ES2241120T3 - Metodos para liofilizar celulas competentes. - Google Patents
Metodos para liofilizar celulas competentes.Info
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Abstract
Método para producir células procariotas que son competentes para la transformación, comprendiendo dicho método: (a) hacer crecer dichas células en un medio propicio para el crecimiento; (b) hacer dichas células competentes; y (c) liofilizar dichas células competentes.
Description
Métodos para liofilizar células competentes.
Esta invención se refiere a un método para
producir células que son competentes para la transformación y que
pueden almacenarse de manera estable durante largos periodos de
tiempo a diversas temperaturas. El método supone hacer crecer
células en un medio propicio para el crecimiento, hacer dichas
células competentes y liofilizar dichas células competentes. La
invención se refiere además a células competentes producidas
mediante tal método, a métodos para transformar dichas células con
una molécula de ADN y a un método para producir una proteína o
polipéptido deseados a partir de dichas células transformadas.
Existen varios procedimientos para la preparación
de células competentes y la introducción de ADN en estas células.
Por ejemplo, Mandel e Higa (Journal of Molecular Biology
53:159 (1970)) describen un procedimiento mediante el cual se
combina ADN de bacteriófago con células de E. coli en
presencia de Ca^{++} 50 mM a 0ºC, seguido de un pulso de calor
breve a 37ºC- 42ºC. Este método se ha ampliado a la captación de ADN
cromosómico (Cosloy y Oishi, Proceedings of the National Academy
of Science 70:84 (1973)) y ADN plasmídico (Cohen et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110 (1972)).
Un resumen de los factores que influencian la eficacia de la
transformación se facilita en Hanahan (JMB 166:557
(1983)). Estos factores incluyen la adición de otros cationes tales
como Mg, Mn o Rb a las células tratadas con Ca, así como la
incubación prolongada de las células en CaCl_{2}. La eficacia de
la transformación de células de E. coli se mejora
sustancialmente mediante el método descrito por Hanahan (JMB
(1983), denominado a continuación en el presente documento
"Hanahan (1983)"). En el método de Hanahan (1983), las células
se hacen crecer a 37ºC en presencia de Mg 20 mM. Se combina ADN
plasmídico con las células a 0ºC en presencia de Mn, Ca, Rb o K,
dimetilsulfóxido (DMSO), ditiotreitol (DTT) y cloruro de
hexaaminocobalto. Las células competentes de varias cepas de
Escherichia coli (E. coli) preparadas mediante este
último método tienen eficacias de transformación de desde 1 hasta 5
x 10^{8} transformantes/\mug de ADN plasmídico.
Otro método para la preparación de células de
E. coli competentes se da a conocer en la patente de los
EE.UU. número 4.981.797 (Jessee y Bloom, 1991). Este método incluye
las etapas de hacer crecer las células en un medio propicio para el
crecimiento a una temperatura inferior a 37ºC, hacer las células
competentes y luego congelarlas.
Generalmente, las células competentes congeladas
preparadas mediante métodos tales como los resumidos anteriormente
tienen eficacias de transformación de aproximadamente 1 x 10^{8}
transformantes/\mug de ADN plasmídico. Estas células competentes
pueden almacenarse a -80ºC durante varios meses sin una pérdida
significativa de la eficacia de transformación. Sin embargo, las
células preparadas mediante los métodos explicados anteriormente
son extremadamente inestables cuando se almacenan a temperaturas
superiores a -80ºC (por ejemplo, a -20ºC). El almacenamiento
estable de células competentes a temperaturas altas es sumamente
deseable, ya que muchos laboratorios de investigación no tienen
acceso a congeladores de -80ºC.
La presente invención se refiere a un método que
permite liofilizar y almacenar células competentes durante largos
periodos de tiempo a diversas temperaturas (de -80ºC a temperatura
ambiente) sin perder apreciablemente eficacia de transformación.
Por tanto, el método de la invención proporciona células competentes
procariotas que no requieren condiciones de almacenamiento
especializadas (por ejemplo, temperaturas extremadamente bajas)
para mantener la eficacia de transformación de tales células.
Por tanto, la invención proporciona un método
para producir células procariotas que son competentes para la
transformación, método que comprende hacer crecer las células en un
medio propicio para el crecimiento, hacer dichas células competentes
y liofilizar dichas células competentes. Según una realización del
método de la invención, las células se hacen competentes mediante
la incubación de las células en un tampón de competencia,
preferiblemente a una temperatura baja (por ejemplo, de 0ºC a 4ºC);
entonces, las células se liofilizan en presencia de un
crioprotector.
crioprotector.
La invención se refiere además a células
competentes procariotas producidas mediante tal método. En una
realización preferida, las células son células de
Escherichia, más preferiblemente E. coli. En una
realización más preferida, las células de E. coli se
seleccionan del grupo que consiste en DH5\alpha y DH10B.
En otra realización, la invención se refiere a un
método para transformar las células competentes liofilizadas
producidas mediante el método resumido anteriormente con una
molécula de ADN. La invención también se refiere a la célula
transformada producida mediante este método.
En otra realización, la invención se refiere a un
método para producir una proteína deseada, obteniéndose en primer
lugar células competentes liofilizadas producidas mediante el
método anterior, transformando las células competentes liofilizadas
con una molécula de ADN que puede expresar la proteína deseada, y
luego cultivando las células transformadas en condiciones
suficientes para producir la proteína deseada. La invención también
se refiere a una proteína producida mediante este método.
La figura 1 es una gráfica que muestra la
eficacia de transformación de DH5\alpha de E. coli
competentes que se habían liofilizado y almacenado a -20ºC en
crioviales NUNC, en los que el crioprotector utilizado era o bien
trehalosa o bien sacarosa.
La figura 2 es una gráfica que muestra la
viabilidad celular de DH5\alpha de E. coli competentes que
se habían liofilizado y almacenado a -20ºC en crioviales NUNC, en
los que el crioprotector utilizado era o bien trehalosa o bien
sacarosa.
La figura 3 es una gráfica que muestra la
eficacia de transformación de DH5\alpha de E. coli
competentes que se habían liofilizado y almacenado a -20ºC, en las
que el crioprotector utilizado era trehalosa, y el producto se cerró
herméticamente a vacío en viales de vidrio.
La figura 4A es una gráfica que muestra la
eficacia de transformación de DH5\alpha de E. coli
competentes que se habían liofilizado y almacenado a -20ºC en
crioviales NUNC, en los que las células se congelaron en primer
lugar a -80ºC durante 16 horas, se liofilizaron y entonces se
almacenaron a -20ºC durante periodos de tiempo variables.
La figura 4B es una gráfica que muestra la
eficacia de transformación de DH5\alpha de E. coli
competentes que se habían liofilizado en crioviales NUNC, en los
que las células se congelaron en primer lugar en nitrógeno líquido,
se liofilizaron y entonces se almacenaron a -20ºC durante periodos
de tiempo variables.
La figura 5 es una gráfica que muestra la
viabilidad celular de DH5\alpha de E. coli competentes que
se habían liofilizado en crioviales NUNC y se almacenaron a - 20ºC
durante periodos de tiempo variables, en los que la liofilización y
el almacenamiento a -20ºC está precedido de una congelación a -80ºC
durante 16 horas o de congelación en nitrógeno líquido.
La figura 6 es una gráfica que muestra la
eficacia de transformación de DH5\alpha de E. coli
competentes que se habían liofilizado según el ejemplo 3.
La figura 7 es una gráfica que muestra la
viabilidad celular de DH5\alpha de E. coli competentes que
se habían liofilizado según el ejemplo 3.
La figura 8 es una gráfica que muestra la
eficacia de transformación de DH5\alpha de E. coli
competentes que se habían liofilizado en viales de vidrio que se
cerraron herméticamente a vacío y se almacenaron a -20ºC, en los que
el crioprotector utilizado era o bien trehalosa o bien
sacarosa.
En la descripción de a continuación, se utilizan
ampliamente varios términos usados en la tecnología del ADN
recombinante. Se proporcionan las siguientes definiciones con el
fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de la
memoria descriptiva y de las reivindicaciones, incluyendo el
alcance que va a darse a tales términos.
Molécula de ADN. Cualquier molécula de ADN, de
cualquier tamaño, procedente de cualquier fuente, incluyendo ADN de
organismos víricos, procariotas y eucariotas. La molécula de ADN
puede estar en cualquier forma, incluyendo pero sin limitarse a,
lineal o circular, y de cadena sencilla o doble. Los ejemplos no
limitantes de moléculas de ADN incluyen plásmidos, vectores y
vectores de expresión.
Vector de clonación. Un ADN plasmídico, de fago,
un cósmido u otra molécula de ADN que puede replicarse de forma
autónoma en una célula huésped, y que está caracterizado por un
sitio o un número pequeño de sitios de reconocimiento para una
endonucleasa de restricción, en los que tales secuencias de ADN
pueden cortarse de un modo determinable sin pérdida de una función
biológica esencial del vector, y en el que puede someterse a corte
y empalme un fragmento de ADN con el fin de provocar su replicación
y clonación. El vector de clonación puede contener además un
marcador adecuado para su uso en la identificación de células
transformadas con el vector de clonación. Los marcadores
proporcionan, por ejemplo, resistencia a tetraciclina o resistencia
a ampicilina.
Vector de expresión. Un vector similar a un
vector de clonación pero que puede expresar un gen que se ha clonado
en él, tras la transformación en un huésped. El gen clonado se
coloca normalmente bajo el control de (es decir, se une
operativamente a) ciertas secuencias de control, tales como
secuencias promotoras.
Almacenarse de manera estable. Dentro del
significado de la presente invención, las células competentes que
pueden "almacenarse de manera estable" pueden resistir al
almacenamiento durante largos periodos de tiempo a una temperatura
adecuada, sin perder apreciablemente su eficacia de transformación.
Mediante el término "sin perder apreciablemente su eficacia de
transformación" se quiere decir que las células competentes
mantienen aproximadamente del 40% al 100%, preferiblemente del 60%
al 100%, más preferiblemente del 70% al 100%, y de la manera más
preferida aproximadamente del 80% al 100% de su eficacia de
transformación original (justamente después de la liofilización),
durante un periodo de almacenamiento de 30 días, preferiblemente de
60 días, más preferiblemente 90 días, y de la manera más preferida
de 120 días, a una temperatura de -20ºC. Las temperaturas de
almacenamiento adecuadas varían desde aproximadamente la
temperatura ambiente hasta aproximadamente -180ºC. Preferiblemente,
la temperatura de almacenamiento oscila desde aproximadamente 4ºC
hasta aproximadamente -80ºC, más preferiblemente desde
aproximadamente -20ºC hasta aproximadamente -80ºC. En un aspecto
preferido de la invención, las células se almacenan a
aproximadamente -20ºC. El periodo o tiempo de almacenamiento puede
oscilar desde aproximadamente 0 días hasta aproximadamente 150 días,
preferiblemente desde aproximadamente 240 días hasta
aproximadamente 365 días, y más preferiblemente desde
aproximadamente 365 días hasta aproximadamente 450 días, aunque
pueden utilizarse tiempos de almacenamiento más largos a
temperaturas de aproximadamente -20ºC e inferiores.
Células competentes. Células que tienen la
capacidad de captar y establecer una molécula de ADN exógeno.
Sustancialmente pura. Tal como se usa en el
presente documento significa que la proteína purificada deseada está
libre de componentes celulares contaminantes que estarían asociados
con la proteína en la naturaleza. "Sustancialmente pura" no
indica que la proteína deba estar completamente libre de todos los
contaminantes.
El método de la invención proporciona la
producción de células procariotas que son competentes para la
transformación y que pueden almacenarse de manera estable durante
largos periodos de tiempo a diversas temperaturas. Tanto las células
procariotas gram-negativas como las
gram-positivas (por ejemplo, bacterias) pueden
utilizarse según la invención. Ejemplos de células procariotas
adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia sp.,
Klebsiella sp., Salmonella sp., Bacillus sp., Streptomyces sp.,
Streptococcus sp., Shigella sp., Staphylococcus sp. y
Pseudomonas sp. Ejemplos no limitantes de especies dentro de
cada uno de los géneros anteriormente mencionados que pueden
utilizarse según la invención incluyen Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium,
Streptomyces aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus
pneumoniae y Pseudomonas syringae.
En una realización preferida, las células que se
hacen competentes mediante el método reivindicado son de
Escherichia, de manera especialmente preferida de E.
coli. Ejemplos no limitantes de cepas de E. coli que
pueden hacerse competentes mediante los métodos reivindicados
incluyen DH5, DH5\alpha, DH10, DH10B, HB101, RR1, JV30, DH11S,
DM1, DH10B/p3, DH5\alphaMCR, DH5\alpha5'IQ, DH5\alpha5', SCS1,
Stab2, DH12S, DH5\alpha-E, DH10BAC,
XL1-Blue MRF, XL2-Blue MRF,
XL1-Blue MR, cepa SURE, cepa SURE 2,
XL1-Blue, XL2-Blue, AG1, JM101,
JM109, JM110/SCS110, NM522, cepas TOPP, cepas ABLE,
XL1-Red, cepas BL21, cepa TK BI y derivados de las
mismas.
Según el método de la invención, las células que
van a hacerse competentes se hacen crecer en un medio propicio para
el crecimiento. Puede utilizarse cualquier medio que pueda mantener
el crecimiento de las células que van a hacerse competentes.
Ejemplos de tales medios incluyen, pero no se limitan a, caldo
Luria, caldo Luria complementado con MgCl_{2} 20 mM, 0,001% de
tiamina y 0,2% de glucosa; medio SOB que contiene 0,001% de PPG
(fórmula facilitada más adelante); y medio 15/10 (fórmula facilitada
más adelante). Otros medios adecuados se reconocerán rápidamente
por un experto en la técnica.
Las temperaturas de incubación para el
crecimiento de las células puede variar desde aproximadamente 10º
hasta aproximadamente 42ºC. Preferiblemente, las temperaturas
oscilan desde aproximadamente 12º hasta aproximadamente 37ºC, más
preferiblemente desde aproximadamente 15ºC hasta aproximadamente
32ºC, y de la manera más preferida desde aproximadamente 20º hasta
aproximadamente 25ºC. En un aspecto preferido de la invención, las
células se hacen crecer a aproximadamente 23ºC.
Tal como entenderá un experto habitual en la
técnica, las condiciones de crecimiento y el tiempo del cultivo
pueden afectar tanto a la viabilidad como a la eficacia de
transformación de las células tras la crioconservación. Las células
que se hacen crecer en un cultivo en matraz de agitación son
normalmente más resistentes a la tensión de la liofilización que
las que son cultivos en caldo estático. Además, el tiempo de un
cultivo también afecta a la capacidad del cultivo para sobrevivir a
la liofilización. Generalmente, las células recogidas en
crecimiento estacionario temprano o logarítmico posterior presentan
la mayor resistencia a la liofilización.
Por tanto, según la presente invención, las
células se hacen crecer en matraces de agitación, aunque pueden
usarse otros medios de crecimiento, incluyendo fermentadores. Los
matraces de agitación usados en la invención pueden ser de cualquier
tamaño y de cualquier tipo. Preferiblemente, se utilizan para este
procesamiento matraces de agitación de 2,8 L litros con
deflectores. Los tiempos de incubación variarán según las
condiciones usadas (temperatura, medio, aireación, etc.) y el tipo
de célula. La aireación en los matraces varía según la rotación por
minuto (rpm) usada, las rpm mayores dando como resultado una mayor
aireación. Los matraces se agitan normalmente a
100-500 rpm, preferiblemente a
200-400 rpm, y de la manera más preferida a
200-300 rpm, aunque un experto habitual en la
técnica puede determinar otros intervalos preferidos. Las células se
hacen crecer normalmente durante un tiempo y en condiciones
suficientes para alcanzar una densidad óptica (DO) a 550 nm de
entre 0,1 y 2,0. Preferiblemente, la DO oscila desde 0,1 hasta 1,0,
más preferiblemente desde 0,3 hasta 0,8, más preferiblemente desde
0,5 hasta 0,8, incluso más preferiblemente desde 0,5 hasta 0,7,
todavía más preferiblemente desde 0,6 hasta 0,8, y de la manera más
preferida desde 0,66 hasta 0,75.
Después de que las células han alcanzado la DO
deseada, las células pueden recogerse para su procesamiento
adicional. Según la invención, si no se alcanza la DO deseada o si
se supera, las células pueden volver a inocularse de nuevo y
repetirse el proceso de crecimiento hasta que se obtenga un cultivo
de densidad óptica suficiente.
Después de recogerse las células (por
centrifugación, filtración, etc.), opcionalmente pueden enfriarse
(por ejemplo, de 0º a 4ºC durante de 5 minutos a 2 horas). La
recogida de las células puede llevarse a cabo mediante
centrifugación de las células para obtener un sedimento celular. La
recogida también puede llevarse a cabo mediante concentración de las
células y luego centrifugación de los cultivos concentrados para
obtener un sedimento celular. Los métodos de concentración de las
células incluyen, pero no se limitan a, deshidratar el cultivo,
filtrar o someter el cultivo a cromatografía de exclusión por
tamaños, por ejemplo, usando columnas Centricon^{MR} (Amicon
Corp., Lexington, MA).
Después de recogerse las células, las células se
resuspenden en un tampón de competencia. Un tampón de competencia es
cualquier solución que permite que las células capten y establezcan
ADN exógeno. Ejemplos no limitantes de tampones de competencia
incluyen CaCl_{2} 50 mM, Tris/HCl 10 mM (Maniatis, T. et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor, NY (1989)); MOPS 0,1 M (pH 6,5), CaCl_{2} 50 mM,
RbCl_{2} 10 mM, 23% V/V de DMSO; tampón CCMB80 (acetato de
potasio 10 mM, pH 7,0, CaCl_{2}\cdotH_{2}O 80 mM,
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O 20 mM, MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 10 mM,
10% de glicerol ajustado a pH 6,4 con HCl 0,1 N); tampón TFB (Liu
et al., Biotechniques 8(1):23-25
(1990)); y tampón \chi1776 (Maniatis, T. et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, Cold Spring Harbor, NY
(1989)). Otros tampones adecuados se dan a conocer en Tang et
al., Nucl. Acids Res.
22(14):2857-2858 (1994); Chung et
al., Proc. Natl. Acad Sci. USA
86:2172-2175 (1989); M. Dagert y S.D. Ehrlich,
Gene 6:23-28 (1974); Kushner, S.R., en:
Genetic Engineering (H.W. Boyer y S. Nicosia, eds.) págs.
17-23, Elsevier/North Holland, Amsterdam (1978);
Mandel e Higa, J. Mol. Biol.
53:159-162 (1970); patente de los EE.UU.
número 4.981.797 de Jessee; y Hanahan, D., J. Mol.
Biol. 166:557-580 (1983).
Las células suspendidas en el tampón de
competencia se incuban durante un tiempo suficiente y a una
temperatura suficiente para hacer las células competentes para la
captación de ADN. Preferiblemente, las células se incuban a baja
temperatura (de 0 a 4ºC) durante de 0 a 3 horas, más
preferiblemente de 5 min. a 1 h, y de la manera más preferida de 5
min. a 30 min. Después de que las células se han hecho competentes,
puede añadirse directamente un crioprotector a la suspensión
celular. Preferiblemente, las células se recogen y entonces
resuspenden en un crioprotector. La concentración del crioprotector
variará dependiendo del tipo de células, tampones usados, el tipo de
crioprotector y otros factores. Un experto en la técnica puede
determinar las condiciones óptimas sin demasiada experimentación.
Los crioprotectores proporcionan protección de las células durante
el proceso de congelación reduciendo el punto de congelación,
minimizando el efecto de los cambios de solución externos a la
célula, penetrando en la célula para protegerla frente a los
efectos de concentración del soluto y/o cambiando la velocidad de
enfriamiento óptima hasta valores inferiores (F. P. Simione,
Journal of Parenteral Science & Technology,
46(6):226-232 (1992)). Por supuesto,
el crioprotector no debe ser tóxico para las células. Puede
encontrarse más información sobre la conservación de células vivas
mediante liofilización en Simione, 1992.
Cualquier crioprotector y combinación de los
mismos puede utilizarse según la invención. Tal como resultará
evidente, el tipo y la cantidad usada pueden variar dependiendo del
tipo de célula y de las condiciones utilizadas. Los crioprotectores
que pueden utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se
limitan a, hidratos de carbono y derivados de hidrato de carbono,
tales como trehalosa, sacarosa, lactosa, maltosa, manitol,
galactosa, ribosa, fructosa, xilosa, manosa, dextrosa, glucosa y
sorbitol, y polímeros tales como polietilenamina,
polivinilpirrolidona (PVP), Ficoll, etc. Otros crioprotectores que
pueden utilizarse según la invención, tales como goma arábiga,
albúmina, gelatina y alcoholes de azúcar, se reconocerán
rápidamente por un experto en la técnica.
Después de que las células se han mezclado con el
crioprotector, pueden llevarse alícuotas de la suspensión celular a
los recipientes que van a utilizarse para la liofilización y el
almacenamiento, tales como crioviales enfriados, por ejemplo, tubos
NUNC (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, nº de cat. 366656), o viales de
vidrio (Wheaton, Millville, N.J.). Antes de la liofilización, las
células se congelan a de aproximadamente -20ºC a aproximadamente
-180ºC, preferiblemente a de aproximadamente -80ºC a
aproximadamente -180ºC, de la manera más preferida a aproximadamente
-80ºC.
Los métodos de congelación de una muestra hasta
una temperatura de desde aproximadamente -80º hasta aproximadamente
-180ºC se conocen bien en la técnica. Éstos incluyen almacenamiento
durante la noche (aproximadamente durante 16 horas) de los viales
que contienen las células en un congelador a -80ºC, o inmersión de
los viales que contienen las células en hielo seco, o en un baño a
baja temperatura, tal como etanol en hielo seco o en un baño de
contiene nitrógeno líquido. Otros sistemas de este tipo se dan a
conocer en The Chemist's Companion: A Handbook of Practical
Data, Techniques, and References, Gordon, A.J., et al.,
eds., John Wiley and Sons, NY (1972).
Las células se liofilizan entonces mediante
técnicas que se conocen bien en la técnica. La liofilización es un
procedimiento mediante el cual se elimina hielo y/o humedad de
células congeladas mediante sublimación a vacío a temperaturas
bajas, bajo cero (por ejemplo, de -40º a -50ºC). Cualquier humedad
residual asociada con la preparación "seca" se elimina entonces
mediante un aumento gradual de la temperatura, dando como resultado
evaporación. Por tanto, según la invención, la liofilización
comprende someter células congeladas a vacío en condiciones
suficientes para eliminar sustancialmente la humedad y/o el hielo
de dichas células (también referido en el presente documento como
células sustancialmente secas). Las células sustancialmente secas
pueden almacenarse entonces a diversas temperaturas (de temperatura
ambiente a aproximadamente -180ºC, preferiblemente de
aproximadamente 4ºC a aproximadamente -80ºC, más preferiblemente de
aproximadamente -20ºC a aproximadamente -80ºC, y de la manera más
preferida a aproximadamente -20ºC).
Un procedimiento de este tipo para la
liofilización de células comprende las etapas de
(a) cargar un recipiente que contiene células
congeladas en un liofilizador, teniendo el liofilizador una
temperatura de aproximadamente de -40º a aproximadamente -50ºC;
(b) someter las células a vacío; y
(c) secar sustancialmente las células.
Preferiblemente, el vacío es inferior a
aproximadamente 100 \mum, y las células se secan mediante:
(i) mantenimiento de la temperatura de la cámara
a aproximadamente -45ºC durante aproximadamente 2 horas; y
(ii) aumento de la temperatura de la cámara desde
aproximadamente -45ºC hasta aproximadamente 10ºC a una velocidad de
aproximadamente de 0,1º a 1,0ºC/h (preferiblemente, de 0,5º a
0,8ºC/h, y de la manera más preferida de 0,6º a 0,8ºC/h).
El recipiente de células puede cerrarse entonces
herméticamente y almacenarse durante largo tiempo a diversas
temperaturas.
El recuento de células viables de las células
competentes producidas mediante el método de la invención seguirá
siendo superior a aproximadamente 1 x 10^{7} células/ml,
preferiblemente superior a aproximadamente 1 x 10^{8} células/ml,
y más preferiblemente superior a aproximadamente 1 x 10^{9}
células/ml cuando se almacenan a -20ºC durante cualquier periodo de
tiempo de desde aproximadamente 0 días hasta aproximadamente 450
días, preferiblemente desde aproximadamente 240 días hasta
aproximadamente 365 días, y más preferiblemente desde
aproximadamente 365 días hasta aproximadamente 450 días. Estas
células conservarán una eficacia de transformación de al menos
aproximadamente 1 x 10^{5}, preferiblemente de al menos
aproximadamente 1 x 10^{6}, más preferiblemente de al menos
aproximadamente 1 x 10^{7}, todavía más preferiblemente de al
menos aproximadamente 1 x 10^{8} y de la manera más preferida de
al menos aproximadamente 1 x 10^{9} transformantes por microgramo
de ADN (T/\mug). Las temperaturas de almacenamiento adecuadas
varían desde aproximadamente la temperatura ambiente hasta
aproximadamente -180ºC. Preferiblemente, la temperatura
almacenamiento oscila desde aproximadamente 4ºC hasta
aproximadamente -80ºC, más preferiblemente desde aproximadamente
-20ºC hasta aproximadamente -80ºC. En un aspecto preferido de la
invención, las células se almacenan a aproximadamente -20ºC. El
periodo o tiempo de almacenamiento puede oscilar desde
aproximadamente 0 días hasta aproximadamente 45 días,
preferiblemente desde aproximadamente 0 días hasta aproximadamente
90 días, todavía más preferiblemente desde aproximadamente 0 días
hasta aproximadamente 150 días, aún más preferiblemente desde
aproximadamente 240 días hasta aproximadamente 365 días, y todavía
más preferiblemente desde aproximadamente 365 días hasta
aproximadamente 450 días, aunque pueden utilizarse tiempos de
almacenamiento más largos a temperaturas de aproximadamente -20ºC e
inferiores. Las células competentes producidas mediante el método
de la invención pueden almacenarse a - 20ºC durante al menos un año
mientras que conservan sustancialmente su eficacia de
transformación. La conservación sustancial de la eficacia de
transformación significa que tras la liofilización, las células
tendrán una eficacia de transformación después del almacenamiento
que es aproximadamente del 40% al 100%, preferiblemente de
aproximadamente el 60% al 100%, más preferiblemente de
aproximadamente el 70% al 100% y de la manera más preferida de
aproximadamente el 80% al 100% de la eficacia de transformación de
las células inmediatamente después de la
liofilización.
liofilización.
La invención también se refiere a la
transformación de células competentes liofilizadas producidas según
el método de invención. La transformación de dichas células
competentes liofilizadas comprende obtener células competentes
liofilizadas, mezclar dichas células con una molécula de ADN e
incubar dicha mezcla en condiciones suficientes para transformar
dichas células con dicha molécula de ADN. Según este aspecto de la
invención, las células competentes liofilizadas puede ser cualquier
bacteria gram-positiva o
gram-negativa que incluyen, pero no se limitan a,
Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Bacillus, Streptomyces,
Streptococcus y Pseudomonas. Preferiblemente, se
transforman células procariotas gram-negativas
según el método de la invención, más preferiblemente
Escherichia, y de la manera más preferida E. coli.
Según la invención, puede utilizarse cualquier molécula de ADN (por
ejemplo, vectores, plásmidos, fagémidos, vectores de expresión,
etc.). Preferiblemente, las células se mezclan con la molécula de
ADN en presencia de un tampón de competencia. Según la invención, el
tampón de competencia puede añadirse a las células competentes
liofilizadas antes de añadir la molécula de ADN o la molécula de
ADN y el tampón de competencia pueden añadirse simultáneamente a las
células competentes liofilizadas. Aunque se prefiere el mezclado de
las células competentes liofilizadas con la molécula de ADN y un
tampón de competencia, puede utilizarse cualquier solución para
rehidratar y mezclas las células competentes con la molécula de
ADN. Tales soluciones incluyen agua, solución salina o cualquier
tampón adecuado.
Después de transformarse las células con la
molécula de ADN de interés, las células transformadas pueden
hacerse crecer en un medio propicio para el crecimiento.
Normalmente, un tal medio propicio para el crecimiento contiene un
antibiótico para ayudar en la selección de las células
transformadas. Es decir, la molécula de ADN que va a transformarse
puede contener un marcador selectivo (por ejemplo, un gen de
resistencia a antibióticos), que permite la selección de células
transformadas cuando se utiliza el antibiótico correspondiente en
el medio.
La invención también se refiere a un método para
producir una proteína deseada mediante la transformación de células
competentes liofilizadas con una molécula de ADN que codifica para
dicha proteína deseada. Por tanto, la invención se refiere a un
método para producir una proteína deseada que comprende obtener
células competentes liofilizadas producidas según la invención,
transformar dichas células con una molécula de ADN que puede
expresar dicha proteína deseada y cultivar dichas células
transformadas en condiciones suficientes para producir dicha
proteína deseada. Las células que pueden utilizarse según este
aspecto de la invención incluyen bacterias tanto
gram-negativas como gram-positivas,
preferiblemente Escherichia, y de la manera más preferida
E. coli. En este aspecto de la invención, las células se
transforman mediante el mezclado de las células con una molécula de
ADN y la incubación de la mezcla en condiciones suficientes para
transformar dichas células con dicha molécula de ADN. Esta etapa de
mezclado puede llevarse a cabo en cualquier solución. De la manera
más preferida, las células competentes liofilizadas se rehidratan
con un tampón de competencia antes de añadir la molécula de ADN, o
las células competentes liofilizadas se mezclan simultáneamente con
la molécula de ADN y el tampón de competencia. Las células
transformadas pueden seleccionarse según técnicas bien conocidas en
la técnica que incluyen, por ejemplo, la selección para genes de
marcadores en la molécula de ADN (por ejemplo, genes de resistencia
a antibióticos). Después de que se han seleccionado las células
transformadas, las células pueden cultivarse entonces, según
técnicas bien conocidas, en un medio propicio para el crecimiento.
Tras el cultivo de las células en las condiciones apropiadas, las
células pueden producir la proteína deseada. La proteína deseada
puede entonces aislarse y obtenerse una proteína sustancialmente
pura mediante técnicas de purificación de proteínas bien
conocidas.
Habiendo descrito en general la invención, la
misma se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los
siguientes ejemplos, que se proporcionan a título de ilustración y
que no pretenden ser limitantes.
Una siembra madre de células DH5\alpha de E.
coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) se preparó tal como sigue:
se sembraron en estría células DH5\alpha en una placa de LB (32 g
de agar LB de Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)
por litro de agua destilada) y la placa se incubó durante 36 horas
a 23ºC. Se pusieron varias colonias en un matraz de agitación sin
deflectores de 500 ml que contenía 25 ml de medio SOB (2% de
bacto-triptona, 0,5% extracto de
bacto-levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2}
10 mM, MgSO_{4} 10 mM).
El matraz se agitó a 23ºC, 275 rpm, durante
varias horas y se siguió la densidad óptica a 550 nm. Cuando la
densidad óptica había alcanzado 0,5, se mezclaron 10 ml de las
células con 10 ml de SOB:glicerol 60:40 (60 ml de SOB, 40 ml de
glicerol, (Gibco BRL) en un tubo cónico de 50 ml. Las células se
mezclaron utilizando una mezcladora de vórtex y se dejaron durante
10 min. en hielo. Se dispensaron alícuotas de 1 ml en los
crioviales NUNC (nº de catálogo 366656) (Life Technologies, Inc.,
Gaithersburg, MD) y se congelaron en un baño de etanol en hielo seco
durante al menos 5 minutos. Las simientes se almacenaron a
-80ºC.
Una siembra de células DH5\alpha almacenada a
-80ºC se descongeló en hielo durante 10 min. Se inocularon 0,450 ml
de la siembra descongelada en 1500 ml de medio SOB que contenía un
0,001% de PPG en un matraz Fernbach de 2,8 L. El matraz de agitó a
23ºC (275 rpm). Después de aproximadamente 20 horas, el cultivo
había alcanzado una densidad óptica a 550 nm de 0,66. Las células
se enfriaron en hielo durante 15 min. y se recogieron mediante
centrifugación usando botellas de 250 ml de Corning con 250 ml de
cultivo celular/botella. Las células se centrifugaron en un rotor
GS3 a 4000 rpm, a 4ºC durante 10 minutos en una centrífuga Sorvall
RC2B.
Cada sedimento celular se resuspendió en 75 ml de
tampón CCMB80 frío (acetato de potasio 10 mM, pH 7,0,
CaCl_{2}\cdotH_{2}O 80 mM, MnCl_{2}\cdot4H_{2}O 20 mM,
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 10 mM, 10% de glicerol ajustado a pH 6,4
con HCl 0,1 N). Las células se mantuvieron en hielo durante 20 min.
El sedimento celular se recogió a 4ºC por centrifugación y cada
sedimento celular se resuspendió en 16 ml de o bien trehalosa
acuosa al 9% (Quadrant, Cambridge, Inglaterra) o bien sacarosa
acuosa al 12% (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Se
añadieron alícuotas de 250 \mul de la suspensión celular a
crioviales NUNC de 1,0 ml enfriados (Life Technologies, Inc.,
Gaithersburg, MD, nº de catálogo 366656). Las tapas se colocaron
sin apretar en la parte superior de los viales y los viales se
pusieron en un congelador a -80ºC durante 16 horas.
De manera alternativa, las células se colocaron
en viales de vidrio de 5 ml enfriados (Wheaton, Millville, N.J., nº
de catálogo 223712). Se colocó un tapón de goma sin apretar en la
parte superior del vial y el vial se puso a una temperatura de -80ºC
durante 16 horas.
Después del almacenamiento durante la noche en el
congelador a -80ºC, los viales se colocaron en un liofilizador Hull
y se secaron a vacío según el siguiente protocolo:
(a) Ajustar la temperatura de almacenamiento a
-45ºC.
(b) Cargar las muestras de DH5\alpha congeladas
de manera uniforme en cada bandeja.
(c) Cerrar la cámara y encender el sistema de
vacío. Cuando el vacío es inferior a 100 m., empezar el programa de
secado compuesto por las 3 partes siguientes:
i) Mantener la temperatura de almacenamiento a
-45ºC durante 2 horas.
ii) Aumentar la temperatura de almacenamiento
desde -45ºC hasta 10ºC a la velocidad de aproximadamente 0,7ºC/hora
(55ºC en 72 horas).
(d) Tan pronto como la temperatura de
almacenamiento alcanza los 10ºC, las células se cambian a un lugar
frío a 4ºC.
(e) Almacenar los viales a -20ºC.
Cuando se completó el ciclo de liofilización, las
células se sacaron del liofilizador y se llevaron a un lugar frío a
4ºC donde se apretaron las tapas. Las células se colocaron entonces
en una bolsa de papel metalizado que contenía un desecante y las
bolsas se colocaron en un congelador a -20ºC para su
almacenamiento.
Para someter a ensayo las células para determinar
la eficacia de transformación y recuento de células viables, los
viales se sacaron del congelador a -20ºC y se pusieron en hielo
húmedo durante 6 minutos. Las células se rehidrataron con 400 \mul
de una mezcla 1:1 de tampón CCMB80 sin glicerol (acetato de potasio
10 mM, pH 7,0, CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 80 mM,
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O 20 mM, MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 10 mM,
ajustado a pH 6,4 con HCl 0,1 N) y tampón FSB (acetato de potasio 10
mM, pH 7,0, KCl 100 mM, MnCl_{2}\cdot4H_{2}O 45 mM,
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 10 mM, cloruro de hexaaminocobalto (III)
3 mM, 10% de glicerol al 10%, 5% de sacarosa acuosa ajustada a pH
6,4 con HCl 0,1 N). Se sacaron 100 \mul de las células del vial y
se pusieron en un tubo Falcon^{MR} 2059 (Becton Dickenson)
enfriado para el ensayo de 50 pg de ADN de plásmido pUC19. El
recuento de células viables de las células resuspendidas también se
determinó mediante dilución habitual usando NaCl al 0,85%. Las
células se volvieron a someter a ensayo para determinar la eficacia
de transformación y el recuento de células viables después del
almacenamiento a -20ºC. Los resultados de un estudio de estabilidad
de este tipo se presentan en las figuras 1, 2 y 3.
La figura 1 indica que las células DH5\alpha
liofilizadas en crioviales NUNC usando o bien sacarosa o bien
trehalosa como crioprotector conservó una eficacia de transformación
> 1,0 X 10^{7} T/ug, cuando se almacenaron durante el menos 12
meses a aproximadamente -20ºC. La figura 2 indica que el recuento
de células viables de las células almacenadas en crioviales NUNC a
aproximadamente -20ºC seguía siendo de aproximadamente 1,0 X
10^{9} células/ml durante el menos 12 meses. La figura 3 indica
que las células liofilizadas usando trehalosa en viales de vidrio
que se cierran herméticamente a vacío conservan una eficacia de
transformación >1,0 x 10^{8} T/\mug después de almacenamiento
a -20ºC durante 12 meses.
El siguiente ejemplo se llevó a cabo
esencialmente como el ejemplo 1 con las siguientes excepciones. Se
descongeló la siembra de DH5\alpha almacenada a -80ºC y se
inocularon 600 \mul de la siembra en 1,7 L de medio SOB que
contenía 0,001% de PPG en un matraz Fernbach de 2,8 L. El matraz se
agitó durante 18 horas a 23ºC, 275 rpm. Cuando la densidad óptica a
550 nm había alcanzado 0,194, se inocularon 175 ml del cultivo en
1,7 L de medio SOB que contenía 0,001% de PPG en un matraz Fernbach
de 2,8 L. El matraz se agitó durante aproximadamente 4 horas a 23ºC,
275 rpm. Cuando la densidad óptica a 550 nm había alcanzado 0,09,
se inocularon 2,7 ml del cultivo en 2 matraces Fernbach que
contenían cada uno 1,7 L de medio SOB y 0,001% de PPG. Los matraces
se agitaron a 23ºC, 275 rpm, durante aproximadamente 22 horas.
Cuando la densidad óptica a 550 nm había alcanzado entre 0,648 y
0,722, los cultivos se recogieron y se procesaron como en el ejemplo
1, con la excepción de que las células no se enfriaron antes de la
recogida por centrifugación. Se centrifugaron entonces 200 ml de
células a aproximadamente 4ºC, tal como se describió en el ejemplo
1, y el sedimento celular se resuspendió en 60 ml de tampón CCMB80
frío. Las células se pusieron en hielo durante 20 minutos y se
recogieron de nuevo mediante centrifugación a aproximadamente 4ºC.
El sedimento celular se resuspendió en 25,6 ml de sacarosa acuosa
al 12% fría y las células se pusieron en hielo durante 2 horas.
Después de una incubación de 2 horas en hielo, se pusieron 250
\mul de las células en crioviales NUNC enfriados. Las células se
congelaron colocando los viales en un congelador a -80ºC durante 16
horas o se congelaron mediante inmersión en un baño de nitrógeno
líquido. Las células se liofilizaron tal como se describió en el
ejemplo 1.
Los resultados se presentan en las figuras 4A, 4B
y 5. Como se observa en las figuras 4A y 4B, las células
liofilizadas en sacarosa pudieron almacenarse a -20ºC durante al
menos 5 meses sin una pérdida sustancial de la eficacia de
transformación. La eficacia de transformación de las muestras fue
de al menos 1 X 10^{7} T/ug. Las muestras congeladas o bien en
nitrógeno líquido (figura 4B) o bien mediante almacenamiento a
-80ºC durante 16 horas (figura 4A) antes de la liofilización
conservaron una eficacia de transformación > 1,0 x 10^{7}
T/\mug. Tal como se observa en la figura 5, las células
DH5\alpha liofilizadas pudieron almacenarse a -20ºC sin una
pérdida significativa de la viabilidad celular. La congelación o
bien en nitrógeno líquido o bien mediante almacenamiento a -80ºC
durante 16 horas antes de la liofilización dio como resultado un
almacenamiento estable de las células. Todas las muestras habían
permanecido en hielo durante al menos 2 horas antes de colocarse en
viales. Por tanto, estos datos indican que las células pueden
permanecer en hielo en el crioprotector durante al menos 2 horas
antes de la congelación y liofilización, mientras que conservan
sustancialmente la eficacia de transformación y la viabilidad
celular.
El siguiente ejemplo se llevó a cabo
esencialmente como el ejemplo 2, con las siguientes excepciones. Se
descongelaron dos siembras de DH5\alpha y se inocularon 800
\mul en dos matraces Fernbach de 2,8 L, que contenían cada uno 1,7
L de medio SOB y 0,001% de PPG. Los matraces se agitaron a 23ºC,
275 rpm, durante aproximadamente 19 horas. La densidad óptica de los
dos matraces era de 0,3918 y 0,3578, respectivamente. Las células
se recogieron mediante centrifugación a 4ºC. Cada sedimento celular
resuspendió en 10 ml de medio SOB a temperatura ambiente que
contenía un 0,001% de PPG y se reunieron (un total de 120 ml). Una
dilución 1:100 de las células tenía una densidad óptica de 0,0754,
indicando que la densidad celular era de 7,54. Se inocularon veinte
ml de las células en 6 matraces Fernbach, que contenían cada uno
1,7 L de medio SOB y 0,001% de PPG. Los matraces se agitaron a 23ºC,
275 rpm, durante 6,5 horas, momento en el que las densidades
ópticas de los matraces eran de 0,705, 0,783, 0,701, 0,749, 0,704 y
0,702. Los matraces se enfriaron en hielo durante 15 minutos. Se
concentraron diez litros de las células en el lugar frío a 4ºC
mediante deshidratación hasta 3 L del siguiente modo.
La bomba peristáltica utilizada era una
Masterflex, modelo 7529-30 (Cole Palmer) y la
columna utilizada era una columna Microgon nº
M22M-300-01N. La columna se conectó
a la bomba y se aclaró una vez con 2 litros de agua desionizada
esterilizada en autoclave. La bomba se encendió y se hicieron
circular 2 litros de lejía al 0,37% a través del sistema durante 20
minutos. El sistema se aclaró entonces con 10 litros de agua
desionizada esterilizada en autoclave. Se vertieron 10 litros de la
suspensión celular en el depósito. La suspensión celular se hizo
circular entonces a través del sistema con la velocidad de la bomba
ajustada en 3,5, para reducir el volumen hasta 3 litros. El proceso
requirió aproximadamente 25 minutos (aproximadamente 280
ml/minuto). Los 3 litros de suspensión celular concentrada se
recuperaron desde el depósito mediante bombeo de la suspensión
celular fuera del depósito.
Se centrifugaron seis botellas que contenían cada
una 250 ml de la suspensión celular concentrada en un rotor GS3 a
4000 rpm, durante 10 minutos, a 4ºC. Cada sedimento celular se
resuspendió en 250 ml de tampón CCMB80 frío. Las células
permanecieron en hielo durante 20 minutos y luego se recogieron las
células mediante centrifugación a 4ºC. Cada sedimento celular se
resuspendió en 53 ml de trehalosa acuosa al 9% fría. Las células se
pusieron en hielo durante 1 hora y se pusieron 250 \mul de las
células en crioviales de 1,0 ml (Wheaton, Millville, N.J.). Los
viales se colocaron en un congelador a -80ºC y permanecieron
durante 16 horas antes de la liofilización. Las células se
liofilizaron en un liofilizador Tri-Philizer^{MR}
modelo TRI585 (FTS Systems Inc.), aumentándose la temperatura a una
velocidad de 0,6ºC/h.
Los resultados se presentan en las figuras 6 y 7.
La figura 6 indica que las células pueden almacenarse a -20ºC
durante al menos 4 meses y mantener una eficacia de transformación
superior a 1 x 10^{7} T/ug. La figura 7 indica que la viabilidad
celular se mantiene superior a 1 x 10^{9} células/ml después del
almacenamiento durante 4 meses a -20ºC.
Este ejemplo se llevó a cabo esencialmente como
el ejemplo 1, con las siguientes excepciones. Se sembró en estría
la cepa DH10B de E. coli a partir de una siembra madre
almacenada a -80ºC en una placa de LB que contenía estreptomicina
100 \mug/ml. La placa se incubó durante 24 horas a 23ºC. Se cogió
una colonia individual de la placa y se inoculó en un matraz que
contenía 250 ml de medio 15/10 (1,0% de
bacto-triptona, 1,5% de extracto de
bacto-levadura, NaCl 10 mM, KCl 2 mM, MgCl_{2} 10
mM, MgSO_{4} 10 mM, 0,001% de polipropilenglicol (PPG)). El matraz
se agitó a 23ºC, 260 rpm, en un agitador Psycrotherm^{MR} de New
Brunswick durante 16 horas. Se inocularon seis ml del cultivo en un
matraz Fernbach de 2,8 L que contenía 1,25 L de medio 15/10, y el
matraz se agitó a 23ºC, 260 rpm. La densidad óptica a 550 nm era
inicialmente de 0,1. El matraz se agitó hasta que la densidad óptica
fue de 0,7 y las células se recogieron entonces mediante
centrifugación a 4ºC. Las células se trataron como en el ejemplo 1.
Después de resuspenderlas en el crioprotector, se pusieron alícuotas
de 1 ml de la suspensión celular en viales de vidrio de 5 ml
estériles (Wheaton) y las células se congelaron durante 5 minutos en
un baño de etanol en hielo seco. Los tapones de goma se ajustaron
sin apretar en los viales y los viales se colocaron en el
liofilizador. Las células se liofilizaron según el programa descrito
en el ejemplo 1, excepto en que los viales se cerraron
herméticamente a vacío.
Después de la liofilización, los viales se
sacaron del liofilizador y se almacenaron a -20ºC en bolsas de
papel metalizado que contenían un desecante. A intervalos, los
viales se sacaron del congelador y se sometieron a ensayo para
determinar la eficacia de transformación esencialmente como en el
ejemplo 1, con la excepción de que las células se resuspendieron en
2 ml de tampón CCMB80 sin glicerol. Los resultados se presentan en
la figura 8. Los datos indican que la cepa DH10B de E. coli
puede liofilizarse y almacenarse a -20ºC durante al menos 6 meses,
mientras que conserva sustancialmente su eficacia de
transformación. Las muestras conservan una eficacia de
transformación > 1 x 10^{8} T/\mug después del
almacenamiento prolongado a -20ºC.
Resultará evidente que la invención puede ponerse
en práctica de otra manera a la descrita particularmente en la
descripción y los ejemplos anteriores.
Claims (59)
1. Método para producir células procariotas que
son competentes para la transformación, comprendiendo dicho
método
(a) hacer crecer dichas células en un medio
propicio para el crecimiento;
(b) hacer dichas células competentes; y
(c) liofilizar dichas células competentes.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células se hacen crecer a de aproximadamente 10ºC a
aproximadamente 42ºC.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células se hacen crecer a de aproximadamente 12ºC a
37ºC.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células se hacen crecer a de aproximadamente 15ºC a
aproximadamente 32ºC.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células se hacen crecer a de aproximadamente 20ºC a
aproximadamente 25ºC.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células se hacen crecer a aproximadamente 23ºC.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células son células procariotas
gram-negativas.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
dichas células se seleccionan del grupo que consiste en
Escherichia, Klebsiella, Salmonella y Pseudomonas.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
dichas células son células de Escherichia.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
dichas células son células de E. coli.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
dichas células de E. coli se seleccionan del grupo que
consiste en DH5, DH5\alpha, DH10, DH10B, HB101, RR1, JV30, DH11S,
DM1, DH10B/p3, DH5\alphaMCR, DH5\alpha5'IQ, DH5\alpha5',
SCS1, Stab2, DH12S, DH5\alpha-E, DH10BAC,
XL1-Blue MRF, XL2-Blue MRF,
XL1-Blue MR, cepa SURE, cepa SURE 2,
XL1-Blue, XL2-Blue, AG1, JM101,
JM109, JM110/SCS110, NM522, cepas TOPP, cepas ABLE,
XL1-Red, cepas BL21, cepa TK B1 y derivados de las
mismas.
12. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de liofilización comprende
(a) congelar las células; y
(b) someter dichas células congeladas a vacío en
condiciones suficientes para secar sustancialmente dichas
células.
13. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa para hacer dichas células competentes comprende
suspender las células en un tampón de competencia.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
dicho tampón de competencia es tampón CCMB80.
15. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho método comprende además mezclar dichas células con un
crioprotector antes de la etapa de liofilización.
16. Método según la reivindicación 15, en el que
dicho crioprotector es un hidrato de carbono o derivado del
mismo.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
dicho hidrato de carbono se selecciona del grupo que consiste en
trehalosa, sacarosa, sorbitol, glucosa y goma arábiga.
18. Método según la reivindicación 16, en el que
dicho hidrato de carbono es trehalosa, sacarosa o mezclas de las
mismas.
19. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células liofilizadas se almacenan a una temperatura de desde
aproximadamente la temperatura ambiente hasta aproximadamente
-180ºC.
20. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células liofilizadas se almacenan a de aproximadamente 4ºC a
aproximadamente -80ºC.
21. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células liofilizadas se almacenan a de aproximadamente -20ºC
a aproximadamente -80ºC.
22. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células liofilizadas se almacenan a aproximadamente
-20ºC.
23. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células liofilizadas tienen una eficacia de transformación
de al menos aproximadamente 1 x 10^{6} transformantes por \mug
de ADN.
24. Método según la reivindicación 1, en el que
la eficacia de transformación de dichas células liofilizadas se
conserva sustancialmente después del almacenamiento.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
dicho almacenamiento es de desde 0 hasta aproximadamente 450
días.
26. Método según la reivindicación 24, en el que
dicho almacenamiento es de desde aproximadamente 240 días hasta
aproximadamente 365 días.
27. Método según la reivindicación 24, en el que
dicho almacenamiento es de desde aproximadamente 365 días hasta
aproximadamente 450 días.
28. Células competentes producidas mediante el
método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 12 o 15.
29. Células competentes según la reivindicación
28, en las que dichas células competentes son células de
Escherichia.
30. Células competentes según la reivindicación
28, en las que dichas células son células de E. coli.
31. Método para transformar células competentes
liofilizadas que comprende
(a) obtener células competentes liofilizadas
producidas mediante el método según una cualquiera de la
reivindicaciones 1, 12 o 15;
(b) mezclar dichas células con una molécula de
ADN; e
(c) incubar dicha mezcla en condiciones
suficientes para transformar dichas células con dicha molécula de
ADN.
32. Método según la reivindicación 31, en el que
dichas células son células de Escherichia.
33. Método según la reivindicación 32, en el que
dichas células son células de E.coli.
34. Método según la reivindicación 31, en el que
dicha molécula de ADN es un vector.
35. Método según la reivindicación 31, que
comprende además rehidratar dichas células liofilizadas con un
tampón de competencia antes de dicha etapa de mezclado.
36. Método según la reivindicación 31, en el que
dicha etapa de mezclado supone mezclar dichas células liofilizadas
con un tampón de competencia y la molécula de ADN.
37. Método de producción de una proteína deseada
que comprende
(a) obtener células competentes liofilizadas
producidas mediante el método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 12 o 15;
(b) transformar dichas células con una molécula
de ADN que puede expresar dicha proteína deseada; y
(c) cultivar dichas células transformadas en
condiciones suficientes para producir dicha proteína deseada.
38. Método según la reivindicación 37, en el que
dichas células son células de Escherichia.
39. Método según la reivindicación 38, en el que
dichas células son células de E. coli.
40. Método según la reivindicación 37, en el que
dicha molécula de ADN es un vector.
41. Método según la reivindicación 37, en el que
dicha etapa de transformación comprende mezclar dichas células con
tampón de competencia y dicha molécula de ADN.
42. Células procariotas liofilizadas
competentes.
43. Células competentes según la reivindicación
42, en las que dichas células son células procariotas
gram-negativas.
44. Células competentes según la reivindicación
43, en las que dichas células se seleccionan del grupo que consiste
en Escherichia, Klebsiella, Salmonella y
Pseudomonas.
45. Células competentes según la reivindicación
44, en las que dichas células son células de
Escherichia.
46. Células competentes según la reivindicación
45, en las que dichas células son células de E. coli.
47. Células competentes según la reivindicación
46, en las que dichas células de E. coli se seleccionan del
grupo que consiste en DH5, DH5\alpha, DH10, DH10B, HB101, RR1,
JV30, DH11S, DM1, DH10B/p3, DH5\alphaMCR, DH5\alpha5'IQ,
DH5\alpha5', SCS1, Stab2, DH12S, DH5\alpha-E,
DH10BAC, XL1-Blue MRF, XL2-Blue MRF,
XL1-Blue MR, cepa SURE, cepa SURE 2,
XL1-Blue, XL2-Blue, AG1, JM101,
JM109, JM110/SCS110, NM522, cepas TOPP, cepas ABLE,
XL1-Red, cepas BL21, cepa TK B1 y derivados de las
mismas.
48. Células competentes según la reivindicación
42, en las que dichas células tienen una eficacia de transformación
de al menos 1 x 10^{5} transformantes por microgramo de ADN.
49. Células competentes según la reivindicación
48, en las que dichas células tienen una eficacia de transformación
de al menos 1 x 10^{6} transformantes por microgramo de ADN.
50. Células competentes según la reivindicación
49, en las que dichas células tienen una eficacia de transformación
de al menos 1 x 10^{7} transformantes por microgramo de ADN.
51. Células competentes según la reivindicación
50, en las que dichas células tienen una eficacia de transformación
de al menos 1 x 10^{8} transformantes por microgramo de ADN.
52. Células competentes según la reivindicación
51, en las que dichas células tienen una eficacia de transformación
de al menos 1 x 10^{9} transformantes por microgramo de ADN.
53. Células competentes según la reivindicación
42, en las que dichas células tienen un recuento de células viables
superior a 1 x 10^{7} células/ml después de almacenarse a -20ºC
durante de 0 a 450 días.
54. Células competentes según la reivindicación
53, en las que dichas células tienen un recuento de células viables
superior a 1 x 10^{8} células/ml después de almacenarse a -20ºC
durante de 0 a 450 días.
55. Células competentes según la reivindicación
54, en las que dichas células tienen un recuento de células viables
superior a 1 x 10^{9} células/ml después de almacenarse a -20ºC
durante de 0 a 450 días.
56. Células competentes según la reivindicación
42, en las que dichas células, después de almacenarse a -20ºC
durante al menos un año, tienen una eficacia de transformación que
es del 40% al 100% de la eficacia de transformación de dichas
células inmediatamente después de la liofilización.
57. Células competentes según la reivindicación
56, en las que dichas células, después de almacenarse a -20ºC
durante al menos un año, tienen una eficacia de transformación que
es del 60% al 100% de la eficacia de transformación de dichas
células inmediatamente después de la liofilización.
58. Células competentes según la reivindicación
57, en las que dichas células, después de almacenarse a -20ºC
durante al menos un año, tienen una eficacia de transformación que
es del 70% al 100% de la eficacia de transformación de dichas
células inmediatamente después de la liofilización.
59. Células competentes según la reivindicación
58, en las que dichas células, después de almacenarse a -20ºC
durante al menos un año, tienen una eficacia de transformación que
es del 80% al 100% de la eficacia de transformación de dichas
células inmediatamente después de la liofilización.
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