JP2013524775A - 変性させることなく可溶性組換えインターフェロンタンパク質を産生する方法 - Google Patents
変性させることなく可溶性組換えインターフェロンタンパク質を産生する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013524775A JP2013524775A JP2012556223A JP2012556223A JP2013524775A JP 2013524775 A JP2013524775 A JP 2013524775A JP 2012556223 A JP2012556223 A JP 2012556223A JP 2012556223 A JP2012556223 A JP 2012556223A JP 2013524775 A JP2013524775 A JP 2013524775A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- interferon
- protein
- recombinant
- ifn
- pseudomonas
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【選択図】 図1
Description
この特許明細書の中で言及されている全ての出版物、特許、特許出願は、個々の出版物、特許、特許出願が具体的にかつ個別的に参照することにより組み込まれる件を示すのと同程度に参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態において、バクテリアの成長条件は本明細書に提供されるような抽出方法を用いて得られる可溶性インターフェロンタンパク質の量を増加させるために最適化される。他の抽出条件、例えば当該技術分野で記載され、使用される他の方法と共に、本発明の成長条件を使用することもまた熟考される。
本明細書の中の他の記載箇所で記載されているように、組換えインターフェロン遺伝子の発現を制御するために誘導性プロモーターが発現構築物(expression construct)において使用され得る。例えばtacプロモーターのようなlacプロモーターの誘導体又はファミリーメンバーの場合、エフェクター化合物が、IPTG(イソプロピル−β―D−1−チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクシド」とも呼ばれる)のような非代謝性誘導物質のような誘導物質である。実施形態において、lacプロモーター誘導体は使用され、細胞密度が約80〜約160のOD575により識別される水準に達したとき、さらにインターフェロン発現は、約0.08mM〜約0.4mMの最終濃度までIPTGを加えることにより誘導される。
高水準の可溶性インターフェロンタンパク質は、本発明の非変性の抽出方法を用いて不溶画分から得ることができるということがわかった。
抽出条件のための多くの異なったパラメータは、本明細書中の実施例3に記載されているように、抽出上清の中で観察される可溶性タンパク質の量に対する影響について評価された。他のパラメータが変化したときと同じく、変化する濃度において、抽出条件が多くの異なる界面活性剤のいずれかを含むとき、可溶性インターフェロンタンパク質が観察されたということが分かった。しかしながら、特定のパラメータは、産生された可溶性タンパク質の量に特に顕著な影響を有した。
ヒトインターフェロンは、3つの主要な型に分類されてきた。I型インターフェロン:I型IFNは、IFNAR1とIFNAR2鎖から成るIFN−α受容体(IFNAR)として知られている特定の細胞表面の受容体複合体に結び付く。ヒトI型インターフェロンが含むのは、IFN−α、IFN−β、IFN−κ、IFN−ω、IFN−εである。II型インターフェロン:II型IFN(ヒトIFN−γ)は、IFNGRに結び付く。III型インターフェロン:III型インターフェロンは、IL10R2(CRF2−4とも呼ばれる)とIFNLR1(CRF2−12とも呼ばれる)から成る受容体複合体を介して信号を送る。
本発明の実施形態において、提供されるパラメータ値の範囲内の抽出条件をさらに最適化するために、図4Bにおいて明らかにされた統計分析の結果を使用する。明らかにされた範囲内の任意の値を用いて本発明を実行すると、すべての1型インターフェロンの高水準の可溶性タンパク質産生が観察されると予期される。それにもかかわらず、近い将来にその必要を満たすために抽出条件を最適化するために、図4のBに示されるツールを利用することは当業者の能力内にある。
(タンパク質収量)
本明細書に記載される不溶性および可溶性の画分中のタンパク質収量は、例えば、キャピラリーゲル電気泳動法(CGE)およびウエスタンブロット分析によって、当業者に既知の方法によって測定されることができる。
本発明の方法において有用な宿主細胞のみでなくシュードモナス宿主細胞においても有用な調節配列(例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびリボソーム結合部位)を含む異種のタンパク質を発現するための方法は、米国特許出願公開第2008/0269070号および米国特許出願第12/610,207号,共に、発明の名称“Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expression of Heterologous Proteins”、 米国特許出願公開第2006/0040352号、 “Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluorescens”、および 米国特許出願公開第2006/0110747号、“Process for Improved Protein Expression by Strain Engineering”、(これらは全て、その全体が参照として本明細書に組み込まれる)に記載される。これらの出版物はまた、本発明の方法を実行する際に有用な細菌宿主株を記載し、それらは、折り畳みモジュレーターを過剰発現するように設計されており、または異種のタンパク質発現を増加させるためにプロテアーゼ変異体が導入されている。配列リーダーは、米国特許出願第12/610,207号のみでなく、米国特許出願公開第2008/0193974号,“Bacterial leader sequences for increased expression”、および、米国特許出願公開第2006/0008877号、“Expression systems with Sec−secretion”(両方ともその全体が参照として本明細書に組み込まれる)にも記載される。
本発明に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、または調節プロモーターであり得る。有用な調節プロモーターの一般的な例は、lacプロモーター(すなわちlacZプロモーター)、特に、Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5、およびT7lacプロモーターだけでなく、DeBoerの米国特許第4,551,433号に記載されるtacおよびtrcプロモーターも含む。1つの実施形態において、プロモーターは、宿主の細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターは、E.coli生物体に由来する。
実施形態において、可溶性タンパク質は、産生の間、細胞の細胞質または周辺質のいずれかの中に存在する。タンパク質を標的化するのに役立つ分泌リーダーは、本明細書の至る所、および米国特許出願公開第2008/0193974号、米国特許出願公開第2006/0008877号において、および米国特許出願第12/610,207号に記載され、これらは、上に参照される。
シュードモナスを含む細菌の宿主、および密接に関連する細菌の生物体が本発明の方法を実施する際に使用するために熟考される。特定の実施形態において、シュードモナス宿主細胞は、Pseudomonas fluorescensである。宿主細胞はまた、E.coli細胞であり得る。
シュードモナス・セドレラ(cedrella);シュードモナス・コルガータ(corrugata)(ATCC 29736);シュードモナス・エクストレモリエンタリス(extremorientali);シュードモナス・フルオレッセンス (ATCC 35858);シュードモナス・ゲサルディイ(gessardii);シュードモナス・リバネンシス(libanensis);シュードモナス・マンデリイ(mandelii)(ATCC 700871);シュードモナス・マージナリス(marginalis)(ATCC 10844);シュードモナス・ミグラエ(migulae);シュードモナス・ムシドレンス(mucidolens)(ATCC 4685);シュードモナス・オリエンタリス(orientalis);シュードモナス・ローデシアエ(rhodesiae);シュードモナス・シンクサンタ(synxantha)(ATCC 9890);シュードモナス・トラアシイ(tolaasii)(ATCC 33618);シュードモナス・ベロニイ(veronii)(ATCC 700474);シュードモナス・フレデリクスベルゲンシス(frederiksbergensis);シュードモナス・ゲニクラタ(geniculata)(ATCC 19374);シュードモナス・ギンゲリ(gingeri);シュードモナスシュードモナス・グラミニス(graminis);シュードモナス・グリモンティ(grimontii);シュードモナス・ハロデニトリフィカンス(halodenitrificans);シュードモナス・ハロフィラ(halophila);シュードモナス・ヒビシコラ(hibiscicola)(ATCC 19867);シュードモナス・ヒュッチエンシス(huttiensis)(ATCC 14670);シュードモナス・ヒドロゲノボラ(hydrogenovora);シュードモナス・ジェッセニイ(jessenii)(ATCC 700870);シュードモナス・キロネンシス(kilonensis);シュードモナス・ランセオラタ(lanceolata)(ATCC 14669);シュードモナス・リニ(lini);シュードモナス・マルギナタ(marginata)(ATCC 25417);シュードモナス・メフィチカ(mephitica)(ATCC 33665);シュードモナス・デニトリフィカンス(denitrificans )(ATCC 19244);シュードモナス・ペルツシノゲナ(pertucinogena)(ATCC 190);シュードモナス・ピクトラム(pictorum)(ATCC 23328);シュードモナス・サイクロフィラ(psychrophila);シュードモナス・フィルバ(filva)(ATCC 31418);シュードモナス・モンテイリイ(monteilii)(ATCC 700476);シュードモナス・モッセリイ(mosselii);シュードモナス・オリジハビタンス(oryzihabitans)(ATCC 43272);シュードモナス・プレコグロシシダ(plecoglossicida)(ATCC 700383);シュードモナス・プチダ(putida)(ATCC 12633);シュードモナス・レアクタンス(reactans);シュードモナス・スピノサ(spinosa)(ATCC 14606);シュードモナス・バレアリカ(balearica);シュードモナス・ルテオラ(luteola)(ATCC 43273);シュードモナス・スタッツェリ(stutzeri)(ATCC 17588);シュードモナス・アミグダリ(amygdali)(ATCC 33614);シュードモナス・アベラナエ(avellanae)(ATCC 700331);シュードモナス・カリカパパヤエ(caricapapayae)(ATCC 33615);シュードモナス・シコリー(cichorii)(ATCC 10857);シュードモナス・フィクセレクタエ(ficuserectae)(ATCC 35104);シュードモナス・フソコバギナエ(fuscovaginae);シュードモナス・メリアエ(meliae)(ATCC 33050);シュードモナス・シリンゲ(syringae)(ATCC 19310);シュードモナス・ビリジフラバ(viridiflava)(ATCC 13223);シュードモナス・サーモカルボキシドボランス(thermocarboxydovorans)(ATCC 35961);シュードモナス・サーモトレランス(thermotolerans);シュードモナス・チベルバレンシス(thivervalensis);シュードモナス・バンコウベレンシス(vancouverensis)(ATCC 700688);シュードモナス・ウィスコンシネンシス(wisconsinensis);およびシュードモナス・キアメンシス(xiamenensis)。
細菌の宿主における発現を向上させるためにコドンを最適化する方法は、当該技術分野で知られており、文献に記載されている。例えば、シュードモナス宿主株における発現のためのコドンの最適化は、米国特許出願公開第2007/0292918号、“Codon Optimization Method”に記載され、これは、その全体が参照として本明細書に記載される。
本発明による発現系は、任意の発酵様式(fermentation format)において培養され得る。例えば、バッチ、フェドバッチ、半連続式、又は連続式の発酵モードが本明細書において利用され得る。
特定の実施形態において、無機塩培地が選択される。
下記の実験において、IFN−βC17S発現株を作製し、各々の得られた不溶画分中のIFN−βの量を定量化した。結果として得られたデータに基づくと、特定の株を本発明の非変性の抽出プロセスを最適化する際に、使用するために選択した。
各々のプラスミド(表6)を、下記のように30のP.fluorescens宿主株(表7)に形質転換した。:コンピテント細胞の25マイクロリットルを解凍し、96ウェルの電気穿孔プレート(BTXECM630 Electroporator)に移し、各々のウェルに1μlのミニプレッププラスミドDNAを加えた。細胞を、2.5KV、200オーム、および25μFで電気穿孔した。細胞を微量元素を用いて75μlのHTP−YE培地中に再懸濁し、500μlのM9塩 1%グルコース培地を用いて96ウェルのディープウェルプレートに移し(種培養)、30℃で培養し、48時間の間、300rpmおよび50mm直径のスロー(throw)で振盪した。
可溶画分(溶解液の遠心分離後に得られた上清)及び、不溶画分(溶解液の遠心分離後に得られたペレット)を、OD正規化培養菌を超音波処理することにより調製し、その後遠心分離にかけた。凍結した、正規化された培養物ブロス(400μl)を解凍し、3.5分間超音波処理した。溶解液を20分間(4℃)20,800×gで遠心分離し、可溶画分は、手動の又は自動化されたリキッドハンドリングを用いて除去する。不溶画分を凍結し、その後残りの上清を取り除くために、20,080×gで20分間4℃でもう一度遠心分離するために解凍した。不溶画分を1×リン酸緩衝食塩水(PBS),pH7.4 400μL中に再懸濁した。SDS−CGE分析のための可溶画分及び不溶画分のさらなる希釈を、1×リン酸緩衝食塩水(PBS),pH7.4の中で行った。可溶画分及び不溶画分を、ジチオスレイトール(DTT)の存在下で、SDS毛管ゲル電気泳動(CGE)(Caliper Life Sciences,protein Express LabChip Kit,Part760301)による、分析のために調製した。
IFN−β1bを、Zwittergent3−14界面活性剤を含む抽出条件を用いて、HTP発現培養物からの不溶画分からうまく抽出した。
発酵培養物からの不溶画分を、異なった界面活性剤を含む条件下で抽出した。
同様の方法を用いて、Zwittergentアナログの抽出効率を評価した。その結果を表10に示す。最も高い収量は、Zwittergent3−14に関して観察した。Zwittergent3−12、Zwittergent3−10、Zwittergent3−08もまた、効果的だった。
タンパク質を効率的に可溶性にするために、界面活性剤の濃度は、典型的に、そのCMC値を超える必要がある。Zwittergent 3−14のCMCは、約0.01%w/vである。Zwittergent 3−14の増加する濃度を有するpH7.4でのリン酸ナトリウムバッファーを含む抽出条件を評価した。使用される細胞ペーストを、32℃、pH6.5で株PS530−001を成長させることによって得、100のOD575で0.2mMのIPTGを使用して誘導した。表11の結果は、1%(w/v)の濃度でのZwittergent 3−14の使用が、最も高い抽出収量をもたらしたことを示す。
表11に示されるように、pH7.4でのリン酸ナトリウムバッファー中の1%(w/v)の濃度でZwittergent 3−14を含む抽出条件によって、元来の不溶画分中で検出された21%のIFN−β 1bをもたらした。さらなる最適化を行った。
塩、例えば、NaClはまた、界面活性剤のCMCに影響を与え得る。変更させたZwittergent 3−14濃度を、界面活性剤のCMCとカオトロピック試薬および塩の存在との間で起こり得る相互作用によって評価した。抽出条件中の不溶性の封入固体の濃度も変更させた。以前に使用された20%(w/v)より低い固体の濃度を評価した。
Pseudomonas fluorescensのPfenex Expression Technology(商標)の株PS530−001内の組換えヒト−βインターフェロン(IFN−β 1b)タンパク質の産生は、2リットルの発酵槽においてうまく達成された。複数の発酵条件は、9.2g/LまでのIFN−β 1bの発現を結果としてもたらすと評価された。
Pseudomonas fluorescens株PS530−001の発酵からのブロース(0.2mMのIPTGを使用して100のOD575で誘導した、32℃、pH6.0での1Lの発酵)を遠心分離にかけ、上清を捨てた。細胞ペーストを、20mMのTris、pH8.2で再懸濁し(1:4の比率で)、15,000psiでMicrofluidics Microfluidizer M110Yに通すことによって溶解した。溶解物を遠心分離にかけ、可溶画分を捨てた。不溶画分は、室温で1時間、抽出バッファー(20mMのTris、2MのNaCl、2Mの尿素、1%のZwittergent 3−14、pH8.2)と混合し、遠心分離にかけ、抽出物の上清画分および抽出物のペレット画分を作り出した。IFN−βの抽出収量(抽出物の上清画分中のIFN−β/最初の不溶画分中のIFN−β)は、SDS−CGE分析に基づいて、100%(>99%)に近かった(データは示されず)。
IFN−α2aおよびIFN−α2bコード配列を、ヒトタンパク質に関してコード化するために、P.fluorescensの好ましいコドンを使用して構築した。図8は、合成のIFN−α2a遺伝子のアミノ酸およびDNAの配列を示し、図9は、合成のIFN−α2b遺伝子のアミノ酸およびDNAの配列を示す。
実施例6に記載されるように得られた第1の不溶画分を、本発明の抽出条件を使用して抽出する。結果として生じる第2の可溶画分中のIFN−α2aおよび2bを、CGEおよび生物活性のアッセイによって評価する。
HTP分析によって選択されるIFN−α2aおよび2bを発現する菌株を、本発明の最適化した発酵条件を使用して、例えば、実施例4に記載されるように、2リットルの発酵槽中で成長させる。第1の不溶画分を、本発明の方法を使用して、例えば、実施例4に記載されるように抽出する。第1の不溶性および第2の可溶性の画分中に存在するIFN−α2aおよび2bのタンパク質を、CGEによって評価し、比較する。
実施例8で得られた抽出産物を、IFN−α2aおよび2bの生物活性に関して分析する。
Claims (35)
- 組換え1型インターフェロンタンパク質を産生する方法であって、該方法は、
宿主細胞における発現のために最適化されたコード配列を含む発現構築物を含むPseudomonasまたはE.coliの宿主細胞の培養によって組換えインターフェロンタンパク質を発現する工程と、
宿主細胞を溶解する工程と、
溶解工程からの不溶画分および可溶画分を得る工程と、
それを非変性の抽出条件にさらすことによって不溶画分を抽出する工程と、
不溶画分から抽出ペレットおよび抽出上清を得る工程と、
を含み、抽出上清中の組換えタンパク質は、さらに再生または再折り畳みの工程にさらされずに、可溶形態、活性形態またはその組み合わせで存在することを特徴とする方法。 - 組換え1型インターフェロンタンパク質を抽出する方法であって、前記組換えインターフェロンタンパク質は不溶画分中に存在し、前記不溶画分は、前記組換えインターフェロンタンパク質を発現するPseudomonasまたはE.coliの宿主細胞の溶解後に産生され、該方法は、
不溶画分を非変性の抽出条件にさらす工程と、
不溶画分から抽出ペレットを得る工程と、
を含み、前記抽出ペレットは、前記組換えインターフェロンタンパク質を含み、
ここで、前記抽出ペレット中の前記組換えインターフェロンタンパク質は、再生又は再折り畳みの工程にさらされずに、可溶形態、活性形態、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。 - 組換え1型インターフェロンタンパク質を含む不溶画分を作成する方法であって、前記組換えインターフェロンタンパク質は、lac誘導体プロモーターに操作可能に連結される核酸配列を含む核酸構築物から、PseudomonasまたはE.coliの宿主細胞において発現され、該方法は、
約80〜約160までのOD600まで、約25℃〜約33℃の温度で、かつ約5.7〜約6.5のpHで、宿主細胞を成長させる工程と、
約0.08mM〜約0.4mMのIPTG濃度で宿主細胞を誘導する工程と、
宿主細胞を溶解し、ペレット画分を作成するためにそれを遠心分離機にかける工程と、
を含み、可溶性の、活性な、または可溶性で活性な組換えインターフェロンタンパク質は、その後の再生又は再折り畳みの工程なしに、非変性の抽出条件の下でペレット画分の抽出により得ることができることを特徴とする方法。 - 前記非変性の抽出条件が、穏やかな界面活性剤の存在を含むことを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 前記穏やかな界面活性剤が、両性イオン界面活性剤であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の方法。
- 前記両性イオン界面活性剤が、Zwittergent 3−08、Zwittergent 3−10、Zwittergent 3−12、又はZwittergent 3−14であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の方法。
- 前記非変性の抽出条件が、約0.5%から約2%のZwittergent 3−14を含むことを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。
- 前記非変性の抽出条件が、カオトロピック剤およびコスモトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項1乃至7のいずれかに記載の方法。
- 前記カオトロピック剤が、尿素または塩酸グアニジウムであり、および前記コスモトロピック塩が、NaCl、KClまたは(NH4)2SO4であることを特徴とする請求項1乃至8のいずれかに記載の方法。
- 前記非変性の抽出条件が、約0.5〜約2%のZwittergent 3−14、約0〜約2Mの尿素、約0〜約2MのNaClを含み、およびpHは約6.5〜約8.5であることを特徴とする請求項1、2又は4乃至9のいずれかに記載の方法。
- 前記非変性の抽出条件が、1%のZwittergent 3−14、約2Mの尿素、約2MのNaClを含み、およびpHは約8.2であることを特徴とする請求項1、2又は4乃至10のいずれかに記載の方法。
- 前記非変性の抽出条件が、さらに約5%w/vの固体を含むことを特徴とする請求項1乃至11のいずれかに記載の方法。
- 前記非変性の抽出条件が、さらに約1%〜約40%w/vの固体を含むことを特徴とする請求項1乃至12のいずれかに記載の方法。
- 前記組換え1型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−β、インターフェロンタ−α、インターフェロンタ−κ、またはインターフェロンタ−ωであることを特徴とする請求項1乃至13のいずれかに記載の方法。
- 前記組換え1型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−βまたはインターフェロン−αであることを特徴とする請求項1乃至14のいずれかに記載の方法。
- 前記組換え1型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−βであり、前記インターフェロン−βは、ヒトインターフェロン−β1bおよびヒトインターフェロン−β1b C17Sからなる群から選択されることを特徴とする請求項1乃至15のいずれかに記載の方法。
- 前記組換え1型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−αであり、前記インターフェロン−αは、ヒトインターフェロン−α2aおよびヒトインターフェロン−α2bからなる群から選択されることを特徴とする請求項1乃至15のいずれかに記載の方法。
- 不溶画分および抽出上清画分中の組換え1型インターフェロンタンパク質の量を測定する工程をさらに含み、抽出上清画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量が、不溶画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量の約10%〜約95%であることを特徴とする請求項1、又は4乃至17のいずれかに記載の方法。
- 組換えタンパク質の活性を測定する工程をさらに含み、アッセイされた組換えタンパク質の総量と比較すると、抽出上清中に存在する組換えタンパク質の約40%〜約100%が活性であると測定されることを特徴とする請求項1、又は4乃至18のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えタンパク質が、インターフェロン−βであり、活性な組換えタンパク質の量は、ブルーセファロースアフィニティカムクロマトグラフィー、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイまたは細胞変性効果アッセイによって測定されることを特徴とする請求項1乃至16、18又は19のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えタンパク質がインターフェロン−βであり、さらに、非変性の抽出条件は、図4のBの情報を用いて最適化されることを特徴とする請求項1乃至16又は18乃至20のいずれかに記載の方法。
- 抽出上清中の前記組換えタンパク質が、約0.3g/L〜約10g/Lの濃度で存在することを特徴とする請求項1又は3乃至21のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、約1〜約20リットルまたはそれ以上の量で培養されることを特徴とする請求項1乃至22のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、約1リットル、約2リットル、約3リットル、約4リットル、約5リットル、約10リットル、約15リットル、又は約20リットルの容積で培養されることを特徴とする請求項1乃至23のいずれかに記載の方法。
- 前記発現構築物又は核酸構築物が誘導プロモーターを含むことを特徴とする請求項1、又は3乃至22のいずれかに記載の方法。
- 前記発現構築物又は核酸構築物が、lacプロモーター誘導体を含み、前記インターフェロンの発現はIPTGによって誘導されることを特徴とする請求項1、又は3乃至23のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、約25℃〜約33℃の温度で、約5.7〜約6.5のpHで成長し、
およびIPTGは、OD575が約80〜約160に達したとき、約0.08mM〜約0.4mMの最終濃度まで加えられることを特徴とする請求項1乃至9、又は12乃至26のいずれかに記載の方法。 - 前記宿主細胞が、約32℃の温度で約5.7〜6.25のpHで成長し、IPTGは、OD575が約120〜約160に達したとき、約0.2mMの最終濃度まで加えられることを特徴とする請求項1乃至27のいずれかに記載の方法。
- 前記発現構築物又は核酸構築物が、高活性リボソーム結合部位を含むことを特徴とする請求項1、又は3乃至28のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、lon hslUVプロテアーゼ欠失株であることを特徴とする請求項1乃至29のいずれかに記載の方法。
- 前記1型インターフェロンが、前記宿主細胞の細胞質において発現されることを特徴とする請求項1乃至28のいずれかに記載の方法。
- 前記1型インターフェロンが、ヒトインターフェロン−β1bまたはヒトインターフェロン−β1b C17Sであり、前記ヒトインターフェロン−β1bまたはヒトインターフェロン−β1b C17Sが、前記宿主細胞の細胞質において発現されることを特徴とする請求項14乃至16、又は18乃至31のいずれかに記載の方法。
- 前記温度が約32℃であり、前記IPTG濃度が約0.2mMであることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記穏やかな界面活性剤がN−ラウロイル−サルコシン(NLS)ではないことを特徴とする請求項4乃至32のいずれかに記載の方法。
- 組換えタンパク質の活性を測定する工程をさらに含み、標準サンプル中の活性タンパク質の量と比較すると、抽出上清中に存在する組換えタンパク質の約75%〜約100%が活性であることが測定され、ここで、各サンプルからの同じ量のタンパク質がアッセイにおいて使用されることを特徴とする請求項1、又は4乃至34のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US31067110P | 2010-03-04 | 2010-03-04 | |
US61/310,671 | 2010-03-04 | ||
PCT/US2011/026921 WO2011109556A2 (en) | 2010-03-04 | 2011-03-02 | Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013524775A true JP2013524775A (ja) | 2013-06-20 |
JP2013524775A5 JP2013524775A5 (ja) | 2014-04-17 |
JP5840148B2 JP5840148B2 (ja) | 2016-01-06 |
Family
ID=44531690
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012556223A Expired - Fee Related JP5840148B2 (ja) | 2010-03-04 | 2011-03-02 | 変性させることなく可溶性組換えインターフェロンタンパク質を産生する方法 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9187543B2 (ja) |
EP (1) | EP2542574B1 (ja) |
JP (1) | JP5840148B2 (ja) |
KR (1) | KR101857825B1 (ja) |
CN (1) | CN102906108B (ja) |
AU (1) | AU2011223627B2 (ja) |
BR (1) | BR112012022292A2 (ja) |
CA (1) | CA2791361C (ja) |
CL (1) | CL2012002378A1 (ja) |
CO (1) | CO6592086A2 (ja) |
ES (1) | ES2639398T3 (ja) |
MX (1) | MX2012010148A (ja) |
NZ (1) | NZ602255A (ja) |
PE (1) | PE20130557A1 (ja) |
RU (1) | RU2573909C2 (ja) |
WO (1) | WO2011109556A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011109556A2 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | Pfenex Inc. | Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing |
US9169304B2 (en) | 2012-05-01 | 2015-10-27 | Pfenex Inc. | Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
CN106967175A (zh) * | 2013-05-15 | 2017-07-21 | 复旦大学 | 长效干扰素及其制备方法和用途 |
LT6164B (lt) | 2013-10-15 | 2015-06-25 | Uab Biotechnologinės Farmacijos Centras "Biotechpharma" | Sulieti interferono-alfa 5 baltymai su kitu citokinu ir jų gamybos būdas |
CN107099569B (zh) * | 2017-06-30 | 2021-05-07 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 一种规模化发酵生产重组人干扰素β1b蛋白的方法 |
CN116120424A (zh) * | 2022-06-06 | 2023-05-16 | 江苏靶标生物医药研究所有限公司 | 一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11501820A (ja) * | 1995-06-06 | 1999-02-16 | カイロン コーポレイション | 疎水性ポリペプチドの細菌生産 |
US20050283000A1 (en) * | 2002-07-31 | 2005-12-22 | Viktor Menart | Process for the production of a heterologous protein |
Family Cites Families (76)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4551433A (en) * | 1981-05-18 | 1985-11-05 | Genentech, Inc. | Microbial hybrid promoters |
US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
US4462940A (en) * | 1982-09-23 | 1984-07-31 | Cetus Corporation | Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides |
US5643566A (en) * | 1982-09-23 | 1997-07-01 | Cetus Corporation | Formulation processes for lipophilic proteins |
US5702699A (en) * | 1982-09-23 | 1997-12-30 | Cetus Corporation | Process for the recovery of lipophilic proteins |
US4588585A (en) * | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
US5281532A (en) * | 1983-07-27 | 1994-01-25 | Mycogen Corporation | Pseudomas hosts transformed with bacillus endotoxin genes |
US4695462A (en) * | 1985-06-28 | 1987-09-22 | Mycogen Corporation | Cellular encapsulation of biological pesticides |
US4695455A (en) * | 1985-01-22 | 1987-09-22 | Mycogen Corporation | Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes |
GB8517071D0 (en) | 1985-07-05 | 1985-08-14 | Hoffmann La Roche | Gram-positive expression control sequence |
US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
DK203187A (da) | 1986-04-22 | 1987-10-23 | Immunex Corp | Human g-csf proteinekspression |
US5183746A (en) * | 1986-10-27 | 1993-02-02 | Schering Aktiengesellschaft | Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β- |
NO176799C (no) | 1986-12-23 | 1995-05-31 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | DNA som koder for et polypeptid, rekombinant plasmid som koder for og kan uttrykke et polypeptid og fremgangsmåte for fremstilling av dette polypeptid |
JP2618618B2 (ja) | 1988-03-04 | 1997-06-11 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗g−csf誘導体、nd28モノクローナル抗体 |
US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
US5128130A (en) * | 1988-01-22 | 1992-07-07 | Mycogen Corporation | Hybrid Bacillus thuringiensis gene, plasmid and transformed Pseudomonas fluorescens |
US5055294A (en) * | 1988-03-03 | 1991-10-08 | Mycogen Corporation | Chimeric bacillus thuringiensis crystal protein gene comprising hd-73 and berliner 1715 toxin genes, transformed and expressed in pseudomonas fluorescens |
CA1340810C (en) | 1988-03-31 | 1999-11-02 | Motoo Yamasaki | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
WO1990006952A1 (en) | 1988-12-22 | 1990-06-28 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically modified granulocyte colony stimulating factor |
US6372206B1 (en) | 1989-03-02 | 2002-04-16 | University Of Florida | Orally-administered interferon-TAU compositions and methods |
US5166322A (en) | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
US5169760A (en) * | 1989-07-27 | 1992-12-08 | Mycogen Corporation | Method, vectors, and host cells for the control of expression of heterologous genes from lac operated promoters |
GB9107846D0 (en) | 1990-04-30 | 1991-05-29 | Ici Plc | Polypeptides |
DE4014750A1 (de) | 1990-05-08 | 1991-11-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Muteine des granulozyten-stimulierenden faktors (g-csf) |
IE912365A1 (en) | 1990-07-23 | 1992-01-29 | Zeneca Ltd | Continuous release pharmaceutical compositions |
WO1992006116A1 (en) | 1990-09-28 | 1992-04-16 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Hybrid growth factors |
US5508192A (en) * | 1990-11-09 | 1996-04-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides |
US5240834A (en) * | 1991-01-22 | 1993-08-31 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Solubilization of protein after bacterial expression using sarkosyl |
DE4105480A1 (de) | 1991-02-21 | 1992-08-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte aktivierung von rekombinanten proteinen |
US6171824B1 (en) | 1991-08-30 | 2001-01-09 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Hybrid cytokines |
US6057133A (en) | 1992-11-24 | 2000-05-02 | G. D. Searle | Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production |
ITFI940106A1 (it) | 1994-05-27 | 1995-11-27 | Menarini Ricerche Sud Spa | Molecola ibrida di formula gm-csf-l-epo o epo-l-gm-csf per la stimolaz ione eritropoietica |
US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
RU2098124C1 (ru) * | 1994-10-24 | 1997-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Ниготек" | Способ получения интерферона |
IT1285405B1 (it) | 1995-06-06 | 1998-06-03 | Alza Corp | Modificazione di farmaci polipeptidici per accrescere il flusso per elettrotrasporto. |
JP2001523480A (ja) * | 1997-11-20 | 2001-11-27 | バイカル インコーポレイテッド | サイトカイン発現ポリヌクレオチドおよびそれらの組成物を用いた癌の処置 |
AU751823B2 (en) | 1998-05-14 | 2002-08-29 | Merck Patent Gmbh | Fused protein |
US20030167531A1 (en) * | 1998-07-10 | 2003-09-04 | Russell Douglas A. | Expression and purification of bioactive, authentic polypeptides from plants |
AU765801B2 (en) | 1999-02-18 | 2003-10-02 | Rmf Dictagene S.A. | Malaria vaccine |
US7001892B1 (en) * | 1999-06-11 | 2006-02-21 | Purdue Research Foundation | Pharmaceutical materials and methods for their preparation and use |
US6531122B1 (en) * | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
KR100358948B1 (ko) | 2000-03-31 | 2002-10-31 | 한국과학기술원 | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자를 분비하는 대장균 |
AU9096001A (en) | 2000-09-08 | 2002-03-22 | Amgen Inc | G-csf analog compositions and methods |
AU3070702A (en) * | 2000-11-07 | 2002-05-21 | Chiron Corp | Stabilized inteferon compositions |
ATE399794T1 (de) | 2001-02-06 | 2008-07-15 | Merck Patent Gmbh | Modifizierter granulozyten stimulierender factor (g-csf) mit verringerter immunogenität |
ES2309167T3 (es) | 2001-02-19 | 2008-12-16 | Merck Patent Gmbh | Metodo para identificar epitotes de celulas t y metodo para preparar moleculas con inmunogenicidad reducida. |
US7189830B2 (en) | 2001-02-19 | 2007-03-13 | Merck Patent Gmbh | Anti-KSA/IL-2 fusion proteins with reduced immunogenicity |
DE60236522D1 (de) | 2001-07-11 | 2010-07-08 | Maxygen Inc | G-csf konjugate |
EP1432822B1 (en) * | 2001-09-10 | 2007-05-23 | EMD Biosciences, Inc. | Method for recovering and analyzing a cellular component of cultured cells without having to harvest the cells first |
US20040247562A1 (en) | 2001-09-28 | 2004-12-09 | Sang Yup Lee | Diagnostic method for cancer characterized in the detection of the deletion of g-csf exon 3 |
ES2516041T3 (es) | 2001-10-10 | 2014-10-30 | Ratiopharm Gmbh | Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH) |
EP1572936A2 (en) | 2002-03-05 | 2005-09-14 | Eli Lilly And Company | Heterologous g-csf fusion proteins |
AU2003267827A1 (en) | 2002-08-31 | 2004-03-19 | Cj Corp. | Glycosylated human granulocyte colony-stimulating factor (g-csf) isoform |
US9453251B2 (en) * | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
US8399217B2 (en) * | 2003-03-14 | 2013-03-19 | Brookhaven Science Associates, Llc | High density growth of T7 expression strains with auto-induction option |
KR101237651B1 (ko) * | 2003-11-19 | 2013-02-27 | 다우 글로벌 테크놀로지스 엘엘씨 | 개선된 단백질 발현 시스템 |
EP2314602A1 (en) * | 2003-11-21 | 2011-04-27 | Pfenex, Inc. | Improved expression systems with SEC-system secretion |
KR100524872B1 (ko) * | 2003-12-04 | 2005-11-01 | 씨제이 주식회사 | 인터페론 베타의 정제방법 |
AU2005206951B2 (en) | 2004-01-16 | 2010-08-19 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
AU2005269527B2 (en) * | 2004-07-26 | 2011-12-01 | Pfenex Inc. | Process for improved protein expression by strain engineering |
CA2591235C (en) * | 2004-12-20 | 2014-03-11 | Cadila Healthcare Limited | Process for preparing high levels of interferon beta |
EP1828241A1 (en) * | 2004-12-23 | 2007-09-05 | Laboratoires Serono S.A. | G-csf polypeptides and uses thereof |
GB0605684D0 (en) | 2006-03-21 | 2006-05-03 | Sicor Biotech Uab | Method For Purifying Granulocyte-Colony Stimulating Factor |
KR20090018799A (ko) * | 2006-05-30 | 2009-02-23 | 다우 글로벌 테크놀로지스 인크. | 코돈 최적화 방법 |
EP1939212A1 (en) * | 2006-12-20 | 2008-07-02 | LEK Pharmaceuticals D.D. | Organic compounds |
AU2008210538B2 (en) * | 2007-01-31 | 2013-06-06 | Pelican Technology Holdings, Inc. | Bacterial leader sequences for increased expression |
JP5444553B2 (ja) * | 2007-04-27 | 2014-03-19 | フェネックス インコーポレイテッド | 微生物宿主を迅速にスクリーニングして、異種タンパク質発現の収率および/または質が改善されている特定の株を同定する方法 |
US9580719B2 (en) * | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
US7625555B2 (en) * | 2007-06-18 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human interferon-like proteins |
KR20100058541A (ko) * | 2007-08-15 | 2010-06-03 | 아뮤닉스 인코포레이티드 | 생물학적 활성 폴리펩티드의 특성을 변경하기 위한 조성물 및 방법 |
EP2445924B2 (en) | 2009-06-25 | 2023-12-13 | Amgen Inc. | Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system |
WO2011109556A2 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | Pfenex Inc. | Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing |
WO2011123570A2 (en) * | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Pfenex Inc. | Methods for g-csf production in a pseudomonas host cell |
-
2011
- 2011-03-02 WO PCT/US2011/026921 patent/WO2011109556A2/en active Application Filing
- 2011-03-02 EP EP11751317.6A patent/EP2542574B1/en not_active Not-in-force
- 2011-03-02 MX MX2012010148A patent/MX2012010148A/es unknown
- 2011-03-02 PE PE2012001389A patent/PE20130557A1/es not_active Application Discontinuation
- 2011-03-02 RU RU2012141653/10A patent/RU2573909C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-03-02 NZ NZ602255A patent/NZ602255A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-03-02 CA CA2791361A patent/CA2791361C/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-03-02 ES ES11751317.6T patent/ES2639398T3/es active Active
- 2011-03-02 KR KR1020127025760A patent/KR101857825B1/ko active IP Right Grant
- 2011-03-02 US US13/039,183 patent/US9187543B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-03-02 CN CN201180021026.9A patent/CN102906108B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-03-02 JP JP2012556223A patent/JP5840148B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-03-02 AU AU2011223627A patent/AU2011223627B2/en not_active Ceased
- 2011-03-02 BR BR112012022292A patent/BR112012022292A2/pt not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-08-28 CO CO12146129A patent/CO6592086A2/es unknown
- 2012-08-29 CL CL2012002378A patent/CL2012002378A1/es unknown
-
2015
- 2015-10-15 US US14/884,081 patent/US9611499B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11501820A (ja) * | 1995-06-06 | 1999-02-16 | カイロン コーポレイション | 疎水性ポリペプチドの細菌生産 |
US20050283000A1 (en) * | 2002-07-31 | 2005-12-22 | Viktor Menart | Process for the production of a heterologous protein |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6015002100; J. Interferon Cytokine Res. (1995) vol.15, no.1, p.31-37 * |
JPN6015002102; 大野茂男ほか監修, 細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ タンパク実験プロトコール1機能解析編, 1997年 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9611499B2 (en) | 2017-04-04 |
ES2639398T3 (es) | 2017-10-26 |
CA2791361A1 (en) | 2011-09-09 |
EP2542574B1 (en) | 2017-08-09 |
PE20130557A1 (es) | 2013-05-19 |
CN102906108B (zh) | 2016-01-20 |
WO2011109556A3 (en) | 2012-01-12 |
CA2791361C (en) | 2018-06-12 |
EP2542574A4 (en) | 2014-01-29 |
CO6592086A2 (es) | 2013-01-02 |
KR101857825B1 (ko) | 2018-05-14 |
JP5840148B2 (ja) | 2016-01-06 |
BR112012022292A2 (pt) | 2017-01-10 |
US20160032345A1 (en) | 2016-02-04 |
KR20130018743A (ko) | 2013-02-25 |
CN102906108A (zh) | 2013-01-30 |
CL2012002378A1 (es) | 2014-01-10 |
US20110217784A1 (en) | 2011-09-08 |
AU2011223627A1 (en) | 2012-09-27 |
EP2542574A2 (en) | 2013-01-09 |
RU2573909C2 (ru) | 2016-01-27 |
RU2012141653A (ru) | 2014-04-10 |
AU2011223627B2 (en) | 2015-06-18 |
US9187543B2 (en) | 2015-11-17 |
MX2012010148A (es) | 2013-01-22 |
NZ602255A (en) | 2014-04-30 |
WO2011109556A2 (en) | 2011-09-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9611499B2 (en) | Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing | |
JP6817939B2 (ja) | ペプチド産生のための融合パートナー | |
ES2707786T3 (es) | Expresión de proteínas de mamífero en Pseudomonas fluorescens | |
Morowvat et al. | Overexpression of recombinant human beta interferon (rhINF-β) in periplasmic space of Escherichia coli | |
Bis et al. | High yield soluble bacterial expression and streamlined purification of recombinant human interferon α-2a | |
JP2004528005A (ja) | 生物学的に活性なタンパク質およびペプチドのファージ依存性超産生 | |
He et al. | Functional expression of porcine interferon-α using a combinational strategy in Pichia pastoris GS115 | |
WO2007033529A1 (fr) | Gène codant pour une protéine antibactérienne de fenneropenaeus chinensis, procédé d'expression et utilisations des recombinants | |
Li et al. | Purification and characterization of recombinant human interleukin-29 expressed in Escherichia coli | |
US8709757B2 (en) | Method for producing interferon alpha 5 | |
Peymanfar et al. | Production and simple purification of recombinant human granulocyte colonystimulating factor using the inteintag in Escherichia Coli | |
KR100890187B1 (ko) | Tsf를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
Mobasher et al. | Two step production of optimized interferon Beta 1b; A way to overcome its toxicity | |
RU2054041C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PIF16, КОДИРУЮЩАЯ ЗРЕЛЫЙ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ ИНТЕРФЕРОН α2 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЗРЕЛОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА α2 ЧЕЛОВЕКА | |
CN116731152A (zh) | 猫ω干扰素、其编码基因及其表达和应用 | |
Salama et al. | Interdisciplinary Gene Manipulation, Molecular Cloning, and Recombinant Expression of Modified Human Growth Hormone Isoform-1 in E. Coli System | |
KR20090025481A (ko) | RpoS를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
MXPA06008061A (en) | Expression of mammalian proteins in pseudomonas fluorescens |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140227 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140227 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150121 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20150121 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150421 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150818 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150908 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151102 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151110 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5840148 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |