CN1743453A - 一种溶葡萄球菌酶工业化纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶葡萄球菌酶工业化纯化工艺，从含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢杆菌培养上清中纯化溶葡萄球菌酶。该方法包括离子交换和疏水层析，处理45升样品只需2个工作日，总回收率为50％，比活性大于1000U/mg蛋白质，非还原SDS－PAGE电泳结果显示纯度在90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶纯化工艺，具体的说涉及溶葡萄球菌酶工业化纯化工艺。
背景技术
溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)是Staphylococus Simulans分泌的能裂解葡萄球菌的酶，它的作用位点是葡萄球菌细胞壁中的甘氨酸五肽键桥。1987年复旦大学在球形芽孢杆菌中表达成功，并建立了该酶的分离纯化方法，该方法包括使用DEAE纤维素的阴离子层析以及CM纤维素的阳离子层析，由于层析介质刚性弱、蛋白载量低，导致层析过程流速不能太快、只能处理小体积样品，处理10升样品需要4天的时间，而且在得率、纯度等方面都不理想，因此不能满足工业化生产的需要。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种溶葡萄球菌酶纯化工艺，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足有关部门的需要。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)上样：将用预冷的无菌水稀释至电导为3～4ms/cm、pH为6.5～7.0的样品以每小时200～400厘米的流速通过预先用缓冲液平衡好层析柱；
所说的样品为从含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢杆菌培养上清；
所说的层析柱采用的介质是颗粒大小为100～300μm的强阳离子琼脂糖凝胶(由安玛西亚生物技术有限公司生产，商品名为SP SepharoseBigBead)；
(2)清洗：用10～50mmol/L pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液，以每小时80～200厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线；
(3)洗脱：用含0.5～1mol/L氯化钠的10～15mmol/L pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液，以每小时8～20厘米的流速将蛋白从层析柱上洗脱并收集洗脱峰。
上述步骤亦称为离子交换层析，其中：缓冲液平衡层析柱包括如下步骤：用15mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液平衡装有适量体积的SP SepharoseBigBead介质的层析柱，以每小时80～200厘米的流速平衡5～10个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
上述步骤的活性蛋白回收率为75％～85％；蛋白比活为350U/mg，蛋白纯化倍数为14以上，此方法的优点是：处理速度快、处理量大、凝胶载样量大、浓缩效果好、回收率高及重复性好等，含一定量的色素。因此按照本发明优选的方案，还包括如下的疏水层析步骤：
(1)样品预处理：在上述的层析洗脱液中加入氯化钠，使其浓度达到1～2mol/L，加入甘油，使甘油浓度达到2％～10％，将样品的温度保持在15～25℃；
(2)上样：以每小时20～60厘米的流速将预处理后的洗脱液通过预先用缓冲液平衡好的疏水层析柱；
所说的疏水层析柱采用的介质是颗粒大小为20～165μm带有苯基的琼脂糖凝胶(由安玛西亚生物技术有限公司生产，商品名为Phenyl Sepharose6 fast flow)；
(3)清洗：用含有浓度为1～2mol/L的氯化钠和浓度为2％～10％的甘油pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液，以每小时20～60厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线；
(4)洗脱：用含有浓度为2％～10％的甘油pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液，以每小时10～30厘米的流速将蛋白从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰。
上述步骤亦称为疏水层析，其中：用缓冲液平衡疏水层析柱包括如下步骤：用含浓度为1～2mol/L的氯化钠和浓度为2％～10％的甘油pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液平衡装有Phenyl Sepharose 6 fast flow介质的层析柱，以每小时10～30厘米的流速平衡5～10个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
离子交换层析洗脱液通过疏水层析，可以很好的去除色素和杂蛋白，产品纯度达到90％左右。
疏水层析活性蛋白回收率为65％～75％，疏水层析会导致部分蛋白失活，所以回收率相对偏低；蛋白比活为1000U/mg，蛋白纯化倍数为3以上；洗脱液清澈透明不含色素。
本发明建立了简单快速的方法从含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢杆菌培养上清中纯化溶葡萄球菌酶。该方法包括离子交换和疏水层析，处理45升样品只需2个工作日，总回收率为50％，比活性大于1000U/mg蛋白质，非还原SDS-PAGE电泳结果显示纯度在90％以上。
附图说明
图1为10毫升阳离子交换柱SP Sepharose BigBead层析图谱。
图2为1毫升疏水层析Phenyl Sepharose 6 fast flow层析图谱。
图3为3000毫升阳离子交换柱SP Sepharose BigBead层析图谱。
图4200毫升疏水层析Phenyl Sepharose 6 fast flow层析图谱。
图5为蛋白SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
实施例1
离子交换层析：
装有10ml颗粒大小为100～300μm的强阳离子琼脂糖凝胶(由安玛西亚生物技术有限公司生产，商品名为SP Sepharose BigBead(请提供具体的规范的化学名称)介质的层析柱，层析柱直径为2.5厘米。
样品：含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢杆菌培养上清200毫升；含9750单位溶葡萄球菌酶。
层析设备：安玛西亚生物技术有限公司生产的AKTA explorer 100；
平衡、清洗缓冲液：15mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液；
洗脱缓冲液：含1mol/L NaCl的15mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液。
平衡：用15mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液平衡装有10毫升体积的SPSepharose BigBead介质的层析柱，以每小时120厘米的流速平衡8个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线；
样品预处理：将200毫升样品(含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢杆菌培养上清)用预冷的无菌水稀释至电导为3.5ms/cm，并用磷酸调节pH至6.7。
上样：以每小时300厘米的流速使样品通过预先用缓冲液平衡好层析柱。
清洗：上样完，用15mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液，以每小时150厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线。
洗脱：清洗至基线后，用含1mol/L氯化钠的15mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液，以每小时15厘米的流速将蛋白从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰10毫升。
试验结果如图1和表1。
表1 10ml SP Sepharose BigBead小柱纯化结果
| 各组分酶活性 | 回收率％ | ||
| 样品上样液200毫升 | 流穿液 | 洗脱峰10毫升 | |
| 9750U | 300U | 8550U | 87.7 |
离子交换层析处理速度快、浓缩效果好，层析规模很容易放大，蛋白活性回收率好；蛋白比活在350U/mg，蛋白纯化倍数为14以上；但含一定量的色素。
实施例2
疏水层析
装有1毫升颗粒大小为20～165μm带有苯基的琼脂糖凝胶(由安玛西亚生物技术有限公司生产，商品名为Phenyl Sepharose 6 fast flow)介质的层析柱，层析柱直径为0.6厘米。
样品：处理10毫升离子交换层析的洗脱液；含8550单位溶葡萄球菌酶。
层析设备：安玛西亚生物技术有限公司生产的AKTA explorer 100；
平衡缓冲液：含1.5mol/L的氯化钠和50mmol/L的甘油pH为6.5的磷酸缓冲液；
清洗缓冲液：含1.8mol/L的氯化钠和甘油50mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液；
洗脱缓冲液：含甘油50mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液；。
平衡：用平衡缓冲液平衡装有1ml体积的Phenyl Sepharose 6 fast flow介质的层析柱，以每小时20厘米的流速平衡5个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
样品预处理：在样品(离子交换层析洗脱液)中加入氯化钠使其浓度达到1.5mol/L，在加入5％的甘油(请将甘油浓度表达清楚)，将样品的温度保持在20度左右。
上样：以每小时40厘米的流速使样品通过预先用缓冲液平衡好的层析柱。
清洗：上样完，用清洗缓冲液以每小时30厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线。
洗脱：清洗至基线后，用洗脱缓冲液以每小时15厘米的流速将蛋白从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰2毫升。
试验结果如图2和表2。
表2 1ml Phenyl Sepharose 6 fast flow小柱纯化结果
| 各组分酶活 | 回收率％ | ||
| 上样液10毫升 | 流穿液 | 洗脱液2毫升 | |
| 8550U | 870 | 6413 | 75％ |
第二步疏水层析会导致部分蛋白失活，所以回收率相对偏低。蛋白比活为1000U/mg，蛋白纯化倍数为3以上；洗脱液清澈透明不含色素。产品纯度达到90％左右。
实施例3
离子交换层析：
装有3000ml SP Sepharose BigBead介质的层析柱，层析柱直径为15厘米。
样品：含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢杆菌培养上清45升；含495万单位溶葡萄球菌酶。
层析设备：安玛西亚生物技术有限公司的6mm Manual Process SystemTC；
平衡、清洗缓冲液：15mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液；
洗脱缓冲液：含1mol/L NaCl的15mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液。
平衡：用15mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液平衡装有3000毫升体积的SP Sepharose BigBead介质的层析柱，以每小时120厘米的流速平衡6个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
样品预处理：将45升样品(含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢杆菌培养上清)用预冷的无菌水稀释至电导为3.5ms/cm，并用磷酸调节pH至6.7。
上样：以每小时2300厘米的高流速使样品通过预先用缓冲液平衡好层析柱。
清洗：上样完，用15mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液，以每小时150厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线。
洗脱：—清洗至基线后，用含1mol/L氯化钠的15mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液，以每小时15厘米的流速将蛋白从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰2000毫升。
试验结果如图3和表3。
表3 3000ml SP Sepharose BigBead小柱纯化结果
| 各组分酶活性 | 回收率％ | ||
| 样品上样液45升 | 流穿液 | 洗脱峰2000毫升 | |
| 495万U | 55万U | 391万U | 79 |
蛋白SDS-PAGE电泳图如图5。图中，1代表低分子量标准蛋白质，2、4代表SP Sepharose BigBead阳离子交换层析洗脱峰，3、5代表疏水层析洗脱峰。
实施例4
疏水层析
装有200毫升Phenyl Sepharose 6 fast flow介质的层析柱，层析柱直径为5厘米。
样品：处理200毫升实施例3的离子交换层析的洗脱液；含391万单位溶葡萄球菌酶。
层析设备：安玛西亚生物技术有限公司生产的GradifracTM System；
平衡缓冲液：50mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液，其中含有1.5mol/L的氯化钠和5％甘油；
清洗缓冲液：50mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液，其中含有1.8mol/L的氯化钠和2.5％甘油；
洗脱缓冲液：50mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液，其中含有2.5％甘油。
平衡：用平衡缓冲液平衡装有1ml体积的Phenyl Sepharose 6 fast flow介质的层析柱，以每小时20厘米的流速平衡5个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
样品预处理：在实施例3的离子交换层析洗脱液中加入氯化钠使其浓度达到1.5mol/L，再加入5％的甘油，将样品的温度保持在20度左右。
上样：以每小时40厘米的流速使样品通过预先用缓冲液平衡好的层析柱。
清洗：上样完，用清洗缓冲液以每小时30厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线。
洗脱：清洗至基线后，用洗脱缓冲液以每小时15厘米的流速将蛋白从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰600毫升。
试验结果如图4和表4。
表4 200ml Phenyl Sepharose 6 fast flow柱纯化结果
| 各组分酶活 | 回收率％ | ||
| 上样液2000毫升 | 流穿液 | 洗脱液600毫升 | |
| 391万单位 | 25万单位 | 266万单位 | 68％ |
Claims (10)
1.一种溶葡萄球菌酶纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)上样：将电导为3～4ms/cm、pH为6.5～7.0的样品通过预先用缓冲液平衡好层析柱；
所说的样品为含溶葡萄球菌酶基因重组质粒的球形芽孢杆菌培养上清；
所说的层析柱采用的介质是颗粒大小为100～300μm的强阳离子琼脂糖凝胶；
(2)清洗：用10～50mmol/L pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液清洗层析柱；
(3)洗脱：用含0.5～1mol/L氯化钠的10～50mmol/L pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液将蛋白从层析柱上洗脱并收集洗脱峰。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，缓冲液平衡层析柱包括如下步骤：用15mmol/L pH为6.5的磷酸缓冲液平衡装有强阳离子琼脂糖凝胶介质的层析柱，以每小时80～200厘米的流速平衡5～10个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，将电导为3～4ms/cm、pH为6.5～7.0的样品以每小时200～400厘米的流速通过预先用缓冲液平衡好层析柱。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，用磷酸缓冲液以每小时80～200厘米的流速清洗层析柱。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，用磷酸缓冲液以每小时8～20厘米的流速将蛋白从层析柱上洗脱。
6.根据权利要求1～5任一项所述的工艺，其特征在于，还包括如下的疏水层析步骤：
(1)样品预处理：在上述的离子层析洗脱液中加入氯化钠，使其浓度达到1～2mol/L，加入甘油，使甘油浓度达到2％～10％；
(2)上样：将预处理后的洗脱液通过预先用缓冲液平衡好的疏水层析柱；
所说的疏水层析柱采用的介质是颗粒大小为20～165μm带有苯基的琼脂糖凝胶；
(3)清洗：用含有浓度为1～2mol/L的氯化钠和浓度为2％～10％的甘油pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液清洗层析柱；
(4)洗脱：用含有浓度为2％～10％的甘油pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液将蛋白从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰。
7.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，用缓冲液平衡疏水层析柱包括如下步骤：用含浓度为1～2mol/L的氯化钠和浓度为2％～10％的甘油pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液平衡装有带有苯基的琼脂糖凝胶介质的层析柱，以每小时10～30厘米的流速平衡5～10个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
8.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，以每小时20～60厘米的流速将预处理后的洗脱液通过预先用缓冲液平衡好的疏水层析柱。
9.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，用磷酸缓冲液，以每小时20～60厘米的流速清洗层析柱。
10.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，用磷酸缓冲液，以每小时10～30厘米的流速将蛋白从层析柱上洗脱下来。
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