CN1319986C - 固相合成多肽的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
固相合成多肽的分离纯化方法，其特征在于：利用固相多肽合成方法合成多肽，将得到的粗肽加入纯水，温度保持在20～40℃，用超声波振荡10～30分钟进行溶解；如有不溶物，以1∶1加入N，N′－二甲基甲酰胺(DMF)帮助溶解。溶解后，用0.22μm的膜过滤，得到澄清溶液。得到短肽的粗肽溶液，再进行离子交换色谱分离模块与低压有机色谱分离模块的分离纯化，即离子交换柱和低压有机色谱柱，醋酸盐缓冲系统和醋酸/乙醇缓冲系统，进行色谱柱的平衡、进样、吸附、洗脱等工艺，获得高纯度的多肽产品，实现化学合成多肽从小试至中试的规模化制备。
Description
技术领域
本发明涉及固相合成多肽的分离纯化方法，属于生物制品加工领域。
背景技术
随着人类基因组计划的完成和功能蛋白质组学研究的开展，标志着人类进入了一个全新时代---后基因时代。这些研究发现了多种多样生物活性蛋白质与多肽，具有促进免疫系统、抗菌、抗血脂等药用作用价值。随之而来的是多肽药物的飞速发展，Datamonitor公司的研究报告表明，多肽蛋白类药物的年增长率达到19％，显示其已成为医药领域的一大热点。
多肽作为药物是因为分子量小，易人工合成，具有成本低，特异性强，副作用低，无免疫原性，比较安全可靠等优点。另外人工合成多肽纯度高，不存在热原问题。
人工合成多肽主要以固相合成为主，特点是合成步骤简单化，同时能够得到高纯度肽类产物。同时，固相合成也存在一些缺点，合成的多肽是一种纯度低的粗产品，必须经过纯化才能得到高纯度产品。一直以来，分离纯化问题是化学合成多肽中的最大障碍，其主要原因：
1、因为在合成多肽过程中各种副反应、消旋化问题等造成的副反应肽；
2、在脱保护过程中，由于保护基的残留，肽键的断裂、烷基化等造成的杂质。
杂质的分子结构与目标多肽很相似，二者或存在某一个位置氨基酸残基的差异，或细微的差别只在某一氨基酸残基侧链上某一基团存在与否等等。由于杂质与目标多肽在分子结构和化学性质上如此相似，就给多肽的分离纯化带来了困难。
化学合成多肽的常用分离方法有三种：凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱。凝胶过滤色谱的优点在于介质不带电荷，不与目标分子发生作用，分离条件温和，工作分子量范围广；它的缺点是对结构相似，分子量接近的无法加以分离，因此凝胶过滤色谱多用于初分离和脱盐操作。离子交换色谱有着分辨率高、分离容量大、易于放大等特点，其缺陷在于只能将电荷有差异的多肽加以分离，对于无电荷差异的类似物无法区分。反相高效液相色谱(RP-HPLC)正好解决这一问题。RP-HPLC是根据多肽及其类似物的亲疏水性差别，将它们分离开来；但其有自身无法克服的先天缺陷：不易规模化，分离成本过高。主要原因是由于反相填料担载量低，载体要求高，而且本身造价大。因此，规模放大时，配套设备要求精度高、体积大、投资大。现在世界主要化学合成多肽公司，如：Bachem公司、Novabiochem公司、American Peptide公司等，其最主要制备分离纯化方法就是反相高效液相色谱。国内化学合成多肽的分离介质主要依赖进口，每年都需花费大量外汇用于购买此类分离介质。同时，与之配套的设备需要高精度、耐高压等标准，这些构成了化学合成多肽成本居高不下的重要原因之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种固相合成多肽的分离纯化方法，建立多肽分离模块化技术，即以凝胶离子交换色谱完成离子交换分离，首先根据目标多肽与杂质的电荷不同加以分离纯化，再以低压有机填料替代反相色谱，实现其分离介质的低成本，又降低对设备的高压要求，实现高效率低成本分离多肽，经过模块化分离后，多肽的收率可以达到90％以上。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
其中所涉及原材料比例除特殊说明外，均为质量比例。
固相合成多肽的分离纯化方法：
①利用固相多肽合成(SPPS)方法合成粗肽，将得到的粗肽以不同比例(以能溶解为止)加入纯水，温度保持在20～40℃，用超声波振荡10～30分钟进行溶解；如有不溶物，以1∶1(m/v)加入N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)帮助溶解。溶解后，膜过滤得到澄清溶液，得到短肽的粗肽溶液，再先后进行离子交换色谱分离模块与低压有机色谱分离模块的分离纯化；
②离子交换色谱分离模块，分离纯化条件：
离子交换柱：离子交换色谱填料为二乙胺乙基凝胶填料(DEAE)、季铵乙基凝胶填料(QAE)、磺酸基凝胶填料(SA)、磺丙基凝胶填料(SP)或羧甲基凝胶填料(CM)，粒径50～150μm；
流动相：A：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液pH＝3～7；
B：0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液pH＝3～7；
流速：5～10毫升/分；
梯度：经20～60分钟流动相由0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液pH＝3～7到0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液pH＝3～7；
③离子交换色谱的操作步骤：
I色谱柱平衡：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液pH＝3～7，平衡至基线稳定为止；
II进样；
III吸附：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液pH＝3～7，待样品穿透后至基线平稳；
IV洗脱：0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液pH＝3～7，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；
V清洗与再生：2摩尔/升氯化钠进行清洗，至基线平稳；1摩尔/升氢氧化钠再生离子交换柱；最后纯水洗至中性。
④将所得到的各组分，经质谱分析，判定目标产物所在组分，然后将目标产物组分进行低压有机色谱分离纯；
⑤低压有机色谱分离模块，分离纯化条件：
有机色谱柱：有机色谱填料为MKF-RP系列的有机反相色谱填料或MKF-PHEMH系列、MKF-ETHMH系列的有机疏水色谱填料，粒径5～20μm；
流动相：A：0.2～2％醋酸溶液；
B：0.2～2％醋酸/乙醇溶液；
流速：10～60毫升/分；
梯度：经20～60分钟流动相由0.2～2％醋酸溶液到0.2～2％醋酸/乙醇溶液；
⑥低压有机色谱的操作步骤：
I色谱柱平衡：0.2～2％醋酸溶液，平衡至基线稳定为止；
II进样；
III洗脱：流动相由0.2～2％醋酸溶液到0.2～2％醋酸/乙醇溶液，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；
IV清洗：5％乙腈/水溶液进行清洗，至基线平稳；
V保存色谱柱：100％乙腈保存色谱柱。
⑦将各收集组分，质谱分析目标产物，然后冷冻干燥，得到多肽成品。
本发明相比现有技术具有如下的优点：
1、易于工艺放大，可以从小试至中试的线性放大制备；
2、采用低压有机填料，避免使用常规反相C18填料，成本大副度降低；
3、实现分离手段的低成本，分离回收率达到90％以上，；
4、使用乙醇作为有机溶剂，避免乙腈、甲醇等有机毒性溶性，进一步降低纯化成本；
5、本发明采用的色谱分离纯化技术，无相变发生，无热源导入，不改变溶液pH值和离子强度，保证了产品的高纯度；
6、整个工艺无三废产生，属于绿色环保工艺，其产品是安全可靠的。
具体实施方式
通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此声明的是以下实施例只用于对本发明进行进一步的描述，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，以作他用。
实施例1
固相合成胸腺五肽的分离纯化
①利用固相技术合成胸腺五肽粗肽，将得到的粗肽以1∶5的比例加入纯水，温度保持在25℃，用超声波振荡15分钟进行溶解；溶解后，用0.22μm的膜过滤，得到澄清溶液。得到短肽的粗肽溶液；
②离子交换色谱分离模块，分离纯化条件：
离子交换柱：磺丙基凝胶填料(SP)，粒径90μm；
流动相：A：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)；
B：0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)；
流速：5～10毫升/分；
梯度：经20～60分钟流动相由0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)到0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)；
检测：220nm
③离子交换色谱的操作步骤：
I色谱柱平衡：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)，平衡至基线稳定为止；
II进样；
III吸附：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)，待样品穿透后至基线平稳；
IV洗脱：0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；
V清洗与再生：2摩尔/升氯化钠进行清洗，至基线平稳；1摩尔/升氢氧化钠再生离子交换柱；最后纯水洗至中性。
④将所得到的各组分，经质谱分析，判定目标产物所在组分，然后将目标产物组分进行低压有机色谱分离纯；
⑤低压有机色谱分离模块，分离纯化条件：
有机色谱柱：MKF-RP系列的有机反相色谱填料，粒径10μm；
流动相：A：0.2～2％醋酸溶液；
B：0.2～2％醋酸/乙醇溶液；
流速：10～60毫升/分；
梯度：经20～60分钟流动相由0.2～2％醋酸溶液到0.2～2％醋酸/乙醇溶液；
检测：220nm
⑥低压有机色谱的操作步骤：
I色谱柱平衡：0.2～2％醋酸溶液，平衡至基线稳定为止；
II进样；
III洗脱：流动相由0.2～2％醋酸溶液到0.2～2％醋酸/乙醇溶液，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；
IV清洗：5％乙腈/水溶液进行清洗，至基线平稳；
V保存色谱柱：100％乙腈保存色谱柱。
⑦将各收集组分，质谱分析目标产物，然后冷冻干燥，得到胸腺五肽成品，其纯度达到99％。
实施例2
固相合成胸腺素α1的分离纯化
①利用固相技术合成胸腺素α1粗肽，将得到的粗肽以1∶10的比例加入纯水(18.2MΩ)，温度保持在30℃，用超声波振荡25分钟进行溶解；以1∶1(m/v)加入N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)帮助溶解，溶解后，用0.22μm的膜过滤，得到澄清溶液。得到短肽的粗肽溶液；
②离子交换色谱分离模块，分离纯化条件：
离子交换柱：二乙胺乙基凝胶填料(DEAE)，粒径120μm；
流动相：A：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)；
B：0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)；
流速：5～10毫升/分；
梯度：经20～60分钟流动相由0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)到0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)；
检测：220nm
③离子交换色谱的操作步骤：
I色谱柱平衡：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)，平衡至基线稳定为止；
II进样；
III吸附：0.1～0.8摩尔/升醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)，待样品穿透后至基线平稳；
IV洗脱：0.1～1.0摩尔/升氯化钠/醋酸盐缓冲液(pH＝3～7)，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；
V清洗与再生：2摩尔/升氯化钠进行清洗，至基线平稳；1摩尔/升氢氧化钠再生离子交换柱；最后纯水洗至中性。
④将所得到的各组分，经质谱分析，判定目标产物所在组分，然后将目标产物组分进行低压有机色谱分离纯；
⑤低压有机色谱分离模块，分离纯化条件：
有机色谱柱：MKF-PHEMH系列、MKF-ETHMH系列的有机疏水色谱填料，粒径10μm；
流动相：A：0.2～2％醋酸溶液；
B：0.2～2％醋酸/乙醇溶液；
流速：10～60毫升/分；
梯度：经20～60分钟流动相由0.2～2％醋酸溶液到0.2～2％醋酸/乙醇溶液；
检测：220nm
⑥低压有机色谱的操作步骤：
I色谱柱平衡：0.2～2％醋酸溶液，平衡至基线稳定为止；
II进样；
III洗脱：流动相由0.2～2％醋酸溶液到0.2～2％醋酸/乙醇溶液，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；
IV清洗：5％乙腈/水溶液进行清洗，至基线平稳；
V保存色谱柱：100％乙腈保存色谱柱。
⑦将各收集组分，质谱分析目标产物，然后冷冻干燥，得到胸腺素α1成品，其纯度达到97％。
Claims (4)
1、一种固相合成多肽的分离纯化方法，其特征在于：
①利用固相多肽合成方法合成多肽，将得到的粗肽加入纯水，温度保持在20～40℃，用超声波振荡10～30分钟进行溶解；溶解后，膜过滤得到澄清溶液，得到短肽的粗肽溶液，再先后进行离子交换色谱分离模块与低压有机色谱分离模块的分离纯化；
②离子交换色谱分离模块，采用粒径为50～150μm离子交换色谱填料；流动相为醋酸盐缓冲液与氯化钠/醋酸盐缓冲液体系，其中，A：0.1～0.8摩尔/升 醋酸盐缓冲液pH＝3～7；B：0.1～1.0摩尔/升 氯化钠/醋酸盐缓冲液pH＝3～7；梯度：经20～60分钟流动相由0.1～0.8摩尔/升 醋酸盐缓冲液pH＝3～7到0.1～1.0摩尔/升 氯化钠/醋酸盐缓冲液pH＝3～7；流速5～10毫升/分；
③低压有机色谱分离模块，采用粒径为5～20μm有机色谱填料；流动相为醋酸溶液与醋酸/乙醇溶液体系，其中，A：0.2～2％醋酸溶液；B：0.2～2％醋酸/乙醇溶液；梯度：经20～60分钟流动相由0.2～2％醋酸溶液到0.2～2％醋酸/乙醇溶液；流速为10～60毫升/分；
④将各收集组分，质谱分析目标产物，然后冷冻干燥，得到多肽成品。
2、根据权利要求1所述的固相合成多肽的分离纯化方法，其特征在于以1∶1(m/v)加入N，N’-二甲基甲酰胺帮助溶解粗肽。
3、根据权利要求1所述的固相合成多肽的分离纯化方法，其特征在于所述的离子交换色谱填料为二乙胺乙基凝胶填料、季胺乙基凝胶填料、磺酸基凝胶填料、磺丙基凝胶填料或羧甲基凝胶填料。
4、根据权利要求1所述的固相合成多肽的分离纯化方法，其特征在于所述的低压有机色谱填料为MKF-RP系列的有机反相色谱填料或MKF-PHEMH系列、MKF-ETHMH系列的有机疏水色谱填料。
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| a cost effective concentration of lisinopril purified byliquidchromatography using reverse osmosis Rzen,Janez et al,CAN 139:185516 2004;应用液相色谱法分离纯化固相化学合成胸腺素α1 甘一如等，化工学报，第55卷第3期 2004 * |
| 应用液相色谱法分离纯化固相化学合成胸腺素α1 甘一如等，化工学报，第55卷第3期 2004 * |
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