CN116731152A - 猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用 - Google Patents

猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用，本发明根据已公布的猫源fIFNω2蛋白的氨基酸序列，经过序列设计，筛选出如SEQ ID NO.1所示的重组蛋白，经过鉴定本申请所提出的SUMO融合标签表达纯化的fIFNω2重组蛋白具有优秀的特异性和较高的体外抗病毒活性，同时其在大肠杆菌中的表达量较高。提出的编码基因能够实现在大肠杆菌中高效表达，并提高重组蛋白的制备效率。利用上述制备表达方法可获得纯度较高、活性较好的重组蛋白，制备方法具有工艺简单、成本低廉、蛋白纯度高、易于放大生产的特点，利于工业生产和大规模的推广应用。

Description

猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用
技术领域
本发明涉及兽药技术领域，特别涉及一种猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用。
背景技术
干扰素(interferon，IFN)是由机体免疫细胞产生的一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性的糖蛋白。根据干扰素的来源、生物学性质及活性，将干扰素分Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素主要起抗病毒和抗肿瘤作用，包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ和IFN-ζ等，Ⅱ型干扰素仅有IFN-γ亚型，由抗原刺激细胞产生后在抗胞内病原体的宿主防御中起关键作用。
1992年，日本东丽株式会社的Nakamura等首次分离到了猫干扰素基因，将其归类为ω型干扰素，有研究表明IFN-ω对于猫白血病毒(FLV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)共感染的猫以及细小病毒具有明显治疗效果，基于文献报道，猫ω干扰素共有13个亚型，其中活性较高的亚型是2和9。
IFN-ω和IFN-α的蛋白序列具有类似的结构特征，以IFN-ω2(NM_001102440.1)为例，1-23位氨基酸为信号肽序列，成熟蛋白的首位氨基酸为半胱氨酸(Cysteine)。而大肠杆菌表达体系，均以甲硫氨酸(Met)起始，为了获得活性序列和活性更接近天然蛋白的干扰素，必须以融合表达的方式进行。世界上首个获批的猫ω干扰素(IFN-ω)VIRBAGEN OMEGA(生产公司相关信息)是以杆状病毒/家蚕表达体系表达并广泛用于犬和猫的细小病毒等的感染的辅助治疗。
近年来随着宠物行业的发展，猫作为传统伴侣动物，其健康越来越受关注，猫瘟、猫鼻支及猫杯状等疾病作为传染性疾病的预防和治疗主要依赖于疫苗的治疗。而现有技术中的猫ω干扰素存在着表达量不高、活性低等缺陷，且猫ω干扰素的外源表达主要包括在大肠杆菌表达系统中的表达，但现有技术中的这种表达方式存在着产量小、制备效率低下等缺陷，难以实现工业化生产。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本申请提出了一种猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用。
发明采用的技术方案是：提出了一种猫ω干扰素，其氨基酸序列SEQ ID NO.1所示。
本发明根据Unipro(www.uniprot.org)公布的猫源fIFNω2蛋白的氨基酸序列(Unipro编号：NM_001102440.1)，经过序列设计，筛选出如SEQ ID NO.1所示的重组蛋白(SUMO-fIFNω2重组蛋白)，经过鉴定本申请所提出的SUMO-fIFNω2重组蛋白具有优秀的特异性，本发明提供的fIFNω2重组蛋白具有较高的体外抗病毒活性，同时其在大肠杆菌中的表达量较高。
一种猫ω干扰素基因，其特征在于，编码如权利要求1所述的猫ω干扰素，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的SUMO-fIFNω2重组蛋白的编码基因能够实现在大肠杆菌中高效表达，并提高重组蛋白的制备效率。
一种包含所述的猫ω干扰素基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料是表达盒、载体或宿主细胞。
在一个较好的实施例中，载体为大肠杆菌表达载体，所述载体的制作方法如下：用NcoI及XhoI对大肠杆菌表达载体进行双酶切，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的猫ω干扰素的编码基因插入到表达载体，得到猫ω干扰素的载体。
一种表达猫ω干扰素的方法，包括步骤：(1)用权利要求4或5所述的载体转化大肠杆菌细胞，得到重组表达菌株；(2)重组表达菌株进行发酵，诱导猫ω干扰素的表达；以及(3)发酵结束后，回收并纯化所表达的猫ω干扰素。
猫ω干扰素的回收工艺包括：收集大肠杆菌菌体，经破碎收集包涵体，按照包涵体:变性缓冲液＝1:10(m:v)的比例溶解，得到变性样品溶液，按照变性缓冲液：复性缓冲液＝1:10(v:v)的比例再将变性样品溶液加入复性缓冲液得到复性样品溶液；所述变性缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl，5-8.5M的Urea，5-50mM的DTT，且所述变性缓冲液的pH为8.0-9.5；所述复性缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl，0.5-2.5M的Urea，1-10mM的GSH及1-10mM的GSSG，且所述复性缓冲液的pH为8.0-9.5。
所述猫ω干扰素的纯化工艺包括：
步骤1、对复性样品溶液采用金属离子螯合亲和纯化并获得可溶和正确折叠蛋白；
步骤2、将步骤1中获得的蛋白进行酶切消化；
步骤3、将步骤2中得到的蛋白采用包括金属离子螯合纯化穿透、阴离子交换层析、凝胶层析中的至少一种方式进行纯化，得到猫ω干扰素。
所述步骤2中酶切方式为以下任意一种：
方法一，工具酶为肠激酶，酶切缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl、50-250mM的NaCl、1-10mM的CaCl2，pH为7.0-9.0，酶切比例为肠激酶:蛋白＝1:500-1:2000(m:m)，4℃酶切10-20小时；
方法二，工具酶为SUMO酶，酶切缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl、1-4M的Urea，pH为7.0-9.0，酶切比例为SUMO酶:蛋白＝1:100-1:500(m:m)，4℃酶切10-20小时。
利用上述fIFNω2重组蛋白的制备方法可获得纯度较高、活性较好的fIFNω2重组蛋白，制备方法具有工艺简单、成本低廉、蛋白纯度高、易于放大生产的特点，利于工业生产和大规模的推广应用。
猫ω干扰素在制备猫FPV病毒的抗感染药物中的应用。
如上述的应用，所述猫ω干扰素保存于稳定剂中，所述稳定剂包括：5-50mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，2-20mg/ml甲硫氨酸，2-10％的甘露醇，0.1-2mg/ml的Tween-80；所述稳定剂的pH为6.0-7.0。
本申请提出的猫ω干扰素可在上述稳定剂中进行长期稳定的保存，使得由fIFNω2重组蛋白制备的猫FPV病毒的抗感染药物具备较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中SUMO-fIFNω2，TRX-fIFNω2,TRX-fIFNω9和SUMO-fIFNω9重组蛋白表达验证结果示意图，其中，BI表示诱导前全菌，AI表示诱导后全菌，Sup表示诱导后破碎上清，IBs表示诱导后破碎沉淀；Marker为10-180kDa的蛋白质分子量标准。
图2为本发明实施例中SUMO-fIFNω2包涵体变复性的电泳验证图，其中，NR表示复性样品的非还原电泳，R表示复性样品的还原电泳；Marker为10-180kDa的蛋白质分子量标准。
图3为本发明实施例中SUMO-fIFNω2亲和层析色谱图和电泳图，其中，色谱图左纵坐标为在280nm处的紫外吸光值(mAu)，右纵坐标为洗脱缓冲液占比(％)，横坐标为体积(ml)；电泳图中FT表示流穿样品，A1-B2表示洗脱缓冲液不同占比条件下的洗脱样品；Marker为10-180kDa的蛋白质分子量标准。
图4为本发明实施例中SUMO-fIFNω2脱盐酶切后，酶切样品亲和穿透层析色谱图和电泳图，其中，色谱图左纵坐标为在280nm处的紫外吸光值(mAu)，右纵坐标为洗脱缓冲液占比(％)，横坐标为体积(ml)。色谱图显示的流穿峰为fIFNω2蛋白，洗脱峰为未完全酶切的SUMO-fIFNω2蛋白及SUMO标签；电泳图中FT表示流穿样品(fIFNω2蛋白)，A1-A3表示洗脱样品(未完全酶切的SUMO-f IFNω2蛋白及SUMO标签)；Marker为10-180kDa的蛋白质分子量标准。
图5为本发明实施例中f IFNω2亲和穿透样品的阴离子交换层析色谱图和电泳图，其中，色谱图左纵坐标为在280nm处的紫外吸光值(mAu)，右纵坐标为洗脱缓冲液占比(％)，横坐标为体积(ml)；电泳图中为成品fIFNω2样品；Marker为10-180kDa的蛋白质分子量标准。
图6为本发明实施例中fIFNω2重组蛋白最终产品的质谱鉴定结果图。
图7为本发明实施例中fIFNω2重组蛋白的制剂稳定性研究性研究数据1示意图。
图8为本发明实施例中fIFNω2重组蛋白的制剂稳定性研究性研究数据2示意图。
图9为TRX-fIFNω2酶切后亲和纯化的电泳图，其中，FT表示流穿样品，A1-A3表示洗脱样品；Marker为10-180kDa的蛋白质分子量标准。
图10为TRX-f IFNω9变复性和酶切后亲和纯化的电泳图，其中，FT表示流穿样品，A1-A3表示洗脱样品；Marker为10-180kDa的蛋白质分子量标准。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。所述试剂和生物材料如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：猫ω干扰素的分子构建与表达鉴定
1、基于目前活性较高的猫ω干扰素亚型2(IFNω2)和9(I FNω9)，通过优化其氨基酸序列，制备了多种重组蛋白用于体外抗病毒活性的检测和验证；其中，本申请基于Unipro(www.un iprot.org)公布的猫源fIFNω2蛋白的氨基酸序列(Unipro编号：NM_001102440.1)及fIFNω9蛋白的氨基酸序列(Unipro编号：NM_001089307.1)，通过分别对fIFNω2蛋白和fIFNω9蛋白进行序列设计，序列设计包括在如fIFNω2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)及fIFNω9蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的N端添加蛋白标签和/或酶切位点进行融合表达等，并对得到的蛋白进行表达量的检测，这里筛选出表达量较高的四种蛋白序列。
分别为：
SUMO-fIFNω2蛋白序列(SEQ ID NO.3),TRX-fIFNω2蛋白序列(SEQ ID NO.5)，SUMO-fIFNω9蛋白序列(SEQ ID NO.7)以及TRX-fIFNω9蛋白序列(SEQ ID NO.9)。
并通过化学合成法合成上述四种蛋白的编码基因序列，SUMO-fIFNω2为SEQ IDNO.4，TRX-fIFNω2为SEQ ID NO.6，SUMO-fIFNω9为SEQ ID NO.8，TRX-fIFNω9为SEQ IDNO.10。
在一个具体的实施例中，采用NcoI及XhoI对大肠杆菌表达载体进行双酶切，分别将上述四种蛋白的编码基因序列插入到大肠杆菌表达载体，从而获得重组表达载体，其中：将SUMO-fIFNω2和SUMO-fIFNω9的编码基因序列分别插入到pET-SUMO表达载体(大肠杆菌表达载体的一种)，从而获得表达SUMO-fIFNω2和SUMO-fIFNω9重组蛋白的重组表达载体；将TRX-fIFNω2和TRX-fIFNω9的编码基因序列分别插入到pET-32a表达载体(大肠杆菌表达载体的一种)，从而获得能够表达TRX-fIFNω2和TRX-fIFNω9的蛋白的重组表达载体。分别将上述重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，分别获得四种蛋白对应的重组表达菌株。
2、重组菌株的表达鉴定
将四种重组表达菌株分别接种到3ml的LB液体培养基(胰蛋白胨10％，酵母浸出粉5％，氯化钠10％，含有50μg/mlKan抗生素)中进行菌种活化，在37℃、220转/分钟的条件下培养至OD600nm值达到0.6-0.8时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，分别置于20℃和37℃继续培养6小时，以诱导表达蛋白。
培养结束后，在4℃、4000转/分钟的条件下离心30分钟，收集菌体。按照“菌体沉淀:PBS缓冲液＝1:10(m:v)”的比例进行重悬，通过超声破碎仪(SCIENTZ-ⅡD，80W，6min)进行破碎。破碎结束之后，在4℃、4000转/分钟的条件下离心30分钟，进行SDS-PAGE检测。基于电泳检测结果，选择有目的蛋白表达的菌株，用于后续的蛋白纯化。
参阅图1，可知根据SDS-PAGE检测，SUMO-fIFNω2为可溶、包涵体同时表达(1-1)，TRX-fIFNω2为可溶表达(1-2),TRX-fIFNω9为包涵体表达(1-3)和SUMO-fIFNω9为包涵体表达(1-4)。
实施例2：根据包涵体制备蛋白
以下主要以SUMO-fIFNω2为例，制备SUMO-fIFNω重组蛋白进行说明
1、SUMO-fIFNω2重组菌株摇瓶发酵
将SUMO-fIFNω2重组表达菌株接种到10ml的LB液体培养基(胰蛋白胨10％，酵母浸出粉5％，氯化钠10％，含有50μg/mlKan抗生素)中进行菌种活化，在37℃、220转/分钟条件下培养至OD600nm值为1.5-2.0时，按照1％接种量，将菌液转接至1L的2YT+G液体培养基中(胰蛋白胨16％，酵母浸出粉10％，氯化钠5％，葡萄糖2％，含有50μg/mlKan抗生素)，在37℃、220转/分钟的条件下培养。当OD600nm值达到0.6-0.8时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，将SUMO-fIFNω2置于20℃继续培养6小时，以诱导表达蛋白。
培养结束后，在4℃、4000转/分钟条件下离心30分钟，收集菌体。按照“菌体沉淀:PBS＝1:10(m:v)”的比例进行重悬，通过超声破碎仪进行破碎(SCIENTZ-ⅡD，300W，开3秒，关5秒，工作30分钟)。破碎结束之后，在4℃、7500转/分钟条件下离心30分钟，分别收集SUMO-fIFNω2的上清及包涵体。
将粗包涵体按照“粗包涵体：包涵体洗涤缓冲液＝1:10(m:v)”的比例进行重悬(包涵体洗涤液为PBS，2M的Urea，pH为7.4)，用组织分散机混合均匀，在4℃、7500转/分钟条件下离心30分钟，获得菌体的包涵体。
2、SUMO-fIFNω2包涵体的变复性
按照“包涵体:变性缓冲液＝1:10(m:v)”，将SUMO-fIFNω2包涵体重悬于变性缓冲液(变性缓冲液优选为20mM的Tris-HCl，8M的Urea(尿素)，20mM的DTT，pH为8.5)，室温搅拌溶解3小时，7500转/分钟离心30min收集上清，得到变性样品溶液。按照“变性缓冲液：复性缓冲液＝1:10(v:v)”，将变性样品溶液加入复性缓冲液(复性缓冲液优选为20mM的Tris-HCl，2M的Urea，3mM的GSH(还原型谷胱甘肽)，1mM的GSSG(氧化型谷胱甘肽)，pH为8.5)，4℃搅拌16小时，得到复性样品溶液。采用Cytiva公司的Sephadex G-25Fine层析柱(HiPrep26/10预装柱，柱体积53ml)在蛋白纯化仪(AKTA EXPLORER 100，下同)，将复性样品脱盐至包涵体洗涤缓冲液，并进行SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示，非还原及还原电泳均有目的蛋白条带，蛋白复性结果较好，可继续进行后续纯化。
3、SUMO-fIFNω2重组蛋白的纯化
SUMO-fIFNω2复性液经过亲和粗纯化、脱盐酶切、亲和穿透及离子交换精纯后得到纯化的SUMO-fIFNω2重组蛋白溶液。
具体纯化工艺路线为以下步骤：
步骤1、对复性样品溶液采用金属离子螯合亲和纯化并获得可溶和正确折叠蛋白；具体方式为亲和层析粗纯：亲和层析填料为Cytiva公司的Ni FF层析柱(BXK 16/20自装柱，柱体积26ml)，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl，pH为7.5，洗脱缓冲液为20mM的Tris-HCl，0.5M咪唑，pH为7.5。层析柱用平衡缓冲液平衡后，将复性样品溶液用平衡缓冲液用纯化水稀释两倍，用0.22μm滤器过滤后上样，先使用平衡缓冲液洗涤5个柱体积，再用洗脱缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，得到纯化的SUMO-fIFNω2重组蛋白，并进行SDS-PAGE检测，检测结果如图3所示，可收集含SUMO-fIFNω2目的条带的A8-B2洗脱组分，进行步骤2。
步骤2、将步骤1中获得的蛋白进行酶切消化；具体方式为脱盐酶切：采用Cytiva公司的Sephadex G-25Fine层析柱(HiPrep 26/10预装柱，柱体积53ml)，将亲和纯化样品脱盐至酶切缓冲液中，酶切缓冲液为20mM的Tris-HCl，2M的Urea，pH为8.0。采用紫外分光光度计在紫外A280nm波长下检测脱盐样品浓度(CARRY 3500UV-Vis，蛋白的消光系数为0.5)，按照SUMO酶:蛋白的酶切比例为1:200(m:m)，4℃酶切16小时。
步骤2中酶切方式为以下任意一种：
方法一，工具酶为肠激酶，酶切缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl、50-250mM的NaCl、1-10mM的CaCl2，pH为7.0-9.0，酶切比例为肠激酶:蛋白＝1:500-1:2000(m:m)，4℃酶切10-20小时；
方法二，工具酶为SUMO酶，酶切缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl、1-4M的Urea，pH为7.0-9.0，酶切比例为SUMO酶:蛋白＝1:100-1:500(m:m)，4℃酶切10-20小时。
步骤3、将步骤2中得到的蛋白采用包括金属离子螯合纯化穿透、阴离子交换层析、凝胶层析中的至少一种方式进行纯化，得到重组蛋白。
在一个具体实施例中，步骤3采用以下方式：
1)酶切样品亲和穿透：亲和层析填料为为Cytiva公司的Ni FF层析柱(BXK 16/20自装柱，柱体积26ml)平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl，pH为7.5。洗脱缓冲液为20mM的Tris-HCl，0.5M的咪唑，pH为7.5。待层析柱用平衡缓冲液平衡后，将酶切后的样品上样，用平衡缓冲液洗涤3个柱体积，收集流穿峰即为fIFNω2重组蛋白，再用洗脱缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，并进行SDS-PAGE检测，检测结果如图4所示，SUMO酶可将SUMO-fIFNω2酶切，通过亲和层析纯化，得到的流穿组分为fIFNω2蛋白，洗脱样品A1-A3为未完全酶切的SUMO-fIFNω2及SUMO标签。
2)离子交换层析精纯：离子交换层析填料为Cytiva公司的Q Sepharose FF层析柱(BXK 16/20自装柱，柱体20ml)。平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl，pH为8.5，洗脱缓冲液为20mM的Tris-HCl，1M的NaCl，pH为8.5。待层析柱用平衡缓冲液平衡后，将亲和流穿峰样品上样，用平衡缓冲液洗涤3个柱体积，再采用平衡缓冲液洗涤至紫外平衡。最后用洗脱缓冲液线性洗脱，根据色谱结果收集洗脱峰，并进行SDS-PAGE检测(图5)。通过阴离子交换层析得到精纯的fIFNω2重组蛋白，采用A280nm吸收法进行蛋白质定量(CARRY 3500UV-Vis，蛋白的消光系数为0.78)，将纯化的fIFNω2溶液置于4℃保存。经过一系列变复性及纯化，每克包涵体最终可得到16.4mg的fIFNω2成品蛋白，其中SUMO酶酶切部分蛋白损失率较高，fIFNω2纯化回收率如表1所示。
表1、SUMO-fIFNω2纯化回收率
实施例3：fIFNω2重组蛋白体外抗病毒活性检测与质谱鉴定
1、fIFNω2重组蛋白体外抗病毒活性检测
通过对fIFNω2重组蛋白进行体外抗病毒活性检测，确定该干扰素对于猫FPV病毒具有中和活性，可用于预防或治疗猫FPV病毒感染。具体体外病毒中和实验参数简要介绍如下。
将F81细胞(猫肾细胞，由金宇保灵生物药品有限公司保存)用胰酶消化分散后，加入含8％-10％新生牛血清的DMEM制备成1:3-1:4比例传代的细胞悬液。将细胞悬液分装在96孔细胞培养板中(150μl/孔)，置于37±0.5℃，5％CO2培养箱中培养24h。待细胞长满单层后，去掉生长液。用维持液(DMEM，8％新生牛血清)清洗两次。每孔加入100μl连续倍比稀释的fIFNω2重组蛋白(浓度为0.2mg/ml，稀释至212)，37±0.5℃，5％CO2培养箱中孵育24h。孵育完成后去除干扰素稀释液并用维持液清洗两次。
干扰素滴度测定：每孔加入100μl含100TCID50的FPV病毒，加100μl维持液(DMEM，8％新生牛血清)。同时设干扰素处理对照组，正常细胞对照组及病毒对照组。置于37±0.5℃，5％CO2培养箱中培养96h后，记录出现CPE的细胞孔数，采用Reed-Muench法(参见《中华人民共和国兽药典(2020年版)》三部附录3402)计算fIFNω2的半数保护量，判定其抗病毒活性(TCID50)。
计算公式：lg TCID50＝高于或等于50％的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。能引起细胞感染的病毒最小剂量为猫ω干扰素的病毒效价(IU/0.1ml)。
对比SUMO融合标签表达纯化的两种fIFNω2重组蛋白、IFNω9体外抗FPV病毒活性，并采用标准品IFN-ω作为参照，结果表明fIFNω2活性最高(表2)。
表2不同样品的活性数据汇总表
2、质谱鉴定
将上述纯化获得的fIFNω2重组蛋白进行完整分子量的质谱分析。质谱分析的简要参数介绍如下：高效液相色谱仪(LC-20ADXR,Shimadzu)和高分辨质谱仪(Triple TOF5600,AB Sciex)。液相部分的色谱柱型号为C4柱(5μm，2.1x150mm，Symmetry300，Waters)；流动相：A：含0.1％甲酸的超纯水；B:含0.1％甲酸的色谱乙腈，色谱梯度见表3。
表3色谱梯度
质谱采集参数如下：正离子模式，离子源：GS150，GS250，CUR 30，TEM 500，ISVE5500；Compound：DP-80，CE-10；母离子扫描范围：m/z 700-4500。
检测fIFNω2重组蛋白，通过IntactMass(Protein Metrics)去卷积软件，对样品的质谱数据进行去卷积分析，确定该fIFNω2分子量符合fIFNω2序列的理论分子量(参阅图6)。
实施例4：fIFNω2重组蛋白HPLC检测方法建立及制剂稳定性研究
1、HPLC检测方法建立
安捷伦高效液相色谱仪，色谱柱型号为C18(5μm，50mm×4.6mm)，柱温为60℃，紫外检测波长为280nm。流动相：A:含0.1％三氟乙酸的5％色谱乙腈；B:含0.1％三氟乙酸的95％色谱乙腈，色谱梯度见表4。
表4色谱梯度
对不同含量的fIFNω2重组蛋白标准品进行检测，以蛋白含量(μg)为横坐标，对应标品峰面积为纵坐标，建立fIFNω2标准曲线，标准曲线为y＝47.137x-1.607(R2＝0.9999)。
2、fIFNω2重组蛋白制剂稳定性研究
将制备好fIFNω2重组蛋白以100μg/ml浓度保存于稳定剂中，稳定剂可为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠，10mg/ml甲硫氨酸，2.5％的甘露醇，1mg/ml的Tween-80，pH为6.6。进行-80℃5次冻融，4℃、25℃及37℃一周加速稳定性研究，通过对这四个条件的考察，并进行SDS-PAGE检测(图7)，未发现蛋白降解。并按照实施例4所述方法，对-80℃反复冻融样品及37℃稳定性样品进行体外抗病毒及反相HPLC检测，HPLC检测结果见图8，数据见表5，初步确定fIFNω2蛋白可于4℃保存，同时通过-80℃反复冻融、37℃一周加速稳定性研究及反相HPLC检测，fIFNω2蛋白制剂可至少保存一年。
表5稳定性样品检测结果
由此可见，上述应用于fIFNω2重组蛋白的稳定剂及保存方法可以对SUMOfIFNω2重组蛋白进行长期稳定的保存，使得由SUMO融合标签表达纯化的fIFNω2重组蛋白制备的猫FPV病毒的抗感染药物具备较好的应用前景。
对比例1：SUMO-fIFNω9包涵体制备fIFNω9蛋白
将SUMO-fIFNω9重组表达菌株培养于1L 2YT+G培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6-0.8时加入IPTG诱导SUMO-fIFNω9重组蛋白的表达，诱导条件为：37℃，6小时。培养结束后，4℃、4000转/分钟离心30分钟，收集菌体。破碎菌体并收集SUMO-fIFNω9包涵体。
按实施例2的变复性及纯化工艺，纯化SUMO-fIFNω9复性液，最终得到fIFNω9重组蛋白。SUMO-fIFNω9重组蛋白纯化回收率如表6所示。
表6、SUMO-fIFNω9纯化回收率
基于SUMO-fIFNω2重组蛋白和SUMO-fIFNω9重组蛋白的包涵体变复性纯化工艺的回收率和体外抗病毒活性数据的比较，fIFNω9的纯化回收率低于fIFNω2，同时fIFNω9的抗病毒活性远低于fIFNω2(参阅表7)，因此SUMO-fIFNω9蛋白劣于SUMO-fIFNω2蛋白。
表7、SUMO-fIFNω2及SUMO-fIFNω9蛋白回收率及活性分析
对比例2：TRX-fIFNω2制备TRX-fIFNω2重组蛋白
将TRX-fIFNω2重组表达菌株培养于1L2YT+G培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6-0.8时加入IPTG诱导TRX-fIFNω2重组蛋白的表达，诱导条件为：20℃，6小时。培养结束后，4℃、4000转/分钟离心30分钟，收集菌体。破碎收集得到的TRX-fIFNω2上清溶液，加至2M的Urea后离心过滤。
将实施例2中酶切缓冲液替换为EK酶切缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,2mMCaCl2,pH8.0)，酶切比例替换为EK酶:蛋白＝1:1000(m:m)，其他操作均按照实施例2所述纯化工艺进行纯化。
结果表明，通过SDS-PAGE检测(参阅图9)，TRX-fIFNω2经过EK酶酶切后，产生的目的蛋白的特异性明显劣于SUMO-fIFNω2重组蛋白，且TRX-fIFNω2重组蛋白存在目的蛋白非特异性结合亲和层析填料的情况。
对比例3：TRX-fIFNω9制备TRX-fIFNω9重组蛋白
将TRX-fIFNω9重组表达菌株培养于1L2YT+G培养基中，37℃、220转/分钟培养。当OD600nm值达到0.6-0.8时加入IPTG诱导TRX-fIFNω9表达，诱导条件为：37℃，6小时。培养结束后，4℃、4000转/分钟离心30分钟，破碎菌体并收集TRX-fIFNω9包涵体。
按实施例2的变复性及纯化工艺进行纯化，将实施例2中酶切缓冲液替换为EK酶切缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,2mM CaCl2,pH8.0)，酶切比例替换为EK酶:蛋白＝1:1000(m:m)。
结果表明，通过SDS-PAGE检测(图10)可知，TRX-fIFNω9重组蛋白经过EK酶酶切后，产生的目的蛋白的特异性明显劣于SUMO-fIFNω9重组蛋白，且TRX-fIFNω9重组蛋白存在目的蛋白非特异性结合亲和层析填料的情况。
综上所述，本申请所提出的SUMO-fIFNω2重组蛋白具有优秀的特异性，本发明提供的SUMO-fIFNω2重组蛋白具有较高的体外抗病毒活性，同时其在大肠杆菌中的表达量。同时，本发明提供的SUMO-fIFNω2重组蛋白的编码基因能够实现在大肠杆菌中高效表达，并提高重组蛋白的制备效率。利用本发明提供的SUMO-f IFNω2重组蛋白的制备方法可获得纯度较高、活性较好的fI FNω2重组蛋白，制备方法具有工艺简单、成本低廉、蛋白纯度高、易于放大生产的特点，利于工业生产和大规模的推广应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (11)

1.一种猫ω干扰素，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种猫ω干扰素基因，其特征在于，编码如权利要求1所述的猫ω干扰素。
3.根据权利要求2所述的猫ω干扰素基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种包含如权利要求2或3所述的猫ω干扰素基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料是表达盒、载体或宿主细胞。
5.如权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述载体为大肠杆菌表达载体，所述载体的制作方法如下：用NcoI及XhoI对大肠杆菌表达载体进行双酶切，将氨基酸序列SEQ IDNO.1所示的猫ω干扰素的编码基因插入到表达载体，得到猫ω干扰素的载体。
6.一种表达猫ω干扰素的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)用权利要求4或5所述的载体转化大肠杆菌细胞，得到重组表达菌株；
(2)重组表达菌株进行发酵，诱导猫ω干扰素的表达；以及
(3)发酵结束后，回收并纯化所表达的猫ω干扰素。
7.根据权利要求6所述的表达猫ω干扰素的方法，其特征在于，猫ω干扰素的回收工艺包括：收集大肠杆菌菌体，经破碎收集包涵体，按照包涵体:变性缓冲液＝1:10(m:v)的比例溶解，得到变性样品溶液，按照变性缓冲液：复性缓冲液＝1:10(v:v)的比例再将变性样品溶液加入复性缓冲液得到复性样品溶液；所述变性缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl，5-8.5M的Urea，5-50mM的DTT，且所述变性缓冲液的pH为8.0-9.5；所述复性缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl，0.5-2.5M的Urea，1-10mM的GSH及1-10mM的GSSG，且所述复性缓冲液的pH为8.0-9.5。
8.根据权利要求6或7所述的表达猫ω干扰素的方法，其特征在于，所述猫ω干扰素的纯化工艺包括：
步骤1、对复性样品溶液采用金属离子螯合亲和纯化并获得可溶和正确折叠蛋白；
步骤2、将步骤1中获得的蛋白进行酶切消化；
步骤3、将步骤2中得到的蛋白采用包括金属离子螯合纯化穿透、阴离子交换层析、凝胶层析中的至少一种方式进行纯化，得到猫ω干扰素。
9.根据权利要求8所述的表达猫ω干扰素的方法，其特征在于，所述步骤2中酶切方式为以下任意一种：
方法一，工具酶为肠激酶，酶切缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl、50-250mM的NaCl、1-10mM的CaCl2，pH为7.0-9.0，酶切比例为肠激酶:蛋白＝1:500-1:2000(m:m)，4℃酶切10-20小时；
方法二，工具酶为SUMO酶，酶切缓冲液包括5-50mM的Tris-HCl、1-4M的Urea，pH为7.0-9.0，酶切比例为SUMO酶:蛋白＝1:100-1:500(m:m)，4℃酶切10-20小时。
10.权利要求1所述的猫ω干扰素在制备猫FPV病毒的抗感染药物中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述猫ω干扰素保存于稳定剂中，所述稳定剂包括：5-50mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，2-20mg/ml的甲硫氨酸，2-10％的甘露醇，0.1-2mg/ml的Tween-80；所述稳定剂的pH为6.0-7.0。
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