séchage classiques, à pression réduite et à température inférieure à 30 C, le
séchage par congélation est préférable. En plus du poly-
saccharide spécifique, on peut incorporer dans la solution
aqueuse, avant son séchage, une ou plusieurs substances sup-
plémentaires comme substance minérale, tampon, acide aminé, saccharide, etc. Le solide sec, ainsi obtenu, se dissout
facilement dans l'eau, et garde de manière stable l'acti-
vité d'une substance protéinique bioactive. Ainsi, ce pro-
duit solide sec peut-il être avantageusement utilisé par exemple comme réactif d'essai, injection, médicament pour administration externe ou interne, etc., afin de prévenir
et/ou de traiter des maladies humaines.
Les expérimentations suivantes permettent de
mieux comprendre l'invention.
EXPERIMENTATION 1
Essai de stabilisation de IFN 1-A Préparation d'IFN
On injecte à des hamsters nouveaux-nés un anti-
sérum préparé de manière classique à partir d'un lapin, afin d'affaiblir leur immunoréaction, puis on y implante par voie sous-cutanée des cellules BALL-1, et on nourrit les animaux de manière habituelle pendant 3 semaines. Les
masses tumorales, formées sous la peau, sont extraites, ha-
chées et désagrégées dans du sérum physiologique. Les cel-
lules ainsi obtenues sont rincées avec du milieu RPMI 1640
exempt de sérum (pH 7,2), mises en suspension dans une pré-
mere paration fratche du/milieu de culture, de manière à avoir une densité cellulaire de l'ordre de 2x106 cellules/ml, et
maintenues à 35 C. Cette suspension de cellules est addi-
tionnée avec un HuIFN partiellement purifié, à une dose de
U/ml, mise à incuber pendant environ 2 heures, addition-
née de virus de Sendal (environ 300 titres d'hémoagglutina-
tion/ml), et mise à incuber pendant 20 heures supplémentai-
res, afin d'y induire la production d'HuFIN. La culture ré-
sultante est centrifugée à environ 1000 xg, près de 4 C,
pour éliminer le solide, et l'on filtre la partie surnagean-
te sur membrane. Le filtrat est chromatographié à l'aide
d'une colonne d'anticorps classiques, anti-HuFIN immobili-
sés, et les fractions non adsorbées sont éliminées. L'HuIFN adsorbé est élué de la colonne, il est concentré à l'aide $5490 d'une membrane pour donner un concentré à 0,01% en poids/ volume, avec une activité spécifique de l'ordre de 1,5 x
108 U/mg de protéine et un rendement voisin de 4 ml/hamster.
L'activité de l'HuIFN est essayée par le procédé classique de réduction de plaque, utilisant des cellules
de FL. Les titres d'hémoagglutination sont essayés confor-
mément au procédé décrit par J.E. Salk, The Journal of
Immunology, Vol. 49, pp. 87-98 (1944).
1-B Comparaison des effets stabilisants sur IFN de plusieurs stabilisants 0,5 ml d'un concentré d'HuIFN, obtenu par le
procédé décrit en 1-1, et 1 ml de solution aqueuse d'un sta-
bilisant, sont placés dans une fiole de verre, puis mélan-
gés, séchés par congélation et conservés à 4 ou à 37 C pen-
dant 2 mois. Le solide est additionné de sérum physiologi-
que à 30 C pour dissoudre ou éluer HuIFN. Cet HuIFN est essayé et le pourcentage de rétention de l'activité obtenue, avant le séchage par congélation, est calculé à l'aide de l'équation suivante: activité après conservation Pourcentage de rétention = x100 activité avant séchage par congélation les résultats sont indiqués dans le Tableau I. Ces résultats confirment avec évidence que les solides secs utilisant comme stabilisant le polysaccharide spécifique, c'est-à-dire pullulane ou elsinane, présentent une solubilité dans l'eau et une stabilité excellentes, et
sont pour cette raison facilement manipulables.
Voir Tableau I à la page suivante.
TABLEAU I
Pourcentage de rétention Stabilisant Solubilité dans le d'activité Remarque sérum physiologique
C 37 C
Néant aisément soluble 60,9 0 Témoin Tampon phosphate l 68,3 15,2 " Maltose " " 72,4 41,2 " - Cyclodextrine " " 78,1 45,6 " HSA soluble 86,2 67,3 " Amylopectine " 80,1 59,2 "
Hydroxyéthyl ami-
don aisément soluble 78,3 56,6 Dextrane " " 81,5 65,3 * / ***.u a'.. -t. TABLEAU I (suite) Stabilisant Solubilité dans le Pourcentage de rétention sérum physiologique d'activité Remarque
4 C 37 C
Pullulane aisément soluble 100,0 100,0 présente invention Elsinane " " 100,0 99,1 " Gomme arabique " " 76,2 54,6 témoin Gomme adragante " " 77,3 52,1 " Carraghénane " " 75,4 48,7 " Agar à peine soluble 33,1 21,6 " Pectine aisément soluble 50,3 25,3 " Note: Dans la colonne "stabilisant", "néant" correspond à de l'eau désionisée, "Tampon phosphate" à 0,01M de ce tampon (pH 7,2); pour les autres, il s'agit de solution aqueuse à 0,5% poids/volume du stabilisant spécifié. t 4. <-n
EXPERIMENTATION 2
Essai de stabilisation de TNF 2-A Préparation de TNF
On injecte à des hamsters nouveaux-nés un anti-
serum préparé de manière classique avec un lapin, afin d'affaiblir leur immunoréaction, on leur implante par voie sous-cutanée une lignée de monocytes humains transformée par du virus SV-40, on les nourrit de manière habituelle
pendant 1 semaine, puis on injecte par voie intrapérito-
néale des cellules de BCG brut à la dose de 107 cellules/
hamster, et on les nourrit pendant 2 semaines supplémen-
taires. Les masses tumorales, formées sous la peau des ani-
maux, et pesant environ 15 g chacune, sont extraites, ha-
chées et désagrégées dans du serum physiologique renfer-
mant de la trypsine. Les cellules ainsi obtenues sont rin-
cées avec du milieu essentiel minimal de Fagle (pH 7,2) additionné de 5% en volume/volume de serum humain, mises en
suspension dans une préparation fra che à 37 C du même mi-
lieu de culture afin d'obtenir une densité cellulaire de l'ordre de 5 x 106 cellules/mi, additionnées d'endotoxine d'Escherichia coli (environ 10 tg/ml), et mises à incuber à cette température pendant 16 heures, afin de provoquer la
production de TNF.
La culture résultante est centrifugée à environ 2.5 1000 x g et à près de 4 C, pour enlever le solide, après quoi la partie surnageante est dialysée contre du serum physiologique renfermant du tampon phosphate 0, 01 M (pH 7,2) pendant 21 heures, et filtrée sur membrane. Le filtrat est concentré, et séché par congélation, pour donner une poudre à activité de TNF. Cette poudre est purifiée par
- adsorption/désorption à l'aide d'échange d'ions, fraction-
nement de poids moléculaire par filtration sur gel, con-
centration, et filtration sur membrane, conformément aux
modes opératoires reportés par G. Bodo, Symposium on Prépa-
ration, Standardisation and Clinical Use of Interferon (11ème Symposium International d'Immunologie, 8 et 9 Juin 1977, Zagreb). La préparation résultante, exempte de HuFIN, est relarguée avec du sulfate d'ammonium, purifiée par chromatographie par analogie, au moyen de Con A-Sepharose, et concentrée pour donner un concentré à 0,01% en poids/ volume, renfermant un TNF très pur, avec un rendement de l'ordre de 30 ml par hamster; ce TNF est caractérisé en
ce qu'il provoque une nécrose hémorragique sur Meth A sar-
coma, mais n'affecte pas les cellules normales. Le TNF
ainsi obtenu est une glycoprotéine ayant une activité spé-
cifique de l'ordre de 3,5 x 105 U/mg de protéine, et qui
est exempte de l'inducteur utilisé.
L'activité de TNF est essayée de manière classique, ainsi qu'il est reporté dans Lymphokines, Vol. 2, édité par E. Pick, pp. 235-272, "Tumor Necrosis Factor", publié par Academic Press Inc. (1981): Après exposition d'une culture de cellules L-929 (lignée cellulaire normale sensible à TNF)
à des dilutions de TNF, pendant la durée prescrite, on comp-
te le nombre de cellules traitées résiduelles.
2-B Comparaison des effets stabilisants sur TNF -
de plusieurs stabilisants Selon un mode opératoire similaire à celui de 1B, on place 0,5 ml d'un concentré de TNF, obtenu conformément au procédé décrit en 2-A, et 1 ml de solution aqueuse d'un stabilisant, dans une fiole de verre, et l'on sèche par congélation et conserve, avant de déterminer le pourcentage
de rétention d'activité.
Les résultats sont indiqués dans le Tableau II
à la page suivante.
/ /--
TABLEAU II
Pourcentage de rétention Stabilisant Solubilité dans le d'activité Remarque sérum physiologique 40C 370C Néant aisément soluble 43,8 0 témoin Tampon phosphate " " 46,2 6,7 Maltose " " 62,5 22,3
i -Cyclo-
dextrine " " 60,3 25,7 " Do HSA soluble 76,1 40,9 Amylopectine " 64,3 41, 7 Hydroxyéthyl amidon aisément soluble 70,9 36,9 Dextrane " " 78,2 43,6 Ln o, o o CD TABLEAU II (suite) Pourcentage de rétention Stabilisant Solubilité dans le d'activité Remarque sérum physiologique
4 C 37 C
Pullulane aisément soluble 100,0 99,4 présente invention Elsinane " " 100, 0 98,2 " Gomme arabique " " 63,8 28,6 témoin Gomme adragante " " 70,4 30, 1 " Carraghenane " " 62,6 25,2 " Agar à peine soluble 25,1 10,5 Pectine aisément soluble 28,8 16,3 " Note: Dans la colonne "stabilisant", "néant" correspond à de l'eau désionisée, "Tampon phosphate" à 0,01 M de ce tampon (pH 7,2); Pour les autres, il s'agit r de solution aqueuse à 0,% poids/volume du stabilisant spécifi.L de solution aqueuse à 0,5% poids/volume du stabilisant spécifié. c% Ln Ces résultats confirment à l'évidence que les solides secs utilisant comme stabilisant le polysaccharide spécifique, c'est-à-dire le pullulane ou l'elsinane, ont une solubilité dans l'eau et une stabilité excellentes, et pour ces raisons sont facilement manipulables.
EXPERIMENTATION 3
Taux de polysaccharide
L'effet de stabilisation sur les substances pro-
téiniques bioactives est étudié avec différents taux pondé-
raux de polysaccharide: 0,5 ml d'un concentré d'HuIFN, obtenu par le procédé décrit en 1-A ou d'un concentré de TNF, obtenu par le procédé décrit en 2-A, est placé dans une
fiole de verre, conjointement avec du pullulane, ou de l'el-
sinane, ayant une concentration appropriée pour donner un rapport pondéral polysaccharide/substance de 0, 0,01, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, ou 100, sur la base des solides secs; puis on mélange et sèche par congélation comme en 1-B, et l'on
conserve à 37 C pendant 1 mois, avant de déterminer le pour-
centage de rétention d'activité.
Les résultats sont donnés dans le Tableau III.
Tous les solides secs se dissolvent aisément dans
le sérum physiologique.
Il ressort de ces résultats que le rapport pondé-
ral,qui stabilise de manière effective une substance pro-
téinique bioactive, est égal ou supérieur à 0,5, de préfé-
rence égal ou supérieur à 1, sur la base des solides secs.
Voir Tableau III à la page suivante.
/______
TABLEAU III
Polysaccharide Rapport pondérai Rétention Rétention à la protéine d'HuIFN de TNF ___ ___ ___ ___(fois) (%) (%)
0 0 0
0,01 12,3 0
0,1 34,5 28,4
Pullulane -0,5 87,2 83,5
1,0 94,6 89,9
,0 98,3 96,2
,0 100,0 97,8
,0 100,0 99,4
0 0 0
O O O
0,01 10,5 0
0,1 27,7 21,2
ElSinane 0,5 83,5 81,6 Elsinane
1,0 91,6 87,3
,0 96,1 93,7
10,0 97,7 96,5
,0 98,9 98,2
Ainsi qu'il est décrit plus haut, le solide sec
selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est facile-
ment soluble dans l'eau, et en ce qu'il retient de manière stable l'activité de la substance protéinique bioactive, sur une longue période de temps,dans des conditions sévères,
par exemple à température ambiante. A l'encontre de stabi-
lisants classiques comme HSA, le polysaccharide spécifi-
que ne présente pas le danger de propager des maladies in-
fectieuses humaines, et il ne dissimule pas l'activité spé-
cifique de la substance qui est utilisée, pour déterminer
son degré de purification.
Aussi, le solide sec selon l'invention peut-il
être avantageusement utilisé pour réactif d'essai, injec-
tion, et médicament pour administration externe et interne,
afin de prévenir ou de traiter des maladies humaines.
La valeur réelle de la présente invention est
illustrée dans les exemples non limitatifs suivants.
EXEMPLE 1
HuIFN
Une partie d'un concentré,renfermant un HuIFN pu-
rifié, obtenu par le procédé décrit en 1-A, est additionnée à une solution aqueuse renfermant 100 parties de pullulane purifié, rapportées au poids de HuIFN solide, puis on filtre dans des conditions stériles, et l'on répartit dans des fioles de verre de 2 ml, de façon à avoir une teneur en
HuIFN de 3 x 106U/fiole, et l'on sèche par congélation.
Le produit est stable sur une longue période de
temps, même à température ambiante, et il se dissout fa-
cilement dans l'eau. Aussi ce produit est-il avantageusement
utilisable comme réactif d'essai, ainsi que pour des injec-
tions intramusculaires ou intraveineuses.
EXEMPLE 2
TNF
Une partie d'un concentré renfermant un TNF pu-
rifié, obtenu par le procédé décrit en 2-A, est additionnée
avec une solution aqueuse renfermant 200 parties d'un pul-
lulane purifié, rapportées au poids du solide TNF; puis on filtre dans des conditions stériles, et l'on répartit dans des fioles de verre de 2 ml, de manière à avoir une teneur
en TNF de 2 000 U/fiole, et l'on sèche par congélation.
Le produit est stable sur une longue période de
temps, même à température ambiante, et il se dissout facile-
ment dans l'eau. On peut l'utiliser avantageusement comme
réactif d'essai, aussi bien que pour injection intramuscu-
laire ou intraveineuse.
EXEMPLE 3
LT
Les fractions non adsorbées provenant d'une co-
lonne d'anticorps anti-HuIFN immobilisés, obtenus par le procédé décrit en 1-1, sont purifiées par chromatographie par affinité au moyen de phytohémoagglutinine-Sepharose, et sont concentrées avec une membrane. Une partie de ce concentré renfermant du LT très pur est mélangée avec une solution aqueuse renfermant 50 parties d'elsinane, rappor- tées au poids du LT solide, et l'on répartit dans des fioles de verre de 5 ml, de manière à avoir une teneur en LT de
1 000 U/fiole, puis l'on sèche par congélation.
Le produit est stable sur une longue durée de
temps, même à température ambiante, et se dissout facile-
ment dans l'eau. On peut donc l'utiliser comme réactiond'es-
sai, injection, granulé, comprimé, pommade, etc. L'activité de LT est essayée de manière classique,
ainsi qu'il est reporté dans "In Vitro Method in Cell-
Mediated Immunity", édité par B.R. Blood & P.R. Glade, pu-
blié par Academic Press, Inc. (1971), dans lequel une cul-
ture de cellules L de souris est exposée à des dilutions'de
LT, puis l'on compte le nombre de cellules L traitées, rési-
duelles.
EXEMPLE 4
GH
* On extrait,à partir d'un patient porteur d'un adé-
nome acidophile, des cellules de ce type d'adénome, que l'on
hache et désagrège, avant de les implanter par voie sous-
cutanée dans des souris nues adultes; les animaux sont nour-
ris pendant 3 semaines. Les masses tumorales, formées sous la peau des animaux, et pesant environ 10 g chacune, sont
extraites, hachées et désagrégées dans du sérum physiologi-
que renfermant de la trypsine. Les cellules ainsi obtenues sont rincées avec du milieu de Eagle 199 exempt de glucose (pH 7,2) additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal
de veau, elles sont mises en suspension dans une prépara-
tion fraîche du même milieu de culture, renfermant en outre mM de Larginine comme inducteur de GH, de manière à avoir une densité cellulaire de 105 cellules/ml environ, et l'on met à incuber à 37 C pendant 6 heures pour amorcer la production de hGH. Les cellules de la culture résultante sont désintégrées par les ultra-sons, et le hGH se trouvant dans la partie surnageante est essayé. La production de hGH est de l'ordre de 500 ng/ml de suspension cellulaire. La partie surnageante est purifiée et concentrée de manière
classique pour donner du hGH concentré, qui est alors mélan-
gé avec une solution aqueuse renfermant 10 000 parties de
pullulane, rapportées au poids de hGH solide, et on répar-
tit dans des fioles de verre de 2 ml pour avoir une teneur
en hGH de 10 ng/fiole, et l'on sèche par congélation.
L'activité de hGH est essayée par le radioimmuno-
essai classique, décrit par S.M. Gilick et coll. dans
Nature, Vol. 199, page 784 (1963).
EXEMPLE 5
EGF
On extrait des cellules de tumeur de glande sous-
maxillaire d'un patient, en hachant, et désagrégeant cette tumeur, et on les ensemence sur milieu deEagle 199 (pH 7,2), additionnées de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, de manière à avoir une densité cellulaire de l'ordre
de 1 x 105 cellules/ml. Ces cellules tumorales sont culti-
vées à 37 C en système clos pendant une semaine, avec ra-
fraîchissement périodique du milieu. Lorsque les cellules
ayant proliféré forment une monocouche, la culture est rin-
cée dans du sérum physiologique renfermant un phosphate et de la trypsine. Les cellules ayant proliféré sont mises en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, de manière à avoir une densité cellulaire de
l'ordre de 1 x 105 cellules/ml, et l'on cultive en suspen-
sion à 37 C et pH 7,2 pendant une semaine supplémentaire.
Les cellules sont alors désintégrées aux ultrasons, et le hEGF surnageant est essayé. Sa production est voisine de 1,3 pg/ml de suspension cellulaire. Après purification et concentrationae la partie surnageante, de manière classique, le concentré résultant de hEGF est mélangé avec une solution aqueuse renfermant 200 parties d'elsinane, rapportées au poids de hEGF solide, et l'on répartit dans des fioles de verre de 5 ml de façon à avoir une teneur en hEGF de 0,5
gg/fiole, puis l'on sèche par congélation.
Le produit est stable sur un grand espace de temps, même à température ambiante, et il se dissout facilement dans l'eau, On peut donc l'utiliser avantageusement pour
réactif d'essai, injection, granulé, comprimé, supposi-
toire, etc.
L'activité d'hEGF est essayée par l'essai radio-
récepteur classique décrit par R.L. Ladda et coll. Dans Ana-
lytical Chemistry, Vol. 93, pp-286-294 (1979).
EXEMPLE 6
EPO On extrait des cellules humaines de tumeur rénale d'un patient, par hachage et désagrégation, et on les met
en suspension dans un ballon avec une lignée de lymphoblas-
toldes humains (Namalwa), et une solution saline renfermant mM de NaCl, 54 mM de KC1, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, de façon à avoir une densité cellulaire respective de l'ordre de 103 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée, sous refroidissement à la glace, d'une
préparation franche de la même solution saline, mais renfer-
mant en outre du virus de Sendai préalablement inactivé par irradiation aux ultra-violets. Apres un laps de temps de minutes, la suspension cellulaire est placée dans un in-
cubateur à 37 C pendant environ 30 minutes, afin que s'ef-
fectue la fusion cellulaire; ainsi, introduit-on l'aptitude à produire hEPO dans les cellules de Namalwa. Des souris nues adultes sont implantées par voie intrapéritonéale avec
ces cellules de Namalwa, puis on les nourrit de manière ha-
bituelle pendant 5 semaines. Les masses tumorales, formées sous la peau des animaux, et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et désagrégées dans du sérum physiologique renfermant de la trypsine. Les cellules ainsi obtenues sont rincées avec du milieu de Eagle 199 (pH 7,2) additionné de % en volume/volume de sérum foetal de veau, de manière avoir une densité cellulaire de l'ordre de 106 cellules/ml,
et l'on met à incuber à 37 C pendant 20 heures sous pres-
sion réduite de 700 mm de Hg, afin d'induire la production de hEPO. Les cellules sont désintégrées par les ultrasons, et l'hEPO surnageant est essayé. Sa production est voisine de 170 U/ml de suspension cellulaire. Après purification
et concentration de la partie surnageante de manière clas-
sique, le concentré résultant d'hEPO est mélangé avec une
solution aqueuse renfermant 500 parties de pullulane, rap-
portées au poids de hEPO solide, et l'on répartit dans des fioles de verre de 5 ml de façon à avoir une teneur en
hEPO de 10 U/fiole,puis l'on sèche par congélation.
Ce produit est stable sur un long espace de temps, même à température ambiante, et il se dissout facilement dans l'eau. Aussi est-il avantageusement utilisable pour
réactif d'essai et injection.
L'activité d'hEPO est essayée par un bioessai classique utilisant l'incorporation de 59Fe, ainsi qu'il est décrit par P.M. Cotes et D.R. Bangham dans Nature N 4793, pp.1065-1067 (1961). L'unité (U) d'activité hEPO est égale à un dixième de l'activité hEPO dans une fiole
répartie à partir de WHO.
EXEMPLE 7
TSH Des cellules d'un adénome basophile humain sont
extraites, hachées et désagrégées, puis mises en suspen- sion conjointement avec des cellules de Namalwa, dans une solution saline
renfermant 140 mM de NaC1, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, de manière à avoir une
densité cellulaire respective d'environ 104 cellules/ml.
Cette suspension cellulaire est additionnée, sous refroi-
dissement à la glace, d'une préparation fraîche de la même solution saline, renfermant en outre du virus de Sendai
préalablement inactivé par irradiation aux ultraviolets.
Après un laps de temps de 5 minutes, cette suspension cel-
lulaire est placée dans un incubateur à 37 C pendant envi-
ron 30 minutes, afin que s'effectue la fusion cellulaire.
Ainsi, introduit-on l'aptitude à produire hhTSH dans les
cellules de Namalwa. On implante dans des souris nues adul-
tes, par voie intrapéritonéale, ces cellules de Namalwa, et on nourrit les animaux de manière habituelle pendant 5 semaines. Les masses tumorales formées chez les animaux, environ 15g chacune, sont extraites, hachées et désagrégées dans du sérum physiologique renfermant de la trypsine. Les cellules ainsi obtenues sont rincées avec du milieu de Earle/(pH 7,2) additionné de 10% en volume/volume de sérum foetal de veau, mises en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, renfermant en plus 30 mM de L-arginine en tant qu'inducteur, de manière à avoir une densité cellulaire de l'ordre de 105 cellules/ml, et l'on
met à incuber à 37 C pendant 35 heures pour induire la pro-
duction d'hTSH. Les cellules sont désintégrées aux ultra-
sons, et l'htSH de la partie surnageante est essayé. Sa pro-
duction est voisine de 180 mIU/ml de suspension cellulaire.
Après purification et concentration de la partie surnagean-
te de manière classique, le concentré d'hTSH résultant est mélangé avec une solution aqueuse renfermant 100 parties
d'elsinane, rapportées au poids d'hTSH solide, et l'on ré-
partit dans des fioles de verre de 5 ml de manière à avoir
une teneur en hTSH de 10 mIU/fiole, puis on sèche par congé-
lation. Ce produit est stable sur une longue période de conservation, même à température ambiante. Aussi est-il
avantageusement utilisable pour réactif d'essai ou injec-
tion.
L'activité de hTSH est essayée par l'essai radio-
récepteur classique, tel que décrit par S.W. Manley et coll. dans Journal of Endocrinology, Vol. 61, pp.419-436 (1974), et est représentée par l'unité internationale (IU) avec référence au spécimen étalon d'hTSH, fourni par The
National Institute for Medcical Research, de Grande-Breta-
gne.
Il est bien entendu que la description détaillée
et les exemples particuliers indiquant des formes de réa-
lisation préférées de l'invention ne sont donnés qu'à ti-
tre d'illustration; différents changements et modifica-
tions possibles apparattront à l'homme de l'art en partant
de cette description détaillée, sans sortir du cadre de
l'invention.
Claims (8)
1. Composition solide sèche, soluble dans l'eau, ren-
fermant une substance protéinique bioactive, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un polysaccharide constitué
principalement par des motifs répétés de maltotriose.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée
en ce que le rapport pondéral du polysaccharide à la sub-
stance protéinique bioactive est au moins supérieur à 0,5, de préférence compris entre 1 et 10 000, sur la base des
solides secs.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, carac-
térisée en ce que la substance protéinique bioactive est
une lymphokine ou une hormone peptidique.
4. Composition selon une des revendications 1 à 3,
caractérisée en ce que le polysaccharide est l'elsinane, le pullulane, un de leurs hydrolysats partiels, ainsi que
les mélanges de ces produits.
5. Composition selon une des revendications 1 à 4, ca-
ractérisée en ce que le poids moléculaire du polysaccharide
est compris dans l'intervalle de 10 000 à 10 000 000 dal-
tons, de préférence entre 20 000 et 2 000 000 daltons.
6. Procédé de fabrication d'une composition selon une
des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on prépare
une solution aqueuse renfermant conjointement le polysac-
charide et la substance protéinique bioactive, puis en ce
que l'on sèche cette solution.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le séchage de la solution aqueuse s'opère sous vide, à
une température inférieure à 30 C.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le séchage de la solution aqueuse est un séchage par congélation.
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| DE (1) | DE3520228C2 (fr) |
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