CN1884575A

CN1884575A - 构建bac亚克隆库的方法

Info

Publication number: CN1884575A
Application number: CN 200510011979
Authority: CN
Inventors: 徐明良; 田秀红; 李建生; 戴景瑞; 郑德刚; 杨琴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2005-06-21
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2006-12-27
Anticipated expiration: 2025-06-21
Also published as: CN1884575B

Abstract

本发明提供了一种改进的BAC亚克隆库构建方法。主要通过以下步骤实现：BAC DNA的提取和纯化；BAC DNA的片段化及末端修补；目标片段的回收及与载体的连接；连接产物的转化。以玉米为例，构建的BAC亚克隆库中，克隆数超过1500，空克隆和大肠杆菌DNA污染率低于5％，插入片段平均为3kb。该方法具有简便、廉价、快速、高效的优点。

Description

构建BAC亚克隆库的方法

一、技术领域：

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及BAC亚克隆的制备。

二、背景技术：

生物体全基因组测序意义非比寻常，通过对全基因组序列的分析可以获得大量的遗传信息，为功能基因组学和比较基因组学等研究奠定基础。测定生物体的基因组序列，鉴定序列的生物学功能，研究生物体的进化规律，已成为生命科学研究领域的热门课题。

克隆步移法是常用的测序法之一。其基本环节包括：构建基困组DNA大片段BAC库；利用高密度的遗传图谱和BAC克隆的指纹图谱将BAC克隆定位到染色体上，构建基于BAC克隆的全基因组物理图谱；BAC克隆的亚克隆库构建；亚克隆测序、组装，获得BAC插入片段序列；最后，将重叠BAC克隆的序列拼接获得全基因组序列。

构建BAC亚克隆库是克隆步移法测序的重要环节之一。大规模基因组测序，要求构建出高质量的BAC亚克隆库，即具有足够的克隆数，无或极少有大肠杆菌基因组DNA污染，空克隆少。目前普遍采用价格昂贵的试剂盒、按照繁琐的操作规程构建BAC亚克隆库，既增加建库成本和工作量，又极易造成DNA的污染，最终影响亚克隆库的质量。如用QIAGEN试剂盒抽提一个BAC克隆DNA的成本就为30美元，构建一个BAC亚克隆库的费用则需50美元左右。按玉米全基因组测序需构建15,000个亚克隆库计，花费高达750,000美元。针对这些问题，我们设计了一系列独特的操作步骤，利用国产廉价的试剂盒，按照简便的操作程序，便可达到构建高质量BAC亚克隆库的目的，而费用大大降低，构建一个亚克隆库约需15美元左右。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供一种简便、廉价、快速、高效的BAC亚克隆库构建方法。

本发明所要解决的技术问题是：现有构建BAC亚克隆库的方法步骤复杂繁琐、费用昂贵，且易存在DNA的污染，影响亚克隆库的质量。

本发明通过以下技术方案实施：

构建BAC亚克隆库的主要环节包括：BAC DNA的提取和纯化；BAC DNA的片段化及末端修补；目标片段的回收及与载体的连接；连接产物的转化。而DNA的量和纯度，对于构建高质量的BAC亚克隆库十分关键。

本发明技术方案包括以下步骤：

(一)BAC DNA的提取：利用Solution I、Solution II和Solution III(配制方法参见Sambrook和Russell编写的《分子克隆实验手册》第三版)，采用碱裂解法大量制备BAC DNA，由于粗提物含较多RNA，利用RNase酶处理粗提物，用氯仿抽提去除RNase酶，再用异丙醇沉淀DNA；

(二)BAC DNA的纯化回收：利用普通琼脂糖胶，低电压、长时间电泳，使共价闭环BAC DNA与大肠杆菌基因组DNA片段充分分开。切取超螺旋BAC DNA，用溶胶液(国产)溶解琼脂糖胶，用注射器简单抽打BAC DNA使之断裂为≤50kb的片段，这样便可用国产的凝胶回收试剂盒回收纯化BAC DNA，其中，对试剂盒的使用进行了改进，即先用去蛋白液(国产)洗涤吸附有DNA的离心柱，再按使用说明漂洗及洗脱DNA，使用该方法有效避免了大肠杆菌基因组DNA的污染，回收到足量(回收率＞85％)且纯净的BAC DNA；

(三)BAC DNA的片段化及末端修补：采用GeneMachines公司的HydroshearDNA剪切仪对BAC DNA大片段进一步剪切，剪切的片段集中在2.5-5kb之间。为确保后续酶学反应的高效性，利用国产的PCR产物纯化试剂盒对片段化后的BACDNA进一步纯化，得到了回收率＞90％、纯净的BAC DNA，采用EPICENTRE的End-It^TM DNA末端修补试剂盒对BAC DNA片段末端进行修补；

(四)目标片段的回收及与载体的连接：采用普通琼脂糖胶，利用国产的凝胶回收试剂盒，回收2.5-5kb之间的DNA片段，连接反应按4∶1(外源DNA片段∶载体)的比例，16℃连接过夜；

(五)连接产物的转化：为了提高转化率、获得足够的克隆，通常用乙醇沉淀法浓缩连接产物中的DNA，此方法的弊端之一是极易造成DNA丢失，在此，利用国产的PCR产物纯化试剂盒，有效去除连接反应液中的蛋白和离子，高效纯化浓缩DNA，电击转化感受态细胞(感受态细胞制备方法参见Sambrook和Russell编写的《分子克隆实验手册》第三版)，每次转化可获得1500个以上的克隆。

本发明的技术效果：价廉、操作简便、快速、高效。

四、具体实施方式：

以下通过玉米BAC亚克隆库的构建实施例对本发明作出解释和说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的限制。可以预见到，构建不同来源的BAC亚克隆库可参照本实施例实现。

(一)BAC DNA的提取

1、1.5ml管中加入200μl 2×YT(含12.5μg/ml的氯霉素)培养基，接种相应的BAC菌种，于37℃、150rpm培养6hr；

2、250ml三角瓶中加入50ml 2×YT(含12.51μg/ml的氯霉素)培养基，取1中培养物50μl于其中，于37℃、250rpm培养14hr；

3、用50ml离心管，于4℃以6500rpm离心10min收菌；

4、吸去培养液，于4℃以6500rpm离心1min去尽残液，获细菌沉淀；

5、加入4ml预冷的Solution I，剧烈振荡，使茵体充分散开；

6、加入8ml新制的Solution II，快速混均(不超过5min)；

7、加入6ml预冷的Solution III，轻轻混均，冰上放置5-10min；

8、于4℃以11000rpm离心15min，吸上清于一50ml新管；

9、加入0.7V异丙醇，混均，于4℃以12000rpm离心15min；

10、弃上清，并于4℃以12000rpm离心30秒，去尽残液；

11、用800μl TE溶解沉淀，并转入2ml离心管中；

12、加入10μl RNase酶(10mg/ml)，于37℃以50rpm处理1hr；

13、加入1V氯仿，充分混均，以12600rpm离心15min；

14、取水相于一新管，加入1/10V 3MNaAc(pH5.2)和0.7V异丙醇，充分混均，并以12600rpm离心15min；

15、弃上清，并以12000rpm离心30秒，去尽残液；

16、用70％乙醇以12600rpm离心5min洗沉淀，去上清及残留；

17、室温放置约10min使乙醇挥发尽；

18、加入160μl TE溶解沉淀；

(二)BAC DNA的纯化回收

1、制备1％TAE琼脂糖胶；

2、在160μl的粗提物中加入6×Loading Buffer后上样；

3、低电压(约80V)、长时间(约3hr)电泳，使超螺旋BAC DNA与大肠杆菌基因组DNA片段等充分分开；

4、切取超螺旋BAC DNA，称重；

5、加3V溶胶液PN，于50℃至胶完全溶解；

6、用100μl注射器抽打BAC DNA一次，使之断裂为≤50kb的片段；用天为时代的离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化BAC DNA；

7、将以上溶液加入普通型(CB2)吸附柱，以12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

8、用500μl去蛋白液PD洗吸附柱，以12000rpm离心1min，弃废液；

9、用800μl漂洗液PW洗吸附柱，以12000rpm离心1min，弃废液；

10、用500μl漂洗液再洗吸附柱，以12000rpm离心1min，弃废液；

11、将吸附柱放回收集管，以12600rpm离心2min，尽量去除漂洗液；

12、取出吸附柱，放入一干净离心管；在吸附膜中间加入200μl洗脱缓冲液EB(65℃预热)，室温放置2min，12600rpm离心1min收集BAC DNA溶液；-20℃保存；

(三)BAC DNA的片段化及纯化

1、片段化前，应确保BAC DNA完全溶解且溶液中无杂质无气泡；

2、用GeneMachines公司的HydroshearDNA剪切仪，按使用说明剪切BAC DNA大片段；本项目选用的参数为：Volume(200μl)、Speed code(12)、Cycle(20)；剪切后片段大小集中在2.5-5kb之间；

3、用天为时代的离心柱型PCR产物纯化试剂盒对片段化后的BAC DNA进一步纯化，以确保后续酶学反应的高效性；具体操作如下：

4、在片段化后的BAC DNA溶液中，加入5V的结合液PB(50℃预热)，充分混均，转入超薄型(CB1)吸附柱；室温放置1min；12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

5、用700μl漂洗液PW洗吸附柱，以12000rpm离心30秒，弃废液；

6、用500μl漂洗液再洗吸附柱，以12000rpm离心30秒，弃废液；

7、将吸附柱放回收集管，以12600rpm离心2min，尽量去除漂洗液；

8、取出吸附柱，放入一干净离心管；在吸附膜中间加入40μl洗脱缓冲液EB(65℃预热)，室温放置1min；12000rpm离心1min收集溶液；

(四)片段化后的末端修补

用EPICENTRE的End-It^TM DNA末端修补试剂盒对BACDNA末端修补；具体操作如下：

1、50μl反应体系中包含：

34μl 片段化后的BAC DNA溶液

5μl 10×End-Repair Buffer

5μl 2.5mM dNTP Mix

5μl 10mM ATP

1μl End-Repair Enzyme Mix

2、于16℃温育14hr；

3、70℃处理10min使酶失活，终止反应；

(五)目标片段的纯化回收

1、制备1％TAE琼脂糖胶；

2、在50μl修补液中加6×Loading Buffer，上样、电泳；

3、用天为时代的离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(CB1超薄型吸附柱)，回收纯化2.5-5kb之间的DNA片段；最后用20μl洗脱液洗脱；

(六)目标片段与载体的连接

1、20μl 连接反应体系含：

xμl 去离子水

2μl 10x T4DNA连接酶缓冲液

2μl 50％PEG 6000

50ng pBluescriptII KS+(EcoR V酶切/CIP去磷酸化)

200ng DNA片段

0.8μl T4DNA连接酶

2、于16℃连接14hr；

3、用天为时代的离心柱型PCR产物纯化试剂盒(CB1超薄型吸附柱)浓缩纯化连接产物DNA；最后用10μl洗脱液洗脱；

(七)连接产物的转化

在20μl的大肠杆菌DH10B感受态细胞中加入2μl浓缩纯化的连接产物DNA；按电击转化的常规程序操作。

按以上过程，构建的玉米BAC亚克隆库：克隆数超过1500，空克隆和大肠杆菌DNA污染率低于5％，插入片段平均为3kb。

Claims

1.一种BAC亚克隆库的构建方法，包括以下步骤：BAC DNA的提取和纯化；BAC DNA的片段化及末端修补；目标片段的回收及与载体的连接；连接产物的转化。

2.权利要求1的方法，其中BAC DNA的提取和纯化中包括用去蛋白液PD洗吸附柱。

3.权利要求1或2的方法，其中BAC DNA的片段化用GeneMachines公司的HydroshearDNA剪切仪按说明书进行。

4.权利要求1或2的方法，其中BAC DNA的末端修补用EPICENTRE的End-It^TM DNA末端修补试剂盒按说明书进行。

5.权利要求1或2的方法，其中的载体选用商业化的pBluescriptIIKS+载体。

6.权利要求1或2的方法，其中连接产物转化入大肠杆菌DH10B感受态细胞中。