CN114306576A - 一种防止il-2衍生物蛋白复合体聚集及非共价连接蛋白亚基脱落的制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了一种防止IL‑2衍生物蛋白复合体聚集及非共价连接蛋白亚基脱落的制剂；较高的离子强度会促进这一非共价连接蛋白复合体的解离，这一问题在患者输液的过程中至关重要，因为常用的接近人体体液离子强度的注射液(如0.9％生理盐水)的离子强度较高，足以使白细胞介素‑2蛋白复合体的非共价连接蛋白复合体解离，本发明系统地研究了溶液的pH、缓冲盐类型、表面活性剂及添加剂对蛋白复合体解离、胶体稳定性和聚集的影响，减少了白细胞介素‑2蛋白复合体的解离，同时保证了蛋白不形成聚集体。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种防止IL-2衍生物蛋白复合体聚集及非共价连接蛋白亚基脱落的制剂。
背景技术
治疗性的非共价连接的蛋白复合体由于缺少共价键的交联，在储存和使用过程中容易发生非共价连接蛋白亚基的脱落，脱落之后的蛋白复合体的生物学活性会受到不良影响，所以必须尽量避免这一现象的发生。非共价连接的蛋白复合体依靠多种非共价相互作用连接在一起，包括但不限于疏水相互作用、离子键相互作用、氢键相互作用，各种相互作用受到溶液和制剂的影响不同，很难通过简单的理论推导和分析评估蛋白复合体的非共价相互作用的大小，需要通过系统的实验研究和分析得到针对特定蛋白复合体的最优制剂，平衡各种因素对总体上非共价相互作用的影响。
现有的大部分治疗性蛋白制剂针对的是共价连接的蛋白复合体，例如抗体，这类蛋白不存在非共价连接蛋白亚基脱落的问题，所以制剂开发过程中没有考虑这个问题带来的风险。例如，表面活性剂会降低蛋白亚基之间的疏水相互作用，在生物制剂中广泛用于防止蛋白聚集，但是对蛋白复合体而言，表面活性剂可能使蛋白复合体亚基之间的疏水相互作用降低，从而引起蛋白复合体亚基的解离。又例如，在共价连接的蛋白复合体制剂开发过程中，pH值接近蛋白的等电点会影响蛋白的胶体稳定性，远离等电点通常增加蛋白的带电，减小蛋白的聚集趋势。然而在非共价连接蛋白复合体中，远离等电点通常增加蛋白的带电，有可能增加亚基之间的电荷排斥力，而使得非共价连接蛋白亚基脱落。另外，由于非共价连接蛋白复合体中有多种非共价相互作用，包括但不限于疏水相互作用、离子键相互作用、氢键相互作用，各种相互作用在不同的蛋白复合体中的贡献大小不同，同时，各种相互作用受到溶液和制剂的影响不同。白细胞介素-2衍生物，是一个治疗性的非共价的蛋白复合体(专利申请公布号CN111018961A)。较高的离子强度会促进这一非共价连接蛋白复合体的解离，这一问题在患者输液的过程中至关重要，因为常用的，接近人体体液离子强度的注射液(如0.9％生理盐水)的离子强度较高，足以使IL-2衍生物蛋白复合体的非共价连接蛋白复合体解离，现有的针对共价连接的蛋白复合体开发的制剂均没有针对这一问题的解决方案。普遍使用的制剂和其他不同的非共价连接蛋白复合体使用的制剂难以借鉴，这些因素都限制了治疗性非共价连接蛋白复合体的制剂开发和临床应用。
本发明针对如白细胞介素-2(IL-2)蛋白复合体，系统地研究了溶液的pH、缓冲盐类型、离子强度、表面活性剂及添加剂对蛋白复合体解离、胶体稳定性和聚集的影响。
本申请发现表面活性剂的加入，是防止IL-2衍生物蛋白复合体非共价连接蛋白亚基脱落的关键，可以保护该蛋白复合体在接近人体体液的离子强度下仍然以复合体的形式存在，为其临床应用创造了条件。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种防止非供价连接的蛋白复合体聚集及非共价连接蛋白亚基脱落的制剂，特别是IL-2衍生物蛋白复合体。
为实现上述目的，本发明首先公开了该防止非供价连接的蛋白复合体聚集及非共价连接蛋白亚基脱落的制剂的组成，具体包括1-100mM缓冲剂，2-12％(w/v)渗透压调节剂,0.01-0.1％(w/v)表面活性剂,pH.5-7.5；
优选地，所述的缓冲剂为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述的渗透压调节剂为蔗糖；
优选地，所述的表面活性剂为聚山梨酯80；
优选地，所述的非共价连接的蛋白复合体为白细胞介素-2衍生物。
其次，本申请还公开了一种防止白细胞介素-2衍生物蛋白复合体聚集及非共价连接蛋白亚基脱落的制剂，所述的制剂包括20mM磷酸盐缓冲液，8％(w/v)蔗糖,0.02％(w/v)聚山梨酯80,pH 6.5；
优选地，所述的白细胞介素-2衍生物序列如申请号201911302355.5中所述。
另外，本申请还公开了上述制剂在制备抗肿瘤、抗炎药物中的应用。
有益效果：
1)本发明找到了合适的表面活性剂，使得即使在极低(≤0.00014％w/v％)的表面活性剂浓度下，IL-2衍生物蛋白复合体在较高的离子强度下和人体血液的离子强度下，较低的浓度下，仍然不会发生非共价连接蛋白亚基脱落。
2)本发明创造性的通过调控pH值范围，防止了IL-2衍生物蛋白复合体发生解离和聚集。
3)本发明通过调整表面活性剂和添加剂的种类和比例，防止了IL-2衍生物蛋白复合体发生聚集。
附图说明
附图1为IL-2衍生物在0.9％氯化钠注射液中，40℃加速实验的尺寸排阻色谱。
附图2为IL-2衍生物在含有0.00014％w/v％吐温80的0.9％氯化钠注射液中，25℃室温24小时的尺寸排阻色谱。
附图3为不同pH值下不含吐温，含有吐温20或吐温80对LTC004蛋白复合体解离的影响结果图。
附图4为IL-2衍生物的尺寸排阻色谱图。
附图5为不同pH值下，IL-2衍生物的尺寸排阻色谱图单体及聚集体百分比图。
附图6为不同表面活性剂下，IL-2衍生物的尺寸排阻色谱图单体及聚集体百分比。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1
在较高离子强度下，IL-2衍生物蛋白复合体容易发生解离。
尺寸排阻色谱：使用SuperdexTM 200 Increase 10/300GL色谱柱(P/N:28990944)；液相系统为Agilent Technologies 1260 Infinity；液相工作站为Waters的网络版Empower3；通过尺寸排阻色谱对解离产物进行分析；流速为0.5mL/min，柱温为25℃，检测UV为215nm，流动相为：1xPBS,pH 7.4；运行时间为60分钟。
流动相1xPBS配制方法：10×PBS母液配制：精确称量2.7g KH2PO4,35.8gNa2HPO4,80g NaCl,2g KCl,纯化水溶解并定容至1L,用0.22um滤膜过滤；1×PBS流动相配制：移取100mL 10×PBS母液,加纯水定容至1000mL,混匀脱气。
0.9％(w/v)的氯化钠溶液配制方法：精确称取0.9g NaCl，加入纯水完全溶解，并定容至100mL，再用0.22um滤膜过滤。
治疗性蛋白药物用药时经常使用0.9％的氯化钠注射液进行稀释进行静脉给药，而0.9％的氯化钠的离子强度较高，对于IL-2衍生物蛋白复合体而言，较高的离子强度会减弱非共价相互作用中的离子相互作用强度。故需要考察IL-2衍生物复合体在0.9％的氯化钠注射液中的解离情况。如图1所示，将IL-2衍生物复合体稀释到0.9％的氯化钠注射液，使蛋白复合体终浓度为0.02mg/mL,40℃加速实验3天之内可以观察到IL-2衍生物解离产物逐渐增加，即使是新鲜制备的数据，已经可以观察到部分解离，对于蛋白药品的注射使用造成了稳定性的问题，可能会在药品的配置和输液过程中出现蛋白效价的变化。
实施例2
在较高离子强度下，IL-2衍生物蛋白复合体活性会明显降低。
MO7E和NK92细胞活性实验：MO7E和NK92细胞株于37℃,5％CO2条件下培养于完全培养基。收获处于对数生长期的细胞，使用PBS洗涤细胞两次，洗掉细胞因子，然后用不含细胞因子的培养基重悬细胞，采用血小板计数器进行细胞计数，用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上，使用不含细胞因子的培养基调整细胞密度，随后接种于96孔细胞培养板，每孔接种90μL，共5000个细胞，将96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2条件下培养，待用，配制10倍药物浓度，使得最后工作浓度为：1)MO7E细胞最高浓度为200nM，3.16倍稀释比例，稀释9个浓度，每个药物浓度设置三个复孔；2)NK92细胞最高浓度为20nM，5倍稀释比例，稀释9个浓度，每个药物浓度设置三个复孔。然后转移连续稀释样品各10μL至96孔细胞板的相应实验孔中。将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2条件下继续培养72小时，之后进行CTG分析。融化CTG试剂并平衡细胞板至室温30分钟。每孔加入等体积的CTG溶液。在定轨摇床上振动5分钟使细胞裂解。将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号。读取冷光值，收集数据。
使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值。
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养基对照)/(Lum溶剂对照-Lum培养基对照)×100％.
由实施例1可知，IL-2衍生物蛋白复合体在0.9％的氯化钠注射液中会发生解离，这一解离过程对药物效价的影响直接影响药物的制剂开发和药物使用。IL-2衍生物蛋白复合体会与白细胞介素2的β和γ受体结合，促进MO7E和NK92细胞的生长，从而发挥对肿瘤细胞的免疫抑制(专利申请公布号CN111018961A)。通过MO7E和NK92细胞的活性实验可以研究IL-2衍生物蛋白复合体在0.9％的氯化钠中效价的变化。MO7E和NK92细胞的EC50可以反应IL-2衍生物蛋白复合体的生物学活性，该值越高，生物学活性越低。IL-2衍生物在0.9％的氯化钠加速实验，40℃存放5天的情况下，可以发现该蛋白复合体的EC50明显增加，说明活性发生了明显降低，药物效价明显下降。与实施例1结合，0.9％的氯化钠中IL-2衍生物复合体会发生解离，且生物学活性会明显下降。故制剂开发过程中应尽量避免IL-2衍生物复合体的解离。
表1 IL-2衍生物在0.9％的氯化钠加速实验细胞活性结果
实施例3
极低浓度的吐温80仍然可以保护IL-2衍生物蛋白复合体免于解离
超高压尺寸排阻色谱：使用AdvanceBio SEC 200A 1.9um 4.6x150mm色谱柱(P/N:PL1580-3201)，液相系统为Waters Acquity UPLC H-CLASS PLUS。液相工作站为Waters的网络版Empower3，通过超高压尺寸排阻色谱对主峰及解离产物进行分析。流速为0.35mL/min，柱温为25℃，检测UV为280nm，流动相为：2xPBS,pH 7.0；运行时间为10分钟。
流动相2xPBS，pH7.0溶液配制方法：10×PBS母液配制：精确称量2.7g KH2PO4,35.8g Na2HPO4,80g NaCl,2g KCl,纯化水溶解并定容至1L,用0.22um滤膜过滤。2×PBS,pH7.0流动相配制：移取200mL 10×PBS母液,加纯水定容至900mL,调pH至7.0，用水定容至1L,混匀脱气。
0.9％(w/v)的氯化钠溶液配制方法：精确称取0.9g NaCl，加入纯水完全溶解，并定容至100mL，再用0.22um滤膜过滤。
如实施例1中所述，在较高离子强度下，IL-2衍生物蛋白复合体会发生解离。如实施例2中所述，IL-2衍生物蛋白复合体解离后会使效价明显降低，故应避免蛋白复合体的解离。通过将含有0.04％吐温80的IL-2衍生物蛋白复合体，用0.9％氯化钠注射液稀释，到10μg/mL浓度，同时，使得吐温80的终浓度低至0.00014％w/v％。这一实验条件模拟了将含有吐温80的药品溶解在0.9％氯化钠注射液中进行静脉滴注的药品使用条件。如图2，在25℃室温24小时内均未观察到明显的解离产物的产生，说明即使极低浓度的吐温80仍可以保护IL-2衍生物蛋白复合体，使其免于解离。虽然理论上，低浓度的蛋白复合体更容易发生解离，而且表面活性剂可能减少蛋白非共价相互作用中的疏水相互作用。但是，本申请意料之外的发现，本实施例证明吐温80实际上对IL-2衍生物非共价蛋白复合体起到了保护作用，综合结果是是蛋白复合体免于解离，从而为在高离子强度和接近人体体液的离子强度中，该蛋白复合体的临床应用创造了必要条件。
实施例4
不同pH值下吐温20及吐温80对IL-2衍生物蛋白复合体解离的保护作用。
不同pH值处理样品尺寸排阻色谱，此方法中使用SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL色谱柱(P/N:28990944)，液相系统为Agilent Technologies 1260 Infinity。液相工作站为Waters的网络版Empower3，通过尺寸排阻色谱对解离产物进行分析。流速为0.5mL/min，柱温为室温25℃，检测UV为280nm，流动相为：1xPBS,pH 7.4；运行时间为60分钟。
流动相1xPBS配制方法：10×PBS母液配制：精确称量2.7g KH2PO4,35.8gNa2HPO4,80g NaCl,2g KCl,纯化水溶解并定容至1L,用0.22um滤膜过滤。1×PBS流动相配制：移取100mL 10×PBS母液,加纯水定容至1000mL,混匀脱气。0.9％(w/v)的氯化钠溶液配制方法：精确称取0.9g NaCl，加入纯水完全溶解，并定容至100mL，再用0.22um滤膜过滤。
pH4.5,0.1M柠檬酸溶液配制方法：称取1.92g柠檬酸，加入纯水完全溶解，并定容至90mL,调节pH至4.5，加入纯水定容至100mL，再用0.22um滤膜过滤。
pH5.5,1M醋酸钠溶液配制方法：称取4.1g醋酸钠，加入纯水完全溶解，并定容至40mL,调节pH至5.5，加入纯水定容至50mL，再用0.22um滤膜过滤。
pH6.5,0.2M PB溶液配制方法：配制0.2M NaH2PO4溶液：称取12g NaH2PO4，加入纯水完全溶解，并定容至500mL，用0.22um滤膜过滤
配制0.2M Na2HPO4溶液：称取14.2g Na2HPO4，加入纯水完全溶解，并定容至500mL，用0.22um滤膜过滤，分别量取34.25mL 0.2M NaH2PO4溶液，和15.75mL 0.2MNa2HPO4溶液；混匀后，即为50mL pH6.5,0.2M PB溶液。
pH7.5,0.1M Tris溶液配制方法：称取0.61g Tris，加入纯水完全溶解，并定容至40mL,调节pH至7.5，加入纯水定容至50mL，再用0.22um滤膜过滤。
pH4.5,0.9％(w/v)的氯化钠溶液配制：分别量取28.5mL 0.9％NaCl溶液，和1.5mLpH4.5,0.1M柠檬酸溶液；混匀后，即为30mL pH4.5,0.9％NaCl溶液。
pH5.5,0.9％(w/v)的氯化钠溶液配制：分别量取29.85mL 0.9％NaCl溶液，和0.15mL pH5.5,1M醋酸钠溶液；混匀后，即为30mL pH5.5,0.9％NaCl溶液。
pH6.5,0.9％(w/v)的氯化钠溶液配制：分别量取29.25mL 0.9％NaCl溶液，和0.75mL pH6.5,0.2M PB溶液；混匀后，即为30mL pH6.5,0.9％NaCl溶液。
pH7.5,0.9％(w/v)的氯化钠溶液配制：分别量取28.5mL 0.9％NaCl溶液，和1.5mLpH7.5,0.1M Tris溶液；混匀后，即为30mL pH7.5,0.9％NaCl溶液。
实验中，取0.5mg/mL溶解于20mM PB,pH 6.5溶液中的IL-2衍生物,分为三份，每份500μL，分别加入水，吐温20,吐温80得到不含有吐温，含有0.4w/v％吐温20和0.4w/v％吐温80的三种样品。每种样品取100μL,稀释于900μL上述不同pH值的0.9％NaCl缓冲溶液中，使得吐温终浓度为0.04w/v％,在25℃和40℃下保存24小时，然后使用尺寸排阻色谱进行解离程度分析。
在pH值4.5，5.5，6.5，7.5下，0.9％的氯化钠注射液中，IL-2衍生物蛋白复合体在室温(25℃)和加速实验(40℃)条件下均会观察到IL-2衍生物蛋白复合体发生不同程度的解离。总体上，加速实验(40℃)条件下解离会更明显，在稀释之前的样品中加入吐温20或者吐温80，之后再稀释到0.04％w/v％吐温的条件下，通过SEC可以观察不同pH条件下吐温对IL-2衍生物蛋白复合体解离的保护情况。在pH 4.5的条件下(图3A)，在室温(25℃)条件下，不含吐温，含有吐温20和吐温80，均观察到明显的IL-2衍生物蛋白复合体的解离，在加速实验(40℃)条件下，含有吐温20和吐温80时，IL-2衍生物蛋白复合体的解离比不含有吐温的更严重，说明在pH 4.5的条件下，吐温加速了IL-2衍生物蛋白复合体的解离，在pH 5.5，6.5和7.5的条件下(图3B-D)，在室温(25℃)条件下，不含吐温时IL-2衍生物蛋白复合体均发生解离，而含有吐温20和吐温80时均未观察到明显的解离；在加速实验(40℃)条件下，不含吐温时IL-2衍生物蛋白复合体解离更加明显，而含有吐温20和吐温80时均未观察到明显的解离，该结果充分说明，在pH 5.5到7.5的范围之内,吐温均可以保护IL-2衍生物蛋白复合体不发生解离。
实施例5
系统筛选pH及缓冲溶液对IL-2衍生物蛋白复合体稳定性及聚集的影响。
外观：将样品瓶擦拭干净，在暗室中置于澄明度检测仪下，调节光照度为2000-3750Lux，置样品于遮光板边缘处(25cm)手持供试品西林瓶颈部，分别在黑色和白色背景下用目检视颜色、澄明度、可见异物等。
蛋白浓度：样品混合均匀后用移液枪吸取2.5μL样品，采用NanoDrop 2000检测样品在280nm波长的浓度。消光系数为1.130AU*mL*mg-1*cm-1。重复测定两次取其均值为最终结果。
尺寸排阻色谱：若样品浓度高于5.0mg/mL,用超纯水稀释至5.0mg/mL，若样品浓度低于或等于5.0mg/mL则无需稀释，SEC-UPLC检测采用ACQUITY UPLC@Protein BEH SECColumn,200A，1.7μm,4.6mm×150mm/Waters色谱柱，使用超高效液相色谱仪UPLC(WatersH-Class Bio Core System)，设置柱温为25±3℃，流动相是50mM PB，300mM NaCl，pH 6.8±0.1，进样量为5μg，在0.4mL/min的流速下，等度洗脱8min，214nm波长下进行检测，采用峰面积归一化法计算得到单体的含量。
差示扫描量热：当样品浓度＞2mg/mL用相应的缓冲液将样品稀释至浓度为1mg/mL，当样品浓度在0.5-2mg/mL则无需稀释。将400μL对应的2对缓冲液加入96孔板，接下的一对孔的左侧孔加400μL缓冲液，右侧孔加400μL的样品。差示扫描量热仪(MalvernSYS12907)实验参数设置：扫描开始温度为10℃，扫描结束温度为95℃，升温速率为200℃/h。使用软件进行数据分析。
动态光散射：将样品在12000rpm离心5min，然后取20μL样品加入到384孔样品盘中，并在样品上加入10μL石蜡油，再将384孔样品盘2000rpm离心5min去除气泡。将384孔样品盘放置在动态光散射仪(WYATT Dynaproplate Reader Ⅱ)上，设定升温程序，扫描时间为3秒，扫描3次，运行程序，数据使用仪器软件DYNAMICS分析。
pH值测量：将pH计(METTLER TOLEDO S400)用3种标准液(pH分别为4.01，7.00，9.21)校准，要求校准斜率在95.0％—105.0％之间，分装100μL样品测定pH值。
在加热的加压条件下，通过使用外观观察、蛋白浓度测定、尺寸排阻色谱(SEC)、差示扫描量热法(DSC)，动态光散射法(DLS)等研究不同的pH及缓冲盐对IL-2衍生物蛋白复合体稳定性、聚集及解离的影响。
实验中测试的pH及缓冲溶液组成如下表
表2测试的pH及缓冲溶液组成
表3 DSC测定不同pH值下蛋白熔解温度
熔解起始温度和熔解温度显示了蛋白结构的稳定性，该温度越高说明蛋白结构约稳定。如表3所示，IL-2衍生物蛋白复合体有两个熔解温度，在不同的pH和缓冲盐体系中，熔解起始温度、熔解温度1和熔解温度2的变化趋势一致，表现为同步上升或同步下降。以熔解起始温度为例，在pH 4.5-6.5的区间内，熔解起始温度随pH升高而升高，在pH 6.5-8.5的区间内，熔解起始温度随pH升高而降低。由数据可见，该蛋白的结构稳定性受pH值得影响，在pH 6.5附近的稳定性较好。
表4 DLS测定不同pH值下蛋白聚集温度
蛋白聚集温度显示了蛋白的胶体稳定性，该温度越高，说明蛋白的胶体稳定性越高。如表4所示，在pH 4.5-6.5范围内，同一类型缓冲盐中，IL-2衍生物蛋白复合的蛋白聚集温度随pH升高而升高。在20mM磷酸盐以及20mM柠檬酸盐/精氨酸缓冲体系中，蛋白聚集温度高于实验测定的温度范围，显示出良好的胶体稳定性。由数据可见，该蛋白的胶体稳定性受pH值得影响，在pH 6.5及以上，稳定性较好。
表5外观及蛋白浓度在加速稳定性实验中的变化
续表5
续表5
其中，C(无色),CL(透明),SO(轻微乳白色),PF(无可见颗粒),PO(有可见颗粒,++观察到多于5个可见颗粒)。蛋白外观和浓度显示了蛋白的聚集和吸附情况，显示出轻微乳白色及观察到可见颗粒证明蛋白发生了明显的聚集，蛋白浓度发生明显下降反应出蛋白发生明显聚集或发生明显吸附。加速实验在40℃下放置4周，并在0，1，2，4周取样进行检测，可以模拟蛋白在较高温度下的表现，对蛋白的长期稳定性有重要参考意义。该蛋白复合体在pH 4.5到pH 6.5，4周的稳定性实验中观察到了乳光的生成，在部分条件下甚至观察到可见颗粒的生产。均显示该蛋白复合体在pH 6.0及以下容易发生聚集。在pH 6.5及以上，均未观察到乳光和可见颗粒的生成，说明在pH 6.5及以上该蛋白的长期稳定性较好。
尺寸排阻色谱(SEC)可以反映出IL-2衍生物蛋白复合体的聚集和解离的情况。在不同的pH值下和缓冲盐中，在40℃下放置4周，可以观察到蛋白复合体的聚集体和解离产物的产生(图4)。通过对SEC中蛋白复合体的单体以及聚集体比例的定量分析(图5)，可以观察到pH值对蛋白稳定性的影响趋势。由数据可见，在pH在5.0及以下时，40℃下放置4周，该蛋白复合体容易形成聚集体。在pH 5.5及以上，单体的比例大部分情况下均在90％以上，同时，聚集体的比例较低。说明该蛋白符合在pH 5.0及以下的胶体稳定性差，容易形成聚集体。在pH 5.5及以上，聚集体的形成不明显。
实施例6
系统筛选表面活性剂及添加剂对IL-2衍生物蛋白复合体稳定性及聚集的影响。
外观：将样品瓶擦拭干净，在暗室中置于澄明度检测仪下，调节光照度为2000-3750Lux，置样品于遮光板边缘处(25cm)手持供试品西林瓶颈部，分别在黑色和白色背景下用目检视颜色、澄明度、可见异物等。
蛋白浓度：样品混合均匀后用移液枪吸取2.5μL样品，采用NanoDrop 2000检测样品在280nm波长的浓度。消光系数为1.130AU*mL*mg-1*cm-1。重复测定两次取其均值为最终结果。
尺寸排阻色谱：若样品浓度高于5.0mg/mL,用超纯水稀释至5.0mg/mL，若样品浓度低于或等于5.0mg/mL则无需稀释，SEC-UPLC检测采用ACQUITY UPLC@Protein BEH SECColumn,200A，1.7μm,4.6mm×150mm/Waters色谱柱，使用超高效液相色谱仪UPLC(WatersH-Class Bio Core System)，设置柱温为25±3℃，流动相是50mM PB，300mM NaCl，pH 6.8±0.1，进样量为5μg，在0.4mL/min的流速下，等度洗脱8min，214nm波长下进行检测，采用峰面积归一化法计算得到单体的含量。
差示扫描量热：当样品浓度＞2mg/mL用相应的缓冲液将样品稀释至浓度为1mg/mL，当样品浓度在0.5-2mg/mL则无需稀释。将400μL对应的2对缓冲液加入96孔板，接下的一对孔的左侧孔加400μL缓冲液，右侧孔加400μL的样品。差示扫描量热仪(MalvernSYS12907)实验参数设置：扫描开始温度为10℃，扫描结束温度为95℃，升温速率为200℃/h。使用软件进行数据分析。
动态光散射：将样品在12000rpm离心5min，然后取20μL样品加入到384孔样品盘中，并在样品上加入10μL石蜡油，再将384孔样品盘2000rpm离心5min去除气泡。将384孔样品盘放置在动态光散射仪(WYATT Dynaproplate Reader Ⅱ)上，设定升温程序，扫描时间为3秒，扫描3次，运行程序。数据使用仪器软件DYNAMICS分析。
pH值测量：将pH计(METTLER TOLEDO S400)用3种标准液(pH分别为4.01，7.00，9.21)校准，要求校准斜率在95.0％—105.0％之间。分装100μL样品测定pH值。
从实施例5中选择了蛋白较稳定的两个pH及缓冲溶液体系，进一步加入不同的表面活性剂及添加剂进行进一步的制剂研究。通过使用外观观察、蛋白浓度测定、尺寸排阻色谱(SEC)、差示扫描量热法(DSC)，动态光散射法(DLS)等研究不同的表面活性剂及添加剂对IL-2衍生物蛋白复合体稳定性、聚集及解离的影响实验中测试的表面活性剂及添加剂组成如表6所示。
表6 DLS测定不同表面活性剂中蛋白聚集温度
蛋白聚集温度显示了蛋白的胶体稳定性。如表6所示，筛选了各种不同浓度的多种表面活性剂的，通过蛋白聚集温度判断蛋白的胶体稳定性。由数据可见，在吐温20、吐温80、泊洛沙姆188中，该蛋白的胶体稳定性均较好。
表7 DSC测定不同表面活性剂中蛋白聚集温度
熔解起始温度和熔解温度显示了蛋白结构的稳定性，如表7所示，在泊洛沙姆188中，随着表面活性剂浓度的提高，熔解起始温度逐渐降低，说明泊洛沙姆188会破坏IL-2衍生物蛋白复合体的结构稳定性。在各个浓度的吐温20和吐温80中均未观察到熔解起始温度和熔解温度1的明显变化，且均与未添加表面活性剂的对照样品接近，说明吐温20和吐温80不会破坏该蛋白复合体的结构稳定性。
表8测试的pH值、缓冲盐、表面活性剂及添加剂组成
表9 DSC测定不同添加剂组成下蛋白熔解温度
熔解起始温度和熔解温度显示了蛋白结构的稳定性，如表9所示，在不同的pH、缓冲盐、表面活性剂和添加剂体系中(表8)，熔解起始温度、熔解温度1和熔解温度2的变化趋势一致，表现为同步上升或同步下降。以熔解起始温度为例，对比F1与F6、F2与F7、F3与F8、F4与F9、F5与F10，20mM磷酸盐pH 6.5相对20mM组氨酸盐pH 5.5表现出更高的熔解起始温度，即更高的蛋白结构的稳定性。以熔解起始温度为例，对比F1与F2、F6与F7，在0.02％w/v％吐温80存在的情况下，8％w/v％蔗糖与8.8％w/v％二水合海藻糖对蛋白熔解起始温度影响不大，蛋白结构的稳定性相似。以熔解起始温度为例，对比F1与F3、F6与F8，在0.02％w/v％吐温80存在的情况下，8％w/v％蔗糖比140mM精氨酸盐酸盐，蛋白熔解起始温度更高，即蛋白结构的稳定性更高。以熔解起始温度为例，对比F1与F4、F6与F9，在0.02％w/v％吐温80与0.04％w/v％吐温80对蛋白熔解起始温度影响不大，蛋白结构的稳定性相似。以熔解起始温度为例，对比F4与F5、F9与F10，在0.04％w/v％吐温80与0.04％w/v％吐温20对蛋白熔解起始温度影响不大，蛋白结构的稳定性相似。
表10外观在加速及室温稳定性实验中的变化
| 序号 | 新鲜配置 | 40℃-2周(w) | 25℃-2周(w) |
| F1 | C,CL,PF | C,SO,PO++ | C,CL,PF |
| F2 | C,CL,PF | C,SO,PO++ | C,CL,PF |
| F3 | C,CL,PF | C,SO,PF | C,CL,PF |
| F4 | C,CL,PF | C,SO,PO++ | C,CL,PF |
| F5 | C,CL,PF | C,SO,PO++ | C,CL,PF |
| F6 | C,CL,PF | C,CL,PF | C,CL,PF |
| F7 | C,CL,PF | C,CL,PF | C,CL,PF |
| F8 | C,CL,PF | C,CL,PF | C,CL,PF |
| F9 | C,CL,PF | C,CL,PF | C,CL,PF |
| F10 | C,CL,PF | C,CL,PF | C,CL,PF |
其中，C(无色),CL(透明),SO(轻微乳白色),PF(无可见颗粒),PO(有可见颗粒,++观察到多于5个可见颗粒)。
表11浓度在加速及室温稳定性实验中的变化
| 序号 | 新鲜配置 | 40℃-2周(w) | 25℃-2周(w) |
| F1 | 1.0 | 1.1 | 1.0 |
| F2 | 1.0 | 1.1 | 1.0 |
| F3 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| F4 | 1.0 | 1.1 | 1.0 |
| F5 | 1.0 | 1.1 | 1.0 |
| F6 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| F7 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| F8 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| F9 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| F10 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
蛋白外观(表10)和浓度(表11)显示了蛋白的聚集和吸附情况。加速实验在40℃下放置2周，室温稳定性实验在25℃下放置2周。在pH 5.5时，即使使用了表面活性剂和添加剂，加速稳定性实验中仍然可以观察到了乳光的生成，在部分条件下甚至观察到可见颗粒的生成。均显示该蛋白复合体在pH 5.5下容易发生聚集。加入表面活性剂及添加剂未能有效避免。在pH 6.5下，使用了各种表面活性剂和添加剂的组合，均未观察到乳光和可见颗粒的生成，说明在pH 6.5时该蛋白的长期稳定性较好。
尺寸排阻色谱(SEC)可以反映出IL-2衍生物蛋白复合体的聚集和解离的情况。如图6，在不同的表面活性剂和添加剂组合中，在40℃下放置2周和25℃下放置2周，在pH 5.5的缓冲体系下，产生的聚集体比pH 6.5的缓冲体系中明显更多。尤其在F3组合中，140mM精氨酸盐酸盐使得蛋白聚集的趋势更加明显。相反地，F8组合中，pH 6.5的缓冲体系中，140mM精氨酸盐酸盐并未对蛋白的聚集体产生和单体比例造成明显影响。说明该蛋白复合体在pH5.5下的胶体稳定性差，容易形成聚集体，即使使用表面活性剂和添加剂，仍然比pH 6.5的条件下要差。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种防止非共价连接的蛋白复合体聚集及非共价连接蛋白亚基脱落的制剂，其特征在于，所述的制剂包括1-100mM缓冲剂，2-12％(w/v)渗透压调节剂,0.01-0.1％(w/v)表面活性剂,pH.5-7.5。
2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的缓冲剂为磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的渗透压调节剂为蔗糖。
4.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的表面活性剂为聚山梨酯80。
5.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的非共价连接的蛋白复合体为白细胞介素-2衍生物。
6.一种防止白细胞介素-2衍生物蛋白复合体聚集及非共价连接蛋白亚基脱落的制剂，其特征在于，所述的制剂包括20mM磷酸盐缓冲液，8％(w/v)蔗糖,0.02％(w/v)聚山梨酯80,pH 6.5。
7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述的白细胞介素-2衍生物序列如申请号201911302355.5中所述。
8.如权利要求1所述的制剂在制备抗肿瘤、抗炎药物中的应用。
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