JP2001517928A - 細菌の低温貯蔵中の生存能および形質転換効率増強法 - Google Patents
細菌の低温貯蔵中の生存能および形質転換効率増強法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、低温での生存能が増強された改良Ｅ．コリ細菌、低温での生存能を増強することができる改良細菌株の製造方法、および低温での細菌の生存能を増強できる遺伝物質の単離および使用に関する。低温での生存能が増強される以外に、この細菌は、低温貯蔵後の形質転換効率が増強されたている。本発明は、このままで外来ＤＮＡ配列を本発明の細菌中に挿入するのに使用できる。
Description
【発明の詳細な説明】
細菌の低温貯蔵中の生存能および形質転換効率増強法発明の分野
：
本発明は、細菌の低温(例えば、約４℃から約−２０℃)での安定貯蔵に関する
。特に、本発明は、低温貯蔵中の生存能が増強された、または形質転換効率が増
強された改良細菌、そのような細菌の生産法、およびかかる増強に関与する遺伝
物質に関する。本発明は更に、形質転換に対してコンピテント状態にした細胞、
そのようなコンピテント細胞の作成法およびそのようなコンピテント細胞を形質
転換する方法に関する。関連出願の相互参照
：
本出願は、出典明示により本明細書の一部とした１９９６年３月２９日出願の
米国特許出願第６０/０１４,３３０号および出典明示により本明細書の一部とし
た１９９６年９月５日出願の米国特許出願第６０/０２５,８３８号の部分継続出
願である。発明の背景
：
細菌の長期間貯蔵は、典型的に非常に低温(−８０℃以下)でなされる。このよ
うな非常に低い温度は細菌の貯蔵のみに使用されてきたのではなく、形質転換に
対してコンピテントにした細菌を貯蔵するのにも使用されてきた(米国特許第４,
９８１,７９７号)。しかしながら、より高い温度(例えば、約−２０℃から約４
℃)での細菌およびコンピテント細菌細胞の貯蔵には各種問題が付随する。これ
らのより高い温度では、細菌およびコンピテント細菌細胞は、生存能および形質
転換効率を迅速に失う。数ヶ月間で、このような細胞の生存可能細胞数および形
質転換効率は、数桁低下する。形質転換に対してコンピテントな細菌は、４℃で
数日間(Dagent et al.，Gene 6:23-28(1979))または１６日間しか(Pope et al.
，Nucl．Acids Res．24(3):536-537(1996))貯蔵できない。従って、生存能およ
びコンピテンシーを維持するため、細菌およびコンピテント細菌細胞は、典型的
には−８０℃で貯蔵されてきた。
多くの研究室が非常に低い温度での貯蔵を利用できないことから、細菌、特に
コンピテント細胞の−８０℃より高い温度での安定貯蔵は、非常に望まれている
。更に、−８０℃での細菌貯蔵はより高い温度の場合よりも費用がかかり、また
細菌細胞を−２０℃以下で輸送するのは困難かつ高価である。発明の概要
：
本発明は、形質転換効率または生存能を明らかに損失することなく、細菌細胞
およびコンピテント細胞を長期間−８０℃以上の温度(例えば、約−２０℃から
約４℃)で貯蔵可能にする方法を提供する。即ち、本発明の方法は、生存能およ
び／または形質転換効率を維持するための特別な貯蔵条件(例えば、極度に低温)
を必要としない、細菌細胞およびコンピテント細胞を提供する。
本発明の方法は、細菌の脂肪酸含量を変えることを含む。好ましくは、本発明
では、細菌の不飽和脂肪酸含量を変える。好ましくは、１種またはそれ以上の脂
肪酸を細菌中で増やし、最も好ましくは細菌膜中にある脂肪酸含量を増やす。脂
肪酸含量を変える好ましい方法は、細菌の遺伝子変更(例えば、１種またはそれ
以上の脂肪酸の生産(合成または異化)に関与する１種またはそれ以上の遺伝子の
発現を増強することによる)を含む。本発明に従い使用される細菌には、グラム
陽性およびグラム陰性菌があるが、エシェリヒア(Escherichia)などのグラム陰
性菌が好ましい。特に好ましい細菌には、エシェリヒア・コリ(Escherichia col
i)がある。
本発明はまた、低温(−８０℃以上、好ましくは約−２０℃から約４℃)貯蔵期
間後の生存能および／または形質転換効率が増強された細菌に関する。このよう
な貯蔵安定性細胞は、脂肪酸含量が変化している。好ましくは、貯蔵安定性細菌
細胞またはコンピテント細胞は、１種またはそれ以上の脂肪酸、好ましくは不飽
和脂肪酸のレベルまたは量が増加している。このような脂肪酸含量の量増加は、
遺伝子変更によって、好ましくは、細菌の脂肪酸含量の変化に関与する１種また
はそれ以上の遺伝子の発現を増強することによって引き起こすことができる。
本発明はまた、本発明の細菌をコンピテントにする方法、そのような本発明の
コンピテント細菌株を形質転換する方法および外来ＤＮＡで形質転換させた本発
明の細菌細胞に関する。本発明によれば、外来ＤＮＡ配列(例えば、プラスミド
、コスミド、ＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、発現ベクター、真核
生
物(特に、哺乳動物、もっと具体的には、ヒト))ＤＮＡ、ファージＤＮＡ等)は、
化学媒介形質転換、エレクトロポレーションおよびリポソーム媒介形質転換など
、これらに限定されないが、様々な技術により、本発明の新規細菌内に形質転換
させることができる。
本発明は更に、低温(例えば、−８０℃以上、好ましくは約−２０℃から約４
℃)で細菌の生存能または形質転換効率を増強できる配列を含むＤＮＡ分子を提
供する。このようなＤＮＡ分子は、好ましくは、細菌中の１種またはそれ以上の
脂肪酸の生産に関与する１種またはそれ以上の遺伝子を含む。最も好ましくは、
本発明の核酸分子は、細菌中の脂肪酸の生産を増強させる。図面の簡単な説明
：
図１は、細胞/mlで表した、２０℃で細胞貯蔵後のＥ．コリＤＨ１０Ｂ、ＳＢ
３４９９Ａ、ＳＢ３４９９ＢおよびＳＢ３４９９Ｃの生存能を示す。
図２は、ＤＮＡμｇ当りの形質転換体で表した、−２０℃で細胞貯蔵後のＥ．
コリＤＨ１０Ｂ、ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９ＢおよびＳＢ３４９９Ｃの形質
転換効率を示す。
図３は、コスミドベクターｐＣＰ１３またはコスミド１(ＮＲＲＬ Ｂ−２１５
５０)、２(ＮＲＲＬ Ｂ−２１５５１)または４(ＮＲＲＬ Ｂ−２１５５２)のい
ずれかを含有するＤＨ１０Ｂ細菌をある期間４℃で貯蔵した後の生存可能細胞数
を示す。
図４Ａは、−２０℃で貯蔵した４ヶ月にわたるベクターｐＣＰ１３およびコス
ミド１、２および４を含有するＤＨ１０Ｂ細胞の生存可能細胞数を示す。
図４Ｂは、クローン１、２および４からキュアリングしたＤＨ１０Ｂ細胞の生
存可能細胞数を示す。
図５は、ＤＨ１０Ｂ細胞、ベクターｐＣＰ１３またはコスミド１を含有するＤ
Ｈ１０Ｂ細胞、コスミド１からキュアリングしたＤＨ１０Ｂ、コスミド１からキ
ュアリングし、ベクターｐＣＰ１３で再形質転換させたＤＨ１０Ｂまたはコスミ
ド１およびコスミド１を含有するＤＨ１０Ｂを、ある期間４℃で貯蔵した後の生
存可能細胞数を示す。
図６Ａおよび６Ｂは、ある期間−２０℃で貯蔵後、４℃で貯蔵した下記の細菌
株：ＤＨ５α、ベクターｐＣＰ１３を含有するＤＨ５α、コスミド１を含有する
ＤＨ５α、ＳＴＢＬ２、ベクターｐＣＰ１３を含有するＳＴＢＬ２およびコスミ
ド１を含有するＳＴＢＬ２の生存能を示す。
図７は、共に−２０℃で５分間貯蔵した、コスミドクローン１を含有するＤＨ
１０Ｂ株およびベクターｐＣＰ１３を含有するＤＨ１０Ｂ株の形質転換効率を示
す。
図８は、４℃で貯蔵後の、コスミドクローン１、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴ
Ａ２ ８Ｋｂ＋、ｐＤＥＬＴＡ２ ８Ｋｂ−、ｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋または
ｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−プラスミドのいずれかを含有するＤＨ１０Ｂ細胞の
生存能を示す。
図９は、−２０℃で貯蔵後の、コスミドクローン１、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥ
ＬＴＡ２ ８Ｋｂ＋、ｐＤＥＬＴＡ２ ８Ｋｂ−、ｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋ま
たはｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−プラスミドのいずれかを含有するＤＨ１０Ｂ細
胞の生存能を示す。
図１０は、様々な間隔をおいて４℃で貯蔵後の、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴ
Ａ２ １４Ｋｂ＋、ｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−プラスミドまたは、ショ糖/アン
ピシリン選択下、欠失ファクトリー・システム(Deletion Factory System)によ
り作製したｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋プラスミドの１１種の欠失誘導体の１つ
のいずれかを含有するＤＨ１０Ｂ細胞の生存能を示す。
図１１は、様々な間隔をおいて４℃で貯蔵後の、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴ
Ａ２ １４Ｋｂ＋プラスミドまたは、ストレプトマイシン/カナマイシン選択下、
欠失ファクトリー・システムにより作製したｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋の１６
種の欠失誘導体の１つのいずれかを含有するＤＨ１０Ｂ細胞の生存能を示す。
図１２は、図１０と１１に概略説明した安定性研究を組み合わせ、欠失ファク
トリー・システムを用いて挿入物の一部を欠失させた後に残る挿入ＤＮＡの長さ
を表す。
図１３は、コスミドクローン１の必須領域(２６５８ｂｐ)のＤＮＡ配列(配列
番号１４)を示す。
図１４は、コスミドクローン１の必須領域内に含まれるオープン・リーディン
グ・フレームおよびMluＩ制限部位の位置を示す。
図１５は、４℃で９日間貯蔵後の、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴＡ２ ３２、
ｐＤＥＬＴＡ２ fabB10、ｐＤＥＬＴＡ２ fabB１３、ｐＤＥＬＴＡ２ fabB１４
、またはｐＤＦＬＴＡ２ fabB１５プラスミドのいずれかを含有するＤＨ１０Ｂ
細胞の生存能を示す。
図１６は、−２０℃で(およそ１２０日間)貯蔵後の、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥ
ＬＴＡ２ ３２、ｐＤＥＬＴＡ２ fabB１０、ｐＤＥＬＴＡ２ fabB１３、ｐＤＥ
ＬＴＡ２ fabB１４、またはｐＤＥＬＴＡ２ fabB１５のいずれかを含有するＤＨ
１０Ｂ細胞の生存能を示す。
図１７は、４℃で３０日まで貯蔵後の、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴＡ２ fab
B１４、ｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失、ｐＤＥＬＴＡ２ fabB１５またはｐＤＥＬＴ
Ａ２ １５欠失プラスミドのいずれかを含有するＤＨ１０Ｂ細胞の生存能を示す
。
図１８は、−２０℃で６０日まで貯蔵後の、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴＡ２
fabB１４、ｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失、ｐＤＥＬＴＡ２ fabB１５またはｐＤＥＬ
ＴＡ２ １５欠失プラスミドのいずれかを含有するＤＨ１０Ｂ細胞の生存能を示
す。
図１９は、菌株ＤＨ５αおよびＤＨ１０Ｂにおけるシスバクセン酸(cisvaccen
ic acid)レベル％に対する様々なfabBクローンの存在効果を示す。
図２０は、菌株ＤＨ５αおよびＤＨ１０Ｂにおける不飽和脂肪酸レベル％に対
する様々なfabBクローンの存在効果を示す。
図２１は、−２０℃で２ヶ月まで貯蔵後の、ｐＣＰ１３、コスミドクローン１
、ｐＤＥＬＴＡ２、またはｐＤＥＬＴＡ２ fabB１５プラスミドのいずれかを含
有するＤＨ５α細胞の生存能を示す。
図２２は、−２０℃で２ヶ月まで貯蔵後の、ｐＣＰ１３、コスミドクローン１
、ｐＤＥＬＴＡ２、またはｐＤＥＬＴＡ２ fabB１５プラスミドのいずれかを含
有するＤＨ１０Ｂ細胞の生存能を示す。
図２３は、−２０℃で２ヶ月のＤＨ５αとＤＨ１０Ｂの生存と細胞膜中に見ら
れる不飽和脂肪酸の量との間に存在する相関関係を示す。
図２４は、２０℃、３０℃、３７℃または４２℃で１６時間増殖させたＤＨ１
０Ｂ、ＳＢ３４９９ＢおよびＣＹ３２２細胞の増殖温度と、細胞中のシスバクセ
ネート量との間に存在する相関関係を示す。
図２５は、２３℃、３０℃、３７℃または４２℃で増殖させたＤＨ１０Ｂ、Ｓ
Ｂ３４９９ＢおよびＣＹ３２２細胞の細胞膜における不飽和脂肪酸のレベルにお
ける増殖温度変化の影響を示す。
図２６は、−２０℃で２ヶ月貯蔵後の、２３℃、３０℃、３７℃または４２℃
で増殖させたＤＨ１０Ｂ細胞の生存能を示す。
図２７は、−２０℃で２ヶ月貯蔵後の、２３℃、３０℃、３７℃または４２℃
で増殖させたＳＢ３４９９Ｂ細胞の生存能を示す。
図２８は、菌株ＤＨ１０ＢおよびＳＢ３４９９Ｂについて、−２０℃での細胞
膜の不飽和脂肪酸総量と細胞生存との相関関係を示す。発明の詳細な説明
：
定義
下記の説明では、組換えＤＮＡ技術で使用される多数の用語を広範囲に使用し
ている。かかる用語に与えた範囲を含めて明細書および請求の範囲の明瞭かつ一
貫した理解を提供するために、下記の定義を与える。
ＤＮＡ分子。ウイルス、原核生物および真核生物を含むあらゆる供給源に由来
するあらゆるサイズのあらゆるＤＮＡ分子。このＤＮＡ分子は、これらに限定さ
れないが、直鎖状または環状かつ一本鎖または二本鎖を含むあらゆる形態である
ことができる。ＤＮＡ分子の非限定的例には、プラスミド、ベクターおよび発現
ベクターがある。
クローニングベクター。宿主細胞において自律的に複製する能力があり、かつ
１またはそれ以下の数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を持ち、その部位でか
かるＤＮＡ配列を、ベクターの実質的な生物学的機能を損失することなく、測定
可能に切断でき、かつその部位にＤＮＡフラグメントをスプライシングして、そ
の複製およびクローニングを実行できることを特徴とする、プラスミド、ファー
ジＤＮＡ、コスミド、またはその他のＤＮＡ分子。このクローニングベクターは
、更に、クローニングベクターで形質転換させた細胞の同定に使用するのに適
したマーカーを含有できる。マーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性または
アンピシリン耐性を与えるものである。
発現ベクター。クローニングベクターに類似するが、宿主内に形質転換後、そ
の中へクローニングされている遺伝子を発現できるベクター。クローン化遺伝子
は、通常、プロモーター配列などのある制御配列の制御下(即ち、作動可能に連
結した状態)にある。
貯蔵安定性。本発明の意味する中では“貯蔵安定性”である細菌細胞および／
またはコンピテント細菌細胞は、目に見えて形質転換効率および／または生存能
を損失することなく、適切な温度での長期間貯蔵に耐えられる。“目に見えて形
質転換効率および／または生存能を損失することなく”という用語は、細胞が、
−２０℃で３０日、好ましくは６０日、より好ましくは９０日、最も好ましくは
１２０日の貯蔵期間中、その元々の形質転換効率および／または生存能の約４０
％から１００％、好ましくは６０％から１００％、より好ましくは７０％から１
００％、最も好ましくは約８０％から１００％を維持することを意味する。本発
明の細菌細胞またはコンピテント細菌細胞の適切な貯蔵温度は、約室温から約−
１８０℃の間で変わる。好ましくは、貯蔵温度は、約４℃から約−８０℃、より
好ましくは約−２０℃から約４℃の範囲である。本発明の好ましい態様では、細
胞を約−２０℃で貯蔵する。貯蔵期間または時間は、約０日から約１８０日(例
えば、６ヶ月)、好ましくは約０日から約１２０日(例えば、４ヶ月)、より好ま
しくは約０日から約９０日(例えば、３ヶ月)の範囲であるが、約−２０℃および
それ以下の温度ではもっと長い貯蔵時間を使用できる。
脂肪酸。飽和または不飽和であるあらゆる脂肪酸。不飽和脂肪酸は、モノエノ
ン酸(monoenic acids)、ジエノン酸(dienoic acids)および高級不飽和脂肪酸(例
えば、トリ、テトラ、ペンタおよびヘキサエノン酸等)を含む。不飽和脂肪酸の
例には、これらに限定されないが、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、シス
バクヤン酸、アラキドン酸、パルミトール酸等がある。飽和脂肪酸の例には、酪
酸、ラウリン酸、パルミチン酸およびステアリン酸がある。本発明で好ましい脂
肪酸は、不飽和脂肪酸、最も好ましくはシスバクセン酸およびパルミトール酸で
ある。
コンピテント細胞。外来ＤＮＡ分子を取り込み、定着させる能力のある細胞。
本発明は、脂肪酸含量(好ましくは不飽和脂肪酸含量)を変えることにより、細
菌の生存能または形質転換効率を増強する方法に関する。本発明はまた、かかる
脂肪酸含量が変えられた細菌を得る方法に関する。この方法は、細菌を修飾また
は変異させて、非修飾または非変異細菌と比べて該細菌の脂肪酸含量を変えるこ
とを含む。次いで、生存能が増強された、または形質転換効率が増強された修飾
または変異細菌を単離できる。このような修飾細菌の選択は、非修飾細菌と比べ
てこのような特性の増強をアッセイすることにより選択できる(実施例参照)。好
ましくは、脂肪酸の量は、細菌内で増加させる。この増加は、様々な技術によっ
て達成でき、例えば、１種またはそれ以上の脂肪酸を細菌に加えるか、または細
菌を遺伝子修飾することによる。天然選択、人工的変異および遺伝子工学を含む
あらゆる種類の遺伝子修飾が本発明によって使用できる。このような技術は、当
分野ではよく知られている。一般的な遺伝子工学技術には、コピー数を増大する
ためにベクター内で１種またはそれ以上の脂肪酸遺伝子をクロ−ニングしたり、
または、例えば、過剰発現による(例えば、発現ベクターを用いる)かかる遺伝子
の翻訳または転写の増強がある。
本発明の方法は、低温(例えば、−８０℃以上、好ましくは約−２０℃から約
４℃)貯蔵中の生存能および／または形質転換効率が増強された細胞の生産を提
供する。このような貯蔵安定性株は、長期間、様々な温度で貯蔵できる。本発明
によれば、１種またはそれ以上の脂肪酸の含量を変えると、生存能または形質転
換効率が増強される。脂肪酸含量の変更は、これらの有益な特性を有する細菌を
提供するあらゆる細菌において達成できる。
本発明によれば、グラム陰性原核細胞とグラム陽性原核細胞(例えば、細菌)の
両方が使用できる。適切な原核細胞の例には、これらに限定されないが、エシェ
リシア種、クレブシエラ種、サルモネラ種、バシラス種、ストレプトマイセス種
、ストレプトコッカス種、シゲラ種、スタフィロコッカス種およびシュードモナ
ス種がある。本発明により使用できる上記した各属内の非限定的例には、エシェ
リシア・コリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、バシラス・スブチルス、サルモ
ネラ・チフィムリウム、ストレプトマイセス・アウレウス、ストレプトコッカス
・
ミュータンス、ストレプトコッカス・ニューモニアエおよびシュードモナス・シ
リンガエがある。
好ましい実施態様では、本発明で使用できる細胞は、エシェリシア、最も好ま
しくはＥ．コリである。Ｅ．コリ株の非限定的例には、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＤＨ
１０、ＤＨ１０Ｂ、ＨＢ１０１、ＲＲ１、ＪＶ３０、ＤＨ１１Ｓ、ＤＭ１、ＤＨ
１０Ｂ／ｐ３、ＤＨ５αＭＣＲ、ＤＨ５αＦ’ＩＱ、ＤＨ５αＦ'、ＳＣＳ１、
Ｓ tb1−２、ＤＨ１２Ｓ、ＤＨ５α−Ｅ、ＤＨ１０ＢＡＣ、ＸＬ−１ブルーＭＲ
Ｆ、ＸＬ−２ブルーＭＲＦ、ＸＬ−１ブルーＭＲ、ＳＵＲＥ株、ＳＵＲＥ２株、
ＸＬ−1ブルー、ＸＬ−２ブルー、ＡＧ１、ＪＭ１０Ｉ、ＪＭ１０９、ＪＭ１１
０/ＳＣＳ１１０、ＮＭ５２２、ＴＯＰＰ株、ＡＢＬＥ株、ＸＬ１−レッド、Ｂ
Ｌ２１株、ＢＪＳ１８３ ＴＫＢ１株およびそれらの誘導体がある。
本明細書で使用する、特定の細菌の“誘導体”は、特定の細菌から直接または
間接的に得られた遺伝物質を含有する後代または他のレシピエント細菌である。
このような誘導体細菌は、例えば、遺伝物質を特定細胞から取り出し、続いて、
それを他の細菌(即ち、後代または他のレシピエント細菌)内へ(例えば、形質転
換、接合、エレクトロポレーション伝達等を介して)導入することにより、形成
できる。あるいは、このような誘導体細菌は、特定の細菌の遺伝物質の有効配列
を有する(クローニング、インビトロ増幅などを介して合成的に生産された)遺伝
物質を所有できる。
脂肪酸含量を変えた本発明の細菌は、よく知られた技術を用いて形質転換に対
してコンピテントにすることができる。このようなコンピテント細菌細胞は、本
発明では、低温(例えば、−８０℃以上、好ましくは約−２０℃から約４℃))貯
蔵中のまたは後の形質転換効率が増強されている。本発明の情況では、形質転換
は、外来ＤＮＡを細菌内へ挿入し、細菌の遺伝子型および/または表現型の変化
をもたらすプロセスである。このような遺伝子型または表現型の変化は、一過性
でもよく、そうでなくてもよい。外来ＤＮＡは、生物体内へ挿入される能力のあ
る供給源由来のあらゆるＤＮＡであり、天然のものでもそうでなくてもよい。好
ましくは外来ＤＮＡは、細菌内へ挿入される能力のある供給源由来のあらゆるＤ
ＮＡであり、天然のものでもそうでなくてもよい。このような外来ＤＮＡには、
これらに限定されないが、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、真核生物(特に
、哺乳動物の、最も具体的には、ヒトの)ＤＮＡ、ＤＮＡライブラリー、ｃＤＮ
Ａライブラリー、発現ベクターおよびファージＤＮＡ(バクテリオファージラム
ダＤＮＡ)がある。
コンピテント細菌の調製およびそれらの細菌へのＤＮＡの導入には、多くの方
法が存在する。Ｅ．コリを使用する非常に簡単で適度に効率の良い形質転換法は
、対数増殖期の細菌を氷冷５０mM塩化カルシウムに約１０10細菌/mlで再懸濁し
、それらを約３０分間氷冷維持するものである。次いで、このコンピテント細菌
の小アリコート(０.２ml)にプラスミドＤＮＡ(0.1mg)を加え、氷上でインキュベ
ーションを更に３０分間続け、次いで、４２℃で２分間熱ショックを与える。そ
の後、普通は、細菌を栄養培地に移し、しばらく(３０分から１時間)インキュベ
ーションして、プラスミドによって与えられる表現型特性、例えば、プラスミド
含有細胞用の選択マーカーとして通常使用される抗生物質耐性を発現させる。コ
ンピテント細菌生産プロトコールは、Hanahan，J．Mol．Biol．166:557-580(198
3);Liu et al.，Bio Techniques 8:21-25(1990);Kushner，In:Genetic Engineer
ing:Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering，E
lsevier，Amsterdam，pp．17-23(1978);Norgard et al.，Gene 3:279-292(1978)
;Jessee et al.，U.S．Patent 4,981,797；Maniatis et al.，Cold Spring Harb
or，New York(1982)に記載されている。
その他の迅速かつ簡単な細菌内への遺伝物質導入法は、エレクトロポレーショ
ンである(Potter，Anal．Biochem．174:361-73(1988))。この技術は、高圧電気
パルスが細胞原形質膜の融合を誘導できるというZimmerman et al.，J．Membr．
Biol．67:165-82(1983)による最初の観測に基づく。その結果、電気ショック(典
型的には、電圧勾配４０００〜１６０００Ｖ/cmに短時間さらす)を与えると、細
菌は、明らかに原形質膜に一時的にできた穴を介して懸濁溶液から外来ＤＮＡを
取りこむことが分かった。これらの細菌の一部は、安定に形質転換され、形質転
換ＤＮＡ上に適切なマーカー遺伝子を持つかどうかを選択できる(Newman et al.
，Mol．Gen．Genetics 197:195-204(1982))。Ｅ．コリの場合、エレクトロポレ
ーションは、１０9〜１０10Ｔ/μgＤＮＡのプラスミド形質転換効率を与え
ることが分かっている(Dower et al.，Nucleic Acids Res．16:6127-6145(1988)
)。
細菌細胞はまた、リポソームによる形質転換にも感受性である(Old and Primr
ose，In:Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Gene Manipula
tion，Blackwell Science(1995))。カチオン性脂質から調製したリポソームを使
用する簡単な形質転換システムが開発されている(Old Primrose，In:Principles
of Gone Manipulation:An Introduction to Gene Manipulation，Blackwell Sc
ience(1995))。小さな単ラメラ(単一二層)小胞を生産する。溶液中のＤＮＡは(
既に採用されていた非イオン性脂質を要するリポソームキャプシド封入(encapsi
dation)法とは反対に)自発的かつ効率良くこれらのリポソームと複合体形成する
。正電荷のリポソームは、ＤＮＡと複合体形成するだけでなく、細菌とも結合し
、おそらく、細胞との融合により、それらを形質転換するのに能率が良い。形質
転換またはトランスフェクションシステムとしてのリポソームの使用は、リポフ
ェクションと呼ばれる。
本発明はまた、該細菌の低温での生存能および/または形質転換効率を増強で
きる遺伝物質にも関する。特に、本発明は、細菌内に導入したときに脂肪酸含量
を変更させる単離核酸分子に関する。好ましくは、核酸分子は、該細菌の脂肪酸
含量を変えるのに関与する１種またはそれ以上の遺伝子を含む。このような遺伝
物質は、好ましくはクローニングまたは発現ベクターに含まれる。本発明の一態
様では、核酸分了は、１種またはそれ以上の脂肪酸レベルを高める１種またはそ
れ以上の遺伝子を含む。好ましくは、その遺伝子は、不飽和脂肪酸レベルを高め
る。このような不飽和脂肪酸には、これらに限定されないが、オレイン酸、リノ
ール酸、リノレン酸、シスバクセン酸およびパルミトール酸がある。このような
遺伝子には、これらに限定されないが、fabB、fabF、fabD、fabG、fabA、fabH、
fabI、habZ、fadA、fadB、fadE、fadL、fadR、farR、fatA等がある。
本発明の方法により生産される生存可能細胞数は−２０℃で約０日から約１ヶ
月、好ましくは約０日から約３ヶ月、より好ましくは約０日から約６ヶ月貯蔵し
た場合、約１×１０6細胞/ml以上、好ましくは約１×１０7細胞/ml以上、より
好ましくは約１×１０8細胞/ml以上、最も好ましくは約１×１０9細胞/ml以上で
あろう。これらの細胞は、ＤＮＡマイクログラム当り少なくとも約１×１０5、
好ましくは少なくとも約１×１０5、より好ましくは少なくとも約１×１０7、更
にもっと好ましくは少なくとも約１×１０8および最も好ましくは少なくとも１
×１０9形質転換体(Ｔ/μg)の形質転換効率を保持するであろう。適切な貯蔵温
度は、約室温から約−１８０℃の間で変わる。好ましくは、貯蔵温度は、約４℃
から約−８０℃、より好ましくは約−２０℃から約４℃の範囲である。本発明の
好ましい態様では、細胞は約−２０℃で貯蔵される。貯蔵期間または時間は、約
０日から約１ヶ月、好ましくは約０日から約３ヶ月、更にもっと好ましくは約０
日から約６ヶ月、もっと好ましくは約０日から約１年の範囲であり得るが、約−
２０℃以下の温度では更に長い貯蔵時間を採用できる。本発明の方法により生産
されるコンピテント細胞は、実質的にその形質転換効率を保持しながら、少なく
とも３ヶ月間−２０℃で貯蔵できる。形質転換効率の実質的な保持とは、細胞が
貯蔵後に、貯蔵前に試験したコンピテント細胞の形質転換効率の約４０％から１
００％、好ましくは６０％から１００％、より好ましくは７０％から１００％、
最も好ましくは約８０％から１００％の形質転換効率を有することを意味する。
本発明はまた、本発明の方法により生産されたコンピテント細菌細胞を形質転
換するのにも適している。該コンピテント細胞の形質転換は、本発明のコンピテ
ント細菌細胞を獲得し、該細胞とＤＮＡ分子とを混合し、該細胞を該ＤＮＡ分子
で形質転換させるのに充分な条件下で該混合物をインキュベーションすることを
含む。本発明のこの態様では、コンピテント細胞はグラム陽性またはグラム陰性
細菌であることができ、エシェリシア、クレブシエラ、サルモネラ、バシラス、
ストレプトマイセス、ストレプトコッカスおよびシュードモナスがあるが、これ
らに限定されない。好ましくは、グラム陰性原核細胞を本発明により形質転換し
、より好ましくは、エシェリシア、最も好ましくはＥ．コリを形質転換する。本
発明によれば、あらゆるＤＮＡ分子(例えば、ベクター、プラスミド、ファージ
ミド、発現ベクター等)が使用できる。
細胞を対象のＤＮＡ分子で形質転換させた後、形質転換細胞を増殖誘導培地に
て増殖させることができる。典型的には、このような増殖誘導培地は、形質転換
細胞の選択を助けるために抗生物質を含有する。即ち、形質転換するＤＮＡ分子
は、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含有することもでき、対応す
る抗生物質を培地に使用する場合に形質転換細胞の選択が可能である。
本発明はまた、本発明のコンピテント細胞を、所望のタンパク質をコードする
ＤＮＡ分子で形質転換することにより、所望のタンパク質を生産する方法に関す
る。よって、本発明は、所望のタンパク質を生産する方法に関し、本発明により
生産されたコンピテント細胞を獲得し、該細胞を、該所望のタンパク質を発現で
きるＤＮＡ分子で形質転換させ、該形質転換細胞を該所望のタンパク質の生産に
充分な条件下で培養することを含む。本発明のこの態様に使用できる細胞には、
グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方があり、好ましくは、エシェリシア、最
も好ましくはＥ．コリである。本発明のこの態様では、細胞をＤＮＡ分子と混合
し、該細胞を該ＤＮＡ分子で形質転換させるのに充分な条件下でその混合物をイ
ンキュベーションすることにより、細胞を形質転換させる。形質転換細胞は、例
えば、ＤＮＡ分子上のマーカー遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子)の選択を含
む当分野で良く知られた技術により選択できる。形質転換細胞を選択した後、次
いで、細胞はよく知られた技術に従い増殖誘導培地にて培養できる。細胞を適切
な条件下で培養する際、その細胞は、所望のタンパク質を生産する能力がある。
その後、所望のタンパク質を単離し、続いて、よく知られた精製技術により純粋
なタンパク質を得る。
ここまで、本発明を総括的に記載してきたが、本発明は、例示目的の、特記し
ない限り本発明を限定することを意図しない下記実施例を参照して一層容易に理
解されるであろう。引用した特許、特許出願および刊行物は全て、出典明示によ
り本明細書の一部とする。
実施例１
サイクリングによる変異株の生産
微生物遺伝学における一般的技術は、リサイクリングを利用する細菌の変異株
の生産である。この技術は、不都合な条件下での迅速な細菌殺傷速度に左右され
る。この特定の場合では、ＣＣＭＢ８０緩衝液中Ｅ．コリ株ＤＨ１０Ｂを−２０
℃で貯蔵することにより、この菌株を迅速に殺傷し、その結果、６ヶ月間で生
存可能細胞数の減少をもたらす。−２０℃で６ヶ月貯蔵後に生き残った細胞は、
再度増殖させ、ＣＣＭＢ８０緩衝液中−２０℃で貯蔵する。この特定の条件下で
４サイクル後、単一コロニーを−２０℃での生存について試験する。単離した菌
株は、ＳＢ３４９９と呼んだ。
実施例２
コンピテント細胞の調製
Ｅ．コリ株ＤＨ１０Ｂの１種の単一コロニー単離物とＥ．コリＳＢ３４９９(
実施例１)の３種の単一コロニー単離物(それぞれＳＢ３４９９Ａ(ＮＲＲＬ Ｂ−
２１６０６)、ＳＢ３４９９Ｂ(ＮＲＲＬ Ｂ−２１６０７)およびＳＢ３４９９Ｃ
(ＮＲＲＬ Ｂ−２１６０８)と呼び、それぞれ微生物寄託に関するブダペスト条
約の規定下、１９９６年８月１日に寄託された)を選択した。これらの単離物の
コンピテント細胞は、出典明示により本明細書の一部としたJessee，J．and Blo
om，F.R.,米国特許第４,９８１,７９７号の方法に従い、作製した。実際には、
下記のようなプロセスである：ＤＨ１０Ｂ、ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９Ｂお
よびＳＢ３４９９Ｃの単一コロニー単離物をそれぞれ１５/１０培地(１.０％バ
クトトリプトン、１.５％バクト酵母抽出物、１０mM ＮａＣｌ、２mM ＫＣｌ、
１０mM ＭｇＣｌ2、１０mM ＭｇＳＯ4、０.００１％ポリプロピレングリコール(
ＰＰＧ))２mlに接種し、３０℃、２７５rpmで一晩振盪した。各一晩培養物の０.
３mlアリコートを用いて、１５/１０培地６０mlを含有する５００mlバッフル付
きフラスコに接種した。得られた培養物を３０℃、２７５rpmで振盪することに
より、培養物のＯＤ550がおよそ０.３になるまで増殖させた。培養物５０mlアリ
コートを、細菌細胞がペレットになるまで充分な時間、４℃、２,０００rpmで遠
心し、回収した。次いで、この細菌細胞ペレットを氷冷ＣＣＭＢ８０緩衝液(１
０mM酢酸カリウム、ｐＨ７.０、８０mM ＣａＣｌ2、２０mM ＭｎＣｌ2、１０mM
ＭｇＣｌ2、０.１ＮＨＣｌでｐＨ６.４に調整した１０％グリセロール、出典明
示により本明細書の一部とした、Hanahan，et al.，Methods in Enzymology，20
4:63-113(1991)に記載)４mlに再懸濁した。次いで、再懸濁させた細菌細胞を氷
上で２０分間維持した。再懸濁させた細菌細胞を２５０μlアリコートに分け、
ドライアイス/エタノール浴で少なくとも５分間凍結させた。
各単離物の１アリコート以外は全て、その生存能および形質転換効率の測定前に
、特定期間、−２０℃で貯蔵した。
生存能および形質転換アッセイ
実施例２に従い調製したコンピテント細胞を含有するアリコートを−２０℃で
特定期間貯蔵後試験し、そのアリコートの生存能および形質転換効率を測定した
。アリコートは、−２０℃で貯蔵後直ちに試験するか、または月１回間隔で試験
するかのいずれかである。
アリコートの住存能を測定するために、アリコートを−２０℃から取り出し、
氷上におよそ１５分間置いた。このアリコートを０.８５％ＮａＣｌを用いて連
続希釈した。次いで、希釈物をＬＢ寒天プレート(Gibco/BRL)に置き、生存可能
細胞数を測定した。図１は、Ｅ．コリＤＨ１０Ｂ、ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９
９ＢおよびＳＢ３４９９Ｃの生存能を示す。ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９Ｂお
よびＳＢ３４９９Ｃの生存可能細胞数は、これらの細胞を２〜４ヶ月の間−２０
℃で貯蔵した後、ＤＨ１０Ｂよりも１００倍以上多かった。
アリコートの形質転換効率を測定するために、アリコートを−２０℃から取り
出し、氷上におよそ１５分間置いた。出典明示により本明細書の一部とするHana
han，J．Mol．Biol．166:577(1983)の方法に従い、プラスミドｐＵＣ１９を用い
て形質転換効率について細胞をアッセイした。図２は、ＤＮＡμg当りの形質転
換体として表現したＥ．コリＤＨ１０Ｂ、ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９Ｂおよ
びＳＢ３４９９Ｃの形質転換効率を示す。ＤＨ１０Ｂ細胞の形質転換効率は、−
２０℃で１ヶ月貯蔵後１.０×１０5形質転換体/ＤＮＡμg以下に減少した。ＳＢ
３４９９Ａ、ＳＢ３４９９ＢおよびＳＢ３４９９Ｃの形質転換効率は、−２０℃
で４ヶ月貯蔵後３.０×１０6形質転換体/ＤＮＡμg以上であった。よって、単離
物ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９ＢおよびＳＢ３４９９Ｃは、−２０℃で長期貯
蔵後、ＤＨ１０Ｂよりも実質的に高い生存可能細胞数および形質転換効率を示す
。
Ｅ．コリＤＨ１０Ｂ、ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９Ｂ
およびＳＢ３４９９Ｃの遺伝子特性化
ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９ＢおよびＳＢ３４９９Ｃ単離物をＥ．コリＤＨ
１０Ｂの特性である遺伝子マーカーについて評価した。表１は、Ｅ．コリ株ＤＨ
１０ＢのＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９ＢおよびＳＢ３４９９Ｃ単離物の特徴で
ある遺伝子マーカーを示す。菌株ＳＢ３４９９Ａ、ＳＢ３４９９ＢおよびＳＢ３
４９９Ｃについて評価した遺伝子マーカーは、ＤＨ１０Ｂの遺伝子マーカーと同
一である。１％ガラクトース含有Difco MacConkey寒天を用いてMacConkeyガラク
トースプレートを作った。５０μg/ml Ｘ−galおよび1mMＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天
を用いてＸ−galＩＰＴＧプレートを作った。最小寒天プレートは、ストックＩ(
塩化アンモニウム２０ｇ、リン酸カリウム(一塩基性)６０ｇ、およびリン酸ナト
リウム(二塩基性)１２０ｇ、蒸留水で１リットルに希釈)１００ml、ストックII(
グルコース６０gおよび硫酸マグネシウム７水和物１.３g、蒸留水で６００mlに
希釈)６０ml、ストックIII(蒸留水で２００mlに希釈した塩化カルシウム脱水物
０.７３５g)２０mlおよび０.１％チアミン１mlをバクト寒天１２gに加え、最終
容量を６００mlに調整することにより作った。ロイシン含有プレート用に、１.
５％ロイシン溶液１００μlをプレートに塗沫した。 実施例５
ゲノムＤＮＡ単離
ゲノムＤＮＡ単離は、出典明示により本明細書の一部とするLin and Kuo，Foc
us 17:66-70(1995)に記載されている。Ｅ.コリ株ＢＲＬ３４３３(Life Technolo
gies，Irc.)をＬＢプレートに画線培養し、３７℃で一晩インキュベーションし
た。単一細菌コロニーを単離し、ＬＢブロス(１リットル当りトリプトン１０グ
ラム、酵母抽出物５グラム、ＮａＣｌ５グラム)５mlに再懸濁し、振盪インキュ
ベーターにて３７℃/２７５rpmで一晩インキュベーションした。培養細胞の１.
０mlアリコートを微小遠心管に移し、細胞ペレットを室温で５分間１１,０００
×ｇで遠心して集めた。ペレットをＴＥＳ−スクロース緩衝液［８％スクロース
、５０mMＮａＣｌ、２０mMトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)および１mMＥＤＴＡ］１m
lに再懸濁し、２５℃で５分間１mg/mlリゾチームと共にインキュベーションした
。容量１００μlの１０％ＳＤＳを管に加え、その管を短時間旋回させた。ＤＮ
Ａをフェノール−クロロホルムで抽出し、０.３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１容量
のイソプロパノールで沈殿させた。溶液を１１,０００×g、４℃で１０分間遠心
した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、１１,０００×g、４℃で１０分間
遠心した。ＲＮＡ夾雑物を除去するために、ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液２００
μlで再懸濁し、次いで、３７℃で１０分間、１μg/mlＲＮアーゼＡで処理した
。その後、試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、ＤＮＡを０.３Ｍ酢酸ナ
トリウムおよび２.５容量の１００％エタノールで沈殿させた。次いで、溶液を
４℃、１１,０００×gで１5分間遠心した。ＤＮＡペレットを７０％エタノール
で洗浄し、１１,０００×g、室温で１０分間遠心した。ＤＮＡペレットを洗浄後
、ＴＥ緩衝液１００μlに溶解させた。
実施例６
Ｅ．コリ株のコスミドゲノムライブラリーの構築
ＢＲＬ３４３３から単離したゲノムＤＮＡのＤＮＡ１００μg(実施例５)を１
０×React２(Life Technologies，Inc.)および滅菌蒸留水と混合して、１×Reac
t２緩衝液中、および１０００μlの最終反応容量中、１００μg/mlＤＮＡの最終
濃度を得た。ゲノムＤＮＡ試料を、１つの管はゲノムＤＮＡ２００μgを
含有し、他の８つの管はゲノムＤＮＡ１００μgを含有する９つの微小管に等分
した。５μlアリコートを最後の管(管９)から取り出し、非処理対照とした。
１０単位の制限エンドヌクレアーゼPstI(Life Technologies，Inc.)を管１に
加えた。２倍の連続希釈物を下記のように準備した：試料(酵素を含む)１００μ
lを管１から第２管へと順次移し、等濃度のゲノムＤＮＡを含有する管中、PstＩ
濃度の一連の２倍希釈物を得た。最終的に、管９から１００μlを新たな管(１０
と番号付ける)に移した。１０管全てを３７℃で正確に１時間インキュベーショ
ンしたら直ちに、使用までの間−２０℃で貯蔵した。
１０管全てを氷上で解凍し、連続希釈物の各管由来の５μlアリコートを、ア
ガロースゲル電気泳動(０.９％アガロースゲル)により非切断対照５μlと比較し
、ゲノムＤＮＡが消化される度合いを解明した。Maniatis et al.，Molecular C
loning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbo
r，New York（(1982)に記載の方法に従い、アガロースゲル電気泳動により見積
もった２５ないし４５ｋｂの範囲内に最高割合のＤＮＡフラグメントを含有した
、連続希釈試料または複数試料を選択して、コスミドライブラリーを構築した。
これらの選択アリコートまたは複数アリコートは、フェノールで２回抽出し、次
いで、２.５容量の１００％エタノールでエタノール沈殿させ、１１,０００gで
３０分間遠心した。ＤＮＡペレットを７０％エタノール２００μlで洗浄し、１
１,０００×ｇで１０分間遠心した。得られた部分消化ゲノムＤＮＡペレット(“
ゲノム消化ＤＮＡ”と呼ぶ)を、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Life Technolo
gies，Inc.)１５μlに再懸濁した。
ＢＪＳ８０(ｐＣＰ１３)コスミドベクター５μgを３７℃で４時間、３０単位
のPstＩ(Life Technologies，Inc.)と共に、１×React２(Life Technologies，I
nc.)中、最終容量５０μlでインキュベーションした。次いで、このコスミドベ
クター含有反応混合物を１００％エタノール２.５容量でエタノール沈殿させ、
１１,０００×gで３０分間遠心した。得られたＤＮＡペレットを７０％エタノー
ル２００μlで洗浄し、次いで、１１,０００×gで１０分間遠心した。洗浄した
ペレットを最終的に１×React２緩衝液(Life Technologies，Inc.)５０μlに再
懸濁させた。ウシ腸内アルカリホスファターゼ((１単位/μl)(Life
Technologies，Inc.))１μlアリコートを予め切断したコスミドベクターと混合
し、３７℃で３０分以上インキュベーションして、５'ホスフェートを除去した
。試料５μlアリコートをManiatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory
Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1982)に記
載の方法に従い、０.９％アガロースゲルで電気泳動し、試料が直鎖状であるこ
とを確認した。次いで、残りの試料を２回フェノール抽出し、１００％エタノー
ル２.５容量でエタノール沈殿し、１１,０００×gで３０分間遠心した。得られ
たＤＮＡペレットを７０％エタノール２００μlで洗浄し、次いで、１１,０００
×gで１０分間遠心した。次いで、洗浄したｐＣＰ１３コスミドベクターを１×
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Life Technologies，Inc.)15μlに再懸濁し、必要
になるまで、−２０℃で貯蔵した。
貯蔵したコスミドベクターを氷上で解凍した。解凍したベクター(１００ng/μ
l)１５μlをPstＩ消化“ゲノム消化ＤＮＡ”(６００ng/μl)１５μlおよび１単
位/μl Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies，Inc.)１μlに加えた(“ライ
ゲーション反応混合物”)。“ライゲーション反応混合物”を室温で一晩インキ
ュベーションし、必要になるまで、−２０℃で貯蔵した。
ライゲートしたＤＮＡを、Epicentre Technologies，1207 Ann Street，Madis
on，WI53713から入手したλパッケージングキット(the Max Plax Packaging Ext
ract)を利用してパッケージングした。パッケージング法は、製造元使用説明書
に記載のとおりであり、出典明示により本明細書の一部とする。反応は、実質的
に下記のとおりである：Max Plaxキットから、−７０℃で貯蔵した凍結解凍超音
波処理抽出物の１管を室温で解凍した。直ちに、解凍抽出物に“ライゲーション
反応混合物”５μ1(約２μg鋳型ＤＮＡ)を加えた。試料を１１,０００×gで２秒
間遠心後、２２℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、フ
ァージ緩衝液(１０mMトリス−ＨＣｌ、１００mMＮａＣｌ、１０mMMgCl2、および
ｐＨ８.３までＮａＯＨ、５００μlを試料に加える。２００μlアリコートを試
料から取り出し、下記のように、ＤＨ１０Ｂ細胞(Life Technologies，Inc.)(Ha
nahan，et al.，Methods in Enzymology，204:63-111(1991)、出典明示により本
明細書の一部とする)を感染させるのに使用した(“保留ファージスト
ック”)。残りの試料をクロロホルム１５μlと混合し、後に使用するためにファ
ージストックとして４℃で貯蔵した。
一晩培養物から、ＤＨ１０Ｂ培養物の２００μlアリコートを使用して、ＬＢ
培地２５mlに接種した。これらの細胞を３７℃、２７５rpmで振盪して増殖させ
た。細胞密度がＣＤ590０.５に到達したら、細胞を１１,０００gで２分間遠心し
、次いで、１０mMＭｇＳＯ4２mlに再懸濁した。“保留ファージストック”２０
０μlをＤＨ１０Ｂ細胞の１５０μlアリコートと混合した。混合物を３７℃で１
５分間インキュベーションした。インキュベーション後、ＳＯＣ培地(Life Tech
nologies，Inc.)７００μlを試料に加え、次いで、試料を３７℃で更に１時間イ
ンキュベージョンした。試料１００μlアリコートを新たに調製したＬＢ＋Tet１
５寒天プレート(１５μg/mlテトラサイクリン含有ＬＢ寒天プレート)に塗沫した
。細菌を３７℃で一晩増殖させた。
１０種の別のコロニーが選択された。各コロニーは、ＬＢ培地３mlを含有する
別の管に入れた。これらの管を３７℃で一晩置いた。コスミドＤＮＡは、Maniat
is et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Pr
ess，Cold Spring Harbor，New York(1982)に記載のミニープレプ法により単離
した。コスミドＤＮＡの確認は、製造元使用説明書に従い、コスミドＤＮＡをPs
tＩで消化することにより実施した。ゲノム挿入物の平均サイズは、２０ｋｂま
たはそれよりも大きかった。
１０プレートの残りの細菌をプールし、ＣＧ培地(CIRCLE GROW，Bio101，Inc.
，Cat # cp-1000C)２０mlに再懸濁した。細菌をプール後、最終グリセロール濃
度１０％グリセロール(v/v)まで、グリセロールを懸濁細菌と混合した。混合物
を５mlアリコートに分け、後の使用のためにコスミドライブラリーグリセロール
ストックとして−７０℃で貯蔵した。
コスミドライブラリー中のクローン数は、グリセロールストックの１つを取り
出し、次いで、氷上でそのストックを解凍することにより、算出した。細菌細胞
数は、解凍ストックから１００μlアリコートを取り出し、予想細菌細胞数(１０11
細胞/ml)に基づき、そのアリコートを希釈した。予想細胞数に基づき、１０4
、１０3、１０2倍に希釈した試料１００μlを３つのＬＢ＋Tet１５寒天プレート
(１５μg/mlテトラサイクリン含有ＬＢ寒天プレート)に入れ、３７℃で一晩増殖
させた。プレート試料から、コスミドライブラリーがそのグリセロールストック
中１０11細胞/mlであったことが算出できた。
実施例７
安定性コスミドクローンの選択
ＢＲＬ３４３３コスミドライブラリー２０μlアリコート(初期生存可能細胞数
１.０×１０5細胞/ml)を用いて、１５/１０培地(１.０％(ｗ/ｖ)バクトトリプト
ン、１.５％(ｗ/ｖ)バクト酵母抽出物、１０mM ＮａＣｌ、２.５mM ＫＣｌ、１
０mM ＭｇＣｌ2、１０mM ＭｇＳＯ4、０.００１％ポリエチレングリコール)５ml
および１００μg/mlカナマイシンに接種した。細菌を３０℃で１８時間インキュ
ベーションした。細菌を３,０００rpm、４℃で１０分間遠心して回収した。次い
で細菌を冷ＣＣＭＢ８０緩衝液(８０mMＣａＣｌ２、２０mMＭｎＣｌ2、１０mMＭ
ｇＣｌ２、１０mM酢酸カリウムおよび１０％(ｖ/ｖ)再蒸留グリセロール)０.５m
lに再懸濁し、氷上で２０分間貯蔵し、次いで、ドライアイスエタノール浴にて
凍結させた。その後、細胞を４℃で貯蔵する前に解凍した。細菌細胞の生存可能
細胞数は、細胞を０.８５％ＮａＣｌ中に希釈し、その希釈物をＬＢプレート上
にまくことによって測定した。次いでプレートを３７℃で一晩インキュベーショ
ンし、コロニー数を測定した。
細胞アリコートを４℃で３６日間貯蔵後、貯蔵コスミドライブラリークローン
の生存可能細胞数を測定した。生存能は、初期値２.５×１０8細胞/mlから１.６
×１０5細胞/mlへ下落する。４℃で３６日生きた個々のコロニーを、貯蔵コスミ
ドクローンを希釈することにより単離した。希釈コスミドクローンをＬＢプレー
ト上にまき、次いで３７℃で一晩インキュベーションした。個々のクローンを無
作為に選択した。コスミドＤＮＡは、単離したコロニーから精製した。コスミド
ＤＮＡは、製造元使用説明書に従い、PstIで消化することにより分析し、３つの
単離物を更なる分析用に保留し、コスミドクローン１(ＮＲＲＬ Ｂ−２１５５０
、１９９６年３月２８日に寄託、Agricultural Research Service Culture Coll
ection(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，USA)
、２(ＮＲＲＬ Ｂ−２１５５１、１９９６年３月２８日に寄託、
Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)，1815 North Unive
rsity Street，Peoria，Illinois 61604，USA)および４(ＮＲＲＬ Ｂ−２１５５
２、１９９６年３月２８日に寄託、Agricultural Research Service Culture Co
llection(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，US
A)とラベルを付けた。
実施例８
コスミドクローン１、２および４の特性化
コスミドクローン１、２、４またはコスミドベクターｐＣＰ１３のいずれかを
含有するＤＨ１０Ｂ細菌を、１５/１０培地２ml中、３０℃で１６時間インキュ
ベーションした。これらの培養物から、０.３mlアリコートを用いて、５００ml
バッフル付振盪フラスコ中１５/１０培地５０mlおよびカナマイシン１０μg/ml
に接種した。このフラスコを振盪インキュベーター中３０℃、２７５rpmで、培
養物の光学密度が０.３３５から０.３９９(ＯＤ550)の間になるまでインキュベ
ーションした。細菌培養物を遠心して回収した。得られたペレットを冷ＣＣＭＢ
８０緩衝液４mlに再懸濁し、氷上で２０分間維持した。再懸濁試料２５０mlアリ
コートを１.０mlNuncクリオバイアルに入れ、次いで、それらの管をドライアイ
ス/エタノール浴にて凍結させた。これらの細胞のアリコートをHanahan（J．Mol
．Biol．166:557-580(1983)の方法に従い形質転換効率についてアッセイし、生
存細胞を計数した。次いで、バイアルを安定性研究のために−２０℃に置いた。
残りのアリコートを解凍し、更なる分析用に４℃で保持した。
図３は、ベクターｐＣＰ１３含有ＤＨ１０Ｂの生存可能細胞数が４℃で４０日
の期間にわたり、およそ５.０×１０8細胞/mlからおよそ１.０×１０5細胞/mlま
で経時的に減少したことを示す。反対に、コスミドクローン１、２または４を含
有するＤＨ１０Ｂは、より安定であり、同じ期間にわたり生存可能細胞数におい
ておよそ５０倍の減少を示しただけであった。
図４は、ベクターｐＣＰ１３含有ＤＨ１０Ｂの生存可能細胞数が、細胞を−２
０℃で貯蔵した場合、４ヶ月の期間で１０００倍に減少したことを示す。反対に
、コスミドクローン１を含有するＤＨ１０Ｂ細胞は、同じ期間で５０倍の細胞能
減少を示す。図４はまた、コスミドクローン２または４を含有するＤＨ１０Ｂ細
胞
がＤＨ１０Ｂ ｐＣＰ１３細胞と比較して１０倍に向上した残存能を示し、コス
ミドクローン１がその生存可能細胞数を１００倍に向上したことを示した。
実施例９
コスミド１の損失は低温安定性の損失をもたらし、
クローン１でのＤＨ１０Ｂ再形質転換は、低温安定性を回復させる
出典明示により本明細書の一部とするDanilevskaya and Gragerov，Mol．Gen
．Genet．178:233-235(1980)に記載のように、クメルマイシンを用いて、コスミ
ドクローンをＤＨ１０Ｂ細胞からキュアリングした。４℃で貯蔵したＤＨ１０Ｂ
コスミドクローン１、ＤＨ１０Ｂコスミドクローン２およびＤＨ１０Ｂコスミド
クローン４細胞の２０μlアリコートをＳＯＢ−Ｍｇ培地(Life Technologies，I
nc.)１mlに接種した。細胞は、３７℃で１６時間増殖させた。その細胞をＳＯＢ
−Ｍｇ培地でおよそ１.０×１０4細胞/mlまで希釈した。細胞の１mlアリコート
を３７℃で１６時間、０、１、２、３および４μg/mlクメルマイシンの存在下、
培養した。その後、４μg/mlクメルマイシンの存在下で増殖させた培養物をＬＢ
プレートにて画線培養し、カナマイシンの存在下および不在下での増殖能につい
てコロニーをスクリーニングした。カナマイシンの存在下で増殖を示さなかった
細胞は、コスミドクローン１を損失していた。
その後、各培養物由来の１つのカナマイシン感受性コロニーを１５/１０培地
５ml中３０℃で４時間増殖させた。細菌細胞を３,０００rpmで１０分間遠心し、
冷ＣＣＭＢ８０緩衝液０.４mlに再懸濁した。その細胞を氷上で２０分間維持し
、次いで、ドライアイスエタノール浴で凍結させた。凍結後、細胞を解凍し、４
℃で置いた。生存可能細胞数は、０日、５日および１１日に計数した。
図４Ｂは、コスミドクローン１、クローン２またはクローン４に関してキュア
リングした細胞の生存可能細胞数がＤＨ１０Ｂ細胞またはｐＣＰ１３含有ＤＨ１
０Ｂ細胞と同程度に速く減少し、コスミドクローン１、２または４を含有する培
養物ではみられた４℃での安定性を呈示できなかったことを示す。ＤＨ１０Ｂ細
胞由来のコスミドクローン１をキュアリングすると、細胞を４℃でＤＤＭＢ８０
緩衝液に入れた場合、生存能の迅速な損失をもたらした。
コスミドクローン１をキュアリングＤＨ１０Ｂ細胞に再導入すれば安定性を回
復するかどうかを評価するために、コスミドクローン１をキュアリングしたＤＨ
１０Ｂのコンピテント細胞を調製した。
ここで、コスミドクローン１、並びにコスミドｐＣＰ１３を、Hanahan(J．Mol
．Biol．166:557-580(1983)の方法を用いてコスミドクローン１をキュアリング
したＤＨ１０Ｂ株のコンピテント細胞に再形質転換させた。最大効率ＤＨ１０Ｂ
コンピテント細胞ロットＦＡ４１０４(Life Technologies，Inc.)もまた、コス
ミドクローン１およびｐＣＰ１３で形質転換させた。形質転換培養物を５０μg/
ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレート上にまき、３０℃でインキュベーションした
。ｐＣＰ１３含有ＤＨ１０Ｂおよびコスミドクローン１含有ＤＨ１０Ｂのコンピ
テント細胞並びにＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞は下記のように調製した：ベク
ターｐＣＰ１３含有ＤＨ１０Ｂおよびコスミドクローン１含有ＤＨ１０Ｂは、５
０μg/mlカナマイシン含有１５/１０培地５０ml中で、細胞がＯＤ550０.２４４
から０.２５８の間になるまで増殖させた。ＤＨ１０Ｂ細胞はカナマイシンなし
の１５/１０培地で増殖させた。これらの細胞は、遠心して回収した後、冷ＣＣ
ＭＢ８０緩衝液４０mlに再懸濁させた。再懸濁後、細胞を氷上で２０分間維持し
た。次いで、細胞をドライアイスエタノール浴で凍結させ、解凍し、４℃で置い
た。
生存可能細胞数は、ＣＣＭＢ８０緩衝液中４℃で貯蔵した細胞についてある間
隔をおいて測定した。図５は、ＤＨ１０Ｂ細胞またはベクターｐＣＰ１３含有Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞の住存可能細胞数がおよそ１６日間にわたり、およそ１.０×１０6
細胞/mlからおよそ１.０×１０5ないし１.０×１０6細胞/mlに迅速に減少したこ
とを示す。一方、コスミドクローン１の存在は、生存可能細胞数/mlの１００倍
増加をもたらした。これらの結果はまた、コスミドクローン１をキュアリングし
たＤＨ１０Ｂ細胞(４℃で不安定)にコスミドクローン１を再導入すると、４℃で
のこれらの細胞の安定性が再び向上することを示す。図６Ａおよび６Ｂは、低温
貯蔵に対する安定性遺伝子を含有するコスミドをＤＨ５αおよびＳＴＢＬ２(Tri
ng et al.，Focus 16:78-80(1994))細胞に導入すると、４℃でのこれらの細胞系
列の生存能が高まることを示す。
実施例１０
クローン１の存在による形質転換効率の増大
図７は、−２０℃で３ヶ月貯蔵したコスミドクローン１を含有するＤＨ１０Ｂ
株が同様に貯蔵したベクターｐＣＰ１３を含有するＤＨ１０Ｂと比較して(１０
０倍以上の)高い形質転換効率を示したことを示す。−２０℃で３ヶ月後、ベク
ターｐＣＰ１３含有ＤＨ１０Ｂ細胞は１.０×１０5形質転換体/μg以下の形質転
換効率を示した。反対に、コスミドクローン１含有ＤＨ１０Ｂ細胞は＞１.０×
１０6形質転換体/μgの形質転換効率を示した。
実施例１１
生存能および形質転換効率の増大を担う
クローン１のＤＮＡフラグメントの単離
コスミドクローン１は、幾つかのＥ．コリ株において実質的に低温安定性の向
上を示した２２Ｋｂ挿入物を含有する。コスミドクローン１中の２２Ｋｂ挿入物
は、制限エンドヌクレアーゼPstＩを用いて消化し、１４Ｋｂと８Ｋｂの２つの
フラグメントを単離した。続いて、これら２つのフラグメントをそのPstＩ部位
でプラスミドベクターｐＤＥＬＴＡ２(下記の入れ子欠失(nested deletions)の
作製に利用されるプラスミドベクター)にクローニングした。両方のサブクロー
ンの制限地図は、HindIIIまたはEcoRＩのいずれかでプラスミドＤＮＡを消化す
ることにより、導き出した。これら２つのサブクローンは、そのサイズを基にし
てそれぞれｐＤＥＬＴＡ２ １４ＫｂおよびｐＤＥＬＴＡ２ ８Ｋｂと呼んだ。ｐ
ＤＥＬＴＡ２ １４ＫｂとｐＤＥＬＴＡ２ ８Ｋｂの配向を区別するために、反対
配向のプラスミドをｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋とｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−お
よびｐＤＥＬＴＡ２ ８Ｋｂ＋とｐＤＥＬＴＡ２ ８Ｋｂ−と呼んだ。
実施例１２
クローン１の１４および８Ｋｂフラグメントの
ｐＤＥＬＴＡ２へのサブクローニング
サブクローンが４℃または−２０℃で貯蔵したＤＨ１０Ｂ細胞を安定化できる
かどうかを測定するために、いずれかの配向(ｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋および
ｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−)の１４Ｋｂサブクローンを含有するｐＤＥＬＴＡ２
プラスミドおよびいずれかの配向(ｐＤＥＬＴＡ２ ８Ｋｂ＋およびｐＤＥＬＴＡ
２ ８Ｋｂ−)の８Ｋｂサブクローンを含有するｐＤＥＬＴＡ２プラスミドをＥ．
コリ株ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞へ形質転換させた。形質転換体は、カナマ
イシン５０μg/mlを含有するＬＢプレートにて３０℃で選択した。ＤＨ１０Ｂコ
スミドクローン１、ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２、ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２ ８
Ｋｂ＋、ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２ ８Ｋｂ−、ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２ １４
Ｋｂ＋およびＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−の単一コロニーをＬＢカナ
マイシンプレートから拾い出して、５０μg/mlカナマイシン含有１５/１０培地
２mlに入れ、培養物を３０℃で１６時間振盪しながらインキュベーションした。
一晩培養物０.３mlを同じ培地６０mlに接種し、培養物を３０℃、２７５rpmでイ
ンキュベーションした。光学密度を監視し、およそ０.３(０.２６から０.３０７
)のＯＤ５５０rmで、細胞培養物５０mlを４℃で１０分間ＩＥＣ臨床遠心機で遠
心して集めた。細胞ペレットを冷ＣＣＭＢ８０緩衝液４mlに再懸濁し、細胞を氷
上に２０分間残留させた。２５０μlアリコートを冷凍ＮＵＮＣクリオバイアル
中に入れ、ドライアイスエタノール浴にて凍結させた。バイアルをアッセイまで
の間−７０℃で貯蔵し、次いで、バイアルを安定性研究用に−２０℃のフリーザ
ーに移した。ＣＣＭＢ８０緩衝液中、残りの細胞(およそ２ml)をドライアイスエ
タノール浴で凍結させ、氷上で１０分間解凍し、生存可能細胞数についてアッセ
イした。次いで、残りの細胞を安定性研究用に４℃で貯蔵した。ある間隔をおい
て、バイアルを−２０℃フリーザーから取り出し、生存可能細胞数を測定した。
更に、４℃で貯蔵した細胞も、生存可能細胞数についてアッセイした。結果は、
図８および９に示す。図８に表したデータは、１４Ｋｂサブクローンがいずれの
配向(ｐＤＥＬＴＡ〜２ １４Ｋｂ＋およびｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−)でも実質
的に４℃で貯蔵した場合のＤＨ１０Ｂ株の安定性を向上させることを示す。一方
、８Ｋｂサブクローンは、細胞の安定性を改善しない。更に、１４Ｋｂサブクロ
ーンは、いずれの配向でも、−２０℃で貯蔵した細胞の安定性も向上させる(図9
)。この事実は、コスミドクローン１中に見られた安定性遺伝子が１４Ｋｂサブ
クローン上にあることを顕示している。
実施例１３
安定性を担うＤＮＡフラグメントを位置特定するための
欠失ファクトリー誘導体の作製
４℃で貯蔵したＤＨ１０Ｂ細胞の多大な安定性をもたらすプラスミドｐＤＥＬ
ＴＡ２ １４Ｋｂ＋中の領域を狭めるために、ライフ・テクノロジー・インコー
ポレイテッド(Rockville MD)欠失ファクトリーTMシステムを利用した。このシス
テムは、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋中の１４Ｋｂ挿入物において様
々な長さの一連の入れ子欠失(nested deletions)を作製する。欠失ファクトリー
システムは、製造元の推薦に従い使用した。
クローンは、アンピシリンおよびスクロースに対するその耐性またはカナマイ
シンおよびストレプトマイシンに対するその耐性に基づき選択した。３６種の異
なるクローンを各選択項目から選択し、プラスミドＤＮＡはコスミドクローン１
の場合と同じ方法に基づき単離した。両方の選択項目について７２種の異なるク
ローン全てに由来するプラスミドＤＮＡをPstＩで消化した。PstＩクローニング
部位の１つが欠失クローンの作製中に損失したため、この消化により、ベクター
から挿入物を切り出すことなく、プラスミドＤＮＡを直鎖状にした。直鎖状プラ
スミドＤＮＡを、標準として１ｋｂラダー(Gibco/BRL)を用いる１％アガロース
ゲルにて分離した。各クローンのサイズは、Sambrook et al，1989に従い、１ｋ
ｂラダーに基づき算出した。更に４℃で貯蔵したＤＨ１０Ｂ細胞を安定化する能
力の分析用に、挿入ＤＮＡのサイズ毎にクローンの代表的な試料を選択した。
５％ショ糖および１００μg/mlアンピシリンを含有する寒天プレートにて作製
した菌株ＤＨ１０Ｂ中のプラスミドｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋の１１の欠失誘
導体を拾い上げて１００μg/mlアンピシリン含有１５/１０培地２mlに入れ、培
養物を３０℃で１６時間増殖させた。プラスミドｐＤＥＬＴＡ２を含有するＤＨ
１０Ｂ、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋を含有するＤＨ１０Ｂおよびプ
ラスミドｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−を含有するＤＨ１０Ｂもまた、同じ培地で
増殖させた。一晩培養物２５μlを５０mlファルコン管中、同じ培地５mlに接種
し、管を３０℃、２７５rpmで３時間振盪させた。ＩＥＣ ＨＮ ＳＩＩ遠心機に
て１０分間、４℃)、２５００rpmで遠心して細胞を集めた。細胞ペレットを冷Ｃ
ＣＭＢ８０緩衝液４００μlに再懸濁した。細胞を氷上に２０分間残留させた。
細胞をドライアイスエタノール浴中で５分間凍結させ、氷上で１５分間解凍させ
た。生存可能細胞数は、０.８５％塩水に希釈することにより測定した。細胞を
安定性研究用に４℃に置いた。ある間隔をおいて、生存可能細胞数を測定し、そ
の結果を図１０に表した。このデータは、プラスミドが２種の別個の分類：ＤＨ
１０Ｂ細胞を安定化するものと安定化しないもの、に分けられることを示す。Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞を安定化するプラスミドの中には、プラスミド１６、１８、２７お
よび３２がある。ＤＨ１０Ｂ細胞を安定化しないプラスミドの中には、プラスミ
ド１４、１９、２３、２８、２９、３３および３４がある。対照として、プラス
ミドｐＤＥＬＴＡ２は、ＤＨ１０Ｂ細胞を安定化しないが、プラスミドｐＤＥＬ
ＴＡ２ １４Ｋｂ＋およびプラスミドｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ−は、ＤＨ１０Ｂ
細胞を安定化する。特に、プラスミド３２に注目されたい(以降、ｐＤＥＬＴＡ
２３２と称する)。このプラスミドは、(欠失ファクトリーシステムを用いて)ｐ
ＤＥＬＴＡ２ １.４Ｋｂ＋から得られた、４℃で貯蔵したＤＨ１０Ｂを安定化す
る能力のある最小のプラスミドである。
このプラスミドが依然として、４℃で貯蔵したＤＨ１０Ｂの安定性を向上させ
る遺伝子または遺伝子群を含有したかどうかを測定するために、１００μg/mlス
トレプトマイシンおよび５０μg/mlカナマイシンを含有する寒天プレートにて単
離した菌株ＤＨ１０ＢにおけるｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋の１６種の欠失誘導
体を拾い上げ、５０μg/mlカナマイシン含有１５/１０培地２mlに入れ、３０℃
で一晩増殖させた。一晩培養物２５μlを、５０mlコーニング管(Fisherカタログ
番号05-539-6)中、同じ培地５mlに接種し、管を３０℃、２７５rpmで３時間振盪
させた。ＩＥＣ ＨＮ ＳＩＩ遠心機を用いて１０分間、４℃、２５００rpmで遠
心して細胞を集め、細胞ペレットを冷ＣＣＭＢ８０緩衝液４００μlに再懸濁し
た。細胞を氷上に２０分間残留させた。細胞をドライアイスエタノール浴中で５
分間凍結させ、氷上で解凍させ、そして生存可能細胞数を測定した。管を安定性
研究用に４℃に置いた。ある間隔をおいて、生存可能細胞数を測定し、その結果
を図１１に表した。このデータは、プラスミドが２種の別個の分類：ＤＨ１０Ｂ
細胞の安定性を向上させるものと向上させないもの、に分けられることを再度示
している。ＤＨ１０Ｂ細胞を安定化するプラスミドの中には、プラスミド３、１
０、１２、１６、２０、２３および３１がある。ＤＨ１０Ｂ細胞を安定化しな
いプラスミドの中には、プラスミド１、２、４、８、９、２１、３２、３５およ
び３６がある。上記のように、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２は、４℃で貯蔵したＤ
Ｈ１０Ｂ細胞を安定化しないが、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２ １４Ｋｂ＋は、そ
の細胞を安定化する。特に、プラスミド１６に注目されたい(以降、ｐＤＥＬＴ
Ａ２ １６と称する)。このプラスミドは、４℃でＤＨ１０Ｂを安定化する能力の
あるこのスクリーニング由来の最小のプラスミドである。
図１２は、図１０および図１１に概略説明した安定性研究を組み合わせたもの
であり、欠失ファクトリーシステムを用いて挿入物の一部を欠失させた後に残っ
ている挿入物ＤＮＡの長さを示す。図１２は、欠失ファクトリーシステムの使用
により、安定性遺伝子含有領域をおよそ２.５Ｋｂの挿入物サイズに狭めること
を例示説明するものである。
実施例１４
コスミドクローン１における安定性/形質転換遺伝子の位置特定および配列
欠失クローン１６および３２は、およそ２５００塩基長の必須配列領域を定め
た。この必須領域内に配列させるために、ベクターに相補的で、かつこれらのク
ローンの欠失末端に隣接するプライマーを用いた。クローン１６の場合、プライ
マーＴ７−２５(ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＡＣ ＴＧＡ ＴＣＣ
Ｔ)(配列番号１)を使用し、クローン３２の場合、プライマーＳＰ６−２５(ＧＡ
Ｔ ＴＴＡ ＧＧＴ ＧＡＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＡＧ ＡＴＣ Ｃ)(配列番号２)を使
用した。
ＤＮＡ配列決定は、[α−35Ｓ]ｄＡＴＰでのサイクルシーケンス法（出典明示
により本明細書の一部とするMurray，V．(1989)Nucleic Acids Res．17，8889)
を用いて実施した。クローン１６から得られた配列は３０２塩基長であり、クロ
ーン３２から得られた配列は１６９塩基長であった。ＢＬＡＳＴサーチは、各配
列断片でＢＬＡＳＴＮを用いて実施した。クローン１６配列と、ベータ−ケトア
シルＡＣＰシンターゼＩをコードするＥ．コリ遺伝子fabBの下流の１４１塩基Ｄ
ＮＡ領域（受託番号Ｍ２４４２７)との間には強力なマッチ(Ｐ(Ｎ)＝２.８×１
０-40）が見られた。クローン３２は、fabB遺伝子の上流のヘモフィラス・イン
フルエンザＤＮＡ９３６塩基領域(受託番号Ｕ３２７７５Ｌ４２０２３)と
の弱いマッチ(Ｐ(Ｎ)＝０.４７)を与えた。Ｅ．コリのこの領域は、まだデータ
ベースにはない。fabB領域の既知のＥ．コリＤＮＡ配列から、およそ３００塩基
間隔で各鎖に沿って配列決定(シーケンシング)プライマーを設計した。染色ター
ミネーターシーケンス法(Dye terminator sequencing)は、ＡＢＩ ３７３Ａスト
レッチシーケンサーを用いて実施した。更なるプライマーは、全ての配列データ
が１つの隣接断片(contiguous piece)内にアセンブルできるまで、クローン１６
および３２由来の配列を伸長するように設計した。更なる配列プライマーには：
“３２由来”ＣＣＡ ＣＡＴ ＡＴＣ ＣＧＧ ＧＴＴ ＴＴＴ ＣＧＣ ＴＧ(配列番
号３)；“fab４６”ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＧＣ ＡＧＧ ＴＴＧ ＴＡＴ ＧＧＡ ＧＴ(
配列番号４)；“fab４７０”ＴＡＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＡＴ ＣＧＣ ＴＧ
Ａ ＴＧ(配列番号５)；“fab１１７６”ＣＧＴ ＧＡＡ ＧＴＧ ＴＴＣ ＧＧＣ
ＧＡＴ ＡＡＧ ＡＧ(配列番号６)；“fab１５１０”ＡＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＴＣ
Ｃ ＧＧＣ ＡＣＴ ＡＡＣ ＡＣ(配列番号７)；“１６由来”ＧＧＴ ＴＡＣ ＧＧ
Ｔ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＴ(配列番号８)；“fab１１０４Ｃ”ＴＡＴ
ＣＡＡ ＣＧＣ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＣＧ ＣＣＡ ＴＣ(配列番号９)；“fab６８Ｃ
”ＡＣＴ ＣＣＡ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＴＧ ＣＣＡ ＡＣＣ ＴＣ(配列番号１０)；
“fab７９６”ＣＴＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＡＡＧ ＡＧ(配列番号１１)；“fa
b１５０”ＡＡＡ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＧＡ ＣＴＴ ＧＴＴ(配列番号１２)
；“fab８６５Ｃ”ＴＣＣ ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＴＡＴ Ｔ(配列番号１
３)が含まれる。シーケンサー２.０(Gene Codes Corp.)は、データをアセンブル
するために使用した。クローン１の重要領域の配列(配列番号１４)は、図１３に
示す。
Ｅ．コリ株ＤＨ１０ＢのfabＢ領域は、１.１×エロンガーゼスーパーミックス
(ＬＴＩ)とＭ２４４２７配列中の３９位(ＴＡＡＡＴＴＣＧＡＧＧＴＴＧＧＣＡ
ＧＧＴＴ)(配列番号１５)および１５９２位(ＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡ
ＡＧＴＴ)(配列番号１６)のプライマーを用いて増幅した。サイクリング条件は
、９５℃で３０秒、５５℃で７５秒および７２℃２分間を３０サイクル、次いで
、７２℃で１０分間インキュベーション１回であった。ＰＣＲ産物は、エキソヌ
クレアーゼＩ(出典明示により本明細書の一部とするAdamczky，J.J.，Jr.，
（1995）Editorial Comments 22，36)で消化し、イソプロパノールで沈殿(Brow
，M.A.D．(1990)in PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Inni
s，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J.，and White，T.J.，eds.)p.194，Acad
emic Press，San Diego.)させて、精製した。ペレットを１０mMトリス−ＨＣｌ(
ｐＨ７.５)、５mMＮａＣｌ、０.１mMＥＤＴＡの初期容量に再溶解させた。再度
、染色ターミネーターシーケンス法を、ＡＢＩ３７３Ａストレッチシーケンサー
および上記のプラスマーを用いて実施した。配列アラインメントプログラムAlig
n Plus(Scientific and Educational Software)を用いて、クローン１６とＤＨ
１０Ｂ由来の配列を比較し、それらが配列決定した領域と同一であることを示し
た。
図１３の配列では、クローン１の必須領域は、fabB以外に幾つかのオープンリ
ーディングフレームを含有した。その機能がfabB遺伝子と特異的に相関すること
を確認するために、欠失させた(下記参照)。クローン１の必須領域内の１００ア
ミノ酸以上のオープンリーディングフレームは、下記の通りである：
ＯＲＦ 塩基 アミノ酸数
１(fabB) １０４３−２２６３ ４０６
２ １９００−１１３３ ２５５
３ ４８８−２４ １５４
図１４は、コスミドクローン１のおよそ２５００ｂｐ必須領域におけるオープ
ンリーディングフレームとMluＩ制限部位の位置を表す。
上記に与えた配列決定データから、fabB遺伝子は、ＣＣＭＢ８０緩衝液中４℃
または−２０℃で貯蔵したＥ．コリ細胞を安定化する可能性のある一遺伝子とし
て同定できる。
fabB遺伝子が−２０℃で貯蔵したＥ．コリ株の安定性を増強できる能力を評価
するために、ｐＤＥＬＴＡ２ ３２由来のfabB遺伝子をプラスミドｐＤＥＬＴＡ
２内へサブクローニングした。先のデータ(Tsay J．et al.，J．Bact 174:508-5
13，1992)により、fabB遺伝子全体が１.８Ｋｂ MluIフラグメントとしてサブク
ローニングされ得ることが示された。ｐＤＥＬＴＡ２ ３２ＤＮＡを３
７℃で２時間、MluＩで消化した。消化反応物をＴＡＥ緩衝液中１％アガロース
ゲルでの電気泳動にかけ、製造元のプロトコールに従い、GlassMax(Gibco BRL)
を用いて１.８Ｋｂフラグメントを精製した。プラスミドｐＤＥＬＴＡ２を３７
℃で３時間、MluＩで消化し、アルカリホスファターゼで３７℃で１時間処理し
た。ドデシル硫酸ナトリウムを０.５％まで加え、次いで、プロテインナーゼＫ
を５０μg/mlまで加えた。反応物を３７℃で１時間インキュベーションし、次い
で、フェノール−クロロホルムで抽出した。ＤＮＡを沈殿させ、１０mMトリス(
ｐＨ７.５)１mMＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁させた。次いで、１.８Ｋｂ MluＩフラ
グメントは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを室温で１６時間使用して、MluＩ切断アルカ
リホスファターゼ処理ｐＤＥＬＴＡ２ベクターＤＮＡとライゲートさせた。その
後、最大効率ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞(Gibco BRL)を形質転換させるのに製
造元の指導書に従い、ライゲーション反応を使用した。次いで、１００μg/mlア
ンピシリン含有ＬＢプレートにて３７℃で選択したコロニーを１００μg/mlアン
ピシリン含有ＬＢ培地中、３７℃で１６時間増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離
した。このプラスミドＤＮＡをMluＩで消化し、１．８Ｋｂ MluＩフラグメント
の存在についてスクリーニングした。１.８Ｋｂ MluＩフラグメントを含有する
４つのプラスミド(１０、１３、１４および１５と番号付ける)を更なる研究用に
選択した。更に、このプラスミドＤＮＡは、BglＩで消化することにより、MluＩ
フラグメントの配向についてスクリーニングした。消化したフラグメントのゲル
電気泳動は、クローン１０と１５が一配向でMluＩフラグメントを含有し、クロ
ーン１３、１４が反対配向でMluＩフラグメントを含有したことを示していた。
プラスミドｐＤＥＬＴＡ２３２由来のクローン化MluＩ挿入物を含有するこれ
らのプラスミドがfabB遺伝子産物に特有の酵素機能をコードする能力を評価する
ために、クローン１０、１３、１４および１５と命名したプラスミド(並びに、
プラスミドｐＤＥＬＴＡ２ ３２およびｐＤＥＬＴＡ２)を、fabB遺伝子の変異を
含有するＥ．コリ株内に導入した。具体的には、この菌株は、温度感受性fabB遺
伝子産物をコードするfabB１５(ts)対立遺伝子を含有する。変異により、この菌
株は３０℃で増殖できるようになったが、４２℃では増殖できない。この
菌株は、エール大学のＥ．コリ・ジェネティック・ストック・センターから入手
し、名称ＣＧＳＣ５６４１を与えた。この菌株のコンピテント細胞は、下記のよ
うにして調製した：ＣＧＳＣ５６４１の幾つかのコロニーを、３０℃で増殖させ
たＬＢプレートからＳＯＢ培地５０mlへと拾い入れ、フラスコを３０℃、２７５
rpmで振盪させた。
５５０nmでの光学密度が０.３０８に到達したら、細胞をＩＥＣ ＨＮ ＳＩＩ
遠心機にて４℃、２５００rpmで１０分間遠心して集めた。細胞ペレットを冷Ｃ
ＣＭＢ８０緩衝液４mlに再懸濁し、細胞を氷上に２０分間置いた。細胞２５０μ
lを冷凍ＮＵＮＣ管に等分し、管をドライアイスエタノール浴中で凍結させた。
バイアルは−８０℃で貯蔵した。コンピテント細胞の数管を−８０℃のフリーザ
ーから取り出し、氷上でおよそ１５分間解凍した。コンピテント細胞１００μl
を、公開された方法(Hanahan J．Mol．Biol．166:557-580(1983))に従い、５μl
のプラスミドＤＮＡ、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴＡ２ ３２、クローン１０、
クローン１３、クローン１４、クローン１５で形質転換させた。細胞をＳＯＣ添
加後３０℃で１時間発現させた。発現期間後、細胞１００μlを１００μg/mlア
ンピシリン含有ＬＢプレート上にまき、そのプレートを３０℃または４２℃のい
ずれかでインキュベーションした。３０℃および４２℃の両方でコロニーがプレ
ート上に現れたら、その場合は、プラスミドが、Ｅ．コリ株ＣＧＳＣ５６４１で
は４２℃で欠損する、酵素的に活性なfabB遺伝子産物を提供したということであ
る。コロニーが３０℃でのアンピシリンプレートのみに現れたら、その場合は、
プラスミドが活性なfabB遺伝子産物を提供できなかったということである。表２
は、fabBts変異の相補性の結果を示す。
表２の結果は、ｐＤＥＬＴＡ２プラスミドでの形質転換が３０℃でのみアンピ
シリン耐性コロニーをもたらすことを示し、これはｐＤＥＬＴＡ２プラスミドが
活性fabB遺伝子産物をコードしないことを示す。プラスミドｐＤＥＬＴＡ２ ３
２、クローン１０、クローン１３、クローン１４およびクローン１５での形質転
換は、３０℃および４２℃の両方でアンピシリン耐性コロニーをもたらし、これ
はこれらのプラスミドが野生型fabB遺伝子産物をコードすることを示す。よって
、１.７Ｋｂの挿入物ＤＮＡ(fabBのコード配列１.２Ｋｂを含む)を含有するクロ
ーン１０、１３、１４および１５は、活性fabB遺伝子産物を発現する。これらの
クローンは、以後、ｐＤＥＬＴＡ２fabB１０、ｐＤＥＬＴＡ２fabB１３、ｐＤＥ
ＬＴＡ２fbB１４およびｐＤＥＬＴＡ２fabB１５と称する。
ｐＤＥＬＴＡ２fabB１０、ｐＤＥＬＴＡ２fabB１３、ｐＤＥＬＴＡ２fabB１４
およびｐＤＥＬＴＡ２fabB１５と称するこれらのプラスミドが、４℃および−２
０℃で貯蔵したＤＨ１０Ｂ細胞の安定性を向上する能力を評価するため、製造元
による指導書に従い、各プラスミド５μlを最大効率ＤＨ１０Ｂコンピテント細
胞(ロット番号ＨＦＫ７０１)に形質転換させた。プラスミドｐＤＥＬＴＡ２およ
びｐＤＥＬＴＡ２ ３２もまた対照として形質転換させた。形質転換体は、１０
０μg/mlアンピシリン含有ＬＢ寒天プレートにて３０℃で選択した。翌日、それ
ぞれの形質転換からアンピシリン耐性形質転換体１つを拾って、１００μg/mlア
ンピシリン含有１５/１０培地２mlに入れ、培養物を３０℃で１６時間振盪させ
た。各一晩培養物０.２５mlを５００mlバッフル付振盪フラスコ中同じ培地６０m
lに接種し、培養物をNew Brunswickフロアー・シェーカー中３０℃、２７５rpm
で振盪させた。光学密度は、５５０nmで監視し、光学密度が０.２６〜０.３２に
到達したら、培養物を回収する。培養物５０mlを４℃で１０分間ＩＥＣベンチ・
トップ遠心機で遠心し、ペレットを冷ＣＣＭＢ８０緩衝液４mlに再懸濁した。細
胞を氷上に２０分間インキュベーションした。細胞を２mlずつ２つに分けた。２
ml部の一方をドライアイスエタノール浴にて５分間凍結させた。次いで細胞を氷
上で解凍した。生存可能細胞数は、０.８５％ＮａＣｌに連続希釈して測定した
。次いで、細胞を４℃の冷蔵庫中に置いた。第２部の細胞は次のように処理した
：細胞２５０μlをＮＵＮＣクリオバイアルに入れ、そのバイアルをドラ
イアイスエタノール浴にて凍結させた。細胞バイアル管１つは、生存可能細胞数
を測定するために使用し、残りのバイアルは−２０℃のフリーザーに入れた。あ
る間隔をおいて、４℃で貯蔵した細胞から生存可能細胞数を測定した。更に、バ
イアル管を−２０℃での貯蔵から取り出し、その生存可能細胞数を測定した。結
果は、図１５および１６に示す。図１５から分かるように、プラスミドｐＤＥＬ
ＴＡ２含有ＤＨ１０Ｂ細胞の生存可能細胞数は、４℃で９日貯蔵後、１００倍低
下した。プラスミドｐＤＥＬＴＡ２３２含有ＤＨ１０Ｂ細胞(fabBコード配列の
クローニングに使用されるMluＩフラグメント源)の生存可能細胞数は、同じ期間
で８倍だけ低下し、よって、生存可能細胞数においてプラスミドｐＤＥＬＴＡ２
含有ＤＨ１０Ｂ細胞と比較し、３０倍増強したことになった。ｐＤＥＬＴＡ２fa
bBクローン１０、１３、１４および１５を含有するＤＨ１０Ｂもまた、ベクター
ｐＤＥＬＴＡ２を含有するＤＨ１０Ｂ細胞に対し、３０〜６０倍の増強された生
存を示した。従って、fabBコード配列を含有するクローンは、４℃でのＤＨ１０
Ｂ細胞の生存増強をもたらした。
図１６から分かるように、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２ ３２およびｐＤＥＬＴ
Ａ２fabBクローン１０、１３、１４および１５はいずれも、細胞を−２０℃で貯
蔵した場合もＤＨ１０Ｂ細胞の生存増強をもたらす。fabBクローンは、ＤＨ１０
Ｂ細胞の生存能において、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２を含有するＤＨ１０Ｂの生
存能に対し、４００〜７００倍の増強をもたらした。
活性fabB遺伝子産物を発現するプラスミドが４℃および−２０℃で貯蔵したＤ
Ｈ１０Ｂ細胞の安定性を増強する更なる証拠を提供するために、プラスミドｐＤ
ＥＬＴＡ２fabB１４およびプラスミドｐＤＥＬＴＡ２fabB１５におけるfabBのコ
ード配列を、およそ７５０ｂｐフラグメントの欠失により中断させた。ｐＤＥＬ
ＴＡ２fabB１４およびｐＤＥＬＴＡ２fabB１５由来のプラスミドＤＮＡ(酵素的
に活性なfabB遺伝子をコードする)を、５５℃で１時間Kpn２Ｉで消化した。次い
で、PinAＩを加え、反応を更に１時間３７℃でインキュベーションした。消化反
応物を１％アガロースゲルでＴＡＥ緩衝液により電気泳動した。ゲルから単離し
た９ＫｂフラグメントをGlassMax(Gibco BRL)で精製し、精製ＤＮＡをＴＥ緩衝
液に再懸濁した。９Ｋｂフラグメントの末端をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で室温で１６時間ライゲートした。ライゲーション反応は、最大効率ＤＨ１０Ｂ
コンピテント細胞を形質転換するために、３７℃で１００μg/mlアンピシリン含
有ＬＢプレートでの選択と併用した。プレートからコロニーを拾って１００μg/
mlアンピシリン含有ＬＢ培地に入れ、培養物を３７℃で１６時間増殖させた。プ
ラスミドＤＮＡを単離し、MluＩおよびBglＩで消化し、ゲル電気泳動により分析
した。ｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失およびｐＤＥＬＴＡ２ １５欠失と呼んだ２つの
プラスミドは、７５０ｂｐフラグメントを欠くことが示された。
７５０ｂｐフラグメントの欠失が、fabB遺伝子産物の損失をもたらすかどうか
を測定するために、ｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴＡ２fabB１４、ｐＤＥＬＴＡ２
fabB１５、ｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失およびｐＤＥＬＴＡ２ １５欠失をＣＧＳＣ
５６４１(fabB１５ts)のコンピテント細胞へ形質転換させた。その結果は、表３
に示す。
表３は、ＣＧＳＣ５６４１(fab１５ts)コンピテント細胞のｐＤＥＬＴＡ２、
ｐＤＥＬＴＡ２fabB１４、ｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失、ｐＤＥＬＴＡ２fabB１５
またはｐＤＥＬＴＡ２ １５欠失プラスミドでの形質転換の結果を示す。プラス
ミドｐＤＥＬＴＡ２をＣＧＳＣ５６４１のコンピテント細胞内に形質転換すると
、３０℃でのみアンピシリン耐性コロニーをもたらし、これは、ｐＤＥＬＴＡ２
プラスミドが機能的fabB遺伝子産物をコードしないことを示す。
プラスミドｐＤＥＬＴＡ２fabB１４またはｐＤＥＬＴＡ２fabB１５をＣＧＳＣ
５６４１のコンピテント細胞内に形質転換すると３０℃および４２℃の両方でア
ンピシリン耐性コロニーをもたらし、これは、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２fab
B１４およびｐＤＥＬＴＡ２fabB１５が機能的fabB遺伝子産物をコードすること
を示す。プラスミドｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失またはｐＤＥＬＴＡ２ １５欠失の
形質転換は、３０℃でのみアンピシリン耐性コロニーをもたらし、これは、これ
らのプラスミドが機能的fabB遺伝子産物をコードしないことを示す。よって、fa
bBコード領域のおよそ７５０ｂｐが欠失すると、fabBts変異を補足できない。
MluＩ部位は、７６８および２４３６位にある。MluＩ１４△およびMluＩ１５
△での欠失は、fab４７０プライマーとの接合部(配列番号５)全域での配列決定
により確認した。fab４７０プライマーの３'末端は、我々のfabB遺伝子配列中の
１２９８塩基に配置する。この欠失により、塩基１３１０から２０３３が除去さ
れるはずである。典型的には、このプライマーの３'配列の最初のおよそ２０塩
基は解読可能でないので、このプライマーを用いた場合、最初の解読可能塩基は
、欠失がない場合はfabB配列の約１３１８位であり、欠失がある場合は約２０４
１位であろう。解読可能な配列は、両方のクローンとも２０４１位で始まるため
、その欠失は予想どおりである。プライマーfab４７０由来のクローンMluＩ１４
△およびMluＩ１５△の配列(配列番号１７)は、下記の通りである：
fabBコード配列の混乱がプラスミドのＤＨ１０Ｂ細胞安定化能力を低減するか
どうかを測定するために、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２、ｐＤＥＬＴＡ２fabB１４
、ｐＤＥＬＴＡ２fabB１５、ｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失およびｐＤＥＬＴＡ２ １
５欠失を最大効率ＤＨ１０ＢロットＨＦＫ７０１に形質転換させた。形質転換体
は、１００μg/mlアンピシリン含有ＬＢプレートにて３０℃で１６時間平板培養
した。それぞれの形質転換から単一コロニーを拾い、１００μg/mlアンピシリン
含有１５/１０培地２mlに入れ、培養物を３０℃で１６時間振盪させる。一晩培
養物０.２５mlを同じ培地５０mlに接種し、５５０nmでの光学密度が０.２７から
０.３０になるまで増殖させた。細胞をＩＥＣ ＨＮ ＳＩＩ遠心機にて４℃、２
５００rpmで１０分間遠心して集め、細胞ペレットを冷ＣＣＭＢ８０緩
衝液４mlに再懸濁させた。細胞を氷上に２０分間置き、細胞２５０μlを冷凍Ｎ
ＵＮＣクリオバイアルに入れた。細胞をドライアイスエタノール浴で５分間凍結
させ、−２０℃のフリーザーに入れた。残りの細胞をドライアイスエタノール浴
で凍結させ、解凍して４℃で置いた。生存可能細胞数は、０.８５％塩水での連
続希釈により測定した。ある間隔をおいて、４℃または−２０℃のいずれかで様
々な期間後の生存可能細胞数を測定した。
結果は、図１７および１８に示す。図１７は、ＣＣＭＢ８０緩衝液中４℃で貯
蔵したｐＤＥＬＴＡ２プラスミド含有ＤＨ１０Ｂ細胞の生存可能細胞数が、３０
日の期間で１×１０8細胞/mlから１×１０5細胞/mlに下落することを示す。プラ
スミドｐＤＥＬＴＡ２fabB１４またはｐＤＥＬＴＡ２fabB１５を含有する細胞の
生存可能細胞数は、ｐＤＥＬＴＡ２ベクター含有細胞よりもおよそ１００倍高い
。これらの結果は、機能的fabB遺伝子を含有するプラスミドが４℃で貯蔵したＤ
Ｈ１０Ｂ細胞の安定性を顕著に増強することを示す。fabBコード配列を中断する
欠失誘導体(プラスミドｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失およびｐＤＥＬＴＡ２ １５欠
失)を含むＤＨ１０Ｂ細胞は、無傷のfabBコード配列を含有するＤＨ１０Ｂ細胞
におけるよりも実質的に低い生存可能細胞数を持つ。これらの結果は、fabBコー
ド配列の混乱が、これらのプラスミドのＤＨ１０Ｂ細胞安定化能力を除去するこ
とを示している。ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２ １４欠失およびｐＤＥＬＴＡ２ １
５欠失の生存可能細胞数は、ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２細胞の生存可能細胞数よ
りもわずかに高い。これらの結果は、中断fabBコード配列と共にプラスミドを含
有する細胞におけるfabB遺伝子産物の僅かな増大が、恐らくこれらのプラスミド
の調節作用によるものであることを示している。図１８は、−２０℃で６０日間
貯蔵したｐＤＥＬＴＡ２プラスミド含有ＤＨ１０Ｂ細胞が、生存可能細胞数を３
対数減少するという著しい不安定性を示すことを指摘している。機能的fabB遺伝
子産物の存在(プラスミドｐＤＥＬＴＡ２fabB１４またはｐＤＥＬＴＡ２fabB１
５の存在に起因する)は、生存可能細胞数の１００倍増大をもたらす。更に、fab
Bコード配列を中断する欠失誘導体の存在は、プラスミドｐＤＥＬＴＡ２含有細
胞よりもわずかに高いが、機能的fabB遺伝子産物をコードするプラスミドを含有
する細胞よりもかなり低い生存可能細胞数をもたらす。
これらの結果は、マルチコピープラスミド上に無傷fabB遺伝子が存在すると、
細胞を４℃または−２０℃のいずれかで貯蔵した場合、ＤＨ１０Ｂ細胞の安定性
を向上することを示す。
実施例１５
不飽和脂肪酸レベルに対するFabBの効果
Ｅ．コリにおけるfabB遺伝子のクローニングおよび過剰発現の結果の１つは、
膜リン脂質にみられる不飽和脂肪酸総量の増大である。この増大は、シスバクセ
ネートレベルが増大した結果である(de Mendoza D．et al.，J．Biol．Chem．25
8:2098-2101(1983))。クローン化fabB遺伝子が、ＤＨ５αおよびＤＨ１０Ｂ細胞
におけるシスバクセネートレベルの増大も同様に引き起こすかどうかを評価する
ために、ｐＣＰ１３、コスミドクローン１、ｐＤＥＬＴＡ２およびｐＤＥＬＴＡ
２fabB１５を、ＤＨ５αおよびＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞に形質転換させ、
細胞膜中に存在する脂肪酸の分析用に、これらの細胞を増殖させた。細胞はまた
、ＣＣＭＢ８０緩衝液中、−２０℃での安定性についても分析した。形質転換体
は、５０μg/mlカナマイシン(ｐＣＰ１３およびコスミドクローン１の場合)また
は１００μg/mlアンピシリン(ｐＤＥＬＴＡ２およびｐＤＥＬＴＡ２fabB１５の
場合)を含有するＬＢプレートにて３０℃で選択した。これらのプレートのコロ
ニーを培地２mlに接種した。ＤＨ５αｐＣＰ１３およびＤＨ５αコスミドクロー
ン１の場合、細胞を５０μg/mlカナマイシン含有ＳＯＢ培地に接種した。ＤＨ５
αｐＤＥＬＴＡ２およびＤＨ５αｐＤＥＬＴＡ２fabB１５の場合、細胞を１００
μg/mlアンピシリン含有ＳＯＢ培地に接種した。ＤＨ１０ＢｐＣＰ１３およびＤ
Ｈ１０Ｂコスミドクローン１の場合、細胞を５０μg/mlカナマイシン含有１５/
１０培地に接種した。ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２およびＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ
２fabB１５の場合、細胞を１００μg/mlアンピシリン含有１５/１０培地に接種
した。ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２およびＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２fabB１５の場
合、細胞を１００μg/mlアンピシリン含有１５/１０培地に接種した。細胞を３
０℃で１６時間増殖させた。培養物２５０μlを同じ培地６０mlに接種し、培養
物を３０℃、２７５rpmで増殖させた。光学密度は５５０nmで監視し、培養物が
光学密度およそ０.３(範囲０.２５３〜０.３１２)に到達したら、
細胞を遠心して集めた。具体的には、細胞４０mlをＩＥＣ ＨＮ ＳIＩ遠心機に
て４℃、２５０rpmで１０分間遠心して集めた。細胞ペレットを冷ＣＣＭＢ８０
３.２mlに再懸濁し、細胞を氷上に２０分間置いた。細胞２５０μlをＮＵＮＣク
リオバイアルに入れ、バイアルをドライアイスエタノール浴中、５分間凍結させ
た。細胞を安定性研究用に−２０℃のフリーザーで貯蔵した。ある間隔をおいて
、２つのバイアルをフリーザーから取り出し、細胞を生存可能細胞数についてア
ッセイした。残りの細胞(１５〜２０ml)を遠心して集め、１０mMトリスＨＣｌｐ
Ｈ７.５中で１回洗浄し、細胞ペレットを−２０℃で貯蔵した。脂質を細胞ペレ
ットから抽出し、脂肪酸について分析した。
細胞ペレットを洗浄し、蒸留水に再懸濁し、溶液をガラス管に移した。各容量
の細胞溶液のガラス管にメタノール２容量とクロロホルム１容量を加えた。混合
および遠心後、上清を新しいガラス管に移した。この管に１容量の蒸留水と１容
量のクロロホルムを加え、二相溶液を得た。有機相を新しいガラス管に移し、有
機溶液を、溶液表面上に窒素ガスを吹き込んで乾燥させた。次いで、エタノール
２mlを各管に加え、溶液を再度窒素で乾燥させた。エタノール洗浄工程を繰り返
した。０.５Ｍナトリウムメトキシド(Aldrich)２mlを各管に加え、その管を室温
で１時間維持した。氷酢酸０.１mlと蒸留水５mlを各管に加えた。溶液をヘキサ
ン５mlで２回抽出した。次いで、溶液を乾燥させ、二硫化炭素２００μlに再溶
解させた。
ＧＣ分析では、キャピラリー注入口システムとＨＰ７６７３自動サンプラーを
装備したHewlett-Packard 5890シリーズIIガスクロマトグラフ装置を使用した(H
ewlett-Packard，Palo Alto，CA)。カラムは、フィルム厚１.０μのジメチリポ
リシロキサンでコーティングされた３０ｍ×０.３２μmI.D.融合シリカキャピラ
リーカラムであった(Alltech，Deerfield，IL)。流速１ml/分の超高純度ヘリウ
ムをキャリアーガスとして使用した。２８５℃に設定したインジェクターによる
分割注入(５０：１)モードを使用した。オーブン温度は１９０℃に設定した。各
分析後に、オーブン温度を５０℃/分ずつ２８５℃まで上昇させ、１０分間維持
した。ＦＩＤ検出器温度は２８５℃であった。
表４は、ＤＨ５αおよびＤＨ１０Ｂにおける不飽和脂肪酸レベルに対するfab
Bクローンの存在効果を示す。
表４中、Ｃ１４：０はミリスチン酸を表し、Ｃ１６：０はパルミチン酸を表し
、Ｃ１６：１はパルミトール酸を表し、Ｃ１７：０はマルガリ酸を表し、Ｃ１８
：０はステアリン酸を表し、Ｃ１８：１はシスバクセン酸を表し、Ｃ１９：０は
ノンデシル酸を表す。表４および図１９から分かるように、ＤＨ５α株における
コスミドクローン１の存在は、シスバクセネートレベルを、ＤＨ５αｐＣＰ１３
株の１５.５％からＤＨ５αコスミドクローン１の４１％へと上げる。プラスミ
ドｐＤＥＬＴＡ２fabB１５の存在は、シスバクセネートレベルをＤＨ５αｐＤＥ
ＬＴＡ２の１２.２％からＤＨ５αｐＤＥＬＴＡ２fabB１５の６９.２％へと上げ
る。シスバクセネートレベルにおける同様の増大が、ＤＨ１０Ｂ株でも見られた
。シスバクセネートレベルは、ＤＨ１０ＢｐＣＰ１３株の２９.９％からＤＨ１
０Ｂコスミドクローン１の４０.６％へ、ＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２株の２９.３
％からＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２fabB１５の６２.４％へと上げる。総不飽和脂
質レベル(Ｃ１８：１およびＣ１６：１の両方)を算出する場合、プラスミド上の
機能的fabB遺伝子の存在は、不飽和脂肪酸レベルをＤＨ５αｐＣＰ１３およびＤ
Ｈ５αｐＤＥＬＴＡ２株の４８〜４９％からＤＨ５αコスミドクローン１の
６６.５％へ、およびＤＨ５αｐＤＥＬＴＡ２fabB１５の９１％へと上げる(図２
０)。予想どおり、より高コピー数プラスミドｐＤＥＬＴＡ２fabB１５は、より
低コピー数コスミドクローン１よりも不飽和脂質レベルを上げる。ＤＨ１０Ｂ株
では、プラスミド上の機能的fabB遺伝子の存在は、不飽和脂肪酸レベルをＤＨ１
０ＢｐＣＰ１３およびＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２株の５６−６０％からＤＨ１０
Ｂコスミドクローン１の６７％へ、およびＤＨ１０ＢｐＤＥＬＴＡ２fabB１５の
８０％へと上げる(図２０)。この場合も、より高コピー数プラスミドｐＤＥＬＴ
Ａ２fabB１５は、より低コピー数コスミドクローン１よりも不飽和脂質レベルを
上げる。
安定性研究の結果は図２１および２２にみることができる。図２１からわかる
ように、ｐＣＰ１３またはｐＤＥＬＴＡ２を含有するＤＨ５α細胞は、−２０℃
で不安定であり、生存可能細胞数は、２ヶ月の間に３〜５×１０8細胞/mlから３
.９〜１０6細胞/mlへ低下する。コスミドクローン１またはｐＤＥＬＴＡ２fabB
１５を含有するＤＨ５α細胞は、対照細胞よりも安定であり、ｐＣＰ１３または
ｐＤＥＬＴＡ２を含有する細胞と比較して、５〜１０倍以上の生存可能細胞/ml
を有する。同様に、ｐＣＰ１３またはｐＤＥＬＴＡ２を含有するＤＨ１０Ｂ細胞
もまた、−２０℃で不安定であり、−２０℃で同じ期間にわたり２〜３×１０8
細胞/mlがらおよそ１.０×１０6細胞/mlに減少する(図２２)。コスミドクローン
１またはｐＤＥＬＴＡ２fabB１５を含有するＤＨ１０Ｂ細胞は、対照細胞よりも
１０〜４０倍高い生存可能細胞数を持ち、より安定である。
図２３に示したように、ＤＨ５αとＤＨ１０Ｂ細胞の−２０℃での生存と細胞
膜中に見られる不飽和脂肪酸量との間には相関関係が存在する。この結果を−２
０℃での細胞生存としてＹ軸上に、不飽和脂肪酸としての総脂質のパーセントを
Ｘ軸上にプロットすると、細胞膜中の総不飽和脂質値が高ければ高いほど、−２
０℃での細胞の生存率が大きくなることが示される(図２３)。
実施例１６
ＳＢ３４９９Ｂ細胞の生存増大
−２０℃で貯蔵したＳＢ３４９９Ｂ細胞の生存増大が細胞膜の不飽和脂肪酸レ
ベルの増大に起因するかどうかを測定するために、ＤＨ１０ＢおよびＳＢ３４９
９Ｂ細胞を数種の異なる温度で増殖させ、脂質を実施例１５のように分析した。
更に、fabFの変異を含むＣＹ３２２株もまた、この研究に含まれる。この特定の
fabF変異は、全ての増殖温度でシスバクセネートの過剰生産をもたらす(Ulrich
，A．K．et al.，J．Bact 154:221-230(1983))。具体的には、−７０℃で貯蔵し
たＣＹ３２２、ＤＨ１０ＢおよびＳＢ３４９９Ｂマスターシードをコスミドの実
験に使用する細胞源として使用した。菌株をＬＢプレートにて画線塗沫し、プレ
ートを２３℃、３０℃、３７℃および４２℃でインキュベーションした。これら
のプレート由来の細胞を用いて１.５mlブロス培養物に接種した。ＤＨ１０Ｂお
よびＳＢ３４９９Ｂの場合、細胞を１５/１０培地に接種した。ＣＹ３２２の場
合、細胞をＳＯＢ培地に接種した。培養物を２３℃、３０℃、３７℃および４２
℃で１６時間増殖させた。ＤＨ１０ＢおよびＳＢ３４９９Ｂ細胞０.３mlを１５/
１０培地６０mlに接種し、培養物を適切な増殖温度、２７５rpmで増殖させ、光
学密度は５５０nmで監視した。ＣＹ３２２細胞０.２mlをＳＯＢ培地２５mlに接
種し、培養物を適切な増殖温度で振盪させた。ＣＹ３２２細胞の光学密度が０.
２５(範囲０.２４〜０.２６２)に到達したら、細胞をＩＥＣ ＨＮ ＳII遠心機に
て４℃、２５００rpmで１０分間遠心して集めた。細胞ペレットを１０mMトリス
ＨＣｌ ｐＨ７.５で１回洗浄し、−２０℃で貯蔵した。脂質を抽出し、実施例１
７に示したようにしてＧＣにより分析した。ＤＨ１０ＢおよびＳＢ３４９９Ｂ細
胞の場合、光学密度を監視し、ＯＤがおよそ０.３(範囲０.２４〜０.３３)に到
達したら、細胞４０mlを遠心して集め、細胞ペレットを冷ＣＣＭＢ８０ ０.３２
mlに再懸濁した。細胞を氷上で２０分間維持させ、２５０μlをＮＵＮＣクリオ
バイアルに入れた。バイアルをドライアイスエタノール浴で凍結させ、安定性研
究用に−２０℃で貯蔵した。細胞１５〜２０mlもまた、遠心し、細胞ペレットを
１０mMトリスＨＣｌ ｐＨ７.５で１回洗浄した。細胞ペレットを−２０℃で貯蔵
し、次いで、実施例１７に示したような脂質分析のために抽出した。
脂質分析の結果は、表５および図２４にみられる。 表５中、Ｃ１４：０はミリスチン酸を表し、Ｃ１６：０はパルミチン酸を表し
、Ｃ１６：１はパルミトール酸を表し、Ｃ１７：０はマルガリ酸を表し、Ｃ１８
：０はステアリン酸を表し、Ｃ１８：１はバクセン酸を表し、Ｃ１９：０はノン
デシル酸を表す。
図２４は、ＳＢ３４９９Ｂの細胞が、ＤＨ１０Ｂの細胞(１７〜２０％)と比較
して高レベルのシスバクセネート(３７〜４２％)を有することを示す。より高レ
ベルのシスバクセネートは、２３℃、３０℃または３７℃のいずれかで増殖させ
たＳＢ３４９９Ｂ細胞中にみられる。しかしながら、ＳＢ３４９９Ｂ細胞を４２
℃で増殖させると、シスバクセネートレベルは、４２℃で増殖させたＤＨＩＯＢ
細胞の場合よりもそれほど高くない。更に、２３℃、３０℃、３７℃または４２
℃で増殖させたＣＹ３２２細胞は、ＤＨ１０Ｂ中にみられたレベルよりも高いシ
スバクセネートレベルを有し、増殖温度によってあまり変化しない。この事実は
、fabF変異を持つ既知のＥ．コリ株表現型(ＣＹ３２２など)、具体的には、増殖
温度に関するシスバクセネートの過剰生産と一致する。
図２５はまた、２３℃、３０℃および３７℃で、不飽和脂質の総レベル(Ｃ１
６：１およびＣ１８：１)がＳＢ３４９９Ｂ細胞ではＤＨ１０Ｂ細胞よりも高い
ことを示している。そのレベルは、ＳＢ３４９９Ｂでは６５％から７１％の範囲
であり、ＤＨ１０Ｂでは４９％から５２％である。一方、これら２種の菌株を４
２℃で増殖させると、不飽和脂質のレベルは、両方の菌株において実質的に同じ
である(ＤＨ１０Ｂでは４１％、ＳＢ３４９９Ｂでは４８％)。これらの結果は、
ＳＢ３４９９Ｂが、せいぜい試験した増殖温度で、ＤＨ１０Ｂ細胞と比べてシス
バクセネートを過剰生産することを示す。結果として、これらの同じ増殖温度で
、リン脂質中の不飽和脂質レベルは、ＤＨ１０ＢよりもＳＢ３４９９Ｂの方が高
い(図２５)。
−２０℃安定性研究の結果は図２６および２７に与える。ＤＨ１０Ｂ細胞は、
−２０℃で貯蔵した場合、かなり不安定であるが、３７℃または４２℃で貯蔵す
ると一層不安定なようである。２３℃または３０℃で増殖させ、−２０℃で貯蔵
させたＤＨＩＯＢ細胞は、−２０℃で１ヶ月後、生存可能細胞のおよそ９０％を
損失するのに対し、３７℃または４２℃で増殖させたＤＨ１０Ｂ細胞は、生存可
能細胞のおよそ９９％を損失する。ＳＢ３４９９Ｂ細胞は、ここでもＤＨ１０Ｂ
細胞と比べて高い生存を示すが、その効果は増殖温度に左右される。２３℃で増
殖させ、−２０℃で１ヶ月貯蔵したＳＢ３４９９Ｂ細胞は、ＤＨ１０Ｂ細胞と比
較して６倍高い生存可能細胞数を有する。しかしながら、ＳＢ３４９９Ｂ細胞の
生存可能細胞数の向上は、ＤＨ１０Ｂ細胞と比べ、増殖温度が上がるにつれ累進
的に低くなる。３７℃または４２℃で増殖させたＳＢ３４９９Ｂ細胞は、ＤＨ１
０Ｂ細胞と同様−２０℃で安定でない。細胞膜中の総不飽和脂肪酸と−２０℃で
の細胞生存との相関関係は、−２０℃での細胞生存を細胞膜の総不飽和脂肪酸含
量に対してプロットすると観察できる。このデータは図２８に示す。データは、
菌株ＳＢ３４９９ＢおよびＤＨ１０Ｂの両方における相関関係を示し、細胞膜の
総不飽和脂肪酸組成の増大は、−２０℃での細胞生存の増強をもたらす。
本発明は、その具体的な実施態様に関連して記載してきたが、更なる修飾が可
能であり、本願が、一般に、本発明の本質に従い、かつ本発明が関連する分野内
の既知または慣用事項に属するような、および上述の実質的な特徴に応用でき、
添付の請求の範囲に従うような本開示からの派生事項を含む本発明のあらゆる変
更、使用または適応を包含することを意図すると理解されるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，
ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ
，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，
ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ
Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ
，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ
(72)発明者 クオ，ジョナサン
アメリカ合衆国20874メリーランド州 ジ
ャーマンタウン、クーパー・リッジ・ロー
ド 13305番
(72)発明者 リン，ジージュ
アメリカ合衆国20854メリーランド州 ポ
トマック、キャンドルライト・コート４番
(72)発明者 マ，ジン
アメリカ合衆国20879メリーランド州 ゲ
イザーズバーグ、ロスト・ナイフ・サーク
ル 18365番、アパートメント203
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．低温貯蔵中の生存能が増強された、または形質転換効率が増強された細菌を 得る方法であって、 ａ．細菌に該細菌の脂肪酸含量を変えるような修飾を施し、 ｂ．低温貯蔵中の生存能が増強されたまたは形質転換効率が増強された修飾細 菌を単離する、 ことを含んでなる方法。 ２．該修飾工程が該細菌を遺伝子的に変えることを含んでなる、請求の範囲第１ 項記載の方法。 ３．該修飾工程が、該細菌の不飽和脂肪酸含量の変化に関与する１種またはそれ 以上の遺伝子を修飾することを含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。 ４．該修飾工程が、該細菌の１種またはそれ以上の不飽和脂肪酸含量を増大する ことを含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。 ５．該修飾工程が、１種またはそれ以上の該不飽和脂肪酸遺伝子の発現を増強す ることを含んでなる、請求の範囲第３項記載の方法。 ６．該発現増強が、該遺伝子のコピー数を増やすことを含んでなる、請求の範囲 第５項記載の方法。 ７．該発現増強が、該遺伝子の転写または翻訳を増大することを含んでなる、請 求の範囲第５項記載の方法。 ８．該細菌がグラム陰性菌である、請求の範囲第１項記載の方法。 ９．該細菌がエシェリヒアである、請求の範囲第８項記載の方法。 １０．該細菌がＥ．コリである、請求の範囲第９項記載の方法。 １１．該脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、パルミトール酸およびシスバクセ ン酸からなる群から選択される不飽和脂肪酸である、請求の範囲第１項記載の方 法。 １２．該不飽和脂肪酸が、シスバクセン酸およびパルミトール酸からなる群から 選択される、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３．該修飾細菌は、細菌膜中の不飽和脂肪酸含量が変えられている、請求の範 囲第１項記載の方法。 １４．該低温が約−２０℃から約４℃の範囲である、請求の範囲第１項記載の方 法。 １５．低温貯蔵中の細菌の生存能を増強する、または細菌の形質転換効率を増強 する方法であって、該細菌の脂肪酸含量を変えることを含んでなる方法。 １６．該修飾工程が遺伝子的に該細菌を変えることを含んでなる、請求の範囲第 １５項記載の方法。 １７．該修飾工程が、該細菌の不飽和脂肪酸含量の変化に関与する１種またはそ れ以上の遺伝子を修飾することを含んでなる、請求の範囲第15項記載の方法。 １８．該修飾工程が、該細菌の１種またはそれ以上の不飽和脂肪酸量を増大する ことを含んでなる、請求の範囲第１５項記載の方法。 １９．該修飾工程が、１種またはそれ以上の該不飽和脂肪酸遺伝子の発現を増強 することを含んでなる、請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０．該発現増強が、１種またはそれ以上の該遺伝子のコピー数を増やすことを 含んでなる、請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１．該発現増強が、１種またはそれ以上の該遺伝子の転写または翻訳を増大す ることを含んでなる、請求の範囲第１９項記載の方法。 ２２．該細菌がグラム陰性菌である、請求の範囲第１５項記載の方法。 ２３．該細菌エシェリヒアである、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．該細菌がＥ．コリである、請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５．該脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、パルミトール酸およびシスバクセ ン酸からなる群から選択される不飽和脂肪酸である、請求の範囲第１５項記載の 方法。 ２６．該不飽和脂肪酸が、シスバクセン酸およびパルミトール酸からなる群から 選択される、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．該修飾細菌は、細菌膜中の不飽和脂肪酸含量が変えられている、請求の範 囲第１５項記載の方法。 ２８．該低温が約−２０℃から約４℃の範囲である、請求の範囲第１５項記載の 方法。 ２９．請求の範囲第１項または第１５項のいずれか１項の方法により生産される 細菌。 ３０．脂肪酸含量が変えられている、貯蔵安定性細菌。 ３１．該細菌が形質転換に対してコンピテントである、請求の範囲第３０項記載 の方法。 ３２．低温貯蔵中の生存能が増強された、または形質転換効率が増強された細菌 であって、脂肪酸含量が変えられている、細菌。 ３３．該細菌は、不飽和脂肪酸含量が増やされている、請求の範囲第３２項記載 の細菌。 ３４．該細菌が遺伝子的に修飾されている、請求の範囲第３２項記載の細菌。 ３５．該細菌が、該細菌の不飽和脂肪酸含量の変化に関与する１種またはそれ以 上の遺伝子を含んでなる、請求の範囲第３２項記載の細菌。 ３６．該不飽和脂肪酸量の増大が、該細菌の不飽和脂肪酸含量の変化に関与する １種またはそれ以上の遺伝子の発現を増強することによって引き起こされる、請 求の範囲第３３項記載の細菌。 ３７．該発現増強が、１種またはそれ以上の該遺伝子のコピー数を増やすことを 含んでなる、請求の範囲第３６項記載の細菌。 ３８．該発現増強が、１種またはそれ以上の該遺伝子の転写または翻訳を増大す ることを含んでなる、請求の範囲第３６項記載の細菌。 ３９．該細菌がグラム陰性菌である、請求の範囲第３２項記載の細菌。 ４０．該細菌がエシェリヒアである、請求の範囲第３９項記載の細菌。 ４１．該細菌がＥ．コリである、請求の範囲第４０項記載の細菌。 ４２．該脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、パルミトール酸およびシスバクセ ン酸からなる群から選択される不飽和脂肪酸である、請求の範囲第３２項記載の 細菌。 ４３．該不飽和脂肪酸が、パルミトール酸およびシスバクセン酸からなる群から 選択される、請求の範囲第４２項記載の細菌。 ４４．該細菌は、細菌膜中の不飽和脂肪酸含量が変えられている、請求の範囲第 ３２項記載の細菌。
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