CN100336912C

CN100336912C - 利用高密度发酵制备重组人心钠肽－rhANP的方法

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Publication number: CN100336912C
Application number: CNB2005100124255A
Authority: CN
Inventors: 林枫; 于志江; 王玉树; 周兆平; 章刚; 陈旭; 梁四五; 姚小建; 骆晓栋; 欧阳藩
Original assignee: Shenzhen State Biochemical Engineering Technology Development Center
Current assignee: Shenzhen State Biochemical Engineering Technology Development Center
Priority date: 2005-03-25
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2007-09-12
Anticipated expiration: 2025-03-25
Also published as: CN1687443A

Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，特别是利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法。本发明利用大肠杆菌遗传工程菌株——pCW112-ANP/DH5α经过斜面菌种、扩大培养制备种子液、高密度发酵、分离纯化等工艺步骤制备纯化的重组人心钠肽-rhANP。本发明解决了ANP的表达和纯化比较困难，因而限制了ANP的产业化应用的问题，具有成本低、原料与菌种易得、操作简单，且生产条件易于控制、重复性好的优点，所制备的产物可有效的适于制药领域的应用。

Description

利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法。

背景技术

人心钠肽(ANP)是由心房肌细胞产生和分泌的一种多肽激素，有α、β、γ三种形式。α-ANP生物活性最强，由28个氨基酸组成，其结构如下：

ANP的生物学作用主要有四方面：排钠利尿；扩张血管；降低血压；抗心率失常。在临床上，ANP目前主要用于治疗急性心率衰竭。

1986年，我国正式将重组人心钠肽项目列入国家重点攻关项目。但由于ANP的表达和纯化比较困难，因而限制了ANP的产业化应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用高密度发酵批量化制备重组人心钠肽-rhANP的方法，该方法成本低，操作筒单，重复性好，完全适合于rhANP在制药领域的应用。

本发明的制备方法的整体技术构思是：

该制备方法包括如下工艺步骤：

A，将斜面菌种经扩大培养制成种子液；

B、将A步骤中制备的种子液按种子液：发酵培养基按2-5％的比例接种于发酵培养基进行发酵，其中发酵培养基包括下列体积重量份组分(g/L)：

甘油 3-8g/L，胰蛋白胨 4-10g/L，酵母粉 2-6g/L，KH₂PO₄ 4-10g/L，

K₂HPO₄ 6-12g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-4g/L，MgCl₂ 0.5-2g/L，微量元素 1ml/L；

培养温度为28-32℃，培养15-20小时后诱导，诱导温度为41-43℃，诱导时间4-6小时；升温诱导之前，将菌体的平均比生长速率控制在0.2～0.4；

发酵过程中细菌增殖阶段的pH值控制在6.9-7.1，在目的基因表达阶段的pH值为7.1-7.3，通气量为0.5～1.5VVM，发酵过程的溶解氧浓度为15％-50％，并进行补料，控制补料速率与菌体的消耗速率相当，使发酵液中的甘油浓度维持在1.0～3.0g/L；发酵液经离心(3500-5000rpm，4-10℃，15-20分钟)收集菌体，发酵周期为19-26小时；

C、纯化

(1)包涵体的提取：将B步骤中收集的菌体按1∶5-10的比例用缓冲液(150-250mM NaCl，10-50mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na₂，PH7.5-9.0)重悬，冰水浴，用均质机以600-700bar压力匀浆，离心，收集沉淀(包涵体)；用缓冲液(2M尿素，150-250mM NaCl，10-50mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na₂，PH7.5-9.0)洗涤包涵体1-2次，使其SDS-PAGE纯度达到60％以上；将包涵体按1∶20-40的比例加入裂解液，室温搅拌5-8小时，离心(8000-11000rpm，4-25℃，15-30分钟)，弃沉淀，取上清；

(2)融合蛋白提取：用Sepharose 6FF(GE Heal thcare)疏水层析提取融合蛋白，将(1)步骤中的上清液直接上样或用2.2M(NH₄)₂SO₄，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0稀释一倍后上样，以2M尿素，0.4M(NH₄)₂SO₄，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0洗脱，280nm紫外检测，收集目标峰(第一峰)；

(3)rhANP初步纯化：将步骤(2)中的疏水层析收集物用缓冲液(10-50mMTris-HCl，150-250mM NaCl，PH8.0-9.0)稀释，按每毫克融合蛋白用1-5单位凝血酶的用量加入凝血酶，于28-35℃反应4-10小时；以0.1M乙酸-乙酸胺，150-250mM NaCl，0-25％乙腈为流动相，用Superdex 30pg(GE Healthcare)分离，收集目标峰；

(4)rhANP精细纯化：采用高效液相色谱柱，流动相A为6％乙腈，0.05％-0.1％TFA(三氟乙酸)，流动相B为30％乙腈，0.05％-0.1％TFA(三氟乙酸)，进行洗脱；收集目标峰，去除乙腈和TFA，即为纯化的rhANP；

发酵菌种选用大肠杆菌遗传工程菌株(pCW112-ANP/DH5α)。

本发明各工艺步骤中具体的工艺条件和工艺参数是：

B步骤中所述的微量元素由下列成份组成：FeSO₄·7H₂O 1-3g/L，CoCl₂·6H₂O2-4g/L，MnCl₂·4H₂O 1-3g/L，CuSO₄ 3-8g/L，ZnSO₄ 1-4g/L，EDTA 2-5g/L，H₃BO₃ 3-6g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 1.5-5g/L。

A步骤中所述的将斜面菌种经二级扩大培养制备成种子液，其中第一级扩大培养中发酵培养基组成为：胰蛋白胨6-15g/L，酵母粉3-8g/L，氯化钠4-6g/L，氨苄青霉素50-200mg/L；接种量1-2％，培养温度为28-32℃，培养周期为6-10小时。

所述的第二级扩大培养中培养基选用甘油培养基，该培养基由下列成份组成：胰蛋白胨12-18g/L，酵母粉8-15g/L，氯化钠5g/L，甘油5-10g/L；接种量1-2％，培养温度28-32℃，培养周期12-18小时。

B步骤中所述的补料方式采用对数流加方式，补料培养基由下列成份组成：甘油100-500g/L，酵母粉20-60g/L，胰蛋白胨20-50g/L，(NH₄)₂SO₄10-50g/L，MgSO₄ 8-20g/L。

所述的步骤(4)中高效液相色谱柱为C18，洗脱方法为梯度洗脱。

所述的步骤(4)中采用旋转蒸发或冷冻干燥的方法去除乙腈和TFA。

步骤(1)中所述的裂解液为8M尿素，50m M Tris，PH8.3。

斜面菌种的培养基为3ml LB/Amp。

所述的步骤(1)中的压力匀浆为2遍。

本发明所取得的技术进步在于：

本发明提供了一种可大规模制备重组人心钠肽-rhANP的方法，该方法成本低，原料与菌种易得，操作简单，且生产条件易于控制，重复性好，所制备的产物可有效的适于制药领域的应用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。

本实施例的制备方法包括如下工艺步骤：

A、将斜面菌种经扩大培养制成种子液

将-70℃保存的生产甘油菌种按1％的比例接种于试管中(3ml LB/Amp+培养基)，在30℃、300rpm、培养周期为15小时的培养条件下制成斜面菌种；再按1％的比例接种于小三角瓶中(20ml LB/Amp+培养基)，30℃、300rpm培养8小时；再按1％的比例接种于大三角瓶中(1500ml 2-YT/Amp+培养基)，30℃、300rpm培养15小时。

B、发酵

将上述种子液按3％的比例接种到30L发酵培养基。发酵培养基的组成为：

甘油 5g/L，胰蛋白胨 7g/L，酵母粉 3g/L，KH₂PO₄ 7g/L，

K₂HPO₄ 9g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，MgCl₂ 1.5g/L，微量元素 1ml/L；

微量元素为：

FeSO₄·7H₂O 2g/L，CoCl₂·6H₂O 3g/L，MnCl₂·4H₂O 2g/L，CuSO₄ 6g/L，

ZnSO₄ 3g/L，EDTA 4g/L，H₃BO₃ 5g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 2.5g/L。

发酵条件为28-32℃培养15小时；41-43℃诱导5小时；细菌增长阶段PH7.0，目的基因表达阶段PH7.2；溶解氧18％；搅拌速度600rpm；培养5小时后开始补料，补料速度2000ml/hr。每隔1小时取样测OD₆₀₀。最终发酵液总体积为50L。发酵结束后离心收集菌体，得菌体3450g。经SDS-PAGE分析，目标蛋白表达率达30％。

C、纯化

(1)包涵体的提取：

称取B步骤中收集的菌体1000g，用10L缓冲液(250mM NaCl，10mMTris-HCl，1mM EDTA-Na₂，PH7.8)悬浮，冰水浴，用均质机以650bar压力匀浆2遍，10000rpm离心，15分钟，弃上清，收集沉淀(包涵体)；用5L缓冲液(2M尿素，250mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na₂，PH7.8)洗涤包涵体1次，使其SDS-PAGE纯度达到60％以上；将上述包涵体用9.7L裂解液(8M尿素，50mM Tris，PH8.3)，室湿搅拌6小时，用6N盐酸调PH至8.0；11000rpm离心，25℃，30分钟。弃沉淀，取上清，即得包涵体裂解液。

(2)融合蛋白提取：

用Sepharose 6FF(GE Healthcare)疏水层析提取融合蛋白，将(1)步骤中的上清液用缓冲液[2.2M(NH₄)₂SO₄，50mM Tris-HCl，PH8.0]对倍稀释后上样，流速25ml/min；以2M尿素，0.4M(NH₄)₂SO₄，50mM Tris-HCl，PH8.0洗脱，280nm紫外检测，收集目标峰(第一峰)；层析柱经再生后再次上样。收集的产物共含蛋白质16740mg；用SDS-PAGE分析，纯度85％左右，分子量与理论值一致。

(3)rhANP初步纯化：

将步骤(2)中的疏水层析收集物用缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，PH8.0)稀释，按每毫克融合蛋白用1-5单位凝血酶的用量加入凝血酶17000单位，于32℃反应8小时，调节PH至5.0终止反应。经SDS-PAGE分析，酶切效率很高，达到90％以上。将上述酶切液经Superdex 30pg柱(XK50/100)将大分子蛋白与rhANP分离，以0.1M乙酸-乙酸胺，18mM NaCl，15％乙腈为流动相，收集目标峰(第2峰，即小分子峰)；等目标峰出现后，不需将柱再生，可直接再次上样，单次层析时间110分钟左右。收集产物经SDS-PAGE分析为单一条带，分子量3K。本步骤可连续进行。

(4)rhANP精细纯化：

采用C18高效液相色谱柱(WTARES PREPLC4000，WTARES C₁₈柱，25mm*100mm*3)，流动相A为6％乙腈，0.1％TFA(三氟乙酸)，流动相B为30％乙腈，0.1％TFA(三氟乙酸)，进行线性梯度洗脱；收集目标峰，去除乙腈和TFA，即为纯化的rhANP。

发酵菌种选用大肠杆菌遗传工程菌株(pCW112-ANP/DH5α)。

采用上述方法得到的rhANP，经SDS-PAGE分析，分子量为3K，与标准品一致，其纯度为单一条带；rp-HPLC的分析结果，与标准品完全一致；肽图、紫外光谱与标准品一致；毛细管电泳测定的等电点，与标准品相同，PI＞10；氨基酸组成、氨基酸序列、二硫键位置与标准品一致，并和理论值相同。

Claims

1、利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法，其特征在于该方法包括如下工艺步骤：

A、将斜面菌种经扩大培养制成种子液；所述的将斜面菌种经二级扩大培养制备成种子液，其中第一级扩大培养中发酵培养基组成为：胰蛋白胨6-15g/L，酵母粉3-8g/L，氯化钠4-6g/L，氨苄青霉素50-200mg/L；接种量1-2％，培养温度为28-32℃，培养周期为6-10小时；

第二级扩大培养中培养基选用甘油培养基，该培养基由下列成份组成：胰蛋白胨12-18g/L，酵母粉8-15g/L，氯化钠5g/L，甘油5-10g/L；接种量1-2％，培养温度28-32℃，培养周期12-18小时；

B、将A步骤中制备的种子液按种子液：发酵培养基按2-5％的比例接种于发酵培养基进行发酵，其中发酵培养基包括下列体积重量份的组分：

甘油3-8g/L，胰蛋白胨4-10g/L，酵母粉2-6g/L，KH₂PO₄ 4-10g/L，

K₂HPO₄ 6-12g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-4g/L，MgCl₂ 0.5-2g/L，微量元素1ml/L；

培养温度为28-32℃，培养15-20小时后诱导，诱导温度为41-43℃，诱导时间4-6小时；升温诱导之前，将菌体的平均比生长速率控制在0.2～0.4；所述的微量元素由下列成份组成：FeSO₄·7H₂O 1-3g/L，CoCl₂·6H₂O 2-4g/L，MnCl₂·4H₂O 1-3g/L，CuSO₄ 3-8g/L，ZnSO₄ 1-4g/L，EDTA 2-5g/L，H₃BO₃ 3-6g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 1.5-5g/L；

发酵过程中细菌增殖阶段的pH值控制在6.9-7.1，在目的基因表达阶段的pH值为7.1-7.3，通气量为0.5～1.5VVM，发酵过程的溶解氧浓度为15％-50％，并进行补料，控制补料速率与菌体的消耗速率相当，使发酵液中的甘油浓度维持在1.0～3.0g/L；发酵液经离心收集菌体，离心条件为3500-5000rpm，4-10℃，15-20分钟，发酵周期为19-26小时；所述的补料方式为对数流加方式，补料培养基由下列成份组成：甘油100-500g/L，酵母粉20-60g/L，胰蛋白胨20-50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10-50g/L，MgSO₄ 8-20g/L；

C、纯化

(1)包涵体的提取：将B步骤中收集的菌体按1∶5-10的比例用缓冲液重悬，缓冲液组成为150-250mM NaCl，10-50mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na₂，PH7.5-9.0，冰水浴，用均质机以600-700bar压力匀浆，离心，收集包涵体沉淀；用缓冲液洗涤包涵体1-2次，该缓冲液组成为2M尿素，150-250mM NaCl，10-50mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na₂，PH7.5-9.0，使其SDS-PAGE纯度达到60％以上；将包涵体按1∶20-40的比例加入裂解液，室温搅拌5-8小时，离心，离心条件为8000-11000rpm，4-25℃，15-30分钟，弃沉淀，取上清；所述的裂解液为8M尿素，50mM Tris，PH8.3；

(2)融合蛋白提取：用Sepharose 6FF疏水层析提取融合蛋白，将(1)步骤中的上清液直接上样或用2.2M(NH4)₂SO4，10-50mM Tris-HCl，PH8.0-9.0稀释一倍后上样，以2M尿素，0.4M(NH4)₂SO4，10-50mM Tris-HCl，PH8.0-9.0洗脱，280nm紫外检测，收集目标峰中的第一峰；

(3)rhANP初步纯化：将步骤(2)中的疏水层析收集物用缓冲液稀释，该缓冲液组成为10-50mM Tris-HCl，150-250mM NaCl，PH8.0-9.0，按每毫克融合蛋白用1-5单位凝血酶的用量加入凝血酶，于28-35℃反应4-10小时；以0.1M乙酸-乙酸胺，150-250mM NaCl，0-25％乙腈为流动相，用Superdex 30pg分离，收集目标峰；

(4)rhANP精细纯化：采用高效液相色谱柱，流动相A为6％乙腈，0.05％-0.1％TFA，流动相B为30％乙腈，0.05％-0.1％TFA，进行洗脱；收集目标峰，去除乙腈和TFA，即为纯化的rhANP；

发酵菌种选用大肠杆菌遗传工程菌株——pCW112-ANP/DH5α。

2、根据权利要求1所述的利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法，其特征在于所述的步骤(4)中高效液相色谱柱为C18，洗脱方法为梯度洗脱。

3、根据权利要求1所述的利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法，其特征在于所述的步骤(4)中采用旋转蒸发或冷冻干燥的方法去除乙腈和TFA。

4、根据权利要求1所述的利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法，其特征在于斜面菌种的培养基为3ml LB/Amp。

5、根据权利要求1所述的利用高密度发酵制备重组人心钠肽-rhANP的方法，其特征在于步骤(1)中所述的压力匀浆为2遍。